專利名稱：：豬袋裝冷凍精液保存液及其保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，涉及一種精液保存液及精液的保存方法，特別是涉及一種豬袋裝冷凍精液保存液及精液的保存方法。二、技術(shù)背景隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展需要，豬常溫保存精液的人工授精已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬的冷凍精液人工授精技術(shù)已成為國內(nèi)外養(yǎng)豬生產(chǎn)中亟待解決的問題。豬冷凍精液與常溫精液保存相比，冷凍精液可以使優(yōu)良基因得到無限期的保存(如本地豬種資源保護(hù))，延長公豬使用年限，不受該公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)的母豬配種，獲得更大的遺傳進(jìn)展；使種豬選擇不受時(shí)間或地理位置差異的限制，可以引進(jìn)國外高性能公豬凍精取代活體公豬，可節(jié)省外匯支出；有利于人工授精體系的完善，公豬冷凍精液完全可以在后裔測定或疾病檢測后開始大量供應(yīng)，為穩(wěn)定的遺傳進(jìn)展和嚴(yán)格的生物安全體系建設(shè)提供額外保障。從健康角度考慮,凍精為疾病檢測提供了足夠的時(shí)間，凍精還可在疾病暴發(fā)時(shí)利用大型的人工授精站提供穩(wěn)定的精液供應(yīng)保障。目前，對豬精液冷凍方法主要有顆粒冷凍精液、細(xì)管冷凍精液和安瓿瓶冷凍精液三種方法。顆粒冷凍精液的顆粒大小一般在0.1ml左右，顆粒過大時(shí)里層和外層精液的受溫過于不均勻，效果較差；若顆粒過小，則在冷凍時(shí)又費(fèi)事也不太方便。細(xì)管冷凍精液的細(xì)管類型有0.25ml型和0.5ml型兩種，如要滿足1頭母豬的輸精劑量，0.5ml的細(xì)管至少要10個(gè)以上，否則，無法滿足精子的總量要求；安瓿瓶冷凍精液的方法，存在制作工藝繁雜、成本較高、安瓿瓶易破裂等問題。專利號(hào)為200410013364.X的文件公開了一種常溫下的豬精液的保存液，該保存液原料為葡萄糖、牛血清白蛋白、氯化鉀、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸、碳酸氫鈉、抗生素和水等成分。該發(fā)明在一定程度上可以高優(yōu)秀種公豬的精液利用率，但精液的保存時(shí)間較短，一般只有7天左右，不能長期保存。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供一種豬袋裝冷凍精液保存液和精液的保存方法，該方法能有效地保持精子的活力、使用簡單、方便，成本低廉，可滿足豬冷凍精液人工授精的需要。本發(fā)明的技術(shù)方案是豬袋裝冷凍精液保存液，所述保存液由A液和B液組成，A液配制稱取葡萄糖110克、乳糖110克、谷氨酸鈉18克、聚乙烯吡咯烷酮18克，依次加入100毫升蒸餾水中，使其完全溶解，再加入抗生素1020萬國際單位，用細(xì)菌過濾器過濾，然后加入維生素Bu0.020.1克、安鈉咖0.020.1克、卵黃1030毫升，充分混勻后得到A液；B液配制取A液50100毫升，加入甘油210毫升、N-N-二甲基甲酰胺210毫升，充分混勻后得到B液。所述A液成分為葡萄糖13克、乳糖13克、谷氨酸鈉12克、聚乙烯吡咯烷酮12克，抗生素1015萬國際單位、維生素B,20.020.04克、安鈉咖0.020.04克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液7595毫升、甘油26毫升、N-N-二甲基甲酰胺26毫升。所述A液成分為葡萄糖37克、乳糖13克、谷氨酸鈉26克、聚乙烯吡咯垸酮25克、抗生素1520萬國際單位、維生素B^0.040.08克、安鈉咖0.040.08克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液70100毫升、甘油48毫升、N-N-二甲基甲酰胺48毫升。所述抗生素為硫酸慶大霉素、青霉素或鏈霉素。所述A液和B液的pH值為6.57.5、滲透壓為300500mmol/L。一種豬袋裝冷凍精液保存液保存精液的方法，該方法包括以下步驟(1)采精和濃縮對公豬進(jìn)行精液采集、精液離心分離，收集下層液體，控制精子密度在10億/ml以上，保存、備用；(2)降溫按A液和濃縮精液的比為l:0.52的比例，在18~35°〇下將精液等溫稀釋，然后冷藏，經(jīng)12小時(shí)降溫至14'C;(3)平衡將冷藏精液用B液進(jìn)行第二次稀釋，B液和冷藏精液的配比1:0.52，稀釋后精液在14'C下保存12小時(shí)；(4)分裝將精液分裝成袋；(5)冷凍將袋裝精液在液氮中保存。