專利名稱：一種檢測snp的磁珠系統(tǒng)及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的磁珠系統(tǒng)及其使用方法，具 體是提供一種基于質(zhì)譜法和磁珠法以檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的磁珠系統(tǒng)及其 使用方法。更具體的說，質(zhì)譜是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，并且磁 珠是與含有SNP的探針片段雜交的磁珠。技術(shù)背景人類的遺傳信息儲存在基因組中，2002年國際合作項(xiàng)目人類基因組計(jì)劃的 最終完成，繪制出了人類基因組結(jié)構(gòu)的精細(xì)圖，為相關(guān)研究提供了參考序列。 人類基因組序列共由30億個(gè)位點(diǎn)組成，研究表明，任意兩個(gè)人之間的基因組差 異在0.1%左右，即大約300萬個(gè)位點(diǎn)的差異。這些差異極有可能是造成兩個(gè)人 之間個(gè)體差異的遺傳因素。發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)，可廣泛地應(yīng)用于遺傳標(biāo)記的研究、 評估個(gè)體遺傳關(guān)系、評估物種進(jìn)化等研究領(lǐng)域。在人類基因組中，約90%的差異是以單個(gè)核苷酸的形式體現(xiàn)出來的，這樣 的差異位點(diǎn)被稱作單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP 具有兩個(gè)顯著的特點(diǎn): 一是數(shù)目眾多,據(jù)估計(jì)人類基因組中的SNP數(shù)目約在1100 萬左右，目前國際數(shù)據(jù)庫dbSNP中已收錄來源于人類基因組的SNP達(dá)1083萬， 其中經(jīng)過確認(rèn)的為644萬(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了研 究這選擇合適的位點(diǎn)進(jìn)行研究，也使得絕大多數(shù)基因組區(qū)域在SNP效力的覆蓋 范圍內(nèi)；另外一個(gè)特點(diǎn)是SNP位點(diǎn)大多數(shù)為雙態(tài)，即在一個(gè)位點(diǎn)上僅有兩種表 現(xiàn)形式(基因型)，這樣很容易就能設(shè)計(jì)出高通量自動(dòng)化的檢測方法。正因?yàn)檫@ 兩個(gè)特點(diǎn)，使得SNP位點(diǎn)越來越受到研究者的青睞，被譽(yù)為是繼限制性片段長 度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)和短串聯(lián)重復(fù)序 列(shorttandemrepeat, STR)之后的第三代分子標(biāo)記物。人類基因組計(jì)劃完成 前后，基因組學(xué)研究的重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向SNP領(lǐng)域，因此，SNP在遺傳標(biāo)記學(xué)、生 物群體遺傳學(xué)、生物分類學(xué)、遺傳育種學(xué)、物種或人類進(jìn)化學(xué)、法科學(xué)、藥物 基因組學(xué)等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。例如，SNP的豐富性和雙等位基因特性使作物或家畜遺傳作圖更加精細(xì)， 使得育種工作者能夠更精確的進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇(MAS)和標(biāo)記輔助導(dǎo)入(MAI)， 降低或消除了目的基因之外的遺傳背景對這些技術(shù)帶來的不良影響，同時(shí)也給 品種資源和品種純度鑒定帶來嶄新局面。姜運(yùn)良等人通過對3種"雙肌臀"豬 品種的肌肉生長抑制基因3個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得肉質(zhì)提高的新品種。 Monna等人利用SNP標(biāo)記技術(shù)成功地將水稻半矮桿基因sd-l圖位克隆，Shen等人構(gòu)建了水稻全基因組SNP數(shù)據(jù)庫，并成功地篩選多個(gè)水稻功能基因。例如，不同個(gè)體中存在的SNP差異，成為了法科學(xué)中身份鑒別的有力工具。 Gabirel等人對105個(gè)樣本的線粒體HVI/HVII區(qū)域的SNP進(jìn)行分析，并用途分 析了實(shí)際案例中毛發(fā)和骨骼等檢材，證明了該方法用于法醫(yī)檢案是可行的。李 莉、李成濤等人對人HLA-DR基因的SNP進(jìn)行檢驗(yàn)，在應(yīng)用于親子關(guān)系鑒定的 25個(gè)案例中，成功率達(dá)到96%。為了搶占市場，各大生物學(xué)公司都推出了自己的SNP檢測方法。其中質(zhì)譜 儀被認(rèn)為是很有發(fā)展前途的儀器，尤其是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOFMS)。