專利名稱：：一種能靶向表達(dá)fadd的重組腺病毒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。涉及腫瘤的基因治療，具體涉及一種腫瘤細(xì)胞專一的、且能在耙細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞凋亡基因FADD、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自殺死亡的腺病毒體重組體。背暴技術(shù)利用病毒載體進(jìn)行腫瘤的基因治療是近十多年興起的一種生物高技術(shù)方案，在整個(gè)基因治療方案中，腫瘤基因治療方案占60%以上，基因治療曾被認(rèn)為是人類最終征服腫瘤的希望。目前作為基因治療的載體分為病毒型和非病毒型兩大類。病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和皰疹病毒等。病毒載體轉(zhuǎn)染率高，表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，但免疫原性強(qiáng)，有一定危險(xiǎn)性。非病毒載體包括裸露DNA、脂質(zhì)體和其它物質(zhì)包裹的DNA。非病毒載體則免疫原性小及安全性好，但轉(zhuǎn)染率低，基因穩(wěn)定性差，表達(dá)時(shí)間短。目前使用最多還是病毒載體。病毒載體又有兩類一類可以整合到染色體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒。另一類則不能整合到染色體，如腺病毒、單純皰疹病毒及EB病毒。在病毒載體中使用最多的還是腺病毒(Adv)載體，Adv有A、B、C、D、E、F等6大類，49個(gè)血清型，其中C類血清型2和5用得最多，腺病毒基因組全長(zhǎng)36Kb，分早期基因(E)和晚期基因(L)，如果將早期基因E1區(qū)(約4Kb)缺失掉(有時(shí)還加上E3區(qū)3.6Kb的部分缺失)，則稱為第一代基因治療載體，這是常用的載體。第二代Adv除E1區(qū)等缺失外，還有E4、EZA區(qū)缺失以降低其免疫原性，但現(xiàn)在很少。第三代無(wú)腸腺病毒GutlessAdv(簡(jiǎn)稱為GL—Adv)載體則是將Adv的所有基因全部去除，僅保留兩端的反向末端重復(fù)順序(rrR)及裝配基因，它沒有抗原性，不會(huì)被抗體清除掉，故有長(zhǎng)期療效。腺相關(guān)病毒(AAV)是一種免疫原性極小的單鏈DNA病毒，它可以定點(diǎn)插入到染色體上，在目前使用中未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用和致癌性。逆轉(zhuǎn)錄病毒(RTv)、慢病毒、單純疤疹病毒(HSV)、EB病毒也是較為常用的病毒載體。基因治療的載體是將基因送到目的處，以發(fā)揮治療(如抗癌)作用?；蛑委熭d體是關(guān)鍵，另一要素是基因，有關(guān)腫瘤治療基因可以是抑癌基因、細(xì)胞因子基因、細(xì)胞凋亡基因等。這些因子或是有很好的抑癌作用，或是對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，或是能剌激免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用?；蛑委煹牟呗允菍?duì)腫瘤細(xì)胞具3有殺傷或抑制作用的基因連接在進(jìn)入腫瘤的病毒載體上，并特異表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的。如何選擇特異在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的靶向機(jī)制是這種基因治療的關(guān)鍵。(3-catenin是一種多功能的胞質(zhì)蛋白，含781個(gè)氨基酸，并含有不同的蛋白結(jié)合功能域。其氨基末端含有數(shù)個(gè)糖原合成酶激酶-3(3(glycogensynthasekinase3(3，GSK-3卩)和酪蛋白激酶lcx(caseinkinasela，CKla)的磷酸化位點(diǎn)，羧基末端有活化相應(yīng)靶基因的功能，中間區(qū)域由42個(gè)氨基酸的12-14個(gè)重復(fù)序列的基本肽鏈單位組成，形成Arm區(qū)域，含有大腸腺瘤息肉蛋白，T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路(thewinglesspathwayinDrosophila)是一條十分保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育過程以及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用。由于其在人類不同腫瘤疾病中的廣泛激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和分化。因此，被認(rèn)定為腫瘤發(fā)生過程中關(guān)鍵的信號(hào)通路之一。而P-catenin在胞內(nèi)水平的升高是這一途徑激活的標(biāo)志特征。