專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種發(fā)酵法從造紙黑液中提純木質(zhì)素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及造紙廢水的處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是利用微生物進(jìn)行厭氧或好氧發(fā)酵的工藝處理技術(shù)。同時(shí)也涉及到提取一種天然高分子化合物一木質(zhì)素的方法。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)素是自然界合成量及存在量?jī)H次于纖維素的天然高分子化合物。木質(zhì)素與纖維素及半纖維素一起構(gòu)成植物的主體，是地球上最豐富的可再生有機(jī)資源。每年地球上最的植物通過(guò)光合作用和生化作用可再生木質(zhì)素200億噸以上，是人類(lèi)可以依存的最大量資源。尤其是隨著石油資源日益枯竭，開(kāi)發(fā)利用新的資源-木質(zhì)素尤為重要。造紙?jiān)纤玫慕斩?，均含有纖維素、木質(zhì)素和半纖維素(聚糖類(lèi))三部分，造紙僅取用其中的纖維素(約占40%)，而其中約占25%的木質(zhì)素以及半纖維素、木糖、鉀、氮、磷等物，則隨黑液廢棄，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。而且，目前國(guó)內(nèi)外是把堿回收法作為草漿造紙黑液處理的有效方法。從資源衡算角度看，堿回收工程是把黑液中大量具有高附加值的木質(zhì)素等多種生物資源一炬化為烏有,間接地?fù)Q取生產(chǎn)所需的單一蒸煮堿,從生態(tài)工程角度看,這并不是一種最佳的循環(huán)經(jīng)濟(jì)技術(shù),仍存在多級(jí)生物資源利用不充分的問(wèn)題。因此，在造紙行業(yè)中分離木質(zhì)素并對(duì)之加以應(yīng)用，不僅可以降低生產(chǎn)成本、回收有用資源，還能減少或消除黑液對(duì)環(huán)境的污染，但目前尚無(wú)達(dá)到此目的有效方法報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用發(fā)酵法從造紙黑液中提純木質(zhì)素，其目的是除去木質(zhì)素絮凝沉降時(shí)隨著絮體顆粒的增大所夾帶的糖和上清液中所存在的糖，提高木質(zhì)素的純度，而且隨著糖的消耗降低了液體的粘度，更有利于后期木質(zhì)素的分離。具體操作方法如下第一步、培養(yǎng)基的制備。斜面培養(yǎng)基，質(zhì)量組成為葡萄糖lg，酵母膏l(xiāng)g，碳酸鈣1.5g，瓊脂2.0g,水100ml。種子培養(yǎng)基，質(zhì)量組成為葡萄糖2g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨2g，水100ml，121。C高壓蒸汽滅菌2030min。發(fā)酵培養(yǎng)基:造紙黑液(pH值11.5)，鹽酸調(diào)試pH值為5.4，100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中殺菌。121。C高壓蒸汽滅菌2030min。第二步、活化菌種。在無(wú)菌的條件下，將實(shí)驗(yàn)室用酒精酵母(5^cc/^畫(huà)vs接種于斜面培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)35天，然后放入冰箱保存。留做一級(jí)種子。第三步、二級(jí)種子培養(yǎng)。將一級(jí)種子，直接種于二級(jí)液體種子培養(yǎng)基，于30'C下，搖床培養(yǎng)24小時(shí)。第四步、發(fā)酵培養(yǎng)。用250ml三角瓶，每瓶加100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，而且加0.1%的酶，每瓶接種10%二級(jí)種子培養(yǎng)液。其中所述的酶為工業(yè)中使用較為普及而常用的強(qiáng)效復(fù)合酶和果膠酶，其質(zhì)量比為1:1。發(fā)酵可以使用以下兩種方法中任一種方法1、厭氧發(fā)酵于30。C下，恒溫培養(yǎng)，每三天測(cè)定殘?zhí)恰?、通風(fēng)好氧發(fā)酵于3(TC下，搖床培養(yǎng)，每12小時(shí)測(cè)定殘?zhí)?。發(fā)酵液中的殘?zhí)呛坎辉侔l(fā)生變化時(shí)停止發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵液的酒精得率和發(fā)酵液的粘度。第五步、木質(zhì)素的分離。發(fā)酵液經(jīng)離心分離，沉淀木素殘?zhí)橇?.3%以下。本發(fā)明采用發(fā)酵法提取造紙黑液中的木質(zhì)素，并在造紙黒液中添加酶制劑來(lái)降解造紙黒液中的多糖，使其分解為酒精酵母可以生長(zhǎng)利用的單糖，，從而除去發(fā)酵液中的糖，提高木質(zhì)素的純度，而且隨著糖的消耗降低了液體的粘度，更有利于后期木質(zhì)素的分離。并且，酒精酵母在厭氧發(fā)酵時(shí)會(huì)有酒精產(chǎn)生，使造紙黒液中的多級(jí)生物資源得到充分的利用；而酒精酵母進(jìn)行好氧發(fā)酵可以很快的得到比較純的木質(zhì)素。本發(fā)明中所使用的菌種和酶制劑都是工業(yè)生產(chǎn)中較為普及而常用的?？傊?，本發(fā)明采用發(fā)酵法提取造紙黑液中的木質(zhì)素有著重要的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。本發(fā)明附圖1幅，即附圖1為葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法在530nm時(shí)進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的OD值得知樣品的總糖及還原糖含量。其中橫坐標(biāo)為OD值，縱坐標(biāo)為葡萄糖濃度g/L。