專利名稱：食蟹猴p450 2b6藥物代謝酶及其與食蟹猴p450氧化還原酶的共表達重組載體的制作方法
食蟹猴P450 2B6藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達重組載體 駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及基因工程研究領(lǐng)域，具體涉及一種食蟹猴(Cynomolgus Monkey, Mamm /osdcw/a^) P450 2B6藥物代謝酶(Cytochrome P450 2B6)及其與食蟹猴P450氧化還原酶 (NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)的共表達重組載體。
背景技術(shù)：
細胞色素P450是重要的藥物代謝I相酶，市場上8TO以上的藥物是通過細胞色素P450代謝的。 2B亞家族是細胞色素P450基因家庭的主要成員，主要包括2B6等。細胞色素P450 2B6能夠代謝 多種藥物如鹽酸丁氨苯丙酮(Bupropion),3-甲基苯乙妥因((s)-(+)-Mephenytoin)。目前，包括人，狗， 大鼠，小鼠等多種動物的細胞色素P450基因序列已經(jīng)被克隆，各種細胞色素P450也已經(jīng)在大腸 桿菌，酵母，哺乳動物細胞等宿主中表達。異源表達的細胞色素P450是研究藥物代謝，進行體外 藥物篩選的重要手段。食蟹猴是常用的臨床前安全性評價實驗大動物，其與人的親緣關(guān)系非常接 近，因而在代謝上表現(xiàn)出較高的相似性。到目前為止，仍未見食蟹猴與人P450 2B6亞型相應(yīng)的基 因的克隆的報道。因此，克隆錢猴P450 2B6基因并進行異源^ii^于體外藥物篩選有重要意義。P450酶在催化反應(yīng)中需要兩個電子和兩個質(zhì)子，其中的電子由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的NADPH(還原型煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，還原型輔酶n)-細胞色素P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)提供。在體外反應(yīng)中，缺少NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的系統(tǒng)不具有催化 活性。到目前為止，將維猴P450 2B6與食蟹猴P450氧化還原麟因共表達還未見報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于,一種食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧,原酶的 共表達重組載體?？寺?，猴P450 2B6(cyp2B6)基因并在昆蟲細胞中進行異源表達；還包括克隆 食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因，構(gòu)建包含NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的，猴P450 2B6(C7p2B6)的昆蟲表達載體，并將此載體用于大翻格食蟹猴P450 2B6的代謝物。 本發(fā)明通過以下方式達到該目的本發(fā)明的食蟹猴(Cynomolgus Monkey, M"rao /osdcw/o^y)的P450 2B6藥物代謝酶 (Cytochrome P4502B6)，能催化鹽酸丁氨苯丙酮(Bupropion)的羥Sifc (Hydroxy)與3-甲基苯 乙妥因((s)-(+)-Mephenytoin)的N端脫甲基(Demethylation)。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人P450基因序列(Genebank, Accession NO. : NM—000767)，以逆轉(zhuǎn)錄自食 蟹tt RNA的cDNA為模板，ilil聚合,式反應(yīng)(PCR)擴增食蟹猴P450 2B6的編碼區(qū)序列(c^ 2B6)，擴增得到的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接得到pT-cynoP2B6質(zhì)粒。其中，設(shè)計的引物不包 含除起始密碼(ATG)外的食蟹猴P450 2B6的編碼區(qū)序列(c^2B6)。經(jīng)測序，得到的編碼區(qū)序列 全長1482堿基對，編碼494個氨基酸，即P450 2B6藥物代謝酶的基因序列或其互補序列是與SEQ ID NO: 1的突變率為0-1%的序列。本發(fā)明的食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)的共表達重組載體包含上述食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶序列的開放閱讀框和 P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。以上述克隆的食蟹猴P450 2B6的基因(c^ 2B6)為模板，以 包含RsrII及HindIII限制性內(nèi)切酶位點的引物擴增食蟹猴P450 2B6的編碼區(qū)序列(cy/ 2B6)并 定向插入昆蟲,載體pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位點之間，得到pFB-cynoP2B6表 達載體。按照Bac-to-Bac中表達，猴P450 2B6蛋白。異源表達的食蟹猴P450 2B6蛋白可以用 作體外篩選，測試藥物的代謝性質(zhì)。