專利名稱：人源性抗大皰性類天皰瘡抗原bp180單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源性抗大皰性類天皰瘡抗 原BP180單鏈抗體，它通過與BP180的結(jié)合，阻斷大皰性類天皰瘡自身抗 體與相應(yīng)自身抗原BP180的結(jié)合，從而阻斷由于自身抗體的結(jié)合而激活補體 所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具有治療大皰性類天皰瘡的作用。
背景技術(shù)：
大皰性類天皰瘡(BP)是一種常見而且頑固的自身免疫性水皰病，而 且是一種疑難病癥，目前缺乏特異性治療手段而主要依靠糖皮質(zhì)激素等進(jìn)行 系統(tǒng)免疫抑制。大皰性類天皰瘡病的主要病理改變是以抗BP180自身抗體為主的致病 性自身抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合，激活補體并引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致表皮真皮 分離形成水皰。目前在臨床上對大皰性類天皰瘡的治療包括皮質(zhì)類固醇激 素、免疫抑制劑和其他治療方法。由于缺乏特異性，因而療效差且毒副作用 顯著。根據(jù)申請人所進(jìn)行的資料檢索，目前國內(nèi)外尚沒有治療大皰性類天皰 瘡的特效藥品。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈 抗體(human anti-BP180scFv)，可在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)，以期利 用該人源性的抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體解決臨床治療大皰性 類天皰瘡的問題，并最終成為治療大皰性類天皰瘡的生物藥品。 為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案 一種人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180基因工程抗體，其基因序列在結(jié)構(gòu)上屬于單鏈抗體(scFv)，由輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因組成，其中輕鏈可變區(qū)基因為CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGGCGGAGGGACC;重鏈可變區(qū)基因為:CACTTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGATTGGAGTGGGTGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA 。上述人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體的制備方法，包括以 下主要步驟a、 分離大皰性類天皰瘡患者外周血單一核細(xì)胞，提取RNA并經(jīng)過RT-PCR 擴增抗體輕重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建噬菌體抗體庫；b、 從噬菌體抗體庫中篩選抗BP180噬菌體抗體；c、 利用基因工程手段，獲得可溶性表達(dá)的人源性抗BP180單鏈抗體；d、 對所獲抗體的結(jié)合活性、特異性、親和力等免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 通過生物學(xué)實驗證明，本發(fā)明的人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體，具#封閉大皰性類天皰瘡自身抗體與相應(yīng)自身抗原結(jié)合的活性，能夠阻斷由于自身抗體的結(jié)合而激活補體所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具有治療大皰 性類天皰瘡的作用。
具體實施方式
大皰性類天皰瘡(BP)的發(fā)病是由致病性自身抗體介導(dǎo)、補體等多種 炎癥成分參與而導(dǎo)致皮膚嚴(yán)重免疫損傷的一個復(fù)雜過程。BP180系表皮基底 細(xì)胞跨膜膠原蛋白，又稱XVII型膠原(COL17)或大皰性類天皰瘡抗原2 (BPAG2)，其基因定位于10q24.3。 BP180分子由細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域三部分組成，其中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域又包括15個膠原編碼區(qū)(分 別由15個非膠原編碼區(qū)相互分隔)以及第十六非膠原編碼區(qū)(NC16A)， 形成一帶有柔性尾部的桿狀膠原蛋白結(jié)構(gòu)，連接基底細(xì)胞并向下延伸達(dá)致密 板，然后其末端向上折返至透明帶。憑借這種獨特的結(jié)構(gòu)，BP180分子作為 "半橋粒-錨纖維復(fù)合物"的重要組成成分，在維持表皮與真皮的正常粘附功 能方面起著至關(guān)重要的作用。BP180基因的遺傳學(xué)異常如缺失突變等會導(dǎo)致 表皮真皮粘附功能的缺陷，發(fā)生先天性大皰性表皮松解癥(EB);而機體免 疫系統(tǒng)紊亂產(chǎn)生針對BP180的自身抗體，則可能通過介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)而 破壞其結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)生BP等自身免疫性水皰病。BP180是BP致病性自 身抗體所針對的主要靶抗原，BP自身抗體與BP180結(jié)合繼而激活補體，趨 化炎細(xì)胞在局部浸潤并釋放多種炎癥介質(zhì)，造成明顯的炎癥反應(yīng)，破壞表皮 真皮的粘附狀態(tài)，最終發(fā)生表皮下水皰。在此過程中，病理性自身抗體與 BP180結(jié)合并激活補體是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。本發(fā)明從這一環(huán)節(jié)入手，采用噬 菌體抗體庫技術(shù)，直接以大皰性類天皰瘡患者的外周血淋巴細(xì)胞為基因來 源，通過構(gòu)建單鏈抗體庫而篩選獲得的具有特異性識別BP180活性的基因工 程抗體，并可在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)。本發(fā)明的人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180基因工程抗體，其基因 序列在結(jié)構(gòu)上屬于單鏈抗體(scFv)，由輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因組成，其中輕鏈可變區(qū)基因為CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT GCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTGGCGGAGGGACC;重鏈可變區(qū)基因為CTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA 。利用抗體庫技術(shù)制備針對BP180的基因工程單鏈抗體(scFv)作為治 療BP的生物藥品，利用其不具有Fc段因而不能激活補體的特性，使之靶 向BP180分子并封閉其抗原表位，競爭性抑制病理性自身抗體的結(jié)合，從 而阻斷后續(xù)的補體活化等免疫炎癥過程，終止對皮膚的免疫損傷而實現(xiàn)BP 的特異性治療。本發(fā)明通過以下生物學(xué)實驗證明本發(fā)明的功能原理、該抗體的穩(wěn)定性和 含有上述抗體的該藥品治療大皰性類天皰瘡的實用性實驗1:用ELISA方法檢測人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈 抗體與人BP180分子以及其他一些無關(guān)抗原如角蛋白、木瓜蛋白酶、牛血 清白蛋白、人IgG等的結(jié)合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此抗體與人BP180具有較高的結(jié)合活性，而與其他無關(guān)抗原不結(jié)合，說明該抗體的特異性、穩(wěn)定性良好。