如wnt基因家族成員的wnt-1、wnt-3和wnt-10b都是由MMTV誘發(fā)小鼠乳腺癌的過程中活化的癌基因。小鼠wnt-1、wnt-2、wnt-3a、wnt-5a、wnt-7基因在體外均具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力。目前雖無(wú)明確證據(jù)表明，wnt基因異常能直接導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)生，但已有大量的研究報(bào)道顯示二者關(guān)系密切。例如，wnt-2在大腸癌發(fā)展的多階段都有過度表達(dá)；wnt-5a在乳腺癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤中過度表達(dá)，在乳腺癌及早期乳腺增生中過度表達(dá)更為明顯，因此wnt-5a具有癌基因的某些特性。造成(3-catenin胞內(nèi)水平升高的機(jī)制可能有以下幾種1、惡性腫瘤的特點(diǎn)之-是細(xì)胞接觸生長(zhǎng)抑制性的喪失。細(xì)胞與細(xì)胞的相互接觸依賴于細(xì)胞表面的黏附分子。E-cadherin是一個(gè)重要的細(xì)胞黏附分子。研究發(fā)現(xiàn)，他在乳腺癌、家族性胃癌、食管癌、膀胱癌等細(xì)胞中均存在不同程度的失活，并且失活機(jī)制不盡相同。在家族性胃癌患者的生殖細(xì)胞中，可檢出E-cadherin基因的突變；而在一些散發(fā)性胃癌、乳腺癌中則發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)被高度甲基化，還有報(bào)道稱E-cadherin的失活和食管癌的惡性程度呈正相關(guān)。另外，低表達(dá)或失活的E-cadherin還能使與膜結(jié)合的(i-catenin減少，導(dǎo)致胞內(nèi)游離的P-catenin量增加，從而激活Wnt信號(hào)通路，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，可以認(rèn)為E-cadherin具有抑癌基因的功能。2、Axin最初作為Wnt信號(hào)通路的抑制因子得以分離。隨后的研究表明，他主要是為APC、p-catenin以及GSK-3P形成復(fù)合物提供支架。盡管Axin的確切作用機(jī)制尚未完全明確，但他確實(shí)能協(xié)助GSK-3p磷酸化(3-catenin和APC,抑制Wnt信號(hào)的活化。最近發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中Axin結(jié)合b-catenin的結(jié)構(gòu)域存在較高頻率的突變，這就證實(shí)野生型Axin可作為腫瘤抑癌基因，在正常細(xì)胞中下調(diào)Wnt信號(hào)。3、在Wnt通路中，與人類腫瘤關(guān)系最密切的是APC(adenomatouspolyposiscoli)基因。最初，APC基因從家族性多發(fā)性息肉腺瘤綜合征(f咖maladenomatouspolyposis)患者中發(fā)現(xiàn)并克隆。在這些患者中，APC基因缺失突變并以常染色體隱性遺傳的方式傳給下一代。由于APC基因在腫瘤細(xì)胞中的表現(xiàn)形式(基因的兩個(gè)拷貝都失活)和具有隱性遺傳的特性，所以，是一個(gè)典型的抑癌基因。APC基因與結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)系極為密切。他突變后可導(dǎo)致結(jié)腸上皮細(xì)胞過度增生，形成息肉，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。大約85%散發(fā)性結(jié)腸癌中可檢測(cè)到APC基因缺失突變或失活，而APC基因的缺失或失活被認(rèn)為是結(jié)腸癌發(fā)生的早期事件。但是，APC基因在結(jié)腸癌形成過程中的具體作用一直不為人所知，直至最近發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中APC的失活可直接導(dǎo)致e-catenin在核內(nèi)的累積，導(dǎo)入正常的APC基因后，可消除該現(xiàn)象，才將APC與Wnt信號(hào)通路聯(lián)系起來。隨后，綜合一些新的發(fā)現(xiàn)，提出了一個(gè)揭示結(jié)腸癌、黑色素瘤發(fā)生的疾病模型，進(jìn)一步解釋APC基因在腫瘤形成中的作用機(jī)制。APC突變后，使其不能有效地與e-catenin、GSK-3(3和Axin結(jié)合而形成復(fù)合物，卩-catenin降解受阻從而在胞內(nèi)累積，隨即進(jìn)入核內(nèi)，激活靶基因的表達(dá)。同時(shí)，(3-catenin氨基端的Ser/Thr磷酸化位點(diǎn)突變也可影響其降解過程，造成卩-catenin胞內(nèi)水平升高，從而激活Wnt信號(hào)通路。令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)還有，(3-catenin和TCF的復(fù)合物可以激活c-myc的表達(dá)。