專利名稱：：一種產白僵菌素的盾葉薯蕷內生鐮孢菌及其抗細菌活性的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及微生物
技術領域：
，特別是涉及一種其代謝產物為白僵菌素的微生物一盾葉薯蕷內生鐮孢菌o
背景技術：
植物內生真菌(plantendophyticfongi)是指那些在其生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物組織或器官內部，宿主植物不表現外在病害癥狀的真菌。植物內生真菌是一種新的微生物資源，能產生生物堿類、肽類、甾體類、萜類、酚類、醌類、脂肪族類、異香豆素類等多種結構類型的代謝產物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗蟲、調節(jié)植物生長等多種生物活性。由于植物內生真菌能產生結構新穎、功能獨特的代謝產物而成為新化合物、新藥物的潛在資源，它們在農業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)、食品等領域具有重要的應用前景。白僵菌素(beauvericin)是一種具有抗菌、殺蟲、抗癌、抑制膽甾醇酰基轉移酶活性、引發(fā)細胞程序性凋亡等生物活性的脂肽類化合物，最早在真菌球孢白僵菌(5eam^^6aw/朋a)中發(fā)現。白僵菌素具有環(huán)狀的化學結構，由3個2-羥基異戊酸和3個N+甲基苯丙氨酸通過肽鍵和酯鍵交錯相連而成，分子式為C45H57N309，分子量為783.4。白僵菌素的活性研究集中在殺蟲活性上，對微生物抑制活性的報道較少。盾葉薯蕷(Dioscoreazi'"g沾erensfsC.H.Wright)在分類上屬于單子葉百合目薯蕷科(Dioscoreaceae)，為我國特有的藥用植物，分布于湖南、湖北、四川、甘肅等省區(qū)，其根狀莖多年生長在地下，對土傳病原菌具有強的抵抗能力，這很可能與其共生的內生菌有關。目前尚未見從盾葉薯蕷內生真菌中分離純化單一化合物的報道。本發(fā)明著重于內生真菌提取物抗菌活性的研究，為探討內生真菌的生理生態(tài)功能(如提髙宿主的抗病性等)提供依據。本發(fā)明的目的是提供一種經發(fā)酵培養(yǎng)能產生白僵菌素成分的微生物，即盾葉薯蕷內生鐮孢菌。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及一種鐮孢菌(尸uwwv'wmsp.)，菌株代號為DzC,現保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2008年1月16日，登記入冊編號為2340。本發(fā)明提供如下的技術方法。1、內生鐮孢菌DzC的分離釆集新鮮的盾葉薯蕷根狀莖，釆用內生真菌的分離和純化技術，獲得一株內生真菌，編號為Dzf2。2、內生鐮孢菌Drf2的形態(tài)特征(l)無性世代菌株Dzf2在PDA培養(yǎng)基上25。C培養(yǎng)，產生大量的氣生菌絲，白色，邊緣菌絲稀疏，菌落背面桔黃色，分生孢子梗單生或輪生，瓶梗狀，基部有分隔，大孢子近鐮刀形，2-3個隔，小孢子卵圓形，橢圓形，腎形無隔或者l個隔，孢子大小4.3-24fimx2.4-5拜。內生真菌Dzf2的形態(tài)特征(見圖l、圖2、圖3和圖4)符合鐮孢菌屬(Fww'鵬)真菌的形態(tài)特征。(2)有性世代未發(fā)現。3、內生鐮孢菌Drf2的分子生物學特征運用PCR技術，擴增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')禾BITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。將Dzf2菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列庫中注冊獲得序列號(accessionnumber)DQ4462U。同時將Dzf2菌株的ITS序列與GenBank中其他真菌的ITS序列進行比對，找出相似性最高，親緣關系最近的真菌，Dzf2菌株的ITS序列與芬芳鐮孢菌(Fusan'wmmto/ens)X94169的ITS序列相似度為99.5%,其同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖5。4、內生鐮孢菌Dzf2的發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)基液體馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度25±1°C。發(fā)酵時間7天。搖床轉速120rpm。發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第2天，菌液無色；培養(yǎng)第5天，菌液略帶橙黃色；培養(yǎng)第7天，菌液為灰黑色。5、內生鐮孢菌Drf2粗提物的抗菌活性采用瓊脂打孔藥劑擴散法，內生真菌Dzf2菌液和菌絲提取物均表現出一定的抗菌活性，菌液提取物的活性強于菌絲提取物。