專利名稱：：一種鏈霉菌及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種新型,微生物及其用途和應用，尤其涉及一種鏈霉菌及其在制備他克莫司中的應用。
背景技術(shù)：
：免疫抑制劑在器官移植中用于防治排斥反應，即干擾受體對外來抗原的識別和非自身細胞的清除。1954年，人類第一例同卵雙生子間腎臟移植的手術(shù)取得成功以后，至今40多年來醫(yī)學科學在器官移植方面的研究有了很多重大的突破。1978年環(huán)孢菌素A(cyclosporineA)的臨床使用為器官移植開辟了新紀元。大多數(shù)患者腎移植2年存活率已超過80%，而患者生存率也有所提高。他克莫司(Tacrolimus,又名為FK506)是鏈霉菌屬產(chǎn)生的具有高度免疫抑制作用的生物活性物質(zhì)。他克莫司體外試驗中抑制T細胞依賴性抗體產(chǎn)生、移植物抗宿主反應和遲發(fā)型過敏反應的作用比環(huán)孢菌素A強10倍以上，且在抑制T細胞增殖時不改變單核吞噬細胞的功能。體內(nèi)試驗表明與環(huán)孢菌素A相比，他克莫司的急性排異率較低，腎移植物的半衰期較長，病人較少用激素、降壓藥和降膽固醇藥，且無環(huán)孢菌素A的諸如多毛癥、齒齦增生等副作用。因此，他克莫司是一種新型、高效的免疫抑制劑，可用于治療器官移植產(chǎn)生的抗排斥反應，還可用于治療因自身免疫系統(tǒng)問題而產(chǎn)生的特應性皮炎。他克莫司為胞內(nèi)產(chǎn)物，發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲體后經(jīng)乙醇提取并經(jīng)濃縮后，再通過一系列純化工藝如萃取、層析、脫色、結(jié)晶和重結(jié)晶等可最終獲得他克莫司。一般的他克莫司產(chǎn)生菌，發(fā)酵單位很低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，導致后提取工作較為復雜。Okuhara等人發(fā)表的專利USP4894366中提到他克莫司的提取和純化過程，StreptomycestsukubaensisNo.9993菌株的發(fā)酵液經(jīng)過濾得菌渣，菌渣用丙酮提取，提取液經(jīng)過HP20樹脂吸附和解吸，解吸液濃縮，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮后得油狀粗品，然后經(jīng)過多次的特殊硅膠層析法來進行純化，最后在乙腈中進行結(jié)晶和重結(jié)晶得到他克莫司，整個提取純化過程十分復雜，尤其是要多次經(jīng)過用特殊型硅膠進行層析，在生產(chǎn)上操作困難，溶媒耗量和能耗較高，而成品收率較低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種高單位的他克莫司產(chǎn)生菌。本發(fā)明的另一個目的是提供該菌種在制備他克莫司中的應用。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的一種鏈霉菌YN06-1593,分類命名為S的;^o/^ce:y印.YN06-1593，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCCNO.M207201，保藏日期為2007年12月14曰。所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株是從云南屏邊大圍山篩選得到的。所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株的菌落特征基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，菌絲細長分枝，無橫隔，不斷裂，直徑為0.5~0.8pm;氣生菌絲生長良好，直型，培養(yǎng)時間長，氣生菌絲就分裂成孢子鏈，有孢子脫落，孢子呈橢圓形或圓柱形，0.5~0.8x0.8~Upm,孢子表面光滑。根據(jù)微生物形態(tài)學及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，該保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株應屬于鏈霉菌屬，定名為5^eptow少cMYN06-1593。所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株可應用于發(fā)酵制備他克莫司。該制備方法包括下列步驟a.發(fā)酵菌株采用保藏編號為CCTCCNO.M207201的菌株；b.按常規(guī)方法制備的菌株孢子懸液按搖瓶種子培養(yǎng)基體積的0.3~1.2%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，180~250rpm，培養(yǎng)45~48小時，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1~0.2%的接種量接種于種子罐，180250rpm，發(fā)酵培養(yǎng)2428h，得罐種子；將罐種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5~15%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，120200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)120-144小時，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為2632'C。