基于MALDI-TOF MS，開發(fā)了一些SNP檢測方法，如美 國Sequenom公司的hME和iPLEX方法，德國Bruker公司的GOOD assay方法， 韓國GeneMatrix公司的RFMP方法。這些方法的原理是設(shè)計(jì)一條與待檢測SNP 位點(diǎn)上游的基因組序列匹配的寡核苷酸探針，根據(jù)SNP位點(diǎn)的基因型差異，探 針將在待檢測SNP位點(diǎn)處連接上不同的脫氧核苷酸。耳中，組成DNA片段的 四種脫氧核苷酸的分子量分別是dAMP 313.21Da， dCMP 289.19Da， dGMP 329.21Da, dTMP 304.20Da。不同脫氧核苷酸之間是存在分子量差異的，其中差 異最小的是dAMP與dTMP之間的9.01Da，差異最大的是dCMP與dGMP之間 的40.02Da，通過質(zhì)譜儀能檢測到這種差異，從而將分子量不同的探針區(qū)分開來。 質(zhì)譜儀的檢測效果與探針的分子量相關(guān)，探針片段越短，分子量越小，區(qū)分效 果越明顯例如，在圖1中，A圖標(biāo)示的兩個(gè)峰，對應(yīng)的兩個(gè)寡核苷酸片段為 5 ，-ACGT-3 ，和5 ，-ACGA-3 ，，分子量分別為1174.699和1183.770Da,相差9.071Da， B圖標(biāo)示的兩個(gè)峰，對應(yīng)的兩個(gè)寡核苷酸片段為5'-ACGTACGT-3'和 5，-ACGTACGA-3，，分子量分別為2410.628和2419.821Da，相差9.193Da， C圖 標(biāo)示的兩個(gè)峰，對應(yīng)的兩個(gè)寡核苷酸片段為5'-ACGTACGTACGT-3'和 5，-ACGTACGTACGA-3，，分子量分別為3645.917和365.4.736Da，相差8.819Da， 同樣相差9Da左右，但如圖所示，A圖中兩個(gè)峰之間的差異最明顯，B圖次之， C圖中兩個(gè)峰之間的差異相對不明顯，也就是說，分子量越小，質(zhì)譜儀的區(qū)分效 果越明顯，即分辨率越高。為了提高質(zhì)譜儀的分辨率，對SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測傾 向于檢測分子量較小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通過對含SNP位點(diǎn)的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，產(chǎn)生2000 4000Da左右的寡核苷酸片段進(jìn)行檢測，而 GOOD assay方法通過磷酸二酯酶(Phosphodiesterase, PDE)將含SNP位點(diǎn)的 寡核苷酸片段切割成1000~2000Da左右的小片段進(jìn)行檢測。然而，國外公司利用質(zhì)譜儀對SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法，在實(shí)際應(yīng)用中存 在不少缺陷(1) Sequenom公司的hME、 iPLEX兩種方法采用的是兩步PCR，即第一次 PCR放大待檢測SNP位點(diǎn)的拷貝數(shù)，第二次PCR對待檢測的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測，在兩次PCR之間，還要使用蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)除去第一次PCR反應(yīng)體系中剩余的dNTP，這樣就造成總檢測時(shí)間的延長， 以及單個(gè)檢測成本的增加；此外，這兩種方法沒有對含SNP位點(diǎn)的寡核苷酸片 段進(jìn)行切割，檢測范圍在4000 9000Da之間，因而分辨率不高；C2) GOOD assay方法也采用了兩步PCR，而且，為了提高分辨率，采用磷 酸二酯酶切割含SNP位點(diǎn)的寡核苷酸片段，提高了成本，延長了時(shí)間，不利于 快速檢測；(3) RFMP方法只有一步PCR,但是同GOOD assay方法(1000~2000Da) 相比，產(chǎn)生待檢測片段過長(2000~4000Da),相應(yīng)的，分辨率不如GOOD assay 方法。因此，基于MALDI-TOFMS，目前需要開發(fā)一種分辨率高、準(zhǔn)確、成本低、 快速的方法來檢測基因組中SNP位點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是在針對以往基于質(zhì)譜法(例如MALDI-TOFMS)檢測基因組SNP 位點(diǎn)的方法存在的前期處理速度慢或檢測分辨率不夠高等問題，而提出的相應(yīng) 的解決方案。因此，本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的是提供一種用于檢測單核苷酸多態(tài)性SNP 的磁珠系統(tǒng)，包括(1) 表面上附著含有SNP的探針片段的磁珠，其中探針片段是包含待檢序列 中的SNP位點(diǎn)并可與待檢序列配對雜交的片段，以及SNP在探針片段中的上下 游序列長度是相同的；(2) 具有磁力并可分離磁珠的磁架。 