專利名稱：附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法及所用生物膜取樣裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法及該方法中專用的生物膜取 樣裝置。
背景技術(shù)：
目前，硫酸鹽還原菌(SRB)的檢測(cè)方法主要集中在三個(gè)層面 一是傳統(tǒng)
的檢測(cè)方法，包括培養(yǎng)法以及顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，前者是通過(guò)選擇性培養(yǎng)基， 在適宜的培養(yǎng)條件下對(duì)樣品中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)進(jìn)行活細(xì)菌的計(jì)數(shù)，主要包括平
板菌落計(jì)數(shù)法、最可幾率計(jì)數(shù)法(most probable number (MPN)，亦稱為倍比 稀釋法)等；而顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是適時(shí)、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定細(xì)菌總量，主要 包括光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡等技術(shù)，混濁度(比濁)計(jì)數(shù)法、電阻抗法以及 流式細(xì)胞儀測(cè)定法等；二是基因?qū)用妫赟RB種屬的16S rDNA序列的定性 檢測(cè)，如基因芯片以及FISH技術(shù)對(duì)SRB的定量和定性檢測(cè)，APS還原酶基因 和異化型亞硫酸鹽還原酶基因進(jìn)行定性檢測(cè)；三是蛋白層面，主要是通過(guò)免疫 吸附的原理得以實(shí)現(xiàn)，如基于APS還原酶的SRB的快速檢測(cè)試劑盒。上述現(xiàn)有 的檢測(cè)方法不適于附著型硫酸鹽還原菌的定量檢測(cè)。
油田系統(tǒng)中硫酸鹽還原菌的計(jì)數(shù)主要是針對(duì)的污水流動(dòng)相中的硫酸鹽還 原菌一非附著型硫酸鹽還原菌。目前對(duì)于非附著型的油田系統(tǒng)內(nèi)硫酸鹽還原菌 (SRB)的計(jì)數(shù)主要執(zhí)行中國(guó)石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)"油田注入水細(xì)菌分析方法 ——絕跡稀釋法"(部頒標(biāo)準(zhǔn))、SY-T0532-93。上述方法存在的問(wèn)題是檢測(cè) 需要十四天的時(shí)間，由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不能有效、即時(shí)地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，在 實(shí)際操作過(guò)程中有些嚴(yán)格的厭氧SRB菌無(wú)法生存，導(dǎo)致SRB菌的記數(shù)結(jié)果不準(zhǔn) 確，不能真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況，同時(shí)檢測(cè)費(fèi)用較高。
授權(quán)公告號(hào)為CN 100348731C、授權(quán)公告日為2007年11月4日的發(fā)明專 利提出了一種油田水質(zhì)硫酸鹽還原菌的定量檢測(cè)方法;授權(quán)公告號(hào)為CN 1003了2943C、授權(quán)公告日為2008年3月5日的發(fā)明專利$#出了一種硫酸鹽還 原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法；上述現(xiàn)有技術(shù)中均沒(méi)有提到附著型硫酸鹽還原菌的定量檢測(cè)方法。因非附著型的油田系統(tǒng)內(nèi)硫酸鹽還原菌(SRB) 的定量檢測(cè)方法存在檢測(cè)周期較長(zhǎng)致使記數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題而無(wú)法適于附 著型硫酸鹽還原菌的定量檢測(cè)，現(xiàn)有技術(shù)中又沒(méi)有專門(mén)提出對(duì)附著型硫酸鹽還 原菌的定量檢測(cè)方法，因此針對(duì)罐壁和管壁上的硫酸鹽還原菌一附著型硫酸鹽 還原菌的檢測(cè)還沒(méi)有開(kāi)展。然而在實(shí)際的生產(chǎn)中附著型的硫酸鹽還原菌是造成 油田腐蝕和硫化物產(chǎn)生的重要原因。因此，對(duì)附著型硫酸鹽還原菌的檢測(cè)更加 具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有的硫酸鹽還原菌檢測(cè)方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)附著型硫酸鹽還 原菌的快速、較準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，且現(xiàn)有的硫酸鹽還原菌檢測(cè)方法費(fèi)用較高的 問(wèn)題；而提供了一種附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法及所用生物膜取樣裝 置。