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1.第一步、培養(yǎng)基的制備。斜面培養(yǎng)基葡萄糖lg，酵母膏l(xiāng)g，碳酸鈣1.5g，瓊脂2.0g，種子培養(yǎng)基葡萄糖2g，酵母膏l(xiāng)g,蛋白胨2g，水100ml,12rC高壓蒸汽滅菌2030min。發(fā)酵培養(yǎng)基:造紙黑液(PH值11.5),鹽酸調(diào)試PH值為5.4，100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中殺菌。121。C高壓蒸汽滅菌2030min。第二步、活化菌種。在無(wú)菌的條件下，將實(shí)驗(yàn)室用酒精酵母(&cc/z"國(guó)謂c^fle)接種于斜面培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)35天，然后放入冰箱保存。留做一級(jí)種子。第三步、二級(jí)種子培養(yǎng)。將一級(jí)種子，直接種于二級(jí)液體種子培養(yǎng)基，于3(TC下，搖床培養(yǎng)24小時(shí)。第四步、發(fā)酵培養(yǎng)。用250ml三角瓶，每瓶加100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，而且加0.1%的酶(發(fā)明中所使用的酶為工業(yè)中使用較為普及而常用的強(qiáng)效復(fù)合酶和果膠酶，其質(zhì)量比為1:1)，每瓶接種10%二級(jí)種子培養(yǎng)液，于30。C下，恒溫培養(yǎng)，每三天測(cè)定殘?zhí)恰０l(fā)酵液中的殘?zhí)呛坎辉侔l(fā)生變化時(shí)停止發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵液的酒精得率和發(fā)酵液的粘度。一、糖的測(cè)定1.樣品中還原糖的提取準(zhǔn)確稱(chēng)取10ml樣品，放入100ml燒杯中，加入85%乙醇50ml?；靹颍?0。C恒溫水浴中保溫30分鐘，過(guò)濾，濾渣再用85%乙醇提取二次。將濾液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水稀2.樣品中總糖的水解及提取準(zhǔn)確稱(chēng)取10ml樣品，放入100ml燒杯中，加入10ml6N鹽酸和15ml蒸餾水。混勻，在沸水浴中加熱半小時(shí)左右，使總糖水解完全。冷卻后加入酚酞指示劑，以10%氫氧化鈉中和至溶液呈微紅色。過(guò)濾并定容至100ml，再精確吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，稀釋到刻度，備用。采用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法在530nm時(shí)進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的OD值，利用圖l得知樣品的總糖及還原糖含量。表1原液中總糖和還原糖的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、粘度的測(cè)定使物體在流體中落下，越是粘度高的流體，物體在其中落下越慢，因此從落下速度可比較流體粘度的大小。假設(shè)直徑為d的小球在粘度為T(mén)！的相同物質(zhì)的流體中以一定速度1)運(yùn)動(dòng)，在滿足速度很小、球是剛性球等條件時(shí)，而且在考慮了管壁等因素的影響，最終可得到[d2(P。-p)gt]/(l81)}[1-2.104(d/D)+2.09(d/D)3]Tl—液體粘度，Pa.SPo—小球的密度，Kg/m3p—流體的密度，Kg/m3d—小球的直徑，mD—圓管的直徑，mt一小球在液體中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，s1—時(shí)間t內(nèi)小球落下的距離，m所以，只要測(cè)定一定距離的落下時(shí)間和試料密度就可以求粘度了。表4原液與厭氧發(fā)酵液的粘度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>第五步、木質(zhì)素的分離。發(fā)酵液經(jīng)離心分離，沉淀木質(zhì)素殘?zhí)橇?.3%以下。實(shí)施例2.第一步、培養(yǎng)基的制備。斜面培養(yǎng)基葡萄糖lg，酵母膏l(xiāng)g，碳酸鈣1.5g，瓊脂2.0g，種子培養(yǎng)基葡萄糖2g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨2g，水100ml，121。C高壓蒸汽滅菌2030min。發(fā)酵培養(yǎng)基:造紙黑液(PH值11.5)鹽酸調(diào)試PH值為5.4，100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中殺菌。121。C高壓蒸汽滅菌2030min。第二步、活化菌種。在無(wú)菌的條件下，將實(shí)驗(yàn)室用酒精酵母(&ccWom函cg簡(jiǎn)、/ag)接種于斜面培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)35天，然后放入冰箱保存。留做一級(jí)種子。第三步、二級(jí)種子培養(yǎng)。將一級(jí)種子，直接種于二級(jí)液體種子培養(yǎng)基，于3(TC下，搖床培養(yǎng)24小時(shí)。第四步、發(fā)酵培養(yǎng)。用250ml三角瓶，每瓶加100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，而且加O.lg的酶(發(fā)明中所使用的酶為工業(yè)中使用較為普及而常用的強(qiáng)效復(fù)合酶和果膠酶)，每瓶接種10%二級(jí)種子培養(yǎng)液，于3(TC下，搖床培養(yǎng)，每12小時(shí)測(cè)定殘?zhí)?。