專利名稱：一種酵母細(xì)胞生物合成1，6-二磷酸果糖鈉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母細(xì)胞生物 合成l， 6-二磷酸果糖鈉的方法。
背景技術(shù)：
1，6-二磷酸果糖[Fructose — l， 6-Diphosphate,簡稱FDP]，分子式為 C6Hl4012P2，常以鈉、鈣、鋅等鹽的形式存在。系糖代謝的中間產(chǎn)物，溶于 水，是人體生命活動(dòng)所必需的，在細(xì)胞代謝過程中起凋節(jié)劑、生物催化劑 和細(xì)胞強(qiáng)壯劑的重要作用。自1908年Harden和Young發(fā)現(xiàn)并闡明1， 6—二磷酸果糖的基本特性以 來，許多科學(xué)家對1,6—二磷酸果糖的制備和應(yīng)用作了研究。Nenfeng等人 于1942年用新鮮的面包酵母或啤酒酵母的酶系在實(shí)驗(yàn)室合成了FDP，進(jìn)一 步證實(shí)l， 6—二磷酸果糖作為糖代謝過程中的中間體的論點(diǎn)，而Markov等 人對FDP進(jìn)行的藥理學(xué)和藥效學(xué)研究則為FDP在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 他們的研究發(fā)現(xiàn)FDP可作用于細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)糖代謝中若干酶活性，尤其是 激活磷酸果糖激酶(PFK)，聚增細(xì)胞內(nèi)高能磷酸根，產(chǎn)生大量的ATP，促進(jìn) 鉀離子內(nèi)流，恢復(fù)細(xì)胞極化狀態(tài)，從而有益于休克、缺氧、缺血、損傷、 體外循環(huán)和輸血等狀態(tài)下的細(xì)胞能量代謝以及劉葡萄糖的利用，以促進(jìn)細(xì) 胞修復(fù)和改善功能。在臨床上，F(xiàn)DP作為調(diào)節(jié)糖代謝中若干酶的活性和恢 復(fù)、改善細(xì)胞代謝的分子水平藥物，用于休克、急性心肌梗塞、心肌直視 手術(shù)、外周血管疾患和重危病人接受胃腸外營養(yǎng)療法等疾病的治療和輔助 治療。八十年代，意大利Foscama公司在FDP的制備技術(shù)和臨床應(yīng)用等領(lǐng)域取 得突破性進(jìn)展。在世界上首家實(shí)現(xiàn)了FDP的工業(yè)化生產(chǎn)，并推出了1，6—二 磷酸果糖鈉鹽的粉針劑，獲得巨大成功，其生產(chǎn)量由1986年的2萬針上升 到1991年的500萬針。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1988年我國進(jìn)口量為10萬針，1991年猛增 到100多萬針，1993年達(dá)200萬針之多。國內(nèi)對FDP的研究起步較晚，而國外對FDP的積累機(jī)理和生產(chǎn)過程也缺乏系統(tǒng)研究，迄今未見專著。除 Foscama公司的Bisso等人在專利中報(bào)道了FDP的制備工藝外，未見有系統(tǒng) 的文章報(bào)道。80-90年代發(fā)現(xiàn)1， 6-二磷酸果糖(Fructose-l， 6-diphosphate)在醫(yī) 藥保健品和植物生長調(diào)節(jié)方面的諸多用途，尤其用于醫(yī)藥備受關(guān)注傳統(tǒng) FDP的生產(chǎn)是用面包酵母或啤酒酵母作酶源，通過糖酵解過程而獲得，以 后有用固定化酵母細(xì)胞、固相化多酶系統(tǒng)及嗜熱脂肪芽胞桿菌轉(zhuǎn)化葡萄糖 為FDP的專利報(bào)道，還有采用重組啤酒酵母轉(zhuǎn)化乳糖為FDP及用CTAB代替甲 苯改變酵母細(xì)胞透性，以葡萄糖為碳源生物合成FDP的研究等。生物轉(zhuǎn)化是利用植物離體細(xì)胞或器官、動(dòng)物細(xì)胞、微生物及其細(xì)胞器， 以及游離酶對外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的生化反應(yīng)。 一方面天然產(chǎn)物一 直是人類尋找有效活性成分的源泉；另一方面，在開發(fā)新藥的過程中，具 有以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物，通過化學(xué)或生物的手段，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾， 得到根多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)毒性更低，療效更好的藥物。微生 物作為一個(gè)完整個(gè)體，其體積雖小，但也具有一套自身特異的酶體系。同 時(shí)由于微生物資源豐富、種類繁多，對于特意的底物，可供篩選的菌株很 多。以多種不同催化功能的酶系對天然活性成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生新 的組合性的天然化合物庫，再通過活性篩選，可尋找新的高效低毒的天然 活性先導(dǎo)化合物，或通過對活性組分中的不同成分結(jié)構(gòu)變化可以發(fā)現(xiàn)新一 代的先導(dǎo)化合物，已取得了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。生物轉(zhuǎn)化規(guī)律還 可以指導(dǎo)新藥的結(jié)構(gòu)修飾，獲得高效長效的新一代藥物，足以說明生物轉(zhuǎn) 化對新藥開發(fā)的重要性?