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人NADPH-細胞色素P450氧化還原HS因序列(Genebank， Accession N0.: NM_000941)，以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹^ffRNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從擴增， 猴P450氧化還原酶基因的編碼區(qū)序列。其中，設(shè)計的引物不包含除起始密碼(ATG)外的 猴 P450 2B6的編碼區(qū)序列。經(jīng)測序，得到的編碼區(qū)序列全長2034個MS對，編碼677個氨基酸。 即所述P450氧化還原酶的序列或其互補序列如SEQ ID NO: 2。以上述克隆的維猴NADPH-細胞 色素P450氧化還原SIS因為模板，以包含BbsI及NsiI限制性內(nèi)切酶位點的引物擴增食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的編碼區(qū)序列并定向插入昆蟲表達載體pFastBac-Dual的Bbsl及Nsil酶切位點之間，得到pFB-cynoPOR表達載體。按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Instruction Manual (由invitrogen公司提供)操作，在sf-9昆蟲細胞中表達食蟹猴NADPH-P450 氧化還原酶。異源表達的食蟹猴NADPH-P450氧化還原酶可以用作體外篩選，測試藥物的代謝性質(zhì)。 所述的重組載體還含有桿狀病毒基因，能感染包括sf-9在內(nèi)的昆蟲細胞，被感染的昆蟲細胞 至少倉辦在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上異源表達權(quán)利要求1所述的P450 2B6藥物代謝酶。本發(fā)明的有益效果在于，分離的，猴P450 2B6基因(《w 2B6)可以通過基因工程的手段在多 種宿主中異源表達。異源表達的蛋白僅代表2B6這一亞型，因此其代謝活性也僅反映該亞型的活 性。此外，本發(fā)明提供同是來源于錢猴的NADPH-細胞色素P450氧〗極原酶，與4頓其他種屬的 氧化還原酶構(gòu)建的體外檢測系統(tǒng)相比，用這一氧化還原酶構(gòu)建的系統(tǒng)顯然更接近于食蟹猴體內(nèi)代 謝的真實情況。


圖1是，猴P450 2B6基因(cyp 2B6)的RT-PCR結(jié)果圖。 圖2是pFB-cynoP2B6的PCR鑒定結(jié)果圖。 圖3是重組食蟹猴P450 2B6桿狀病毒的PCR鑒定結(jié)果圖。 圖4是食蟹猴P450氧化還原酶的RT-PCR結(jié)果圖。 圖5是pFB-DU-cynoP2B6-0R重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果圖。 圖6是pFB-DU-cynoP2B6-0R重組桿狀病毒的PCR鑒定結(jié)果圖。 具體實駄式實施例1.維猴藥物代謝酶P450 2B6基因(cj^ 2B6)的克隆根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人P450 2B6基因序列(Genebank， Accession NO. :NM_000767)，設(shè)計以下引物引物1: 5，- ATGGAGCTCAGCGTCCTC -3， 引物2: 5，-CCTTCAGCGGGGCAGG-3，5以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹猴肝RNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從擴增食蟹猴P450 2B6 的編碼區(qū)序列(c^ 2B6)，擴增得到的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接得到pT-cynoP2B6質(zhì)粒。其 中，設(shè)計的弓l物不包含除起始密碼(ATG)外的，猴P450 2B6的編碼區(qū)序列(《rp2B6)。經(jīng)測序， 得到的編碼區(qū)序列全長1482堿基對，編碼494個氨基酸。圖1是食蟹猴P450 2B6基因(《^ 2B6) 的RT-PCR結(jié)果圖，Lane 1: Marker DL2000 (由上至下條帶大小分別為；2000bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp， 100bp)， Lane 2: RT-PCR擴增產(chǎn)物，其大小約為1520bp。圖2是pFB-cynoP2B6 的PCR鑒定結(jié)果圖，Lane 1， 2， 4, 5: 4個pFB-cynoP2B6單菌落，主帶大小約為1520bp;Lane 3: Marker DL20(X)。實施例2. ^g猴藥物代謝酶P450 2B6昆蟲表達系統(tǒng)的構(gòu)建及,以上述克隆的^ll猴P450 2B6的基因(cyp 2B6)為模板，設(shè)計包含RsrII及HindIII限制性 內(nèi)切,點的引物引物3: 5，- ATACGGTCCGATGGAGCTCAGCGTCCTC -3, 引物4: 5，-AGAAAGCTTCAGCGGGGCAGGAAGCGG-3，PCR擴增 猴P450 2B6的編碼區(qū)序列(cyp 2B6)并定向插入昆蟲表達載體pFastBac-Dual 的RsrII及HindIII酶切位點之間，得到pFB-cynoP2B6表達載體。測序以確定基因正確插入載體 中。按照桿狀病毒表達手冊操作，在sf-9昆蟲細胞中表達食蟹猴P450 2B6蛋白。