本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè) 方法是按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內(nèi)壁 上附著的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側(cè)壁上打通 L，再將 生物膜取樣裝置安裝在所述通孔處，并使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管 體的內(nèi)側(cè)壁平齊，并保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充 分成膜后即可取下生物膜；步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體制備將所述探頭上 的生物膜剝離至配制的溶液中制成菌體；步驟三、將步驟二中制備好的菌體進(jìn) 行倍比稀釋；步驟四、進(jìn)行冰上的PCR操作；步驟五、PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增； 步驟六、擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)；步驟七、結(jié)果觀察， 查表記數(shù)。
前面所述方法的實(shí)現(xiàn)必須借助生物膜取樣裝置才能實(shí)現(xiàn)，該取樣裝置包括 主體、探頭壓緊總成、固定件和控制閥，所述取樣裝置還包括探頭，所述探頭 的上端設(shè)有臺(tái)肩，壓緊總成位于主體的上端，探頭依次穿過(guò)探頭壓緊總成、主 體，探頭通過(guò)固定件固裝在主體的上端面上，探頭上端的臺(tái)肩搭接在探頭壓緊 總成的上端面上，探頭壓緊總成安裝在主體上設(shè)有定位臺(tái)肩上，控制閥安裝在 主體的下端側(cè)壁上。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了附著型硫酸鹽還原菌的快速、較準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。本發(fā)明的方法記數(shù)更加準(zhǔn)確，可以精確到一個(gè)菌體，有效地 縮短了計(jì)數(shù)時(shí)間，整個(gè)發(fā)明從做樣到出結(jié)果只需要四個(gè)小時(shí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于十四天
的記數(shù)時(shí)間，真實(shí)的表證了水樣的實(shí)際的SRB菌的數(shù)量，準(zhǔn)確的反應(yīng)了當(dāng)時(shí)生 產(chǎn)實(shí)際情況、可以直接有效的指導(dǎo)生產(chǎn)，同時(shí)還降低了檢測(cè)費(fèi)用。運(yùn)用本發(fā) 明裝置可有效取得罐壁和管壁的附著生物膜，本發(fā)明裝置還具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的優(yōu) 點(diǎn)。本發(fā)明適于油田水系統(tǒng)中常規(guī)污水、含聚污水、地面工藝的水處理過(guò)程中 管壁、罐壁等附著型硫酸鹽還原菌(SRB)的快速定量檢測(cè)，也可以用于各種 生物膜、結(jié)構(gòu)物中等含有附著型硫酸鹽還原菌的環(huán)境樣本的檢測(cè)。


圖1為本發(fā)明所述生物膜取樣裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2是本發(fā)明所述生物 膜取樣裝置的探頭從管道取出后的結(jié)構(gòu)示意圖，圖3是探頭的結(jié)構(gòu)示意圖，圖 4是本發(fā)明的具體實(shí)施例的現(xiàn)場(chǎng)工藝流程框圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式所述的附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法是 按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內(nèi)壁上附著 的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側(cè)壁上打通孔，再將生物膜 取樣裝置安裝在所述通孔處，并使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的內(nèi) 