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的磁珠系統(tǒng)還包括(1) 用于擴(kuò)增待檢序列的引物，其中待檢序列中可能包含SNP位點(diǎn)；(2) S1核酸酶；(3) 用于檢測含有SNP的擴(kuò)增產(chǎn)物-探針復(fù)合物的質(zhì)譜裝置。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中在探針序列中，所述SNP的上下游序列的 相同長度為10-14bp (優(yōu)選ll-13bp，更優(yōu)選12bp)，并且引物不含特殊的酶切位 點(diǎn)和標(biāo)記。例如，合成與待檢測SNP位點(diǎn)上下游各12bp序列(含SNP位點(diǎn)共 25bp)互補(bǔ)的探針，可以僅合成正鏈或反鏈DNA的探針，也可以正反雙鏈的探 針均合成；可以僅合成含SNP位點(diǎn)的任意一種基因型的探針。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，磁珠直徑為lOnm-lO^im,并且磁架是具有磁性或 內(nèi)部有磁條或磁塊的支架，當(dāng)把含磁珠的反應(yīng)體系置于磁架上時(shí)，在磁力的作用下，在溶液中均勻分布的磁珠聚集于磁極，從而純化或分離磁珠。還在另一具體實(shí)施方案中，其中所述的質(zhì)譜儀是基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI TOF MS)，例如，德國Bruker公司的flex系列，如 MicroFlex 、 AutoFlex 、 UltraFlex等，也包括其他公司的對應(yīng)產(chǎn)品，如 AppliedBiosystems公司、Agilent公司等。本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目的是提供使用上述系統(tǒng)以檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的方法，步驟包括步驟(l):制備直徑lOnm-lOum的磁珠步驟(2):根據(jù)待檢序列中可能的SNP，合成包含SNP的探針片段步驟(3):充分混合磁珠和探針片段，使得探針片段附著在磁珠表面，形成 磁珠-探針復(fù)合物；步驟(4):使用引物，擴(kuò)增樣品中的待檢序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠-探針 復(fù)合物進(jìn)行充分雜交配對，形成磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物。其中，PCR引物為普通設(shè)計(jì)，不含特殊的酶切位點(diǎn)和標(biāo)記。PCR產(chǎn)物長度 大約在100bp左右，包含SNP位點(diǎn)。具體的PCR反應(yīng)體系，即含SNP位點(diǎn)的 DNA模板、本發(fā)明的引物、dNTPs、耐熱保真聚合酶、緩沖液、Mg2+、無菌的 去離子水等各種試劑的體積，以及反應(yīng)溫度條件和反應(yīng)時(shí)間根據(jù)具體的SNP位 點(diǎn)、引物Tm值及反應(yīng)片段大小而定。PCR反應(yīng)完成后，往反應(yīng)產(chǎn)物中加入帶有探針的磁珠，并在56'C溫浴1小 時(shí)，使反應(yīng)產(chǎn)物與探針雜交。若PCR產(chǎn)物帶有的SNP位點(diǎn)的基因型與探針帶有 的SNP位點(diǎn)的基因型互補(bǔ)，它們將完全雜交，即PCR產(chǎn)物中含SNP位點(diǎn)的25bp 與探針以共價(jià)鍵連接；若PCR產(chǎn)物帶有的SNP位點(diǎn)的基因型與探針帶有的SNP 位點(diǎn)的基因型不互補(bǔ)，它們將不完全雜交，即PCR產(chǎn)物中tSNP位點(diǎn)的25bp 序列將有24bp與探針以共價(jià)鍵連接，而在SNP位點(diǎn)處沒有共價(jià)鍵連接，形成一 個(gè)"泡"狀結(jié)構(gòu)。磁珠加入量視反應(yīng)產(chǎn)物量而定。步驟(5):使用S1核酸酶，充分酶切磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物，并將S1 核酸酶消化后的反應(yīng)液置于磁架上，在磁力的作用下，收集磁珠和磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物，并棄去澄清液體。其中，如果待檢序列中含有SNP位點(diǎn)，則 在復(fù)合物中，由于探針和待檢序列在SNP位點(diǎn)處不能配對連接，將形成一個(gè)"泡" 狀結(jié)構(gòu)，因此Sl核酸酶在形成"泡"狀結(jié)構(gòu)的SNP處將探針-待檢序列復(fù)合物切 斷。其中，酶切反應(yīng)和隨后的滅活反應(yīng)的時(shí)間根據(jù)具體的雜交反應(yīng)體系的大小和S1核酸酶的濃度、質(zhì)量而定。