簡單來說，用 ±^構(gòu)建的pFB-cynoP2B6質(zhì)粒轉(zhuǎn)DH10Bac感受態(tài)細胞，PCR鑒定陽性克隆，從陽性克隆中提取重 組桿狀病毒，用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染sf-9昆蟲細胞獲得重組病毒，在多次反復(fù)感染后獲得高滴 度的病毒，病毒感染的sf-9細胞即能表達食蟹猴P450 2B6蛋白。圖3是重組食蟹猴P450 2B6桿 狀病毒的PCR鑒定結(jié)果圖，Lane 1: Marker DL15000(由上至下條帶的大小依次為15000bp， 10000bp， 7500bp， 5000bp, 2500bp, 1000bp， 250bp); Lane 2-4: 3個轉(zhuǎn)化單菌落的PCR結(jié)果，條帶的大小 約為4000bp。實施例3.食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因的克隆根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因序列(Genebank， Accession NO.:NM_000941)，設(shè)計如下引物(引物5和弓嫩6): 引物5: 5， - ATGATCAACATGGGAGACTCCC -3， 引物6: 5， - CTAGCTCCACACGTCCAGGG -3，以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹MRNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從擴增食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因的編碼區(qū)序列。將得到的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接得到 pT-cynoP0R質(zhì)粒。經(jīng)測序，得到的編碼區(qū)序列全長2034個 對，編碼677個氨基酸。圖4是 食蟹猴P450氧化還原酶的RT-PCR結(jié)果圖，Lane 1: Marker DL2000 (由上至下條帶大小分別為； 2000bp， 1000bp, 750bp， 500bp， 200bp， 100bp); Lane 2: RT-PCR擴增產(chǎn)物，條帶的大小約為 2扁bp。實施例4.共表達食蟹猴P450 2B6及其NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的表達系統(tǒng)的構(gòu)建以上述克隆的食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因為模板，設(shè)計包含Bbsl及Nsi I限制性 內(nèi)切酶位點的引物(引物7和引物8):引物7: 5， - GMGACTTGATCATGATCAACATGGGAGACTC-3，引物8: 5， -TTATGCATCTAGCTCCACACGTCCAG-3,PCR擴增食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因的編碼區(qū)序列并定向插入昆蟲表達載體 pFastBacDual的Bbsl及NsiI酶切位點之間，得到pFB-Du-0R重組質(zhì)粒。然后，將pFB-cynoP2B6 載體的RsrII及HindIII酶切片段定向插入昆蟲表達載體pFastBac Dual的RsrII及HindIII位 點，得至!jpFB-DU-cynoP2B6-0R載體。按照Bac-to-BEic Baculovirus Expression System Instruction Manual操作，獲得能感染昆蟲細胞的病毒。圖5是pFB-DU-cynoP2B6-OR重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié) 果圖，Lanel: pFB-DU-cynoP2B6-OR重組質(zhì)粒經(jīng)BbsI， Nsil雙酶切產(chǎn)物；Lane 2: Marker DL2000; Lane 3: pFB-DlhcynoP2B6-OR重組質(zhì)粒經(jīng)RsrII， Hindlll雙酶切產(chǎn)物。圖6是pFB-DU-cynoP2B6-OR 重組bacmid的PCR鑒定結(jié)果圖，Lane 1-4: 4個pFB-DU-cynoP2B6-OR重組bacmid的PCR結(jié)果； 條帶大小為6000bp， Lane 2: Marker DL15000,由上至下條帶大小分別為(由上至下條帶的大小 依次為15000bp， lOOOObp， 7500bp， 5000bp, 2500bp， lOOObp， 250bp)。實施例5. sf-9昆蟲細胞重組皿的食蟹猴P450 2B6的代謝鹽酸丁氨苯丙酮活性測定用制備的含有食蟹猴P450 2B6基因(cjT 2B6)的桿狀病毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培養(yǎng)到指數(shù)期的sf-9細胞，并在感染后2-3日收集細胞；以磷酸鹽緩沖液將收集的sf-9 細胞勻漿；以差速離心法離心制備微粒體；以磷酸鹽緩沖液S^懸微粒,淀，用BCA法測定蛋白 含量，用一氧化碳結(jié)合法測定P450含量；將上述微粒與系列稀釋的鹽酸丁氨苯丙酮混合物置于反 應(yīng)管中，同時加入相應(yīng)量的NADPH-細胞色素P450氧化還原酶，水浴。力卩40pL10mMNADPH 溶液啟動反應(yīng)。