所述精液分裝成袋是將精液用無菌袋按每袋5ml精液分裝。所述在液氮中保存是將袋裝精液先在距離液氮面25cm處熏蒸510分鐘，然后投入液氮中冷凍保存。本發(fā)明的積極有益效果(1)本發(fā)明的豬袋裝冷凍精液保存液配方中，葡萄糖和乳糖主要為精子提供營養(yǎng)和能量，并具有保護(hù)精子、抗低溫的作用；谷氨酸鈉主要為精液提供緩沖作用；卵黃和聚乙烯吡咯烷酮主要由抗低溫保存精子的作用；維生素Bu和安鈉咖有減少精子畸形率，提高精子活力的功能；抗生素如硫酸慶大霉素主要是殺菌、抑制細(xì)菌生長的作用，各成分采用合適的比例混合后，可產(chǎn)生較好的協(xié)同作用，有利于豬精液的保存。(2)本發(fā)明的方法采用5ml無菌塑料袋對豬精液進(jìn)行分裝、冷凍、解凍和輸精等操作，具有每袋豬精液可滿足l頭母豬輸精需要的特點(diǎn)，整個(gè)操作簡單、方便，避免了二次污染，成本低廉，可滿足豬冷凍精液人工授精的需要。(3)運(yùn)用本發(fā)明方法保存的豬袋裝冷凍精液表明，該方法保存的精液可以正常用于豬的人工授精，并且豬的妊娠率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)均和常溫保存的豬精液人工授精效果相當(dāng)，可以正常使用。(4)本發(fā)明方法保存的豬袋裝冷凍精液可以在液氮中長期保存，可以顯著提高優(yōu)秀種公豬的精液利用率，降低生產(chǎn)成本，能獲得更大的遺傳進(jìn)展，有利于豬人工授精體系的完善。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配制A液配制稱取葡萄糖10克、乳糖1克、谷氨酸鈉8克、聚乙烯吡咯垸酮8克，溶于100毫升蒸餾水中，再依次加入使其完全溶解，再加入硫酸慶大霉素IO萬國際單位，用細(xì)菌過濾器過濾，然后加入維生素B^0.02克、安鈉咖0.02克、卵黃10毫升，充分混勻后為A液。B液配制取A液50毫升，加入甘油2毫升、N-N-二甲基甲酰胺2毫升，充分混勻后得到B液。要求上述所用試劑均為分析純，A液和B液的pH值均為6.57.5、滲透壓為300500mmol/L，對酸、堿均具有一定的緩沖能力。(二)利用上述冷凍精液保存液的保存豬精液的方法，包括以下步驟1.采精和精液濃縮采用手握法對8頭公豬進(jìn)行采精，將采集的精液用離心機(jī)800轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分層后收集下層的精子部分，精子密度控制在10億個(gè)/ml以上。對精液進(jìn)行品質(zhì)檢査，確保精子活力在0.6以上，畸形率在20%以內(nèi)，保存、備用；2.降溫將濃縮的精液，按A液和濃縮精液為1:0.5的比例在20。C下等溫稀釋，可將A液緩慢加入到精液中，然后在冰箱冷藏室經(jīng)12小時(shí)降溫至12°C。3.平衡將降溫至14。C的精液，按B液和濃縮精液為1:0.5的比例在l2'C下進(jìn)行第二次稀釋，可將B液緩慢加入到精液中，在12"C存放12小時(shí)。4.分裝將平衡好的精液用無菌塑料袋按每袋5ml分裝，即按每頭豬5ml的用量分裝好。5.冷凍將分裝好的精液先在距離液氮面2cm處進(jìn)行熏蒸5分鐘，然后直接投入到液氮中冷凍，使其與液氮溫度保持一致(即一196°C)，然后一直在液氮中保存。6.解凍和解凍后精液品質(zhì)檢査使用前將冷凍的精液投入到384(TC溫水中，解凍1020秒鐘；然后進(jìn)行精液品質(zhì)檢査，精子活力在0.4以上、畸形率20%以下、頂體完整率在60%以上為合格。實(shí)施例二(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配制，同實(shí)施例一不同之處在于A液成分葡萄糖1克、乳糖1克、谷氨酸鈉1克、聚乙烯吡咯烷酮1克，蒸餾水100毫升，硫酸慶大霉素20萬國際單位，維生素B120.02克、安鈉咖0.02克、卵黃10毫升。B液成分A液60毫升、甘油2毫升、N-N-二甲基甲酰胺2毫升。(二)利用上述的冷凍精液保存液的保存豬精液的方法，包括以下步驟-1.采精和精液的濃縮同實(shí)施例一。2.降溫按A液和濃縮精液為1:1的比例在25'C等溫稀釋，然后在冰箱經(jīng)1小時(shí)降溫至4'C。3.平衡將降溫至4t:的精液，按B液和精液1:1的比例在4r下第二次稀釋，然后在4'C下存放1小時(shí)。其他分裝、冷凍、解凍和解凍后精液的品質(zhì)檢查同實(shí)施例一。