實驗2:用免疫熒光技術(shù)檢測人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈 抗體與人皮膚冰凍切片的結(jié)合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此抗體結(jié)合于人皮膚的表皮-真皮交界處，形成線狀熒光條帶。當(dāng)人皮膚先用lmol/L氯化鈉裂解后，該 抗體結(jié)合得熒光條帶位于表皮側(cè)。該抗體與人皮膚其他部位以及鼠皮膚等均 不結(jié)合，說明該抗體特異性識別人皮膚表皮-真皮交界處的BP180分子。實驗3:用ELISA法和免疫熒光技術(shù)觀察人源性抗大皰性類天皰瘡抗 原BP180單鏈抗體對BP自身抗體與BP180分子結(jié)合的競爭抑制作用。結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體能夠明顯抑制BP患 者血清自身抗體與BP180自身抗原的結(jié)合。實驗4:用正常人皮膚冰凍切片為底物，先使BP自身抗體與之結(jié)合， 然后加新鮮分離的正常人血清作為補體來源，待充分反應(yīng)后用抗人補體C3 和Clq熒光抗體觀察沿皮膚基底膜帶的補體沉積情況；在反應(yīng)體系中加入 不同濃度的人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體，觀察其對補體 活化的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗 體能夠明顯抑制BP自身抗體介導(dǎo)的補體活化作用，說明該抗體能夠通過抑 制補體活化而發(fā)揮治療BP的效果。通過大量的生物學(xué)實驗證實，本發(fā)明所述的人源性抗大皰性類天皰瘡抗 原BP180單鏈抗體具有抑制BP患者血清自身抗體與BP180自身抗原結(jié)合 的活性，具有治療大皰性類天皰瘡的作用。該抗體克服了鼠源性單克隆抗體 存在的免疫原性問題，能夠保證長期療效，具有可工業(yè)化生產(chǎn)、操作簡單、 生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量和純度高、活性好、質(zhì)量穩(wěn)定、使用安全等優(yōu)點。本發(fā)明的人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體制備方法是 (1)人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體基因的獲得利用BP患者的淋巴細(xì)胞作為基因來源構(gòu)建噬菌體抗體庫，用人BP180作為抗原，從噬菌體抗體庫中經(jīng)過常規(guī)采用的數(shù)輪"親和吸附——洗脫——擴增"過程，篩選具有較好結(jié)合活性的抗BP180噬菌體抗體，得到由輕鏈 可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因組成的基因序列；(2) 人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體的可溶性表達(dá)-利用分子生物學(xué)手段，酶切去除噬菌體載體上的基因in，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性的人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單 鏈抗體；(3) 人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體大腸桿菌表達(dá)產(chǎn) 物經(jīng)飽和硫酸銨鹽析，充分透析后用金屬鰲和親和層析法分離純化，得到人 源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體的基因工程產(chǎn)物。人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180基因工程抗體基因序列 輕鏈可變區(qū)基因CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGGCGGAGGGACC;重鏈可變區(qū)基因CTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA 。
權(quán)利要求
1、一種人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體，其特征在于，該人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體由輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因組成；其中輕鏈可變區(qū)基因由299個核苷酸組成，其核苷酸序列如下CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATGTATGCTAACAGCCATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCGCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAAGCTCATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGACCGGCGAGGTATTCGGCGGAGGGACC；重鏈可變區(qū)基因由344個核苷酸組成，其核苷酸序列如下CTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGATTGGAGTGGGTGGCAGCTATATCGTATGACGGAAGTAGAAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGATAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGTTCTATTATGATTGGGGGACTTATTACGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA。
2、權(quán)利要求1所述的人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體用 于作為治療大皰性類天皰瘡的藥物應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源性抗大皰性類天皰瘡抗原BP180單鏈抗體，其基因序列在結(jié)構(gòu)上屬于單鏈抗體(scFv)，由輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因組成。該抗體的制備方法包括以下主要步驟a.分離大皰性類天皰瘡患者外周血單一核細(xì)胞，提取RNA并經(jīng)過RT-PCR擴增抗體輕重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建噬菌體抗體庫；b.從噬菌體抗體庫中篩選抗BP180噬菌體抗體；c.利用基因工程手段，獲得可溶性表達(dá)的人源性抗BP180單鏈抗體；d.對所獲抗體的結(jié)合活性、特異性、親和力等免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的抗體具有封閉大皰性類天皰瘡自身抗體與相應(yīng)自身抗原結(jié)合的活性，能夠阻斷由于自身抗體的結(jié)合而激活補體所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具有治療大皰性類天皰瘡的作用。
文檔編號C12N15/13GK101333255SQ20081015025
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者劉玉峰, 孫娜娜, 剛 王 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)