專利名稱:一種補料發(fā)酵生產輔酶Q<sub>10</sub>的方法
技術領域:
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域,具體涉及一種補料發(fā)酵生產輔酶Q1Q的方法。
背景技術:
輔酶Q^別名癸烯醌、泛酮、萬有醌,英文名Coenzyme Q1Q,簡稱Cc^。,為脂溶性酮類 化合物,化學名稱2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌。分子式C59H9。04 ;CAS號
303-98-0 ;化學結構式^^-^11^^^^^^.性質黃色或淺黃色結晶性粉
末。易溶于氯仿、苯和四氯化碳,溶于丙酮、乙醚,微溶于乙醇,不溶于水和甲醇。遇光易分 解。 輔酶Qw在動植物、微生物細胞內與線粒體內膜相結合,是呼吸鏈中重要遞氫體, 是一種有效的生化藥物,具有重要的生理作用,近年來已被廣泛應用于各類心臟病、糖尿 病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。此外,在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性 牙周炎以及促進胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。最近,研究發(fā)現(xiàn)CoQ,具有抗衰老 作用,從而將其應用擴展到化妝品和保健品領域,使其在國內外的需求進一步擴大。
CoQ1Q的制備方法主要有五種 1、半合成法目前開發(fā)的半合成法工藝是以對甲基苯酚為原料通過溴代,醚化、氧 化獲得甲基二甲氧基苯醒,然后與從煙草或馬鈴薯葉子中提取茄呢醇縮合得到輔酶Qi。。該 方法的關鍵是如何將側鏈連接到母環(huán)上。 2、全合成法1988年Eem和Kanan開發(fā)的全合成法生產輔酶Qw工藝是目前唯一 成功的全合成法技術,但是由于合成線性不飽和側鏈存在一定難度,以及合成條件苛刻,與 工業(yè)化還有一定的距離。 3、發(fā)酵法1977年實現(xiàn)了微生物發(fā)酵法生產輔酶Q^。這種生產工藝被認為是最有 前途的合成工藝,近幾年來微生物發(fā)酵法成為國內外開發(fā)的熱點。紅極毛桿菌、脫氮極毛桿 菌,甲烷微環(huán)菌等是生產輔酶Q1Q的主要菌種。 4、植物細胞培養(yǎng)法植物細胞培養(yǎng)技術是將植物體的某一部分經過無菌處理后, 置于人工培養(yǎng)基上使其細胞增殖,進而按需要進行培養(yǎng)的技術。植物的各個部位,如根、莖、 葉、花、果、花藥和花粉等都可以作為外植體來啟動細胞培養(yǎng),所形成的脫分化細胞團稱為 愈傷組織,將愈傷組織轉移到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)稱為懸浮培養(yǎng)。 5、生物提取法(1)醇一堿皂化制造法該工藝輔酶Q1Q的收率為61. 2mg/kg新鮮 豬心,這是國內普遍采用工藝。在乙醇的存在下,長時間的皂化可能導致輔酶Qw中的甲氧 基和乙醇中乙氧基換位,生成單或雙乙氧基衍生物,為了避免這些雜質的生成??梢杂肒0H 代替NaOH和甲醇皂化,但也必須加入焦性沒石子酸,否則輔酶Q1Q在皂化過程中全部被破 壞,加入量占起始原料的5% _7%,皂化過程中可以通入氮氣。(2)醇一醚混合提取法該工 藝醇一堿皂化制造法工藝相似,只是省去了皂化反應。 總的來說化學合成法合成步驟繁多,條件苛刻,副產物含量多,提純成本高;并
3且合成產物為順反異構體的混合物,生物活性低,要合成生物活性高的CoQ1Q尚未達到工業(yè) 化生產的程度。生物提取法中動植物CoQ1Q含量低,而且各種化學成份復雜,并受原料和來 源限制,因此產品成本高,價格昂貴,規(guī)模化生產受到了一定限制。植物細胞培養(yǎng)法周期長, 產率低,而且生產成本高,不利于工業(yè)化生產。相比之下利用微生物發(fā)酵法生產CoQw有幾 個基本優(yōu)點(l)發(fā)酵產物為天然品,生物活性好,易被人體吸收;(2)沒有原材料的制約, 可通過規(guī)模放大提高生產能力。如能選擇合適菌株進行誘變選育,選育性能優(yōu)良的菌種,同 時優(yōu)化發(fā)酵工藝,使菌種的Co(^。。生產水平提高,生產成本就會大幅度下降。因此,微生物 生產CoQ1Q在工業(yè)化生產上更為看好。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種補料發(fā)酵的方法來生產CoQw。 本發(fā)明技術人員經長期研究發(fā)現(xiàn)紅色酵母菌HY-05能用于發(fā)酵生產C0Q1Q,并能高 密度發(fā)酵。研究表明,蔗糖是酵母菌HY-05發(fā)酵生產C0Q1Q的較佳碳源,但濃度過高會抑制 CoQw合成。玉米漿中含有多種氨基酸、生物素、蛋白質等成分,可提供細胞生長所需的氮, 并可作為CoQ1Q合成的促進劑,但研究表明,玉米漿起始濃度過高不利于CoQ1Q發(fā)酵。本發(fā)明 以補料分批培養(yǎng)的方式較好的解決了此問題。