，F(xiàn)報(bào)道的轉(zhuǎn)化合成方法大都是采用霉菌菌絲體作為轉(zhuǎn)化的微生物，這 類微生物培養(yǎng)煩瑣，費(fèi)時(shí)較長，而且不利于操作的簡便化，同時(shí)生物合成 效率不高。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種周期短，產(chǎn)量高的酵母細(xì)胞生物合成l， 6-二磷酸果 糖鈉的方法。一種酵母細(xì)胞生物合成l， 6-二磷酸果糖鈉的方法，包括如下步驟將梅山酵母或釀酒酵母(釀酒酵母的商品名稱為酒精酵母，可采用安 琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的酒精酵母)接種在發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基為糖度為12柏林，pH為6. 5的麥芽汁；接種采用的是對數(shù)生長期的酵母 種子液。于25 30°C、 150r/min搖床預(yù)培養(yǎng)12 36h得到發(fā)酵液；在4°C， 10000r/min條件下將發(fā)酵液冷凍離心20 30min得到菌體。預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間 優(yōu)選18 24h，最優(yōu)選24 h。本發(fā)明方法并不僅僅限于釀酒酵母，對于梅山酵母、K字酵母等其它 (酵母菌是單細(xì)胞真核微生物。酵母菌細(xì)胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、 臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等，具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有細(xì)胞 壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、液泡、線粒體等，有的還具有微體)酵母 也同樣適用。經(jīng)與培養(yǎng)得到菌體后，以lOOmL滅菌的反應(yīng)液計(jì)，加入l 5g菌體， 在25 30。C、 100 200r/min轉(zhuǎn)化反應(yīng)4 10h，加lmol/L三氯醋酸終止 反應(yīng)；4°C， 10000 r/min離心30min收集上清液。上清液中含有l(wèi)， 6-二磷酸果糖鈉(FDP鈉)，可以采用常規(guī)的提取方 法從上清液中提取高含量的FDP鈉，如沉淀法、離子交換吸附法等。為檢測到的上清液中1， 6-二磷酸果糖鈉濃度，可以通過已經(jīng)報(bào)道的 方法對上清液進(jìn)行處理并在波長570nm下測吸光值。作為反應(yīng)條件的優(yōu)選，以lOOmL滅菌的反應(yīng)液計(jì)，加入3g菌體，在 30°C、 150r/min轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h，加lmol/L三氯醋酸終止反應(yīng)；4°C， 10000 r/min離心30min收集上清液。所述的反應(yīng)液的pH5. 0 9. 0，反應(yīng)液的質(zhì)量百分比組成為 2 12% 葡萄糖； 2 15% 磷酸二氫鈉； 余量為水。所述的反應(yīng)液優(yōu)選PH5. 5 8. 9，反應(yīng)液的質(zhì)量百分比組成優(yōu)選 9% 11% 葡萄糖； 3% 7% 磷酸二氫鈉；余量為水。作為優(yōu)選在反應(yīng)液中加入反應(yīng)液總質(zhì)量0. 05 0. 1%的表面活性劑 Tween 80 (吐溫80)可以改善酵母細(xì)胞的通透性，提高FDP的生物合成量。加入表面活性劑Tween 80時(shí)，反應(yīng)液的質(zhì)量百分比組成為 9% 11% 葡萄糖； 3% 7% 磷酸二氫鈉； 0. 05 0. 1%吐溫80; 余量為水。本發(fā)明方法，不僅酵母細(xì)胞培養(yǎng)簡單、費(fèi)時(shí)較短，而且轉(zhuǎn)化體系簡單， 易于操作，F(xiàn)DP鈉合成效率高，采取表面活性劑吐溫80調(diào)控和提高FDP鈉 的合成效率，具有極大的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1選用釀酒酵母菌種，30°C， 150 r/min搖床培養(yǎng)細(xì)胞(培養(yǎng)基糖度 為12柏林的麥芽汁，p朋.5， 500mL三角瓶裝100mL)， 24h收集細(xì)胞，在 J-6M型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)10000 r/min的4。C條件下離心 30分鐘得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞lg，加入質(zhì)量百分比為11%葡萄糖，5%磷酸二氫 鈉，pH 7的30mL反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150 r/min，轉(zhuǎn)化6h 后，用1 mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三氯醋酸水溶液用量5 ml)， 經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中l(wèi)， 6-二磷酸果糖鈉濃度為4. 79 g/L。