20年前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，c-myc的激活與Burkitt's淋巴瘤、肺癌、結(jié)腸癌等多種人類腫瘤相關(guān)。而c-myc與Wnt通路的整合，進(jìn)一步說明，Wnt通路在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用不容忽視。TCF是Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)的最后一步，|3-cat必須與TCF結(jié)合才能夠激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。卩-catenin有一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，但他沒有DNA結(jié)合域，這個(gè)缺失由TCF提供，他們共同組成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體。TCF家族包含4個(gè)不同的蛋白TCF1、TCF2、TCF3、TCF4和LEF。這些蛋白在胚胎發(fā)育中正常表達(dá)，但在大部分分化好的組織中表達(dá)下調(diào)，而其中的某些蛋白可以繼續(xù)表達(dá)于人體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)活躍的部位，如骨髓、皮膚、腸黏膜等。編碼TCF1和LEF1的基因包含兩種不同的啟動(dòng)子，-個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)牛一個(gè)全長(zhǎng)的蛋白，而另一個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)生一個(gè)失去p-catenin結(jié)合位點(diǎn)的縮短蛋白。這些縮短蛋白在其他抑制蛋白的協(xié)助下，占據(jù)調(diào)節(jié)位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄。因此，如果全長(zhǎng)蛋白上調(diào)而縮短蛋白下調(diào)將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。腫瘤組織中Wnt信號(hào)的過度激活導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)耙基因異常轉(zhuǎn)錄。這些耙基因多與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成及組織重塑有關(guān)，如c-myc、cyclinDl、MMP-7等。已知家族性腺瘤息肉病(familialadenomatosispolyposis)和由此而進(jìn)展的結(jié)直腸癌中存在c-myc表達(dá)過度給予反義寡核苷酸探針直接針對(duì)c-myc在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)異常，將抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。cyclinDl調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中Gl/S轉(zhuǎn)化期。在散發(fā)結(jié)直腸癌中有卩-catenin的核積累，同時(shí)也有cydinDl的高表達(dá)。對(duì)裸鼠的胃癌細(xì)胞導(dǎo)入反義寡核苷酸探針抑制cyclinDl后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑制，致瘤性消失。MMP家族降解胞外基質(zhì)蛋白，在許多腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起作用。在食管癌屮，異常的核P-catenin表達(dá)和MMP-7表達(dá)相關(guān)，并且與腫瘤的浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。同樣，胃癌也表達(dá)增高的MMP-7并且和胃癌有密切關(guān)系的幽門螺旋桿菌促進(jìn)MMP-7的表達(dá)。研究顯示，大部分胰腺癌中有MMP-7的高表達(dá)。大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)在一些腫瘤中，這些耙基因的異常表達(dá)可能具有診斷意義。(3-catenin最初是作為細(xì)胞黏附分子的一員被人們認(rèn)識(shí)的。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)卩-catenin同時(shí)在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中擔(dān)當(dāng)重要的角色，圍繞p-catenin核內(nèi)水平的增高而引起的一系列轉(zhuǎn)錄基因活性的增強(qiáng)是經(jīng)典Wnt通路誘導(dǎo)細(xì)胞惡性變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。