專利名稱：5′核苷酸酶診斷試劑盒及5′核苷酸酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5'核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5'核苷 酸酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見 于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢 性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏 感性高于堿性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒 肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測 定5'-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強酸測磷 法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法 為- 5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié) 果，求得5'-核苷酸酶活性?；蛘呃?'-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生 無機磷，再用化學(xué)強酸法分析無機磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此 難以切實推廣應(yīng)用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準確度不好，強酸 污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5，核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的5'核苷 酸酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生
化分析儀上進行5'核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因 而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明5'核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下
核苷單磷酸+水5'核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+還原型輔酶甲醛脫氫酶甲酸+輔酶 核苷可以是腺苷、肌苷、尿苷。
這種方法應(yīng)用5'核苷酸酶(5'Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)聯(lián)丙酮酸羧 {七酶(pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)、甲醛月兌氫酶(formate dehydrogenase; EC 1.2丄2; EC 1.2丄43)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。5'核苷酸酶酶解核苷單磷酸反 應(yīng)產(chǎn)生磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶的作用，最終 將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量 340nm處吸光度下降的速度，可以測算5'核苷酸酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5'核苷酸酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L
甲醛脫氫酶 10000 U/L
核苷單磷酸 9 mmol/L
腺苷二磷酸 7 mmol/L
草酰乙酸 8mmol/L 本發(fā)明的5'核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單 磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶。 還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草 酰乙酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸。
6試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。
還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草 酰乙酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定5，核苷酸酶活性濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
甲醛脫氫酶 10000 U/L
核苷單磷酸 9 mmol/L
腺苷二磷酸 7 mmol/L
草酰乙酸 8mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘 左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。 實施例二
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 核苷單磷酸 腺苷二磷酸 草酰乙酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶 甲醛脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 9 mmol/L
7 mmol/L
8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L
10000U/L
10000 U/L1.8±0.7，測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時 間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。 實施例三
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 核苷單磷酸 腺苷二磷酸 草酰乙酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 甲醛脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
層mmoI/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 9 mmol/L
7 mmol/L
8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 滿00U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定5，核苷酸酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反
應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測5，核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0007;吸光 度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達500 U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3%;試劑在2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年； ——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5’核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下核苷單磷酸+水 5′核苷酸酶 核苷+磷酸根磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+ 丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+還原型輔酶 甲醛脫氫酶 甲酸+輔酶核苷可以是腺苷、肌苷、尿苷。將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5’核苷酸酶的活性濃度大小結(jié)果。
2. —種5'核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑l一—4000 mmol/L還原型輔酶O.l—0.35 mmol/L丙酮酸羧化酶1000———80000 U/L甲醛脫氫酶1000——-80000 U/L核苷單磷酸卜50 mmol/L腺苷二磷酸卜50 mmol/L草酰乙酸卜50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷 酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷 酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶組成。還原型輔酶、丙酮酸羧化 酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷 酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶 、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化 酶組成。還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二 磷酸、草酰乙酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1-"4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為:硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5′核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5′核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、丙酮酸羧化酶、甲醛脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出5′核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/68GK101609008SQ20081012282
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司