其中所述的搖瓶培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源l~4g，氮源25g，無機鹽00.5g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源l~3g，氮源l~3g，無機鹽0.10.5g，其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源38g，氮源l4g，無機鹽0.1lg，氨基酸0~0.5g，其余為水。其中所述的培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例，優(yōu)選為搖瓶培養(yǎng)基各組分的比例為每100ml培養(yǎng)基中碳源1.5~2.5g，氮源3~4g，無機鹽0~0.3g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分的比例為每100ml培養(yǎng)基中碳源22.5g，氮源1.52.5g，無機鹽0.3~0.5g，其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的比例為每100ml培養(yǎng)基中碳源4~6g，氮源1.5~3g，無機鹽0.3~0.8g，氨基酸00.4g，其余為水。其中所述的碳源選自面粉、淀粉、淀粉水解物、糊精、甘油、葡萄糖、麥芽糖、土豆汁、麥芽汁、豆汁、土豆浸出粉、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、蛋白胨、魚胨、蠶蛹水解液、尿素、硫酸銨、酵母粉、酵母浸出物、黃豆粉、棉子粉、氨水、蠶蛹粉、硝酸鹽中的幾種,，無機鹽為氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈣中的一種或幾種；氨基酸為L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一種或幾種。其中所述的培養(yǎng)基優(yōu)選為碳源為淀粉、糊精、甘油、麥芽糖中的一種或幾種；氮源為黃豆粉、玉米漿、酵母粉、蠶蛹粉中的一種或幾種；無機鹽為氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀中的一種或幾種；氨基酸為L-賴氨酸、L-異亮氨酸中的一種或幾種。本發(fā)明所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株是目前分離到的一種天然高單位的他克莫司產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵過程是他克莫司生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)，本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過搖瓶和10噸發(fā)酵罐中進行試驗，其生產(chǎn)能力穩(wěn)定。經(jīng)檢測，用本發(fā)明提供的菌種及發(fā)酵培養(yǎng)方法制備的他克莫司單位可高達50(^g/ml左右或以上，從而為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎。同時本發(fā)明的發(fā)酵副產(chǎn)物相對較少，并降低了后提取的難度，在應用于工業(yè)化生產(chǎn)上具有優(yōu)勢。菌株保藏情況保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO.M207201,分類命名為鏈霉菌YN06-1593(5Yr印t咖yces印.YN06-1593)。保藏日期為2007年12月14曰。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術(shù)參數(shù)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1:保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株的培養(yǎng)特征將保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株接種于高氏一號、葡萄糖天門冬素等用于觀察形態(tài)特征的培養(yǎng)基。28t:培養(yǎng)一定的時間5、7、10天，觀察并進行描述。保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株在各種培養(yǎng)基上的菌落特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:生理生化特征生理生化性質(zhì)采用鏈霉菌分類中的標準方法。保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株的生理生化反應為在明膠培養(yǎng)基上能液化明膠，胨化牛奶，不能凝固牛奶，淀粉水解陰性，不利用纖維素，硝酸鹽還原陰性。實施例3:碳源利用采用國際鏈霉菌計劃(ISP)所推薦的方法，碳源利用實驗以ISP9為基礎培養(yǎng)基，28'C培養(yǎng)3~7天，觀察菌株對各種所試的碳源的利用情況。