同時(shí)P-catenin以其雙重身份將細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來，進(jìn)一步揭示了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。研究已確認(rèn)p-catenin激活的突變?cè)谠S多腫瘤中存在，如黑色素瘤、肝癌、皮膚癌、腦瘤、卵巢腫瘤和前列腺癌等，由于缺乏(3-catenin下調(diào)的重要缺陷，弓l起包括TCF/LEF應(yīng)答基因的異常激活，包括c-myc和cyclinDl已被確認(rèn)為p-catenin轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的靶基因。這些基因的激活可以引起細(xì)胞周期進(jìn)程的失控，造成非正常的細(xì)胞增殖。由于這條通路在腫瘤生成中的重要作用，針對(duì)其中的某些成分靶向給予抑制劑，可以減弱腫瘤的生長(zhǎng)，起到治療癌癥的作用。我們利用p-catenin轉(zhuǎn)錄活性在iH常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的區(qū)別，將(3-catenin信號(hào)傳遞活性升高作為選擇腫瘤細(xì)胞的靶向點(diǎn)，設(shè)計(jì)開發(fā)出將細(xì)胞凋亡基因FADD置于含野生型TCF/LEF結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子控制下的基因治療方法，使得具有卨活性p-catenin/TCF的癌細(xì)胞被選擇性地殺死。這種方法可以進(jìn)一歩開發(fā)出靶向治療那些Wnt/p-catenin/TCF信號(hào)傳導(dǎo)途徑缺陷的腫瘤方法和藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于將(3-catenin信號(hào)傳遞活性升高作為治療腫瘤靶向點(diǎn)，設(shè)計(jì)將人類細(xì)胞凋亡基因FADD置于含野生型TCF/LEF結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子控制下的重組病毒，從而提供一種6具有腫瘤靶向性，同時(shí)又能高效殺死腫瘤細(xì)胞的重組病毒Ad-TCF-FADD。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種腫瘤靶向重組病毒Ad-TCF-FADD的構(gòu)建方^S。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種腫瘤靶向重組病毒Ad-TCF-FADD用于治療腫瘤的用途。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種腫瘤靶向重組病毒Ad-TCF-FADD，該重組病毒以El/E3基因缺失的腺病毒為載體，并攜帶有針對(duì)腫瘤細(xì)胞中卩-catenin/TCF通路激活的結(jié)合位點(diǎn)TCF，和在TCF控制下的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因FADD。本發(fā)明并提供了腫瘤靶向重組腺病毒Ad-TCF-FADD的構(gòu)建方法，其步驟包括A.以質(zhì)粒pBLCAT2-TCF(含三個(gè)TCF識(shí)別序列及TK基本啟動(dòng)子，見圖1)為模板，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增TCF結(jié)合位點(diǎn)及TK基本啟動(dòng)子的嵌合DNA片段。該片段克隆進(jìn)BglII酶切過的pAd-Track質(zhì)粒，所得之載體命名為pAd-Track-TCF。該載體中包含=個(gè)TCF結(jié)合序列。B.將細(xì)胞凋亡因子FADD克隆到pAd-Track-TCF的TK基本啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成pAd-Track-TCF-FADD腺病毒穿梭載體。C.pAd-Track-TCF-FADD腺病毒穿梭載體與El/E3缺失的腺病毒質(zhì)粒在原核細(xì)胞中整合產(chǎn)生重組腺病毒Ad-TCF-FADD。D.重組腺病毒Ad-TCF-FADD在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的復(fù)制擴(kuò)增及分離純化。利用上述重組腺病毒的構(gòu)建方法，可以用于開發(fā)有效治療腫瘤的抗癌新藥。