側(cè)壁平齊，并保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成膜 后即可取下生物膜；步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體制備將所述探頭上的生物 膜剝離至配制的溶液中制成菌體；步驟三、將步驟二中制備好的菌體進(jìn)行倍比 稀釋；步驟四、進(jìn)行冰上的PCR操作；步驟五、PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增；步驟 六、擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)；步驟七、結(jié)果觀察，查 表記數(shù)。本實(shí)施方式所述的步驟二至步驟七為現(xiàn)有技術(shù)，授權(quán)公告號(hào)為CN 100372943C、授權(quán)公告日為2008年3月5日的發(fā)明專利提出了一種"硫酸鹽 還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測(cè)方法"，在該專利中對(duì)步驟二至步驟七 的內(nèi)容均有披露。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式所述的附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法是
按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的
步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內(nèi)壁上附著的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側(cè)壁上打通孔，再將生物膜取樣裝置安裝在所 述通孔處使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的內(nèi)側(cè)壁平齊，并保持在線 安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成膜后即可取下生物膜；
步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體制備將所述探頭上的生物膜剝離至配制的 溶液中制成菌體；具體包括以下步驟a、將取下的生物膜放入裝有l(wèi)mL去離 子水且經(jīng)滅菌的1.5mL的離心管中；b、將離心管在震蕩器上充分震蕩5min， 13000r/min離心lmin，從管中輕輕的棄上清液0. 9mL; c、在剩余的0. lmL中 加入"菌體前處理緩沖液"(DNA前處理緩沖液)0.9mL，在震蕩器上充分震蕩 5min; d、 13000r/min離心2min，棄上清液0. 98mL (剩余20 u 1)，充分震蕩 2 min，制備完畢短時(shí)間內(nèi)(0 1天)在4'C條件下保存即可，長(zhǎng)時(shí)間(大于 1天)不用在-2(TC條件下保存；所述"菌體前處理緩沖液"的母液成分為 70gNaCi、 2gKci、 12g Na2HP04、 2g KH2P0" 1%。 SDS;將母液稀釋10倍成為 菌體前處理緩沖液；控制工作液的pH為7.5，在12rC條件下滅菌15 30min 后即可。
步驟三、將步驟二中制備好的菌體進(jìn)行倍比稀釋吸取2ul步驟二中得 到的菌體加入用于倍比稀釋的管中，加入18ul的去離子水，然后在從中取2 P1進(jìn)行下一步的稀釋，依次從上管中取樣1加入下一個(gè)用于倍比稀釋的 管中，加入18 y 1的去離子水，直到選擇稀釋的倍數(shù)(或最終水樣被稀釋十倍)；
步驟四、進(jìn)行冰上的PCR操作所述進(jìn)行冰上的PCR操作過(guò)程中的PCR 反應(yīng)體系為20lil:包括Buffer (10X) 2ul、 0. 3咖o1 L-1的dNTP 2 u 1、 濃度為0. 1 " mol L/1的正向弓l物SRBF 1 u 1、濃度為0.1 u mol U1的反向引 物SRBR lul， rTaq酶0.3U，其余加去離子水11. 7 y 1 ，然后加2ul的樣品 (步驟二中得到的菌體)；所述正向引物SRBF的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿 基組成為5， -CCTGACGCAGCGACGCCG-3，，共18bp;反向引物SRBR的硫酸鹽 還原菌特意性探針的堿基組成為5， -CTACCAGGGTATCTAATCC-3，，共19bp;
步驟五、PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增擴(kuò)增程序?yàn)?4。C預(yù)熱5min， 94。C變性 30s， 58.8。C復(fù)性45s， 72。C延伸90s，循環(huán)30次，最后72。C延伸10min，整 個(gè)擴(kuò)增程序需要2個(gè)小時(shí)16分鐘；