采用多孔板液體稀釋法，噻唑藍(MTT)為顯色劑，測定了內生真菌Dzf2菌液和菌絲提取物的最低抑菌濃度(MIC),菌液提取物對大腸桿菌、番茄細菌斑點病菌、枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌的MIC值分別為0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0625mg/ml和0.125mg/ml。6、白僵菌素的追蹤分離特征通過薄層層析-生物自顯影抗菌活性檢測，對內生真菌Dzf2培養(yǎng)物的提取物進行反復的柱層析，包括常規(guī)的硅膠柱層析、S印hadexLH-20凝膠柱層析、RP-18反相柱層析，分離到一純的抗菌化合物，該化合物為白色針狀晶體。7、白僵菌素的結構特征白僵菌素為一具有環(huán)狀化學結構的脂肽類化合物，由3個2-羥基異戊酸和3個N-甲基苯丙氨酸通過肽鍵和酯鍵交錯相連而成，分子式為C4SH57N309,分子量為783.4。8、白僵菌素的抗菌活性特征采用多孔板-MTT比色法測定白傻菌素對4種革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌、番茄細菌斑點病菌)和兩種革蘭氏陽性細菌(枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌)的抑制活性。白便菌素對大腸桿菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌、番茄細菌斑點病菌、枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌的半抑制濃度(IC5o)分別為55.59^ig/ml、21.23jig/ml、70.71pg/ml、18.97ng/ml、18.45pg/ml、26.57fig/ml，而陽性對照硫酸鏈霉素對大腸桿菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌、番茄細菌斑點病菌、枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌的半抑制濃度分別為18.75ng/ml、21.23ng/ml、17.51ng/ml、18.97fig/ml、12.05ng/ml、36.76ng/ml。其中白僵菌素對溶血葡萄球菌的抑制活性要強于硫酸鏈霉素，對根癌土壤桿菌和番茄細菌斑點病菌的抑制活性與硫酸鏈霉素相當。圖1為內生真菌Dzf2菌落正面。圖2為內生真菌Dzf2菌落背面。圖3為內生真菌Dzf2的菌絲、分生孢子梗、分生孢子。圖4為內生真菌Dzf2的分生孢子。圖5為內生真菌Dzf2同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖6為內生真菌Dzf2提取物和已分離純化的白僵菌素薄層層析-生物自顯影檢測結果[l為溶劑前沿；2和3為有白色斑點，表示有抗菌活性成分的存在；4為點樣點，樣品為分純的抗菌活性成分；5為點樣點，樣品為發(fā)酵培養(yǎng)物的總提取物；供試菌株為黃瓜角斑病菌(Psewdo;nomK/ac/io^ans);TLC條件正相硅膠板，展開劑為氯仿:甲醇=10:1(v/v)]。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明首次明確了具有廣譜抗菌活性的內生鐮孢菌Dzf2菌株的微生物學分類地位，同時發(fā)現該菌提取物對大腸桿菌、番茄細菌斑點病菌、枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌的生長具有明顯的抑制作用。采用活性追蹤的分離方法，從Dzf2菌株中分離到具有明顯抗菌活性的化合物白僵菌素。目的是利用植物內生真菌資源，以求獲得天然抗生素類成分，為探討內生真菌的生理生態(tài)功能提供依據。為了更好地理解本發(fā)明，下面結合本發(fā)明的實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但本發(fā)明的內容并不局限于此。具體實施方式實施例l:內生真菌Drf2的分離采集新鮮的盾葉薯蕷根狀莖，表面先用70%乙醇處理303，然后用0.2。/。氯化汞處理20min以進行徹底的表面滅菌，無菌條件下去除表皮，將根狀莖分成約0.5cmx0.5cmx0.5cm大小的塊段，擺放在PDA培養(yǎng)基上，每皿1塊，在25""C,光照條件下培養(yǎng)至第7^20天，從每個菌落的邊緣挑取一小段菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上進行純化，連續(xù)純化4-5次，至菌落形態(tài)一致。將純化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株內生真菌的編號為Dzf2。實施例2:內生真菌Dzf2菌株提取物的抗菌活性采用瓊脂打孔藥劑擴散法，分別對內生真菌Dzf2菌液和菌絲提取物進行了檢測，結果見表l。表l內生真菌Df2提取物的抗細菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中數據為抑菌圈直徑±標準誤差(cm);每孔中內生真菌提取物量為2.5噸硫酸鏈霉素(陽性對照)為每孔10昭；陰性對照為每孔加50(iL二甲基亞砜，未表現出抑制活性，采用多孔板液體稀釋法，以噻唑藍(MTT)為顯色劑，測定了內生真菌Dzf2菌液和菌絲提取物對細菌生長的最低抑制濃度(MIC)，結果見表2。