實(shí)施例三(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖3克、乳糖10克、谷氨酸鈉5克、聚乙烯吡咯烷酮3克，蒸餾水100毫升，硫酸慶大霉素15萬國際單位，維生素B120.03克、安鈉咖0.04克、卵黃30毫升。B液成分A液75毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲酰胺4毫升。(二)利用豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，包括以下步驟1.采精和精液的濃縮同實(shí)施例一。2.降溫按A液和濃縮精液l丄5的比例在20'C等溫稀釋，然后在冰箱經(jīng)2小時(shí)降溫至rc。3.平衡將降溫至rC的精液，按B液和濃縮精液1:1.5的比例在rc下進(jìn)行第二次稀釋，然后在rc存放2小時(shí)。其他分裝、冷凍、解凍和解凍后精液的品質(zhì)檢査同實(shí)施例一。實(shí)施例四(一)豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于-A液成分葡萄糖1.5克、乳糖2克、谷氨酸鈉1.5克、聚乙烯吡咯烷酮l克，蒸餾水100毫升、青霉素15萬國際單位、維生素8120.03克、安鈉咖0.04克、卵黃15毫升。B液成分A液80毫升、甘油3毫升、N-N-二甲基甲酰胺3毫升。(二)利用豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，包括以下步驟1.采精和精液的濃縮同實(shí)施例一。2.降溫按A液和濃縮精液l丄8的比例在常溫下20'C等溫稀釋，然后在冰箱冷藏室經(jīng)1.5小時(shí)降溫至2°C。3.平衡將降溫至2。C的精液，按B液和濃縮精液1丄8的比例在2'C下第二次稀釋，然后在2'C存放1.5小時(shí)。其他分裝、冷凍、解凍和解凍后精液的品質(zhì)檢査同實(shí)施例一。實(shí)施例五豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖5克、乳糖7克、谷氨酸鈉4克、聚乙烯吡咯烷酮5克、蒸餾水100毫升、連霉素20萬國際單位、維生素Bu0.06克、安鈉咖0.03克、卵黃16毫升。B液成分A液60毫升、甘油8毫升、N-N-二甲基甲酰胺7毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例六豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖7克、乳糖3克、谷氨酸鈉2克、聚乙烯吡咯烷酮4克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素10萬國際單位，維生素B120.04克、安鈉咖0.03克、卵黃10毫升。B液成分A液90毫升、甘油4毫升、N-N-二甲基甲酰胺9毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例七豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖3克、乳糖2克、谷氨酸鈉4克、聚乙烯吡咯烷酮5克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素15萬國際單位、維生素B120.03克、安鈉咖0.07克、卵黃15毫升。B液成分A液65毫升、甘油8毫升、N-N-二甲基甲酰胺8毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例八豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于-A液成分葡萄糖4克、乳糖2克、谷氨酸鈉3克、聚乙烯吡咯烷酮4克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素20萬國際單位、維生素B120.08克、安鈉咖0.07克、卵黃18毫升。B液成分A液95毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲酰胺5毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例九豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖6克、乳糖2克、谷氨酸鈉5克、聚乙烯吡咯垸酮3克、100毫升蒸餾水、硫酸慶大霉素15萬國際單位、維生素BI20.07克、安鈉咖0.06克、卵黃20毫升。