步驟六、擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，需要一個(gè)小時(shí);
步驟七、結(jié)果觀察，查表記數(shù)。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式在步驟一中所述生物膜取樣裝置保持在線安 裝在罐體或管體的側(cè)壁上15天。其它步驟與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式在進(jìn)行冰上的PCR操作過(guò)程中采用三管或五
管平行法，每個(gè)梯度3個(gè)或5個(gè)樣。本發(fā)明的方法試驗(yàn)結(jié)果表明，三管平行法
記錄的結(jié)果無(wú)論在水樣低濃度或高濃度的情況下，數(shù)量級(jí)上與五管平行法無(wú)差
別。重要在于五管平行法記錄的結(jié)果更加準(zhǔn)確，置信度大于99%。五管平行法 SRB-MPN-PCR法記數(shù)的結(jié)果與用硫酸鹽還原菌細(xì)菌檢測(cè)試劑瓶(北京華興化學(xué) 試劑廠)14天的記數(shù)結(jié)果相比數(shù)量級(jí)上平均大102，更能反應(yīng)水樣中實(shí)際的SRB 菌的數(shù)量。其它步驟與具體實(shí)施方式
一、二或三相同。授權(quán)公告號(hào)為CN 100348731C、授權(quán)公告日為2007年11月4日的發(fā)明專利提出了一種"油田水 質(zhì)硫酸鹽還原菌的定量檢測(cè)方法"；授權(quán)公告號(hào)為CN 100372943C、授權(quán)公告 日為2008年3月5日的發(fā)明專利提出了一種"硫酸鹽^S原菌直接倍比稀釋PCR 快速定量檢測(cè)方法"；上述兩件專利均披露了三管或五管平行法的技術(shù)方案。
具體實(shí)施方式
五如圖1 3所示，本實(shí)施方式的生物膜取樣裝置包括主 體4、探頭壓緊總成5、固定件2和控制閥3 (帶螺旋扣的水閘)，所述取樣裝 置還包括探頭1，所述探頭1的上端設(shè)有臺(tái)肩1-1，壓緊總成5位于主體4的 上端，探頭1依次穿過(guò)探頭壓緊總成5、主體4，探頭1通過(guò)固定件2固裝在 主體4的上端面上，探頭1上端的臺(tái)肩1-1搭接在探頭壓緊總成5的上端面上， 探頭壓緊總成5安裝在主體4上設(shè)有定位臺(tái)肩4-1上，控制閥3安裝在主體4 的下端側(cè)壁上。探頭壓緊總成5的作用是防止探頭1被罐體或管體6內(nèi)的液體 的壓力將探頭l頂出。在使用時(shí)，先在罐體或管體6的側(cè)壁上打通孔，再將生 物膜取樣裝置安裝在所述通孔處使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的 內(nèi)側(cè)壁平齊，并保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成 膜后即可取下生物膜。把探頭上的菌膜剝離至配制的溶液中，震蕩后保存。生 物膜取樣裝置是附著型硫酸鹽還原菌快速定量檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵所在，它解決 了附著型硫酸鹽還原菌無(wú)法取樣的難題，是后續(xù)檢測(cè)的前提條件。
具體實(shí)施例
試驗(yàn)以采油三廠北三三脫水站地面處理系統(tǒng)為測(cè)試點(diǎn)，開(kāi)展了管壁和罐壁 附著型SRB含量測(cè)定研究?，F(xiàn)場(chǎng)將測(cè)試組件(包括生物膜取樣裝置)分別安裝在北三三脫水站沉降罐出口和入口、北三一三沉出口和入口、北三一外輸水匯
管出口和入口上，現(xiàn)場(chǎng)工藝流程參見(jiàn)圖4，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表l。采用改良后的SRB 培養(yǎng)基進(jìn)行記數(shù)。
根據(jù)生長(zhǎng)結(jié)果計(jì)算菌膜中的SRB含量，現(xiàn)場(chǎng)附著型SRB含量測(cè)定結(jié)果， 由表1可見(jiàn)，管壁上有大量的SRB菌附著生長(zhǎng)，在一定程度上表明，同一管道 中管壁SRB菌的數(shù)量相對(duì)大于污水中的數(shù)量，通過(guò)安裝在管壁上的檢測(cè)裝置與 絕跡稀釋法(MPN)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了管壁和罐壁上的附著型SRB菌的定量檢測(cè)，該 技術(shù)在生產(chǎn)中已經(jīng)得到應(yīng)用。同行也是目前細(xì)菌記數(shù)中只監(jiān)測(cè)污水中、流動(dòng)相 中的附著型SRB，并沒(méi)有監(jiān)測(cè)附著型SRB，現(xiàn)場(chǎng)附著SRB含量測(cè)定結(jié)果顯示， 系統(tǒng)的管壁上有大量的SRB附著生長(zhǎng)，這一研究結(jié)果也證實(shí)了室內(nèi)SRB菌群種 類及生長(zhǎng)特性研究的結(jié)論，即油田地面系統(tǒng)中存在附著生長(zhǎng)的SRB和非附著生 長(zhǎng)的SRB。對(duì)于指定硫酸鹽還原菌的系統(tǒng)控制方法，具有非常重要的意義，改 變了以往的"殺菌方案"治標(biāo)不治本的問(wèn)題。
