專利名稱：：Pas激酶調(diào)控能量?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定的制作方法PAS激酶調(diào)控能量?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定相關(guān)申請(qǐng)的交互引用本申請(qǐng)要求2006年6月8日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/811,819的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)通過援引全文納入本申請(qǐng)。致謝本申請(qǐng)受到NIH基金ROlDK071962的政府支持。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：因?yàn)轱嬍澈蜕罘绞降淖兓?，肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)急劇增加。根據(jù)美國國立健康研究所，目前大約2/3的美國成年人是超重或肥胖的(Services2001)。2型糖尿病是當(dāng)胰腺p細(xì)胞不能分泌足夠的胰島素以補(bǔ)償外周的胰島素抗性時(shí)發(fā)生的，這是一種肥胖癥嚴(yán)重惡化的病癥(Rhodes2005,Lazar2005)。2型糖尿病現(xiàn)在纟皮廣泛看作是一種凈皮稱為代謝綜合征的更廣泛的基礎(chǔ)代謝疾病的表現(xiàn)，其特征在于高血糖、高胰島素血癥、血脂障礙、高血壓、內(nèi)臟型肥胖和心血管疾病(Zimmet2001)。世界衛(wèi)生組織估計(jì)這十年將見證糖尿病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)會(huì)增加46%(從1億5100萬增加到2億2100萬)，其中該增加的絕大多數(shù)都是由于與代謝綜合征相關(guān)的2型糖尿病所致。本領(lǐng)域需要調(diào)節(jié)PASK的方法和組合物。
發(fā)明內(nèi)容本文公開的是治療受試者中的胰島素抗性的方法，包括選擇需要胰島素抗性治療的受試者；并給予該受試者有效量的抑制PASK的組合物。本文公開了增加細(xì)胞中線粒體代謝的方法，包括抑制PASK，從而增加線粒體代謝。4本文還公開了篩選可調(diào)節(jié)PASK的測(cè)試化合物的方法，包括用測(cè)試化合物與PASK接觸；并檢測(cè)PASK與所述測(cè)試化合物的相互作用；其中所述測(cè)試化合物和PASK之間的相互作用標(biāo)示可調(diào)節(jié)PASK的化合物。本文公開了一種篩選可調(diào)節(jié)PASK的測(cè)試化合物的方法，包括用測(cè)試化合物與PASK缺失的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物接觸；并檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中PASK水平的差異；其中PASK水平的差異標(biāo)示可調(diào)節(jié)PASK的化合物。本文公開的是治療受試者體內(nèi)的癌癥的方法，包括選擇患有癌癥的受試者；并給予所述受試者有效量的抑制PASK的組合物；從而治療所述受試者體內(nèi)的癌癥。本文還公開了治療受試者體內(nèi)的I型糖尿病的方法，包括選擇患有I型糖尿病的受試者；并給予所述受試者有效量的抑制PASK的組合物；從而治療受試者體內(nèi)的I型糖尿病。本文還公開了治療受試者體內(nèi)的胰島素抗性的方法，包括選擇需要胰島素抗性治療的受試者；給予所述受試者一段編碼可抑制PASK的組合物的核酸。納入并成為本說明書一部分的附釋了若干實(shí)施方案并和描述一起闡釋了公開的組合物和方法。圖1顯示的是PASK-A小鼠中胰島素分泌和敏感度的分析結(jié)果。a.腹膜內(nèi)注射葡萄糖前后的血漿胰島素濃度(n=24只雄性小鼠，12周齡)，b.用3-30mM的葡萄糖濃度梯度的氣化Krebs緩沖液表面灌流15-17個(gè)經(jīng)分離的胰島40分鐘以上(n-4只雌性小鼠，16周齡)。曲線以下的面積野生型胰島的為1146±129,并且PASK-A胰島的為646±171。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩次，結(jié)果類似。*，P<0.05。c-f,腹膜內(nèi)注射葡萄糖(c，e)或胰島(d，f)前以及在所示時(shí)間點(diǎn)的血漿葡萄糖水平。數(shù)據(jù)代表每種基因型的12只雄性小鼠的平均值士平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.e.m.)，這些雄性小鼠要么喂以普通飲食(c，d),要么從12周開始喂以高脂飲食(e，f)。*,P<0.05，**，PO.Olo圖2顯示PASK-A小鼠得以避免患飲食導(dǎo)致的肥胖癥。a、b是喂以普通飲食(a)或高脂飲食(b)的野生型和PASK-A型小鼠的生長(zhǎng)曲線。數(shù)據(jù)代表每種基因型的12只雄性小鼠的平均值士s.e.m.，這些小鼠要么喂以NCD，要么從12周開始喂以HFD。*,P<0.05,**，P<0.01。