Sl核酸酶是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶， 能催化RNA和單鏈DNA分子降解成為5'單核苷酸，同時(shí)它也能作用于雙鏈核 酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子。在S1核酸酶的作用下，體系中的單 鏈DNA，如沒有與PCR產(chǎn)物雜交的探針、PCR產(chǎn)物中沒有與探針雜交的部分， 都將被降解；此外，若PCR產(chǎn)物與探針不完全雜交，Sl核酸酶將在"泡"狀結(jié)構(gòu) 處將PCR產(chǎn)物-探針復(fù)合體切斷。步驟(6):洗滌磁珠和磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物的混合物，然后將混合物從 磁架上取下來，稀釋后，在95'C高溫水浴5分鐘、冰浴驟冷20分鐘，使酶切后 的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針分離，并得到單鏈核酸溶液；其中，由于通過高溫-驟冷的方 法，使得雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物-探針復(fù)合物解離成單鏈，并釋放到溶液中呈游離狀態(tài)， 因此在通過磁架分離探針和擴(kuò)增產(chǎn)物后，得到了可用于質(zhì)譜檢測的單鏈核酸溶 液。然后，在磁力的作用下，磁珠(包括磁珠上的PCR產(chǎn)物-探針復(fù)合物)將聚 集在一起，以移液器吸取并丟棄反應(yīng)體系中的液體，以無菌的去離子水配合磁 架將磁珠洗滌幾次。將反應(yīng)體系從磁架上取下來，加入無菌的去離子水，95°C 水浴5分鐘，冰浴20分鐘，使PCR產(chǎn)物與探針分離，再將反應(yīng)體系置于磁架上， 室溫或者冰浴條件下將不含磁珠的液體轉(zhuǎn)移至另一個(gè)干凈試管中。步驟(7):將溶液再次置于磁架上，然后在室溫或者冰浴條件下收集不含磁 珠的單鏈核酸溶液；步驟(8):將單鏈核酸溶液進(jìn)行經(jīng)質(zhì)譜檢測，根據(jù)產(chǎn)物分子量相比對確定相 應(yīng)的SNP，從而判斷待檢樣品中的SNP類型。其中，由于野生型和突變型SNP 位點(diǎn)所代表的酶切片段相差13bp，在質(zhì)譜儀中區(qū)分度在3500Da以上，因此利用 高分辨率質(zhì)譜裝置檢測酶切片段的分子量，可測定待檢序列中的SNP基因型。在使用質(zhì)譜儀檢測所述的單鏈核酸溶液過程中，先在樣品靶上點(diǎn)0.5nl基質(zhì)， 基質(zhì)組成為檸檬酸氫二銨(Diammonium hydrogen citrate, DAC) 1.6g/L， 3—羥 基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinicacid， 3-HPA) 6g/L,以l:l的乙腈-水混合溶解， 待基質(zhì)在自然狀態(tài)下結(jié)晶后，在結(jié)晶后的基質(zhì)上點(diǎn)lul樣品(即干凈試管中的液 體)，自然狀態(tài)下結(jié)晶。然后進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，獲得酶切產(chǎn)物的質(zhì)譜 圖，經(jīng)質(zhì)譜檢測測得酶切產(chǎn)物分子量根據(jù)實(shí)驗(yàn)推測的產(chǎn)物分子量相比對確定相 應(yīng)的SNP類型，實(shí)現(xiàn)SNP檢測。定義:術(shù)語"SNP"，又稱單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism)是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。從理論上來看每一 個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變異形式，但實(shí)際上發(fā)生的多為轉(zhuǎn)換和顛換，二 者之比為2: 1。 SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T,原因是 CG中的C常為甲基化的,自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。術(shù)語"磁珠"，又稱磁粒(biomag)或磁性微球，是一種殼/核結(jié)構(gòu)的微球，由磁 性、可磁化的、帶電的以及可帶電的內(nèi)核(優(yōu)選金屬氧化物，如鐵鈷鎳的氧化 物)和高分子材料的外殼組成，根據(jù)需要，磁珠外殼可包被不同的高分子材料。磁珠可以具有任何合適的尺寸，例如直徑從10nm-10nm。參見 CN03123726.6、 CN01109870.8或WO02/075309。在實(shí)際應(yīng)用中，在非固定的復(fù)合物中所采用的磁珠可以是磁性微粒。磁性 微?？梢酝ㄟ^任何合適的方法制備。例如，可以采用專利CN01/109870.8或 WO02/075309所述的方法來制備。在本發(fā)明所述的生物芯片系統(tǒng)和方法中可以 采用可以磁化的材料來制備磁性微粒?？纱呕牧系睦影▉嗚F磁性材料， 鐵磁性材料，順磁性材料以及超順磁性材料。