發(fā)酵液中的殘?zhí)呛坎辉侔l(fā)生變化時(shí)停止發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵液的粘度。一、糖的測(cè)定1、樣品中還原糖的提取準(zhǔn)確稱(chēng)取10ml樣品，放入100ml燒杯中，加入85。/。乙醇50ml?；靹颍?(TC恒溫水浴中保溫30分鐘，過(guò)濾，濾渣再用85%乙醇提取二次。將濾液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水稀釋到刻度，備用。2、樣品屮總糖的水解及提取準(zhǔn)確稱(chēng)取10ml樣品，放入100ml燒杯中，加入10ml6N鹽酸和15ml蒸餾水?；靹?，在沸水浴中加熱半小時(shí)左右，使總糖水解完全。冷卻后加入酚酞指示劑，以10%氫氧化鈉中和至溶液呈微紅色。過(guò)濾并定容至100ml，再精確吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，稀釋到刻度，備用。采用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法在530nm時(shí)進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的OD值，利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得知樣品的總糖及還原糖含量。表5好氧發(fā)酵的發(fā)酵液中的殘?zhí)堑暮?兩天)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、粘度的測(cè)定用實(shí)例1測(cè)粘度同樣方法測(cè)取黑液原液與好氧發(fā)酵液的粘度，結(jié)果如表6:表6原液與好氧發(fā)酵液的粘度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第五步、木質(zhì)素的分離。發(fā)酵液經(jīng)離心分離，沉淀木質(zhì)素殘?zhí)橇?.3%以下。權(quán)利要求1.一種發(fā)酵法從造紙黑液中提純木質(zhì)素的方法，按以下步驟進(jìn)行操作第一步、培養(yǎng)基的制備斜面培養(yǎng)基質(zhì)量組成為葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸鈣1.5g，瓊脂2.0g，加水100ml；種子培養(yǎng)基質(zhì)量組成為葡萄糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，水100ml，121℃高壓蒸汽滅菌20～30min；發(fā)酵培養(yǎng)基造紙黑液加鹽酸調(diào)試pH值為5.4，100ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶中121℃高壓蒸汽滅菌20～30min；第二步、活化菌種在無(wú)菌的條件下，將酒精酵母(Saccharomycescererisiae)接種于斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5天，然后放入冰箱保存，留做一級(jí)種子；第三步、二級(jí)種子培養(yǎng)將一級(jí)種子，直接種于二級(jí)液體種子培養(yǎng)基，于30℃下，搖床培養(yǎng)24小時(shí)；第四步、發(fā)酵培養(yǎng)用250ml三角瓶，每瓶加100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，而且加其質(zhì)量0.1％的酶，每瓶接種其質(zhì)量10％二級(jí)種子培養(yǎng)液；采用厭氧發(fā)酵方法于30℃下恒溫培養(yǎng)，每2～3天測(cè)定殘?zhí)?，發(fā)酵液中的殘?zhí)呛坎辉侔l(fā)生變化時(shí)為止；第五步、木質(zhì)素的分離；發(fā)酵液經(jīng)離心分離，沉淀木質(zhì)素殘?zhí)橇?.3％以下。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種發(fā)酵法從造紙黑液中提純木質(zhì)素的方法，其特征在于所述第四步的發(fā)酵培養(yǎng)中采用的是通風(fēng)好氧發(fā)酵，其發(fā)酵條件為于30°C下?lián)u床培養(yǎng)，每12小時(shí)測(cè)定殘?zhí)?，發(fā)酵液中的殘?zhí)呛坎辉侔l(fā)生變化時(shí)為止。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種發(fā)酵法從造紙黑液中提純木質(zhì)素的方法，其特征在于所述在發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)程中添加酶制劑為強(qiáng)效復(fù)合酶和果膠酶，其質(zhì)量比為l:1。全文摘要一種發(fā)酵法從造紙黑液中提純木質(zhì)素的方法，以酒精酵母為菌種通過(guò)活化菌種后經(jīng)一級(jí)、二級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵法，并且在發(fā)酵過(guò)程中添加酶制劑來(lái)降解造紙黑液中的多糖，使其分解為酒精酵母可以生長(zhǎng)利用的單糖，從而除去發(fā)酵液中的糖，提高木質(zhì)素的純度；而且隨著糖的消耗降低了液體的粘度，更有利于后期木質(zhì)素的分離。本發(fā)明中所使用的菌種和酶制劑都是工業(yè)生產(chǎn)中較為普及而常用的?？傊景l(fā)明采用發(fā)酵法提取造紙黑液中的木質(zhì)素有著重要的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。文檔編號(hào)C12R1/865GK101250568SQ20081001103公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者楊瑞豐,趙長(zhǎng)新申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)