實(shí)施例2選用釀酒酵母菌種，30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)菌體(培養(yǎng)基糖度為 12柏林的麥芽汁，p朋.5, 500mL三角瓶裝100mL)， 24h收集細(xì)胞，在J-6M 型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)10000r/min的4。C條件下離心30分鐘 得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞lg，加入質(zhì)量百分比為8%葡萄糖，5%磷酸二氫 鈉，pH8. 4的30mL反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化溫度為3(TC，轉(zhuǎn)速為150r/min，轉(zhuǎn)化6h 后，用1 mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三氯醋酸水溶液用量5 ml)， 經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中l(wèi)， 6-二磷酸果糖鈉濃度為3. 9 g/L。選用釀酒酵母菌種，30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)細(xì)胞(培養(yǎng)基糖度為 12柏林的麥芽汁，pH6.5， 500mL三角瓶裝100mL)， 24h收集細(xì)胞，在J-6M 型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)IO，OOO r/min的4。C條件下離心30 分鐘得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞lg，加入質(zhì)量百分比為9.7%葡萄糖，5.8%磷酸 二氫鈉，pH8. 8的30mL反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150r/min，轉(zhuǎn) 化6h后，用1 mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三氯醋酸水溶液用量5 ml), 經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中l(wèi)， 6-二磷酸果糖鈉濃度為5. 07 g/L。實(shí)施例4選用釀酒酵母菌種，30°C， 150 r/min搖床培養(yǎng)細(xì)胞(培養(yǎng)基糖度 為12柏林的麥芽汁，pH6. 5， 500mL三角瓶裝100mL)， 24h收集細(xì)胞，在 J-6M型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)10000 r/min的4'C條件下離心 30分鐘得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞lg，加入質(zhì)量百分比為9.7%葡萄糖，5.8%磷酸 二氫鈉，添加吐溫80 0.08%, pH8.8的30mL反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化溫度為30。C， 轉(zhuǎn)速為150r/min，轉(zhuǎn)化6h后，用1 mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三 氯醋酸水溶液用量5 ml)，經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中1， 6-二磷酸果糖鈉濃 度為5. 67 g/L，而同樣的轉(zhuǎn)化體系中未加吐溫80的FDP鈉合成量為5. 02 g/L， 1， 6-二磷酸果糖鈉濃度明顯高于同樣條件下的未加吐溫80的體系。選用釀酒酵母菌種，3CTC， 150 r/min搖床培養(yǎng)細(xì)胞(培養(yǎng)基糖度 為12柏林的麥芽汁，pH6.5， 500mL三角瓶裝100mL)，生長24h后收集細(xì) 胞，在J-6M型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)10000 r/min的4'C條件 下離心30分鐘得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞100g，加入質(zhì)量百分比為9.7%葡萄糖，5.8%磷 酸二氫鈉，pH8. 8的3000mL反應(yīng)液(5L反應(yīng)罐)，轉(zhuǎn)化溫度為30°C，轉(zhuǎn)速 為150r/min，轉(zhuǎn)化6h后，用l mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三氯醋 酸水溶液用量5 ml)，經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中1， 6-二磷酸果糖鈉濃度為 5. 11 g/L。選用梅山酵母菌種，28-3CTC， 150 r/min搖床培養(yǎng)細(xì)胞(培養(yǎng)基糖 度為12柏林的麥芽汁，pH6.5， 500 mL三角瓶裝100mL)， 24h收集細(xì)胞， 在J-6M型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)10000 r/min的4'C條件下離 心30分鐘得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞lg,加入質(zhì)量百分比為10.0%葡萄糖，3. 10%磷 酸二氫鈉，pH6. 