具體發(fā)酵方法如下所示
1、種子培養(yǎng) 從活化斜面上挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基,28°C , 240r/min培養(yǎng)24h。種子培養(yǎng) 基(%):蔗糖2.0,蛋白胨1.0,酵母粉1.0;自然pH。
2、搖瓶培養(yǎng) 菌種在平板上28t:培養(yǎng)48h后,接入種子培養(yǎng)基(20mL/250mL錐形瓶),28t:振蕩 培養(yǎng)2處后,以2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(40mL/500mL錐形瓶),26t:振蕩培養(yǎng)72h。發(fā)酵 培養(yǎng)基(% ):蔗糖4.0,蛋白胨2.8,腿2 040. 13 ;PH= 5.0。
3、補料分批培養(yǎng) 5L發(fā)酵罐裝液量3L,接種量2 % ,發(fā)酵溫度26 °C , pH5. 5 6. 5為宜,攪拌速度 300r/min。在發(fā)酵前期可通過轉速和通氣量控制溶解氧在50 %左右,從發(fā)酵第24h開始,在 減速流加20%蔗糖溶液的同時以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米漿,保持溶解氧的濃度在 35X左右,48h時終止發(fā)酵。 本發(fā)明用補料發(fā)酵的方法,生產出的Co(^。明顯優(yōu)于分批發(fā)酵,并且補料方式、補 加底物的量都影響著CoQ1Q的合成量。當?shù)孜锵乃俾瘦^高,細胞生長較快時,CoQ1Q的合 成速率較低,在細胞生長的穩(wěn)定期CoQ1Q合成繼續(xù)進行。細胞的生長與CoQ1Q的合成屬于半 耦聯(lián)型,底物的流加必須兼顧細胞生長和產物的合成。采用補料分批發(fā)酵方式不僅可減少 底物的反饋抑制,而且可增大發(fā)酵過程中的溶氧,進一步提高CoQw的合成量。玉米漿中含 有嘌呤類、硫氨素、苯丙氨酸、纈氨酸等多種成分,可作為Co(^。合成的促進劑提高產物的合 成。從發(fā)酵第24h開始,在減速流加蔗糖的同時以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米漿,CoQ1Q 的積累可達到最大為156. 2mg/L,與不補料相比產量提高了 58. 1%。
與現(xiàn)有CoQ1Q生產方法相比,本發(fā)明具有如下有益效果
1、所用發(fā)酵菌株紅色酵母菌HY-05為安全性菌株;
2、所用發(fā)酵培養(yǎng)基及相關原料價廉易得,可降低發(fā)酵成本;
3、發(fā)酵溫度適中,發(fā)酵條件要求低;
4、發(fā)酵所得單位產量高。
權利要求
一種生產輔酶Q10的方法,采用補料發(fā)酵法生產,其特征在于發(fā)酵所采用的菌種為紅色酵母菌HY-05。
2. 根據(jù)權利要求1所說補料發(fā)酵的方法,其特征在于,所述發(fā)酵方法具體包括如下步驟① 種子培養(yǎng)從活化斜面上挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基,28t:,240r/min培養(yǎng)24h。 種子培養(yǎng)基(%):蔗糖2.0,蛋白胨1.0,酵母粉1.0;自然pH。② 搖瓶培養(yǎng)菌種在平板上2『C培養(yǎng)48h后,接入種子培養(yǎng)基(20mL/250mL錐形瓶), 28t:振蕩培養(yǎng)24h后,以2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(40mL/500mL錐形瓶),26。C振蕩培養(yǎng) 72h。發(fā)酵培養(yǎng)基(% ):蔗糖4. 0,蛋白胨2. 8, KH2P040. 13 ;pH = 5. 0。③ 補料分批培養(yǎng)接種量為2%,發(fā)酵溫度26°C, pH5. 5 6. 5為宜,攪拌速度300r/ min。在發(fā)酵前期可通過轉速和通氣量控制溶解氧在50%左右,從發(fā)酵第24h開始,在減速 流加20%蔗糖溶液的同時以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米漿,保持溶解氧的濃度在35% 左右,48h時終止發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域,具體涉及一種補料發(fā)酵法生產輔酶Q10。本發(fā)明采用紅色酵母菌HY-05用于發(fā)酵生長輔酶Q10,并用玉米漿補料分批發(fā)酵,在減少底物的反饋抑制同時,增大發(fā)酵過程中的溶氧,進一步提高輔酶Q10的合成量,發(fā)酵成本低。
文檔編號C12P7/24GK101760484SQ200810162759
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權日2008年12月11日
發(fā)明者吳菁 申請人:吳菁