B液成分A液80毫升、甘油7毫升、N-N-二甲基甲酰胺4毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例十豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液配制葡萄糖5克、乳糖1克、谷氨酸鈉6克、聚乙烯吡咯烷酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素12萬國際單位、維生素B120.06克、安鈉咖0.04克、卵黃13毫升。B液成分A液70毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲酰胺3毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例十一豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖1克、乳糖1.5克、谷氨酸鈉2克、聚乙烯吡咯烷酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素10萬國際單位、維生素B120.02克、安鈉咖0.03克、卵黃15毫升。B液成分A液80毫升、甘油3毫升、N-N-二甲基甲酰胺4毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例十二豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖2.5克、乳糖1克、谷氨酸鈉1.5克、聚乙烯吡咯垸酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素20萬國際單位、維生素B^0.06克、安鈉咖0.04克、卵黃13毫升。B液成分A液80毫升、甘油4毫升、N-N-二甲基甲酰胺3毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例十三豬袋裝冷凍精液保存液的配制同實(shí)施例一，不同之處在于A液成分葡萄糖3克、乳糖2克、谷氨酸鈉6克、聚乙烯吡咯烷酮2克、蒸餾水100毫升、硫酸慶大霉素10萬國際單位、維生素B120.06克、安鈉咖0.04克、卵黃13毫升。B液成分A液70毫升、甘油5毫升、N-N-二甲基甲酰胺4毫升。豬袋裝冷凍精液保存液的保存方法，同實(shí)施例一，不再重述。實(shí)施例十四在同一豬場、采用相同種豬運(yùn)用本發(fā)明的豬袋裝冷凍精液的人工授精和常溫保存的豬精液人工授精的比較(一)本發(fā)明的豬袋裝冷凍精液的人工授精的運(yùn)用1.發(fā)情母豬的鑒定當(dāng)按壓其背部或人騎在母豬背上時(shí)，母豬站立不動(dòng)，同時(shí)表現(xiàn)為耳豎起，背弓起，尾豎起，顫抖，對外陰和側(cè)腹部的剌激敏感，視為發(fā)情，作輸精準(zhǔn)備。2.輸精前精液的處理取本發(fā)明方法已冷凍存放一年的豬袋裝冷凍精液一袋即5ml，解凍，可直接投入到3840'C溫水中，解凍1020秒鐘；然后進(jìn)行精液品質(zhì)檢查，要求精子活力均在0.4以上、畸形率20%以內(nèi)、頂體完整率在60%以上，合格精子用豬精液常溫保存液(如EDTA、GuelPh、BTS、Zorpva、Reading等)按1:10的比例在一次性豬人工授精輸精瓶中稀釋。3.輸精采用豬一次性無消毒輸精器對發(fā)情母豬進(jìn)行輸精，發(fā)情后612小時(shí)內(nèi)作第一次輸精，間隔12小時(shí)第二次輸精。4.結(jié)果共輸精25歲繁殖母豬26頭。其中23頭繁殖母豬分娩，1頭流產(chǎn)，2頭未妊娠，出現(xiàn)返情。妊娠率為88.4%，23頭繁殖母豬分娩，平均窩產(chǎn)仔數(shù)為9.3頭。(二)采用常溫保存的豬精液的人工授精1.發(fā)情母豬的鑒定，同上；2.輸精前精液的處理采集豬新鮮精液，對精液進(jìn)行品質(zhì)檢査，用豬精液常溫保存液(如EDTA、GuelPh、BTS、Zorpva、Reading等)按50億/60ml/份分裝好，在常溫(17~18°C)下保存，4天內(nèi)(活力不能低于0.6)可用于輸精。3.輸精將分裝好的豬精液，采用豬一次性無消毒輸精器對發(fā)情母豬進(jìn)行輸精。發(fā)情后612小時(shí)內(nèi)作第一次輸精，間隔12小時(shí)第二次輸精。4.結(jié)果共輸精25歲繁殖母豬143頭。其中132頭繁殖母豬分娩，3頭流產(chǎn)，8頭未妊娠，出現(xiàn)返情。妊娠率為92.3%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)為9.5頭。