c，禁食8h后喂以NCD和HFD的24周齡野生型和PASK一雄性小鼠的肝臟冰凍切片的代表性油紅O染色。油紅O對(duì)中性脂質(zhì)進(jìn)行染色。d是8小時(shí)禁食條件下喂以NCD和HFD的24周齡野生型和PASK-A型雄性小鼠的肝臟甘油三酯含量(11=每種基因型3-5只雄性小鼠)。圖3顯示iM^WT,小鼠在線粒體質(zhì)量沒有增加的情況下表現(xiàn)出代謝速率的增加。A，野生型和戶AWT〃小鼠的代謝室分析(i^3只雄性小鼠，24周齡)。VO尸02消耗量，VCO尸C02釋放量，激光束打斷是一種運(yùn)動(dòng)活性的度量。對(duì)每個(gè)參數(shù)，將野生型數(shù)值的平均值設(shè)定為100%。所示數(shù)據(jù)是在夜間測(cè)量的數(shù)值(6pm-6am)。野生型和iM5JT、鼠之間的日間值表現(xiàn)出相似差異。B，皂苷透化的比目魚肌纖維的最大ATP生成速率，是在lmM外源ADP和琥珀酸鹽存在的的情況下測(cè)量的(11=10只雄性小鼠，16周齡)。C,16周齡野生型和/M5X^雄性小鼠的比目魚肌的代表性電子顯微照片。所示電子顯微照片的放大倍數(shù)是8000倍。每種基因型取3只動(dòng)物，每只動(dòng)物取4個(gè)切片進(jìn)行檢查。D,從每種基因型的10張電子顯微照片中用人工數(shù)出的方式對(duì)線粒體數(shù)目的定量。所示數(shù)據(jù)是平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差，且被標(biāo)準(zhǔn)化為Z線值。E，野生型和iM5X〃小鼠的比目魚肌提取物中的檸檬酸合成酶活性(n=6只雄性小鼠，16周齡)。所示數(shù)據(jù)是平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。圖4示出AMPK表達(dá)和活性由PASK失活上調(diào)。a，取自喂以NCD的野生型和PASK^小鼠的肝臟中的AMPK、磷-AMPK(T172)、ACC(乙酰輔酶A羧化酶)和磷-ACC(S79)的蛋白水平。b,是喂以NCD的WT和PASK-、鼠的腓腸肌和比目魚肌中以及分離的胰島中的AMPK蛋白水平，c，培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞和大鼠L6肌細(xì)胞被腺病毒感染后24和48小時(shí)的AMPK蛋白水平，其中所述腺病毒可表達(dá)靶向PASK的小發(fā)夾RNA(shRNA)構(gòu)建體。UI-未感染細(xì)胞，Scr-亂序shRNA，#1=PASKshRNA-l，#2=PASKshRNA-2。d，喂以NCD或HFD的年齡匹配的野生型和PASK-A小鼠的腓腸肌中的AMPK蛋白水平。a-d的每個(gè)泳道都代表50jug蛋白樣品。圖5顯示喂以HFD的/M^W^-小鼠的肝臟中甘油三酯積聚的下降。A，喂以NCD和HFD的野生型和尸ASX^小鼠的肝臟提取物中磷-AMPK(Thr172)、磷-S6K(Thr389)和微管蛋白(作為上樣對(duì)照)水平的免疫印跡分析。每組顯示了兩只小鼠。還分析了總AMPK和S6K的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)各組相同。B,用qRT-PCR測(cè)量的喂以HFD的野生型和PASK小鼠的肝臟中SCD1、FAE、CD36、PPARy、CYP3A11和PXRmRNA的水平。所示數(shù)據(jù)是每組6只小鼠的平均值，野生型值設(shè)為1。RPL13A用作標(biāo)準(zhǔn)品。所有所示數(shù)據(jù)都是平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。圖6顯示了L6細(xì)胞中氧化代謝和細(xì)胞ATP含量在PASK沉默后增加。A，在不含多西環(huán)素的情況下表達(dá)亂序shRNA或PASKshRNA的L6克隆中的PASKmRNA水平。數(shù)據(jù)表示每組三個(gè)重復(fù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。B，從在"C-葡萄糖中培養(yǎng)的所示L6克隆中釋放的"C02的測(cè)量結(jié)果(11=3)。C,從在"C-棕櫚酸鹽(palmitate)中培養(yǎng)的L6克隆中釋放的"<:02的測(cè)量結(jié)果(11=3)。D,被標(biāo)準(zhǔn)化為提取物中蛋白質(zhì)的細(xì)胞ATP含量測(cè)量結(jié)果。圖7示出通過再飼喂在肝臟和H印G2細(xì)胞中誘導(dǎo)PASK表達(dá)。A，取自禁食19小時(shí)和禁食12小時(shí)/再祠喂7小時(shí)的小鼠的肝臟和脂肪組織中的PASK和SREBP-lcmRNA水平的qRT-PCR分析結(jié)果。數(shù)據(jù)表示每組6只小鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。B，HepG2細(xì)胞中hPASKmRNA水平的qRT-PCR分析結(jié)果。OGOS-缺少葡萄糖和血清的饑餓培養(yǎng)基，HG0S:含有30mM葡萄糖但無血清的再飼喂培養(yǎng)基，0GHS-含有15%血清但無葡萄糖的再飼喂培養(yǎng)基，HGHS-含有30mM葡萄糖和15%血清的再飼喂培養(yǎng)基。