8辦中反應(yīng)后加0.8 mL含內(nèi)標的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水上述各 反應(yīng)管離心，取上清加入到96孔feit樣板，^S用HPLC和LC-MS測定代謝物的生成或減少， ^il實驗方法，定量分析和數(shù)據(jù)處理，計算得到昆蟲細胞重組表達的，猴P450 2B6代謝鹽酸丁 氨苯丙酮的活性，使其酶活指標Km和Vmax值處于理想范圍，通過，猴P450 2B6有效的代謝 鹽酸丁氨苯丙酮可以產(chǎn)生羥基化丁氨苯丙酮。具體方法底物濃度鹽酸丁氨苯丙酮100 nM, 反應(yīng)條件37°C， lOrain;色i普柱Zorbax SB~C18 (2.1 mm ID X100 mm， 3. 5-Micro);流動相 A組成為CHaOH/ftOdO: 90， v/v，含0.1%HC00H)， B組成為CH3OH/UO(9O: 10， v/v，含0.1%HC00H); 梯度(min， B%): 0， 30%— 0.2， 30%— 1.6, 95%— 2.6, 95%— 2.8， 30%— 4.0, 30%; 釆用TurboIonSpray離子源，在正離子檢測方式下，選擇MRM工作方式進行二級質(zhì)譜分析。 實施例6.化，體外抑制sf-9昆蟲細胞重組表達的賴猴P450 2B6的活性測定 如實施方案5中制備sf-9昆蟲細胞重組表達的#||猴P450 2B6的微粒體；4微粒體與固定濃度的鹽酸丁氨苯丙酮以及系列稀釋的待測化合物的混合物置于反應(yīng)管中，同時加入相應(yīng)量的 NADPH-細胞色素P450氧化還原酶，水浴。加40^iL lOmMNADPH溶液啟動反應(yīng)。8射中反應(yīng) 后加O.SmL含內(nèi)標的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水；上述各反應(yīng)管離心，取上清加入到 96孔腿樣板，g^t用HPLC和LC-MS觀啶代謝物的頓或減少，粒實驗方法，定量分析 和數(shù)據(jù)處理，ffl3i化合物體外抑制實驗，測得化合物體外抑制有效的抑制了食蟹猴P450 2B6的活 性。實施例7. sf-9昆蟲細胞重組共表達的食蟹猴P450 2B6和NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的代謝鹽酸丁氨苯丙酮活性測定用制備的含有食蟹猴P450 2B6(cyP 2B6)基因和NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的桿狀病 毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培養(yǎng)到指數(shù)期的sf-9細胞，并在感染后2-3日 收集細胞；以磷酸鹽緩沖液將收集的sf-9細胞勻漿；以差速離心法離心制織粒體；以磷酸鹽緩 沖液重懸微粒,淀，用BCA法測定蛋白含量，用一氧化碳結(jié)合法測定P450含量；將上述微粒與 系列稀釋的鹽酸丁氨苯丙酮混合物置于反應(yīng)管中，7K浴。加40pL10mMNADPH溶液啟動反應(yīng)。 8辦中反應(yīng)后加0.8 mL含內(nèi)標的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，混勻后置于冰水；上述各反應(yīng)管離心，取 上清加入到96孑L豐腿樣板，齢運用HPLC和LC-MS測定代謝物的生成或減少，粒實驗》法， 定量分析和數(shù)據(jù)處理，計算得到昆蟲細胞重組共表達的食蟹猴P450 2B6和NADPH-細胞色素P450 氧化還原酶代謝鹽酸丁氨苯丙酮的話性，使其酶活指標Km和Vmax值處于理想范圍，fflii昆蟲 細胞重組共表達的，猴P450 2B6和NADPH-細胞色素P450氧^S原酶有效的代謝鹽酸丁氨苯丙 酮可以產(chǎn)生羥基化丁氨苯丙酮。實施例8.化合物體外抑制sf-9昆蟲細胞重組共表達的食蟹猴P450 2B6和NADPH-細胞色素 P450氧化還原酶的活性測定。如實施例7中制備sf-9昆蟲細胞重組表達的 猴P450 2B6的微 粒體；將微粒體與固定濃度的鹽酸丁氨苯丙酮以及系列稀釋的待測化合物的混合物置于反應(yīng)管中， 水浴。加40 pL 10 mMNADPH溶液啟動反應(yīng)。8射中反應(yīng)后加0.8mL含內(nèi)標的反應(yīng)終止液終止反 應(yīng)，混勻后置于冰水；戰(zhàn)各反應(yīng)管離心，取上清加入到96 L板進樣板，進行LC/MS/MS定量分 析和 處理，通過化合物體夕W制實驗，測得化合物體外抑制有效的抑制了食蟹猴P450 2B6的 活性。實施例9.鹽酸丁氨苯丙酮的，猴P450 2B6代謝物的大量制備用制備的同時含有，猴P450 2B6 2B6)及其氧化還原酶基因的桿狀病毒以M0I=3感染培 養(yǎng)到指數(shù)期的sf-9細胞；在感染3天后，將溶解的鹽酸丁氨苯丙酮加入感染的細胞中；在加入鹽 酸丁氨苯丙酮2-3天后，離心，棄去細胞碎處，保留上清；用制備HPLC純化鹽酸丁氨苯丙酮被 食蟹猴P450 2B6代謝的主要產(chǎn)物羥基化丁氨苯丙酮(Hydroxybupropion)。