_表l采油三廠附著型SRB含量測(cè)試結(jié)果_
測(cè)試部位 管壁 污水 測(cè)試部位 管壁 污水
_(個(gè)/cm2)(個(gè)/mL)_(個(gè)/cm2)(個(gè)/niL)
脫水站罐入口 1.0X 1061.5X 103脫水站罐出口2.5X106 2.0X103
沉降罐入口 4. 8X106 4. 5X 103 沉降罐出口 6.0X106 7.5X103 外輸水匯管入口 1.0X 106 1.25X 103外輸水匯管出口1.3X106 1.5X10權(quán)利要求
1、一種附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法，其特征在于它是按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內(nèi)壁上附著的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側(cè)壁上打通孔，再將生物膜取樣裝置安裝在所述通孔處，并使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的內(nèi)側(cè)壁平齊，并保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成膜后即可取下生物膜；步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體制備將所述探頭上的生物膜剝離至配制的溶液中制成菌體；步驟三、將步驟二中制備好的菌體進(jìn)行倍比稀釋；步驟四、進(jìn)行冰上的PCR操作；步驟五、PCR在擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增；步驟六、擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)；步驟七、結(jié)果觀察，查表記數(shù)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟一中所述生物膜取樣裝置保持在線安裝在罐體或管體的側(cè)壁上15天。
3、 實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法中的生物膜取樣裝置，其特征在于所述取樣 裝置包括主體(4)、探頭壓緊總成(5)、固定件(2)和控制閥(3)，其特征 在于所述取樣裝置還包括探頭(1)，所述探頭(1)的上端設(shè)有臺(tái)肩(1-1)， 壓緊總成(5)位于主體(4)的上端，探頭(1)依次穿過(guò)探頭壓緊總成(5)、 主體(4)，探頭(1)通過(guò)固定件(2)固裝在主體(4)的上端面上，探頭(1) 上端的臺(tái)肩(1-1)搭接在探頭壓緊總成(5)的上端面上，探頭壓緊總成(5) 安裝在主體(4)上設(shè)有定位臺(tái)肩(4-1)上，控制閥(3)安裝在主體(4)的 下端側(cè)壁上。
全文摘要
附著型硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)方法及所用生物膜取樣裝置，它涉及一種硫酸鹽還原菌的定量檢測(cè)方法及該方法中專用的生物膜取樣裝置。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的檢測(cè)方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)附著型硫酸鹽還原菌的快速、較準(zhǔn)確的定量檢測(cè)問(wèn)題。本方法主要步驟為用生物膜取樣裝置取下生物膜、菌體制備、倍比稀釋、PCR操作、擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、查表記數(shù)。所述探頭(1)依次穿過(guò)探頭壓緊總成(5)、主體(4)，探頭(1)通過(guò)固定件(2)固裝在主體(4)的上端面上，探頭(1)上端的臺(tái)肩(1-1)搭接在探頭壓緊總成(5)的上端面上，控制閥(3)安裝在主體(4)的下端側(cè)壁上。本發(fā)明方法記數(shù)更加準(zhǔn)確、縮短計(jì)數(shù)時(shí)間，運(yùn)用本發(fā)明裝置可有效取得罐壁和管壁的附著生物膜。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK101302557SQ20081006490
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者寧 侯, 李大鵬, 楊基先, 珊 邱, 放 馬, 利 魏 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)