列表對比<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>通過上述比較可以看出，采用常溫保存的豬精液人工授精和本發(fā)明豬袋裝冷凍精液人工授精在妊娠率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)等方面接近。權(quán)利要求1.豬袋裝冷凍精液保存液，其特征是所述保存液由A液和B液組成，A液配制稱取葡萄糖1～10克、乳糖1～10克、谷氨酸鈉1～8克、聚乙烯吡咯烷酮1～8克，依次加入100毫升蒸餾水中，使其完全溶解，再加入抗生素10～20萬國際單位，用細(xì)菌過濾器過濾，然后加入維生素B120.02～0.1克、安鈉咖0.02～0.1克、卵黃10～30毫升，充分混勻后得到A液；B液配制取A液50～100毫升，加入甘油2～10毫升、N-N-二甲基甲酰胺2～10毫升，充分混勻后得到B液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特征是所述A液成分為葡萄糖13克、乳糖13克、谷氨酸鈉12克、聚乙烯吡咯垸酮12克，抗生素10~15萬國際單位、維生素B120.020.04克、安鈉咖0.020.04克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液7595毫升、甘油26亳升、N-N-二甲基甲酰胺26毫升。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特征是所述A液成分為葡萄糖37克、乳糖13克、谷氨酸鈉26克、聚乙烯吡咯烷酮25克、抗生素15-20萬國際單位、維生素B120.040.08克、安鈉咖0.040.08克、卵黃1020毫升；所述B液成分為A液70100毫升、甘油48毫升、N-N-二甲基甲酰胺48毫升。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特征是所述抗生素為硫酸慶大霉素、青霉素或鏈霉素。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液，其特征是所述A液和B液的pH值為6.57.5、滲透壓為30050Ommol/L。6.—種用權(quán)利要求1所述的豬袋裝冷凍精液保存液保存精液的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)采精和濃縮對公豬進(jìn)行精液采集、精液離心分離，收集分離的下層液體，控制精子密度在10億/ml以上，保存、備用；(2)降溫按A液和濃縮精液的比為l:0.52的比例，在1835。C下將精液等溫稀釋，然后冷藏，經(jīng)12小時(shí)降溫至14'C;(3)平衡將冷藏精液用B液進(jìn)行第二次稀釋，B液和冷藏精液的配比1:0.52，稀釋后精液在14t:下保存12小時(shí)；(4)分裝將精液分裝成袋；(5)冷凍將袋裝精液在液氮中保存。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的保存精液的方法，其特征是所述精液分裝成袋是將精液用無菌袋按每袋5ml精液分裝。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的保存精液的方法，其特征是所述在液氮中保存是將袋裝精液先在距離液氮面25cm處熏蒸510分鐘，然后投入液氮中冷凍保存。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬袋裝冷凍精液保存液及其保存方法，保存液由A液和B液組成，A液中葡萄糖1～10克、乳糖1～10克、谷氨酸鈉1～8克、聚乙烯吡咯烷酮1～8克、蒸餾水100毫升、抗生素10～20萬國際單位、維生素B₁₂0.02～0.1克、安鈉咖0.02～0.1克、卵黃10～30毫升；B液為A液50～100毫升、甘油2～10毫升、N-N-二甲基甲酰胺2～10毫升。用此保存液保存精液的方法包括，包括采精后將精液濃縮，按A液和濃縮精液按比例等溫稀釋、冷藏；再用B液進(jìn)行第二次稀釋，將精液分裝成袋；然后在液氮中保存。該方法能有效地保持精子的活力、使用簡單、方便，成本低廉，可滿足豬冷凍精液人工授精的需要。文檔編號(hào)C12N5/06GK101418282SQ200810231378公開日2009年4月29日申請日期2008年12月15日優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日發(fā)明者孟令坤,尹慧茹,張松濤,張長興,凱權(quán),陳理盾,高家登,魏紅芳,黃炎坤申請人:鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校