從已在0G0S饑餓培養(yǎng)基中挨餓培養(yǎng)了24小時(shí)、然后在所述四種指定條件下被刺激7小時(shí)的HepG2細(xì)胞中提取RNA。數(shù)據(jù)表示每組兩個(gè)重復(fù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。C，HepG2細(xì)胞中hPASK和微管蛋白水平的免疫印跡分析結(jié)果。對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行同樣的處理，除了在所示培養(yǎng)基中的時(shí)間增加至24小時(shí)。6孔板中的細(xì)胞在IXSDS-PAGE上樣緩沖液中直接裂解并進(jìn)行分析。圖8示出喂以HFD的尸AWT、鼠表現(xiàn)出降低的循環(huán)胰島素水平和肥胖。A，喂以HFD的24周齡野生型和iM5X^雄性小鼠禁食8小時(shí)的血漿胰島素水平的測(cè)量結(jié)果。數(shù)據(jù)表示每種基因型IO只小鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。B是用雙能X-線吸收儀(DEXA)測(cè)量的，喂以HFD的23周齡野生型和尸AW^-雄性小鼠的體脂肪質(zhì)量。數(shù)據(jù)表示每種基因型67只小鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差。具體實(shí)施例方式在本文化合物、組合物、物品、設(shè)備和/或方法被公開和描述之前，應(yīng)理解的是，除非另外指出，否則它們并不限于具體的合成方法和具體的重組生物技術(shù)方法，或特殊試劑，因?yàn)檫@些當(dāng)然可能有所變化。也應(yīng)理解本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施方案而不是為了作出限制。A.定義本說明書和所附權(quán)利要求所用的單數(shù)形式"a(—)"、"an(—個(gè))"和"the(該)"包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有清楚地說明相反。因此，比如"一個(gè)藥物載體，，應(yīng)包括兩個(gè)或更多個(gè)這種載體的混合物，等等。本文可用從"大約"一個(gè)具體值，和/或到"大約，，另一個(gè)具體值來表示范圍。當(dāng)表示了這樣一個(gè)范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從一個(gè)具體值和/或到另一個(gè)具體值。類似地，通過在前面使用"大約"來將數(shù)值表示為近似值時(shí)，應(yīng)理解成該具體數(shù)值可形成另一個(gè)實(shí)施方案。進(jìn)一步可理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)相關(guān)和獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。還應(yīng)當(dāng)理解的是本文公開了許多數(shù)值，且除了數(shù)值本身外每一個(gè)數(shù)值在此還以"大約"該具體數(shù)值公開。例如，如果公開了數(shù)值"10",那么也公開了"大約10"。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開了一個(gè)數(shù)值時(shí)，也公開了"小于或等于該數(shù)值"，"大于或等于該數(shù)值"以及數(shù)值間可能的范圍，這正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所恰當(dāng)理解的。例如，如果公開了數(shù)值"10"，也公開了"小于或等于IO"以及"大于或等于10"。還應(yīng)理解，在整個(gè)本申請(qǐng)中，以多種不同格式提供數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)代表了端點(diǎn)和起點(diǎn)，以及這些數(shù)據(jù)點(diǎn)任何組合的范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點(diǎn)"10"和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)15，應(yīng)該理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之間的數(shù)值也認(rèn)為已經(jīng)被公開。還應(yīng)理解的是兩個(gè)特定單元之間的每個(gè)單元也都被公開。例如，如果10和15被>^開了，那么11、12、13和14也都#/>開。在本說明書和其后的權(quán)利要求中，會(huì)提到被定義為具有如下含義的術(shù)語"任選的"或"任選地"是指后面描述的事件或情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，且所述描述包括所述事件或情況發(fā)生和不發(fā)生的情形。