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，磁性微 粒帶有順磁性材料，例如順磁性金屬氧化物。更適宜的，順磁性金屬氧化物是 過渡態(tài)金屬氧化物或者合金等。任何過渡態(tài)的金屬均可被釆用，例如鐵，鎳， 銅，鈷，錳，鉅，鋅以及zirconium(Zr).更好的情況是金屬氧化物為？6304或 Fe203 。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在磁珠中所采用的可磁化的物質(zhì)是金屬，這 一金屬可以是過渡態(tài)金屬或者合金鐵，鎳，銅，鈷，錳，鉭，鋅以及zirconium(Zr) 以及鈷-鉭-zirconium( CoTaZr )合金。磁珠也可以從可獲得的初級磁珠中制備，也可以從被單體所包被的粗的材 料以及金屬氧化物中制備，如專利U.S.PatentNo.5，834，121所示，上述單伴在經(jīng) 過交聯(lián)以后可以形成一個(gè)堅(jiān)固的多聚物殼體。在這里"堅(jiān)固"指的是交聯(lián)而形成的 多聚物殼體可以對包裹在其內(nèi)的金屬氧化物起到穩(wěn)定的作用(也就是殼體不會膨 脹或者溶解)，因此顆粒會保留在殼體的內(nèi)部。在這里"微孔的"指的是在畸形的 有機(jī)溶劑中會膨脹或者擴(kuò)展的樹脂狀的多聚物基質(zhì)。這里的"裝載"指的是顆粒上 的集合位點(diǎn)可以被功能化或者衍生化的一種能力。合適的材料可以被用作可磁化的材料，例如，錳鐵礦，錳鐵酸鹽，鈷，鎳， 磁鐵礦以及多種不同的合金。錳鐵礦是優(yōu)選的金屬氧化物。通常，金屬鹽往往 先被轉(zhuǎn)化成金屬氧化物然后被包被上多聚物或者被吸收進(jìn)磁珠中，該磁珠帶有 熱塑性的多聚物樹脂并且在其上有較少的基團(tuán)。當(dāng)想從金屬氧化物開始而獲得 疏水的初級微球，有必要提供來源于乙烯基單體的熱塑多聚物堅(jiān)固的殼體，最 好是能夠與微孔基質(zhì)結(jié)合或者被微孔基質(zhì)結(jié)合的交聯(lián)的聚苯乙烯。磁珠可以采 用已有的方法來制備，例如來自文獻(xiàn)中的方法(Vandenberge等，J.ofMagnetism9and Magnetic Materials, 15-18: 1117-18(1980); Matijevic， Acc.Chem.Res.， 14: 22-29(1981);和U.S.PatentNos.5,091，206; 4,774,265; 4,554,088;和4,421 ，660.)。本發(fā)明中可能用到的初級磁珠可來于專利所述U.S.Patent.Nos.5,395，688; 5,318,797; 5,283,079; 5，232，7892; 5，091，206; 4，965，007; 4,774,265; 4,654,267; 4，4卯,436; 4,336,173;以及4，421,660)或者初級微球可以通過商業(yè)途徑從已有的 親水或者疏水的微球中獲取，只要其能夠滿足尺寸以及穩(wěn)定性的要求，并且具 有吸收使用的乙烯基單體而形成網(wǎng)狀基質(zhì)的能力。優(yōu)選的是，初級磁珠是一種 疏水的，聚苯乙烯包被的，順磁性的顆粒。這種聚苯乙烯順磁性小球可以從 Dynal， Inc.(Lake Success, N.Y.)， Rhone Poulonc (France);禾卩SINTEF(Trondheim， Norway)獲得。原始的僅帶有一層不穩(wěn)定的多聚物的微?；蛘叽判晕⒘？赏ㄟ^在 其表面上進(jìn)行進(jìn)一步的處理而帶上堅(jiān)固的多聚物外殼而被使用。術(shù)語"待檢序列"，指可能包含SNP位點(diǎn)的核酸序列，包括單鏈/雙鏈DNA、 單鏈/雙鏈RNA、 DNA-RNA雜交序列等。術(shù)語"磁架"，指磁架是具有磁性或內(nèi)部有磁條或磁塊的支架，當(dāng)把含磁珠的 反應(yīng)體系置于磁架上時(shí)，在磁力的作用下，在溶液中均勻分布的磁珠聚集于磁 極方向，從而純化或分離磁珠。


圖1分別是具有相同SNP(T/A)的不同長度的序列分子量與質(zhì)譜儀分辨率關(guān) 系的示意圖。其中，圖例A是5bp長度(5'-ACGT-3'和5'-ACGA-3')的分子量 質(zhì)譜檢測差異，圖例B是8bp長度(5'-ACGTACGT-3，和5'-ACGTACGA-3，)的 分子量質(zhì)譜檢測差異，圖例C是12bp長度(5，-ACGTACGTACGT-3，和 5'-ACGTACGTACGA-3')的分子量質(zhì)譜檢測差異。圖2-A是待檢序列與磁珠-探針復(fù)合物的幾種雜交結(jié)合模式。其中，圖例1 表示待檢序列與所述復(fù)合物上的單鏈探針片段完全雜交；圖例2表示待檢序列 與所述復(fù)合物上的單鏈探針片段不完全雜交，并在SNP位點(diǎn)形成一個(gè)鼓起的泡 狀結(jié)構(gòu)；圖例3表示不含待檢序列的對照。圖2-B是使用Sl核酸酶進(jìn)行酶切磁珠-探針復(fù)合物的示意圖。其中，圖例1 表示Sl核酸酶切去待檢序列中不與單鏈探針配對結(jié)合的單鏈部分，得到不含 SNP的磁珠-完整探針片段-待檢序列復(fù)合物；圖例2表示Sl核酸酶切去待檢序 列中不與單鏈探針配對結(jié)合的單鏈部分，并在形成泡狀結(jié)構(gòu)的SNP位置進(jìn)行切 斷，從而得到磁珠-1/2探針片段-待檢序列復(fù)合物；圖例3表示不含待檢序列的 磁珠-探針復(fù)合物的酶切對照。