5的30mL反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化溫度為30。C，轉(zhuǎn)速為150 r/min， 轉(zhuǎn)化6h后，用1 mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三氯醋酸水溶液用量5 ml)，經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中l(wèi)， 6-二磷酸果糖鈉濃度為3. 57 g/L。選用梅山酵母菌種，28-30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)細(xì)胞(培養(yǎng)基糖 度為12柏林的麥芽汁，pH6.5， 500 mL三角瓶裝100mL)， 24h收集細(xì)胞， 在J-6M型大容量冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)10000 r/min的4。C條件下離 心30分鐘得到酵母細(xì)胞。取離心得到酵母細(xì)胞lg，加入質(zhì)量百分比為10.0%葡萄糖，3. 10%磷 酸二氫鈉，添加吐溫80 0.05。/。，pH6.5的30mL反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化溫度為30。C， 轉(zhuǎn)速為150r/min，轉(zhuǎn)化6h后，用1 mol/L三氯醋酸水溶液終止反應(yīng)(三 氯醋酸水溶液用量5 ml)，經(jīng)處理后測得發(fā)酵液中1， 6-二磷酸果糖鈉濃 度為5. 57 g/L。而同樣的轉(zhuǎn)化體系中未加吐溫80的FDP鈉合成量為3. 60 g/L， 1，6-二磷酸果糖鈉濃度明顯高于同樣條件下的未加吐溫80的體系。9
權(quán)利要求
1、一種酵母細(xì)胞生物合成1，6-二磷酸果糖鈉的方法，包括如下步驟以100mL滅菌的反應(yīng)液計(jì)，加入1～5g經(jīng)預(yù)培養(yǎng)得到的菌體，在25～30℃、100～200r/min轉(zhuǎn)化反應(yīng)4～10h，加三氯醋酸終止反應(yīng)后，離心分離得到含有1，6-二磷酸果糖鈉的上清液；所述的菌體為釀酒酵母經(jīng)預(yù)培養(yǎng)12～36小時(shí)，再經(jīng)冷凍離心得到的細(xì)胞；所述的反應(yīng)液的pH5.0～9.0，反應(yīng)液的質(zhì)量百分比組成為2～12％葡萄糖；2～15％磷酸二氫鈉；余量為水。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以100mL滅菌的反應(yīng)液 計(jì)，加入3 g菌體，在30。C、 150 r/min轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h，加三氯醋酸終止 反應(yīng)后，在4"C， 10,000 r/min離心30min得到含有1， 6-二磷酸果糖鈉 的上清液。
3、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的反應(yīng)液pH5. 5 8. 9， 反應(yīng)液的質(zhì)量百分比組成優(yōu)選9% 11% 葡萄糖； 3% 7% 磷酸二氫鈉； 余量為水。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的反應(yīng)液的質(zhì)量百 分比組成為9% 11% 葡萄糖； 3% 7% 磷酸二氫鈉； 0.05% 0. 10%吐溫80; 余量為水。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的預(yù)培養(yǎng)采用的發(fā) 酵培養(yǎng)基為糖度為12柏林，pH為6. 5的麥芽汁。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述的預(yù)培養(yǎng)在25 30°C、 150 r/min搖床預(yù)培養(yǎng)。
7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的冷凍離心的條件為4。C、 10000 r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母細(xì)胞生物合成1，6-二磷酸果糖鈉的方法，以100mL滅菌的反應(yīng)液計(jì)，加入1～5g經(jīng)預(yù)培養(yǎng)得到的菌體，在25～30℃、100～200r/min轉(zhuǎn)化反應(yīng)4～10h，加三氯醋酸終止反應(yīng)后，離心分離得到含有1，6-二磷酸果糖鈉的上清液；所述的菌體為釀酒酵母經(jīng)預(yù)培養(yǎng)12～36小時(shí)，再經(jīng)冷凍離心得到的細(xì)胞；所述的反應(yīng)液的pH5.0～9.0，反應(yīng)液的質(zhì)量百分比組成為2～12％葡萄糖；2～15％磷酸二氫鈉；余量為水。采用本發(fā)明方法合成1，6-二磷酸果糖鈉，不僅酵母細(xì)胞培養(yǎng)簡單、費(fèi)時(shí)較短，而且轉(zhuǎn)化體系簡單，易于操作，F(xiàn)DP鈉合成效率高。
文檔編號C12R1/865GK101328489SQ20081006379
公開日2008年12月24日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者何國慶, 傅明亮, 婧 劉, 章海鋒, 陳啟和 申請人:浙江大學(xué)