本發(fā)明能產(chǎn)生以下有益效果1、本發(fā)明提供了一種攜帶腫瘤靶向表達(dá)細(xì)胞凋亡基因FADD的重組腺病毒Ad-TCF-FADD，其中細(xì)胞凋亡基因FADD能特異性地在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞巾不表達(dá)，從而在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)卻不損害正常細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞試驗(yàn)證明，可以用于殺死p-catenin/TCF通路激活的腫瘤細(xì)胞，如結(jié)腸癌細(xì)胞SW480;2、本發(fā)明并提供了腫瘤靶向重組腺病毒Ad-TCF-FADD的構(gòu)建方法，該方法易于掌握；3、本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒Ad-TCF-FADD，能選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所攜帶的細(xì)胞凋亡基因FADD，故該重組病毒具有很高的靶向抗癌作用，為今后用于人類腫瘤治療打下了良好基礎(chǔ)。附圖表說明圖l:pBLCAT2TCF含有三個(gè)T細(xì)胞因子(TCF)結(jié)合位點(diǎn)。圖2:pAdTrack-TCF-FADD的示意圖。圖3:AdEasy-1是一種El和E3缺失的人體五型腺病毒。圖4:Ad-TCF-FADD在具有高激活p-catenin/TCF信號(hào)通路的細(xì)胞中特異性誘導(dǎo)FADD的表達(dá)。圖5:Ad-TCF-FADD特異性殺傷具有高激活(3-catenin/TCF信號(hào)通路的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞。圖6:AdTCF-FADD對(duì)人正常腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞HRCE不具殺傷性。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)例一:含有TCF識(shí)別序列及FADD細(xì)胞凋亡的腺病毒穿梭載體pAd-Track-TCF-FADD的構(gòu)建。若無(wú)特別說明，本發(fā)明所采用的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)均為此領(lǐng)域之常規(guī)操作技術(shù)。所涉及的分子克隆技術(shù)、細(xì)胞學(xué)及微生物學(xué)技術(shù)等均可參考此領(lǐng)域之經(jīng)典文獻(xiàn)。如Harlow的《抗體》和Sambrook等所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》等。本例構(gòu)建的腺病毒穿梭載體的終產(chǎn)物是pAd-Track-TCF-FADD。該載體經(jīng)重組后所產(chǎn)生的腺病毒Ad-TCF-FADD能在受感染的靶細(xì)胞中表達(dá)具細(xì)胞殺傷功能的細(xì)胞凋亡蛋白FADD,其中FADD的表達(dá)受單純皰疹病毒(HSV)之胸苷激酶(TK)基本啟動(dòng)子和T細(xì)胞因子(TCF)識(shí)別序列的調(diào)控。此穿梭載體的具體構(gòu)建方法如下1、以質(zhì)粒pBLCAT2-TCF(含三個(gè)TCF識(shí)別序列及TK基本啟動(dòng)子，見圖1)為模板，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增TCF結(jié)合位點(diǎn)及TK基本啟動(dòng)子的嵌合DNA片段。PCR反應(yīng)得的引物為5，引物5'CCTAGATCTACGTTGTAAAACGACGGCCAG3'3'引物5，TCGAGATCTGCGGCACGCTGTTGACGC3，所得之270bp的PCR產(chǎn)物DNA片段用QiagenDNA純化試劑盒分離純化后，用BglII酶切，再經(jīng)制備電泳純化后，克隆進(jìn)BglU酶切過的pAd-Track質(zhì)粒，所得之載體命名為pAd-Track-TCF，該載體中三個(gè)TCF結(jié)合序列的核苷酸順序如下8其共有順序如下劃線所示。除此例所用的TCF結(jié)合序列之外，其它所有人工合成的或天然的TCF識(shí)別的核苷酸順序均可使用。TCF識(shí)別序列通常含有(A/T)(A/T)CAA(A7T)GG共有順序(參見Roose&Clevers，1999，Biochem.Biophys.Acta.l424:23-37)。其次，所串聯(lián)的TCF結(jié)合序列數(shù)目也具可塑性，少至一個(gè)，或多至十個(gè)甚至超過二十個(gè)TCF結(jié)合序列可用此例的方法克隆到pAd-Tmck穿梭載體。另外，除TK基本啟動(dòng)子順序之外，其它類似基本啟動(dòng)子均可按類似方法串聯(lián)在TCF結(jié)合序列的下游。2、將細(xì)胞凋亡因子FADD克隆到pAd-Track-TCF的TK基本啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成pAd-Track-TCF-FADD穿梭載體用KpnI和XbaI酶切pcDNA3-FADD質(zhì)粒，然后跑制備性瓊脂糖電泳，將約650kp的FADD編碼基因片段帶在弱紫外燈下切得。