圖3是利用磁珠系統(tǒng)檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的流程圖。圖4是是根據(jù)本發(fā)明的方法，所得到的陰性對照A、待測樣品B、待測樣品 C的質(zhì)譜檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng) 理解，下面的實(shí)施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對上述本發(fā)明總 體的限制。實(shí)施例1:磁珠的制備稱取20g FeS04'7H20和40g FeC13'6H20分別溶于50mL蒸餾水中，充分 溶解后混合在500mL的三口瓶中攪拌。將上述混合液溫度降到5°C，在攪拌 (200 400rmin-l)的同時(shí)滴加10。/。的NaOH溶液，使反應(yīng)液pH值到ll，攪拌10min 后將反應(yīng)釜溫度調(diào)節(jié)到8(TC，反應(yīng)釜溫度升至8(TC后加2g沉降劑，在8(TC下 攪拌60min。將反應(yīng)溫度降至室溫。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到500mL的燒杯后放在一塊 強(qiáng)磁鐵上，10min后將上部清夜傾出。反復(fù)數(shù)次，直到反應(yīng)液顯中性。將上述溶 液過濾分離出磁珠，準(zhǔn)備下一步使用。實(shí)施例2:設(shè)計(jì)乙肝病毒P基因的SNPs38的探針片段，并結(jié)合磁珠乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是嚴(yán)重的世界性衛(wèi)生問題，每 年約有近百萬人死于乙肝病毒感染引起的各類疾病。但是對于已經(jīng)確診的乙肝 病人而言，不同個(gè)體中的乙肝病毒基因組存在多種SNP突變，導(dǎo)致相同疾病的 病人對同一藥物產(chǎn)生耐藥性。如果對乙肝病人體內(nèi)的SNP標(biāo)記進(jìn)行研究，揭示 了人群中不同個(gè)體對相同藥物的敏感性差異的根本原因，將有助于研究者篩選 更合適的藥物。 ，其中，乙肝病毒基因組編碼的P基因(NCBI Gene ID: 944565)上第838位 核苷酸發(fā)生A—C突變，使編碼氨基酸由天冬酰胺變?yōu)樘K氨酸(N236T)，從而 產(chǎn)生對阿德福韋酯(adefovirdipivoxil)的耐藥性。對于該位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測，我們設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)合成探針GTATACATTTGAaCCCTAATAAAAC，該探針含突變位點(diǎn)的A等 位基因型(小寫字母a表示)以及突變位點(diǎn)上下游各12bp的DNA序列。分別溶解所制備的探針和磁珠，根據(jù)適當(dāng)比例(例如V:V-10:1)混合探針 溶液和磁珠溶液(500til:5(^1)，然后加入300W丙酮。在漩渦振蕩器上輕微振蕩 30s，室溫靜置5min。用磁架將磁珠固定，棄上清后，再用70%乙醇洗磁珠2次， 最后溶于10(^1TE溶液(或無菌水)，得到磁珠-探針復(fù)合物。實(shí)施例3:乙肝病毒P基因的擴(kuò)增根據(jù)乙肝病毒基因組的P基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物如下:上游弓I物為CTTGAGTCCCTTTTTACCTC ， 下游引物為TTAAGGGAGTAGCCCCATCG ，PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小為95個(gè)核苷酸，PCR反應(yīng)條件:95'C 150s，然后95。C 25s、 50°C 40s、 72°C 75s循環(huán)45次，之后72°C 3min。 PCR產(chǎn)物有兩種，在突變位點(diǎn) 為A核苷酸的稱之為野生型(wild type, wt)，在突變位點(diǎn)為C核苷酸的稱之為 突變型(mutant type， mt)。實(shí)施例4:磁珠-探針片段-擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物的制備PCR反應(yīng)后，將磁珠-探針復(fù)合物加入擴(kuò)增產(chǎn)物中，56'C水浴1小時(shí)，使PCR 產(chǎn)物與探針雜交。其中野生型PCR產(chǎn)物的反義鏈(在突變位點(diǎn)處為T)將與探 針完全雜交(參見圖2-A-l)，而突變型PCR產(chǎn)物的反義鏈(在突變位點(diǎn)處為G) 在SNP位置與探針不完全雜交，而形成泡狀結(jié)構(gòu)(參見圖2-A-2)。而兩種PCR 產(chǎn)物的正義鏈以及空白對照不與探針雜交(參見圖2-A-3)。