保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株生長時，能很好利用甘油、麥芽糖，不利用木糖、果糖、鼠李糖、蔗糖、棉籽糖、肌糖醇、山梨醇、阿拉伯糖。實施例4:發(fā)酵培養(yǎng)制備他克莫司采用保藏編號為CCTCCNO.M207201的菌株1.種子菌種培養(yǎng)及保存固體培養(yǎng)基淀粉10g，燕麥粉20g,瓊脂15g，加水至1000ml，pH自然。固體培養(yǎng)菌株接種于固體培養(yǎng)基斜面上，28'C培養(yǎng)7-10天。孢子懸液的制備在無菌狀態(tài)下，將滅菌好的20%(v/v)甘油水溶液加入生長好的斜面，用刮刀輕輕將孢子刮下，制成孢子懸浮液，然后分裝至小試管中(5ml/支)，制備好的放置-2(TC冷藏備用。2.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基麥芽糖5g可溶性淀粉20g黃豆粉20gCaC032g加水至1000ml,pH自然。裝量500ml三角瓶裝100ml培養(yǎng)基接種量0.5。/。(V/V)的孢子懸液培養(yǎng)溫度26°C培養(yǎng)時間45h搖床轉(zhuǎn)速220rpm3.種子罐種子培養(yǎng)基培養(yǎng)基麥芽糖5kg糊精7.5kg酵母粉7.5kg玉米漿2.5kgKH2P041.5kg加水至500L，調(diào)pH6.5，12rC滅菌30min。接種量1L搖瓶種子液工藝控制罐壓0.04~0.05MPa攪拌速度250rpm通氣量1:0.5(V/V)溫度28°C周期28h4.發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基按5000L培養(yǎng)基計糊精150kg酵母粉25kg蠶蛹粉75kg黃豆粉100kgKH2P0415kg裝量在10000L發(fā)酵罐內(nèi)裝入上述培養(yǎng)基和水約4800L,調(diào)pH6.4~6.6，滅菌后補水至5000L。接種量接入500L的種子液。工藝控制罐壓0.02~0.03MPa攪拌速度120rpm通氣量1:1.5(V/V)溫度28°C周期140小時按照上述發(fā)酵條件和工藝，在10噸發(fā)酵罐進行3批發(fā)酵試驗，發(fā)酵單位分別為48(Vg/ml、550(ag/ml禾口520|ig/ml。發(fā)酵液過濾取菌體，經(jīng)乙醇提取并濃縮后，通過大孔吸附樹脂(如HP-20、XAD1600、X-5等)吸附并解吸，解吸液經(jīng)濃縮和離心即得到固體狀粗品，然后再經(jīng)過l次或兩次的層析進行純化，并在乙醇中結(jié)晶最終可獲得他克莫司。與Okuham等人的專利USP4894366中8提到的純化工藝相比，本發(fā)明所述的菌株由于發(fā)酵單位高，提取和純化的工藝相對簡單，在工業(yè)化生產(chǎn)上更具優(yōu)勢。實施例5:發(fā)酵培養(yǎng)制備他克莫司采用保藏編號為CCTCCNO.M207201的菌株搖瓶種子培養(yǎng)每100ml培養(yǎng)基中含淀粉1.5g，黃豆粉3.0g，麥芽糖0.5g，其余為水，調(diào)pH6.8。接入1.2。/。(V/V)的孢子懸浮液，180rpm，28。C培養(yǎng)48h得種子液。種子罐培養(yǎng)每100ml培養(yǎng)基中含糊精2.5g，蠶蛹粉2.0g，酵母粉0.5g，KH2P040.4g，其余為水，調(diào)pH6.5。種子接種量0.r^(V/V)，220rpm，32'C培養(yǎng)24小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)每100ml培養(yǎng)基中含糊精6.0g，玉米漿0.5g，蠶蛹粉0.5g，酵母粉0.5g，KH2P040.5g，L-異亮氨酸0.02g，其余為水，調(diào)pH6.5。種子接種量15%(V/V)，180rpm，32'C培養(yǎng)140小時。放罐所得發(fā)酵液效價為520ug/ml。實施例6:發(fā)酵培養(yǎng)制備他克莫司采用保藏編號為CCTCCNO.M207201的菌株搖瓶種子培養(yǎng)每100ml培養(yǎng)基中含淀粉l.Og，麥芽糖0.5g，黃豆粉4.0g,其余為水，調(diào)pH6.5。接入0.3。/。(V/V)的孢子懸浮液，250rpm，28。C培養(yǎng)46h得種子液。種子罐培養(yǎng)每100ml培養(yǎng)基中含淀粉2,0g，黃豆粉l.Og，酵母粉1.5g，KH2P040.2g，KC10.3g，其余為水，調(diào)pH6.5。種子接種量0.2。/。(V/V)，180rpm，30。C培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)每100ml培養(yǎng)基中含糊精3.5g，麥芽糖0.5g，玉米漿2.0g，蠶蛹粉0.5g，酵母粉0.5g，KH2P040.3g，MgS04'7H200.05g，L-異亮氨酸0.01g，L-賴氨酸O.Olg，其余為水，調(diào)pH6.5。種子接種量10%(V/V)，200rpm，30。C培養(yǎng)120小時。放罐所得發(fā)酵液效價為550ug/ml。權(quán)利要求1.一種鏈霉菌YN06-1593(Streptomycessp.YN06-1593)，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO.M207201，保藏日期為2007年12月14日。2.