用常規(guī)溶膠DNA抽提純化法得到FADD基因，基因和蛋A序列表為人體FADD基因的蛋白序列:將該基因又克隆入經(jīng)KpnI和XbaI酶切過的pAd-Track-TCF載休。所得產(chǎn)物命名為腺病毒穿梭載體pAd-Tmck-TCF-FADD(見圖2)。該載體的外源DNA順序(包括TCF結(jié)合序列、TK基本啟動(dòng)子及FADD編碼序列)經(jīng)DNA順序分析后證明無(wú)誤。本例所用的FADD只是細(xì)胞凋亡途徑中的一個(gè)因子，其他細(xì)胞凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物，如TRADD，Caspase級(jí)聯(lián)酶系的活化因子(如Caspase2，8,9，10，11,12)，以及Caspase級(jí)聯(lián)酶系的效應(yīng)子(如Caspase3,6,7)。此外，F(xiàn)ADD亦可以下列基因產(chǎn)物取代，如CD,TK類自殺基因，P53,Trail類的抗癌基因，IL-2,IL-12,IFN，GM-CSF類的細(xì)胞因子，等等。實(shí)例二:腺病毒穿梭載體與El/E3缺失的腺病毒質(zhì)粒在原核細(xì)胞中整合產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒。1、取1微克穿梭載休pAd-Track-TCF-FADD，加10單位PmeI酶切1小時(shí)。然后用苯-氯仿抽提，酒精沉淀得穿梭載體DNA，抽干后溶于6微升水中。2、取20微升感受態(tài)大腸桿菌BJ5183細(xì)胞，與1微升上述PmeI酶切過的穿梭載體DNA及0.1微克AdEasy-1質(zhì)粒(El/E3基因缺失的腺病毒質(zhì)粒，見圖3，Strategene，CA)混合。然后用Bio-RadGenePulser電轉(zhuǎn)化細(xì)菌，再將細(xì)菌轉(zhuǎn)入500微升LB培養(yǎng)液，在37'C保溫約2010分鐘，隨后涂在含Kanamycin的培養(yǎng)基平板上，37'C保溫過夜。重組腺病毒質(zhì)粒(Ad-TCF-FADD)攜有Kanamycin抗性基因，因而只有帶此質(zhì)粒的細(xì)菌可在Kanamycin選擇性培養(yǎng)基上繁殖。第二天，挑取小菌斑若干，在3毫升LB-Kanamycin培養(yǎng)液中繁殖，然后用QiogenDNA質(zhì)粒分離方法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒用Pacl酶水解，IH確的質(zhì)粒Ad-TCF-FADD經(jīng)酶解后得30kb和約3-5kb的兩個(gè)DNA片段。實(shí)例三:重組腺病毒Ad-TCF-FADD在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的復(fù)制擴(kuò)增及分離純化。293細(xì)胞為腺病毒E1轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞株，是腺病毒體外感染復(fù)制的常用細(xì)胞。除293細(xì)胞外，其它腺病毒E1轉(zhuǎn)化的人體細(xì)胞株，如E1轉(zhuǎn)化的人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞株911，均可類推使用。實(shí)驗(yàn)步驟如下1、取4微克經(jīng)PacI酶解的Ad-TCF-FADD質(zhì)粒DNA，與Lipofectamine轉(zhuǎn)染液混合后加入293細(xì)胞培養(yǎng)皿。由于Ad-TCF-FADD腺病毒基因組中含有CMV啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因(參見圖2)。293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率及重組腺病毒Ad-TCF-FADD的復(fù)制增殖可在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)水平來檢測(cè)。2、轉(zhuǎn)染后7-10天，用熒光顯微鏡檢測(cè)表達(dá)GFP的病毒空斑，如此證實(shí)重組腺病毒轉(zhuǎn)染復(fù)制后，即可收集細(xì)胞，并反復(fù)凍融細(xì)胞三次，隨后低速離心機(jī)(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C)IO分鐘，收取含重組病毒的上清液。3、用約l/3的上清液，感染新鮮293細(xì)胞，重復(fù)上述病毒分離及感染步驟。如此重復(fù)2-3次后可得到高滴度重組腺病毒液，最后用CsCl梯度超離心得到高度純化的重組腺病毒制劑。有關(guān)293細(xì)胞感染及大量繁殖，提取，純化的具體方法可參見Strategene的相關(guān)技術(shù)說明。實(shí)例四:檢測(cè)重組腺病毒Ad-TCF-FADD在被感染細(xì)胞中表達(dá)FADD的能力。