〈110〉中科院廣州生物醫(yī)藥與健Jg 開究院 〈120〉 "tM猴的P450 2B6藥物代謝酶 <130> 1 <160> 1<170> Patentln version 3.2 <210> 1 〈211〉 1482 〈212>薩〈213> ^frM猴Macaca fascicularis < 1atggaactca gcgtcctcct cttccttgca ctccttacag gtctcctgct actcctggtt 60 cagcgccacc ctaatgccca cggccgcctc ccaccaggtc cccgccctct gccccttttg 120 gggaaccttc tgcagatgga cagaagaggc ctactcagat cctttctgag gttccgagag 180 aaatatgggg acgtcttcac agtatacctg ggaccg郷c ccgtggtcat gctgtgtgga 240 gtagaggcca tacgggaggc cctggtggac aacgctgagg ccttctctgg ccggggaaaa 300 atcgccatca ctgacccagt attccaggga tatggcgttg tctttgccaa tggaaaccgc 360 tggaaggtgc ttcggcgatt ctctctgacc accatgaggg actttgggat gggaaagcgg 420 agtgtggagg agcggattca ggaggaggct cagtgtctga tagaggagct tcggaaatcc 480 aagggagccc tcgtggaccc caccttcctc ttccattcca ttaccgccaa catcatctgc 540 tccatcgtct ttggaaaacg cttccactac caagatcaag agttcctgaa gatactgaac 600<formula>formula see original document page 11</formula>SEQ ID N0:2〈110〉中科KT州生物醫(yī)藥與M^研究院 〈120〉，猴的P450氧itaS原酶 〈130〉 1 〈160〉 11482<170〉Patentln version 3. 2<210〉<211〉2034<212〉脆〈213>猴Macaca fascicularis<400〉atgggagact cccacgtgga caccagctcc accgtgtccg aggcggtggc cgaagaagta tctcttttca gcatgacgga cgtgattctg ttttcagtca tcgtgggcct cctaacctac tggttcctct ttagaaagaa aaaagaagaa gtccctgagt tcaccaaaat tcagacattg accagctctg tcagagagag cggcUcgtg gaaaagatga agaaaacggg 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ggggccatgg agcacgccca ggccgtggac 1980tatgtcaaga agctgatgac caagggccgc tactccctgg acgtgtggag ctag 203權(quán)利要求
1. 一種食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶，能催化鹽酸丁氨苯丙酮的羥基化與3-甲基苯乙妥因的N端脫甲基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶，其特征在于，所述食蟹猴的P450 2B6 藥物代謝酶的基因序列或其互補序列是與SEQ ID NO: 1的突變率為0-1%的序列。
3. —種食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶與食蟹猴的P450氧化還原酶的共表達重組載體，其特 征在于，含有權(quán)利要求2所述的，猴的P450 2B6藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹猴的P450 氧化還原酶序列的開放閱讀框。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述食蟹猴的P450氧化還原酶的序列或 其互補序列如SEQ ID NO: 2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，還含有桿狀病毒基因，能感染包括sf-9 在內(nèi)的昆蟲細胞，被感染的昆蟲細胞至少能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上異源表達權(quán)利要求1所述的食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食蟹猴P450 2B6藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達重組載體。食蟹猴P450 2B6藥物代謝酶能催化鹽酸丁氨苯丙酮的羥基化與3-甲基苯乙妥因的N端脫甲基，其基因序列或其互補序列是與SEQ ID NO1的突變率為0-1％的序列。食蟹猴P450 2B6藥物代謝酶與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達重組載體包含食蟹猴的P450 2B6藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹猴的P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。食蟹猴的P450氧化還原酶的序列或其互補序列如SEQ ID NO2。本發(fā)明異源表達的蛋白僅代表食蟹猴P450 2B6亞型，其系統(tǒng)更接近于食蟹猴體內(nèi)代謝的真實情況。
文檔編號C12N15/62GK101250506SQ200810027058
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者佘妙琴, 戴仁科, 溫鼎聲, 王海濤, 楊 白 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院