如權(quán)利要求1所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株在發(fā)酵制備他克莫司中的應用。3.如權(quán)利要求2所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株在發(fā)酵制備他克莫司中的應用，其特征在于該制備方法包括下列步驟a.發(fā)酵菌株采用保藏編號為CCTCCNO.M207201的菌株；b.按常規(guī)方法制備的菌株孢子懸液按搖瓶種子培養(yǎng)基體積的0.31.2%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，180250rpm,培養(yǎng)4548小時，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1~0.2°/。的接種量接種于種子罐，180~250ipm，發(fā)酵培養(yǎng)24~28h，得罐種子液；將罐種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5~15%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，120200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)120-144小時，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為26-32'C。4.如權(quán)利要求書3所述的鏈霉菌云南變種在發(fā)酵制備他克莫司中的應用，其特征是，所述的搖瓶培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源卜4g，氮源25g，無機鹽00.5g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源l3g，氮源l3g，無機鹽0.10.5g，其余為水；發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源38g，氮源l4g，無機鹽0.1lg,氨基酸00.5g,其余為水。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的保藏號為CCTCCNO.M207201的菌株在發(fā)酵制備他克莫司中的應用，其特征為培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例，搖瓶培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源1.52.5g，氮源34g,無機鹽00.3g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源2~2.5g，氮源L52.5g，無機鹽0.30.5g，其余為水；發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基'中，碳源46g，氮源L53g,無機鹽0.3^0.8g，氨基酸00.4g，其余為水。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征是所述的碳源選自面粉、淀粉、淀粉水解物、糊精、甘油、葡萄糖、麥芽糖、土豆汁、麥芽汁、豆汁、土豆浸出粉、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、蛋白胨、魚胨、蠶蛹水解液、尿素、硫酸銨、酵母粉、酵母浸出物、黃豆粉、棉子粉、氨水、蠶蛹粉、硝酸鹽中的幾種，無機鹽為氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈣中的一種或幾種；氨基酸為L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一種或幾種。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是所述的碳源為淀粉、糊精、甘油、麥芽糖中的一種或幾種；氮源為黃豆粉、玉米漿、酵母粉、蠶蛹粉中的一種或幾種；無機鹽為氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀中的一種或幾種氨基酸為L-賴氨酸、L-異亮氨酸中的一種或幾種。全文摘要本發(fā)明公開了一種鏈霉菌及其應用，該菌株由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNo.M207201，保藏日期為2007年12月14日。本發(fā)明還公開了一種用此菌株發(fā)酵制備他克莫司的方法。本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過搖瓶和10噸發(fā)酵罐中進行試驗，其生產(chǎn)能力穩(wěn)，發(fā)酵單位高且發(fā)酵副產(chǎn)物相對較少，并降低了后提取的難度，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)。文檔編號C12N1/20GK101481662SQ20081001900公開日2009年7月15日申請日期2008年1月8日優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日發(fā)明者健朱,許永峰,謝祥茂,陳俊勇,陳曉霞申請人:杭州華東醫(yī)藥集團生物工程研究所有限公司