表2內生真菌Dzf2提叫物對細菌生長的最低抑制濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注硫酸鏈每素為陽性對照；表明沒有檢測到MIC值實施例3:內生真菌Drf2菌株的形態(tài)特征觀察內生真菌Dzf2在PDA培養(yǎng)基上25。C培養(yǎng)，產生大量的氣生菌絲，白色，邊緣菌絲稀疏，菌落背面桔黃色，分生孢子梗單生或輪生，瓶梗狀，基部有分隔，大孢子近鐮刀形，2-3個隔，小孢子卵圓形，橢圓形，腎形無隔或者l個隔，孢子大小4.3-24nmx2.4-5nm。形態(tài)特征圖分別見圖1~圖4。在培養(yǎng)條件下，未發(fā)現Dzf2的有性世代。實施例4:內生真菌Dzf2菌株ITS序列分析與分子鑒定首先將在平板上活化的Dzf2菌株的菌絲轉移到PDA液體培養(yǎng)基中,懸浮培養(yǎng)5天后獲得新鮮的菌絲,釆用常規(guī)的分子生物學方法提取基因組DNA。運用PCR技術，DNA擴增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5，'TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。DNA測序所用的引物分別為ITS1和ITS4，采用ABIPRISM3730淵序儀，分別進行正向(5'—3')和反向(3'—5')雙向測序。反向序列經DNAMAN軟件反向互補后與正向序列拼接形成5'—3'完整序列。把所得的ISTrDNA序列提交至!lGenBank數據庫(NationalCenterforBiotechnologyInformationWebsite,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得序列號(accessionnumber)DQ4462U。利用Blast工具進行序列比對，找出與該序列相似度最髙的菌的序列信息。Dzf2菌株的ITS序列與芬芳鐮孢菌(尸usW函mto/e/w)X94169的ITS序列相似度為99.5%。根據Blast比對結果，從中抽取與所分離的內生真菌Dzf2菌株序列相似性高的菌株的序列，采用ClustalX1.8軟件進行序列對準，再用MEGA軟件計算遺傳距離，然后利用距離依靠法中的鄰位相連法(Neighbor-joining,NJ)構建進化樹，計算Bootstrap值來評價系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。Dzf2同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖5實施例5:內生真菌DzC的發(fā)酵工藝本發(fā)明采用的是搖床發(fā)酵，1000ml體積的三角瓶中盛馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養(yǎng)基400ml,將預先培養(yǎng)好的Dzf2菌絲接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，在25士1。C、120rpm下暗培養(yǎng)7天，得總發(fā)酵液40L，通過減壓過濾獲得菌絲和菌液，菌液用等體積的正丁醇萃取，重復3次，合并萃取液，在50。C下減壓濃縮，得菌液提取物16g。菌絲在50。C下烘干后，得干重260g，研磨成粉，用2000ml正丁醇-浸泡24h后，再用超聲波提取，過濾，重復3次，合并濾液，在5(TC下減壓濃縮，得菌絲提取物31g。實施例6:內生真菌Dzf2白倕菌素的追蹤分離對實施例5中所獲得的發(fā)酵培養(yǎng)物提取物，通過薄層層析(TLC)和薄層層析-生物自顯影(TLC-bioautography)抗菌活性檢測，表明菌絲提取物和菌液提取物所含成分一致，將菌絲和菌液提取物合并成總提取物，總提取物的TLC-生物自顯影抗菌活性測定結果見圖6。首先對提取物進行粗分離，柱層析條件為環(huán)己垸:乙酸乙酯梯度(環(huán)己烷:乙酸乙酯=100:0，4L;100:1,4L;100:2,4L;100:3，4L;100:5，4L;100:10，4L;100:204L;100:50，4L,100:100，4Land0:100，4L)洗脫，洗脫部分通過TLC檢測，合并，分別得到10個組分(F-1:2.21g，F-2:1.21g，F-3:1.20g,F-4:0.92g,F-5:1.95g,F-6，2.48g，F-7,3.56g，F-8:4.13g,F-9，4.46g，F-10:6.18g)，其中，F-8組分表現出較強的抗菌活性，繼續(xù)通過SephadexLH-20柱層析，氣仿:甲醇(1:1，v/v)洗脫，最后通過RP-18反相硅膠柱層析，得到一純化合物，為白色針狀晶體，實施例7:白傻苗素的結構鑒定用實施例6所述的方法制各到一白色針狀晶體(甲酵).m.p.91-93°C;ESI-MS(positive)w/z806.7[M+Na]+，(negative)w/z，782.4[M-H]-。