為闡明Ad-TCF-FADD重組病毒具表達(dá)FADD的能力，且證明其表達(dá)受Wnt/(3-catenin/APC/TCF信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的調(diào)控，我們比較了細(xì)胞株SW480(Wnt/卩-catenin/APC/TCF通路超常激活)與HeLa(此通路未激活)被Ad-TCF-FADD感染后的FADD表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下在6孔板中，每孔接種1-5><105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋約70%孔底面積時(shí)，加入濃縮的重組腺病毒(病毒接種量按每個(gè)細(xì)胞加入50個(gè)病毒空斑形成單位計(jì)，即50病毒Pfu/細(xì)胞)。48小時(shí)后收集細(xì)胞，裂解并檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。然后按常規(guī)方法跑SDS-蛋白電泳，并用WesternBlot的方法檢測(cè)FADD的表達(dá)水平以及PARP的降解程度。PARP的降解被公認(rèn)為是細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)的標(biāo)志。如圖4A所示，Ad-TCF-FADD在SW480中表達(dá)FADD，而在HeLa細(xì)胞株中未見FADD。然而在同一實(shí)驗(yàn)中'重組腺病毒Ad-CMV-FADD(FADD基因表達(dá)受CMV啟動(dòng)子調(diào)控，故不應(yīng)受Wnt/卩-catenin/APC/TCF信號(hào)通路活性的影響)既能在SW480也能在HeLa細(xì)胞中表達(dá)FADD。其次，我們也比較了Wntl基因轉(zhuǎn)染對(duì)Ad-TCF-FADD表達(dá)FADD的影響。圖4B顯示293細(xì)胞經(jīng)Wntl轉(zhuǎn)染后明顯增強(qiáng)Ad-TCF-FADD表達(dá)FADD的水平。另外，我們比較了結(jié)腸癌細(xì)胞株SW48和SW480(兩者均為(3-catenin/TCF高度激活的細(xì)胞株)與兩種正常人上皮細(xì)胞(均為正常的基態(tài)(3-catenin/TCF活性)被重組腺病毒感染后表達(dá)FADD的水平。結(jié)果表明，重組腺病毒Ad-CVM-FADD感染后，這四種細(xì)胞都有相似高水平的FADD表達(dá)，而重組腺病毒Ad-TCF-FADD感染后，只有SW48和SW480細(xì)胞內(nèi)有FADD表達(dá)，正常上皮細(xì)胞中均未檢測(cè)到FADD，如下表所示細(xì)胞株(3-catenin/TCF活性FADD表達(dá)水平Ad-CMV-FADDAd-TCF-FADDSW48結(jié)腸癌細(xì)胞高度激活++++++SW480結(jié)腸癌細(xì)胞高度激活+++++人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞正常+++—人正常腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞正常+++—綜上所述，圖4和上表所示的結(jié)果表明，其一，Ad-TCF-FADD能在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)FADD凋亡因子；其二，F(xiàn)ADD在細(xì)胞中的表達(dá)直接為耙細(xì)胞中的(3-catenin/TCF途徑的激活水平所控制，因而Ad-TCF-FADD具有定向細(xì)胞殺傷的分-了基礎(chǔ)；其三，Ad-TCF-FADD病毒屮TCF結(jié)合序列是該病毒專一腫瘤細(xì)胞殺傷的關(guān)鍵機(jī)制。實(shí)例五:檢測(cè)重組腺病毒在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。本例專述重組腺病毒Ad-TCF-FADD對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性殺傷的檢測(cè)，此實(shí)驗(yàn)方法可推廣至類似的重組腺病毒。為證實(shí)Ad-TCF-FADD可專一殺傷(3-catenin/TCF途徑有變異的腫瘤細(xì)胞，我們選用了(3-catenin/TCF途徑高度激活的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW48和SW480，卩-cateniiVTCF途徑中等激活的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株，人正常腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞株，以及(3-catenin/TCF12途徑TT-常的腫瘤細(xì)胞株HeLa和A549。在96孔板巾，每孔接種2000-8000個(gè)細(xì)胞。次日，加入濃縮的重組腺病毒(病毒接種量按每個(gè)細(xì)胞加50個(gè)病毒空斑形成單位計(jì))。