實(shí)施例5: Sl核酸酶消化雜交后加入S1核酸酶，37'C水浴1小時(shí)，進(jìn)行完全的酶切反應(yīng)。體系中的 單鏈部分將被降解。PCR產(chǎn)物僅有25bp因與探針雜交而形成雙鏈，其余部分都 將被降解，其中，野生型PCR產(chǎn)物與探針完全雜交，不受S1核酸酶的影響， 因此得到不含SNP的磁珠-完整探針片段-待檢序列復(fù)合物(參見圖2-B-l);而 突變型PCR產(chǎn)物與探針不完全雜交，在突變位點(diǎn)處形成一個(gè)"泡"狀結(jié)構(gòu)，Sl核 酸酶從這里切斷PCR產(chǎn)物-探針復(fù)合體，因此得到磁珠-1/2探針片段-待檢序列復(fù) 合物(參見圖2-B-2)。這樣，將產(chǎn)生兩個(gè)12bp的雙鏈DNA片段(即部分探針-部分待檢序列的雙鏈片段)，其中一個(gè)與磁珠聯(lián)接，另外一個(gè)釋放到溶液當(dāng)中， 呈游離狀態(tài)。實(shí)施例6:分離純化單鏈核酸片段酶切反應(yīng)后，將含反應(yīng)體系的小管在磁架上靜置1分鐘，吸取并丟棄液體， 將小管從磁架上取下，加入500ul無菌的去離子水，輕混數(shù)次，然后將小管在磁 架上靜置1分鐘，吸取并丟棄液體，如此反復(fù)洗滌3次，再將小管從磁架上取 下，加入15ul無菌的去離子水，95'C水浴5分鐘，冰浴20分鐘，使PCR產(chǎn)物-探針復(fù)合體解成單鏈，再將小管置于磁架上1分鐘，將不含磁珠的液體轉(zhuǎn)移至 另一個(gè)干凈的小管中。實(shí)施例7:質(zhì)譜檢測先在樣品靶上點(diǎn)lul基質(zhì)，待基質(zhì)在自然狀態(tài)下結(jié)晶后，在結(jié)晶后的基質(zhì)上 點(diǎn)lul樣品(即干凈小管中的液體)，自然狀態(tài)下結(jié)晶。然后進(jìn)行MALDI-TOFMS 分析，獲得酶切產(chǎn)物的質(zhì)譜圖?；|(zhì)組成為檸檬酸氫二銨(Diammonium hydrogen citrate, DAC) 1.6g/L， 3—羥基吡啶羧酸(3腸hydroxypicolinic acid， 3-HPA) 6g/L，以1:1的乙腈-水混合溶解，避光室溫保存。判定標(biāo)準(zhǔn)如下若患者體內(nèi)的乙肝病毒基因組序列沒有發(fā)生耐阿德福韋酯 突變，酶切產(chǎn)物應(yīng)為25bp長的5'- GTTTTATTAGGGTTCAAATGTATAC-3'，分 子量為7701.05;若患者體內(nèi)的一個(gè)拿病毒基因組序列發(fā)生耐阿德福韋酯突變， 酶切產(chǎn)物應(yīng)為12bp長的5'-TCAAATGTATAC-3'，分子量為3628.39。其中，樣品A為陰性對照樣本，樣品B和樣品C為待測樣本。(1) 對于陰性對照樣本A，由于其為沒有發(fā)生耐藥突變的野生型(wt) 病毒株，其SNP基因型為A，因此酶切產(chǎn)物為5'-GTTTTATTAGGGTTCAAATGTATAC-3',而實(shí)測分子量為7700.953， 與預(yù)期的分子量(7701.05)僅偏差0.1Da不到，這屬于可以接受的 誤差范圍。因此，證實(shí)樣品A為陰性對照樣本(參見圖4A)。(2) 對于樣品B，片段長度12bp，實(shí)際質(zhì)譜檢測分子量為3628.214，這 與預(yù)期的陽性結(jié)果的分子量(3628.39)僅^差0.20&不到(屬于可 以接受的誤差范圍)，因此證實(shí)樣品B屬于發(fā)生耐藥突變的突變型(mt)病毒株，SNP基因型為C，酶切產(chǎn)物為 5'-TCAAATGTATAC-3'(參見圖4B);(3) 對于樣品C，實(shí)際質(zhì)譜檢測分子量為3628.460和7701.102，這與預(yù) 期的陰性分子量(7701.05)以及陽性分子量(3628.460)分別相差 0.1Da不到(屬于可以接受的誤差范圍)，因此證實(shí)樣品C屬于發(fā)生 耐藥突變的突變型(mt)病毒株與沒有發(fā)生耐藥突變的野生型(wt) 病毒株共存時(shí)的檢測結(jié)果，其基因型為A/C，酶切產(chǎn)物為12bp的 5，-TCAAATGTATAC-3， 和 25bp 的 5，國 GTTTTATTAGGGTTCAAATGTATAC-3'(參見圖4C)。因此，根據(jù)檢測結(jié)果，揭示了樣本A、 B以及樣本C個(gè)體對相同藥物的敏 感性差異的根本原因，這有助于研究者篩選更合適的藥物。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的磁珠系統(tǒng)，包括(1)表面上附著含有SNP的探針片段的磁珠，其中探針片段是包含待檢序列中的SNP位點(diǎn)并可與待檢序列配對雜交的片段，以及SNP在探針片段中的上下游序列長度是相同的；(2)具有磁力并可分離磁珠的磁架。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁珠系統(tǒng)，還包括(3) 用于擴(kuò)增待檢序列的引物，其中待檢序列中可能包含SNP位點(diǎn)；(4) Sl核酸酶；(5) 用于檢測含有SNP的擴(kuò)增產(chǎn)物-探針復(fù)合物的質(zhì)譜裝置。