NMR(MeOD，300MHz)<5(ppm),0.23(9H，d，《^6.5取H-14，14'，14")，0.83(9H，d,H:^H-15，15',15")，1.83(3H，m，H-13，13'，13"),2.98(3H，dd，^14.5,12.0HaH-3b,3b',3b"),3.02(9H，s，H陽IO，10'，10"),3.35(3H，dd,^R5,5.0Hz^H-3a,3a',3a"),4.82(3H，dd，>12.0，5.0H-2,2'，2")，5.76(3H，d,>/=8.6Hz,H-12,12'，12"),7.25-7.15(15H，m,H-5,6,7,8，9,5'，6',7'，8'，9',5",6",7"，8",9");13CNMR(MeOD,75MHz)3(ppm),173.0(C-l，l',l")，57.8(C-2,2',2")，35.5(C-3,3'，3"),138.1(C-4,4'，4")，129.7(C-5,5',5"，9,9',9"),129.8(C-6,6'，6",8，8'，8"),128.0(C-7,7'，7")，32.2(C-10,10',10")，171.0(C-ll，11',ir)，77.2(C-12,12'，12")，31.2(C-13,13',13")，19.3(C-14，14',14")，17.3(C-15,15'，15")。根據理化常數和波譜數據，該化合物鑒定為白僵菌素，其結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>實施例8:白傻菌素的抗菌活性測定用實施例6所述的方法，從內生真菌Dzf2中分離到的白僵菌素進行抗細菌活性測定。(1)活性測定的細菌菌株枯草芽孢桿菌(5flc,7/m犯6ft'toATCC11562)(革蘭氏陽性)；溶血葡萄球菌(5topA>>/ococatf/we加o/沖'cusATCC29970)(革蘭氏陽性)；黃瓜角斑病菌(尸seufito/wonos/oc/wymansATCC11921)(革蘭氏陰性)；根癌土壤桿菌C4g^toc/m'柳fWMe/acfewATCC11158)(革蘭氏陰性)；大腸桿菌(&c/wrtcAtoco//ATCC25922)(革蘭氏陰性)；番茄細菌斑點病菌(Xa"rto加onosvew'ca/ortaATCC11633)(革蘭氏陰性)。(2)培養(yǎng)基采用LB瓊脂培養(yǎng)基(酵母浸裔5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,瓊脂20g/L,pH7.0)和LB液體培養(yǎng)基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,pH7.0)。(3)抗菌活性測定采用多孔板-MTT比色法測定白僵菌素對細菌的抑制活性，結果見表3。具體步驟為每孔加入濃度為106cfii/mL的供試菌液90jiL,然后加入不同濃度的藥液10uL，28°C暗培養(yǎng)24h后,每孔中加入5mg/mL的MTT溶液10nL,繼續(xù)培養(yǎng)411后加入10%二甲基亞砜100nL，繼續(xù)振蕩30min,以終止反應并助其溶解.將顯色的菌懸液在3000g下離心10min,上演液轉到另一多孔板中，用酶標儀測定其在590nm處的吸光值(OD590nm),按下式計算藥物抑制率(％):無藥對照孔Oi)590mn-藥液孔OZ)590nm抑制率(％)-xlOO無藥對照孔OD外o,根據抑制率，査機率值表，可得抑制率機率值a),將藥液濃度(mg/mL)換算成濃度對數a),即可求出線性方程r-aZ+b，根據線性方程可求出半數抑制濃度(IC5)。本發(fā)明中的數據均為3次重復平均值。表3多孔板-MTT比色法測定白僵菌素的抗細菌活性供試細菌白僵菌素的半抑制濃度(IC50)Oig/ml)陽性對照硫酸鏈霉素的半抑制濃度(IC50)(pg/ml)大腸桿菌55.5918.75根癌土壤桿菌21.2321.23黃瓜角斑病菌70.7117.51番茄細菌斑點病菌18.9718.97枯草芽孢桿菌18.4512.05溶血葡萄球菌26.5736.7權利要求1、一株產白僵菌素的盾葉薯蕷內生真菌，其特征是命名為鐮孢菌(Fusariumsp.)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.2340。2、一種按權利要求1所述的內生真菌的分離方法，通過嚴格的表面消毒，從植物內都分離出來的，并通過形態(tài)和分子鑒定，將ITSrDNA序列提交到GenBank數據庫，獲得序列號DQ446211。3、一種從按權利要求1所述的內生真菌中分離白僵菌素的方法，白僵菌素具有抗細菌活性，其化學結構式如下白僵菌素全文摘要本發(fā)明涉及一種產白僵菌素的盾葉薯蕷內生鐮孢菌。本發(fā)明所述的內生真菌Dzf2是從盾葉薯蕷中采用內生真菌分離技術分離獲得的，經微生物分類鑒定為鐮孢菌(Fusariumsp.)，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.2340。本發(fā)明首次從盾葉薯蕷中分離出產白僵菌素的內生真菌，并明確了白僵菌素的抗菌活性。目的是利用植物內生真菌資源，獲得天然活性成分。文檔編號C12P17/14GK101240249SQ20081005684公開日2008年8月13日申請日期2008年1月25日優(yōu)先權日2008年1月25日發(fā)明者周立剛,姜微波,彭友良,徐利劍,王明安,趙江林,黃永富申請人:中國農業(yè)大學