48小時(shí)之后，用MTT試劑盒(Promega)檢測(cè)細(xì)胞的存活率，結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>重組腺病毒Ad-CMV-FADD無(wú)選擇性地殺傷以上所有的細(xì)胞株，然而重組腺病毒Ad-TCF-FADD卻具有極強(qiáng)的(3-catenin/TCF途徑依賴性細(xì)胞殺傷能力SW48和SW480有高度激活的卩-catenin/TCF途徑，其細(xì)胞殺傷率超過98%;HCT116有中度激活的(3-catenin7TCF途徑，其細(xì)胞的殺傷率約40%;其余細(xì)胞株具正常卩-catenin/TCF活性，Ad-TCF-FADD對(duì)其無(wú)殺傷作用。此外，我們用顯微鏡觀察記錄了HeLa細(xì)胞，SW480細(xì)胞，以及人正常腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞HRCE被重組腺病毒感染后細(xì)胞形態(tài)及殺傷結(jié)果。如圖5和圖6所示，Ad-TCF-FADD只殺傷p-catenin/TCF高度激活的SW480細(xì)胞，而Ad-CMV-FADD不具這樣的選擇性細(xì)胞殺傷能力。權(quán)利要求1、一種可在腫瘤細(xì)胞中專一表達(dá)細(xì)胞凋亡蛋白的腺病毒重組體Ad-TCF-FADD，其特征在于該重組腺病毒以Ad-5為載體，攜帶細(xì)胞凋亡基因FADD，并且FADD的表達(dá)受到單純皰疹病毒(HSV)之胸苷激酶(TK)基本啟動(dòng)子和T細(xì)胞因子(TCF)識(shí)別序列的控制。2、權(quán)利要求1所述腺病毒重組體，其中FADD的表達(dá)受TCF識(shí)別序列的控制，使其只在Wnt/APC/p-catenin通路異常激活的細(xì)胞中表達(dá)。3、權(quán)利要求1所述腺病毒重組體，其中載體是Ad-5，同時(shí)也可以是另外血清型的腺病毒載體，如Ad-2或復(fù)制型腺病毒載體如pZD55以及逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等其他病毒載體。4、權(quán)利要求1所述腺病毒重組體，其中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因是FADD，同時(shí)也可以是TRADD及Caspase家族成員如Caspase(2、3、6、7、8、9、10、11、12)等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物，CD、TK等自殺基因產(chǎn)物和P53、Trail等抑癌基因產(chǎn)物，IL-12、IL-24、IFN、GM-CSF等細(xì)胞因子。5、權(quán)利要求l所述的重組基因腺病毒體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟。A.以質(zhì)粒pBLCAT2-TCF(含三個(gè)TCF識(shí)別序列及TK基本啟動(dòng)子，見圖l)為模板，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增TCF結(jié)合位點(diǎn)及TK基本啟動(dòng)子的嵌合DNA片段。該片段克隆進(jìn)BalII酶切過的pad-Track質(zhì)粒，所得之載體命名為pad-Track-TCF。該載體中包含三個(gè)TCF結(jié)合序列。B.將細(xì)胞凋亡因子FADD克隆到pAd-Track-TCF的TK基本啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成pAd-Track-TCF-FADD穿梭載體。C.pAd-Track-TCF-FADD腺病毒穿梭載體與El/E3缺失的腺病毒質(zhì)粒在原核細(xì)胞中整合產(chǎn)生重組腺病毒。D.重組腺病毒Ad-TCF-FADD在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的復(fù)制擴(kuò)增及分離純化。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，可制備出用于腫瘤治療的藥物。全文摘要本發(fā)明公開一種腫瘤靶向基因重組病毒Ad-TCF-FADD。該重組病毒能在受感染的靶細(xì)胞中表達(dá)具有細(xì)胞殺傷功能的細(xì)胞凋亡蛋白FADD，其中FADD的表達(dá)受單純皰疹病毒(HSV)之胸苷激酶(TK)基本啟動(dòng)子和T細(xì)胞因子(TCF)識(shí)別序列的調(diào)控。FADD在腫瘤細(xì)胞中的專一表達(dá)可殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)卻不損害正常細(xì)胞。本發(fā)明同時(shí)公開上述腫瘤靶向基因重組病毒的Ad-TCF-FADD構(gòu)建方法。本發(fā)明構(gòu)建的腫瘤靶向基因重組病毒Ad-TCF-FADD可用于開發(fā)出有效的腫瘤治療藥物。文檔編號(hào)C12N7/01GK101560501SQ20081004424公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者瑩張,建陳申請(qǐng)人:陳建;張瑩