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其中在探針序列中，所述SNP的上下游 序列的相同長度為10-14bp，并且引物不含特殊的酶切位點(diǎn)和標(biāo)記。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中磁珠直徑為10nm-10Mm，并且磁架是具 有磁性或內(nèi)部有磁條或磁塊的支架，當(dāng)把含磁珠的反應(yīng)體系置于磁架上 時(shí)，在磁力的作用下，在溶液中均勻分布的磁珠聚集于磁極方向，從而純 化或分離磁珠。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中所述的質(zhì)譜儀是基體輔助激光解吸電離 飛《亍日寸l、司質(zhì)i普(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry ， MALDITOF MS )。
6. 使用權(quán)利要求1-5所述的任一系統(tǒng)以檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的方法。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，步驟包括(1) 制備直徑10nm-10|im的磁珠；(2) 根據(jù)待檢序列中可能的SNP，合成包含SNP的探針片段； 。)充分混合磁珠和探針片段，使得探針片段附著在磁珠表面，形成磁珠-探針復(fù)合物；(4) 使用引物，擴(kuò)增樣品中的待檢序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠-探針復(fù)合物 進(jìn)行充分雜交配對，形成磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物；(5) 使用Sl核酸酶，充分酶切磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物，并將Sl核酸酶消 化后的反應(yīng)液置于磁架上，在磁力的作用下，收集磁珠和磁珠-探針-待檢 序列復(fù)合物，并棄去澄清液體；(6) 洗滌磁珠和磁珠-探針-待檢序列復(fù)合物的混合物，然后將混合物從磁架上 取下來，稀釋后，在95"C高溫水浴5分鐘、冰浴驟冷20分鐘，使酶切后 的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針分離，并得到單鏈核酸溶液；OO將溶液再次置于磁架上，然后在室溫或者冰浴條件下收集不含磁珠的單鏈 核酸溶液；(8)將單鏈核酸溶液進(jìn)行經(jīng)質(zhì)譜檢測，根據(jù)產(chǎn)物分子量相比對確定相應(yīng)的 SNP,從而判斷待檢樣品中的SNP類型。 '
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在步驟(5)中，如果待檢序列中含有SNP位 點(diǎn)，則在復(fù)合物中，由于探針和待檢序列在SNP位點(diǎn)處不能配對連接，將形成 一個(gè)"泡"狀結(jié)構(gòu)，因此Sl核酸酶在形成"泡"狀結(jié)構(gòu)的SNP處將探針-待檢序列 復(fù)合物切斷。
9. 權(quán)利要求7所述的方法，其中在步驟(6)中，由于通過高溫-驟冷的方法，使得 擴(kuò)增產(chǎn)物-探針的雙鏈復(fù)合物解離成單鏈，并釋放到溶液中呈游離狀態(tài)，因此在 通過磁架分離探針和擴(kuò)增產(chǎn)物后，得到了可用于質(zhì)譜檢測的單鏈核酸溶液。
10. 權(quán)利要求7所述的方法，其中在步驟(8)中，由于野生型和突變型SNP位點(diǎn)所 代表的酶切片段相差13bp，在質(zhì)譜儀中區(qū)分度在3500Da以上，因此利用高分辨 率質(zhì)譜裝置檢測酶切片段的分子量，可測定待檢序列中的SNP基因型。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的磁珠系統(tǒng)及其使用方法，具體是提供一種基于質(zhì)譜法和磁珠法以檢測單核苷酸多態(tài)性SNP的磁珠系統(tǒng)及其使用方法。該方法的要點(diǎn)在于將含SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與磁珠上聯(lián)接的對應(yīng)探針雜交，然后以S1核酸酶識別野生型的完全雜交和突變型的不完全雜交，將不完全雜交的DNA片段切斷，隨后進(jìn)行洗脫、單鏈制備、點(diǎn)靶、質(zhì)譜儀檢測等步驟，以質(zhì)譜儀分析基因組中的突變位點(diǎn)。本發(fā)明與以往方法相比，成本和耗時(shí)均得到降低，而分辨率明顯提高。
文檔編號C12Q1/68GK101245390SQ20081008948
公開日2008年8月20日 申請日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者于中連, 芳 呂, 呂萍萍, 趙洪斌, 馬慶偉 申請人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司