術(shù)語"多孔板，，是指位于一個(gè)基本平坦的表面上的可定位孔的兩維陣列。多孔板可包括任何數(shù)目離散的可定位孔，并包括任何寬度或深度的可定位孔。多孔板的常見實(shí)例包括96孔板、384孔板和3456孔NanoplatesTM。這些多孔板可由塑料、玻璃或任何基本不導(dǎo)電的材料制成。本文所用的術(shù)語"基因敲除"，是指已經(jīng)用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何轉(zhuǎn)基因技術(shù)完成的體內(nèi)基因的靶向破壞，使其完全喪失功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過靶向到有待通過同源重組來使其喪失功能的靶基因的插入物，已使得該基因喪失功能的那些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。術(shù)語"命中物"是指在測(cè)定中表現(xiàn)出所需特性的測(cè)試化合物。術(shù)語"重復(fù)的"是指重復(fù)至少2次。術(shù)語"測(cè)試化合物"是指用一種或多種本發(fā)明的篩選方法測(cè)試的，被推測(cè)為調(diào)節(jié)劑的化學(xué)制品。測(cè)試化合物可以是任一化學(xué)制品，如無機(jī)化學(xué)制品、有機(jī)化學(xué)制品、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或它們的組合。通常，測(cè)試化合物的多種預(yù)設(shè)濃度被用于篩選，如0.01微摩爾、1微摩爾和IO微摩爾。測(cè)試化合物對(duì)照可包括在測(cè)試化合物不存在的情況下對(duì)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，或與已知可調(diào)節(jié)靶標(biāo)的化合物進(jìn)行比較。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的"用于描述在其所有細(xì)胞內(nèi)包含外源遺傳物質(zhì)的生物體。該術(shù)語包括通過對(duì)早期胚胎或受精卵的體外操作或任何導(dǎo)致具體基因敲除的轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變了基因組的任何生物體。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"是指人工插入一個(gè)細(xì)胞并成為該細(xì)胞所發(fā)育成的生物體的基因組的一部分(穩(wěn)定整合或作為穩(wěn)定的染色體外元件)的任何一段DNA。這樣的轉(zhuǎn)基因包括與轉(zhuǎn)基因生物體部分或全部異源的基因，或代表與該生物體的內(nèi)源基因同源的基因。此定義還包括通過提供被轉(zhuǎn)錄成DNA然后整合入基因組的RNA序列所形成的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因包括編碼可在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中表達(dá)的熒光或生物發(fā)光蛋白的DNA序列。本文所用的術(shù)語"活性"是指分子相互作用的可測(cè)結(jié)果。本文提供了一些測(cè)量這些活性的示例性方法。本文所用的術(shù)語"調(diào)控"是指與合適的對(duì)照相比，一種化合物以某種可測(cè)量的方法改變活性的能力。測(cè)定中這些化合物的存在可使活性與無這些化合物存在的對(duì)照相比增加(如PASK或其下游基因/蛋白的水平增加)，或"降低，，(如PASK或其下游基因/蛋白的水平下降)。優(yōu)選地，活性比無該化合物存在的情況的活性水平至少增加25%,更優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選至少100%。類似地，活性比無該化合物存在的情況的活性水平至少降低25%，更優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選至少100%。增加已知活性的化合物是"激動(dòng)劑"。降低或阻止已知活性的是"拮抗劑"。本文所用的術(shù)語"監(jiān)測(cè)"是指本領(lǐng)域中可測(cè)活性的任何方法。本文所用的"提供"是指向本領(lǐng)域已知的某物添加化合物或分子的任何手段。提供的實(shí)例包括移液管、自動(dòng)移液器、注射器、針頭、管型材料、噴射器等的使用。這可以是手動(dòng)的或自動(dòng)的。它包括采用任何方法的轉(zhuǎn)染或任何其他向平皿、細(xì)胞、組織、無細(xì)胞系統(tǒng)提供核酸的方法，它可是體外或體內(nèi)的。本文所用的術(shù)語"防止"是指在疾病或病癥的臨床癥狀發(fā)作之前給予化合物以防止與該疾病或病癥有關(guān)的身體異常表現(xiàn)。本文所用的術(shù)語"治療，，是指在臨床癥狀發(fā)作之后給予化合物。本文所用的術(shù)語"需要治療"是指由護(hù)理者(例如，就人而言，指醫(yī)師、護(hù)士、正式護(hù)士或個(gè)體；就包括非人哺乳動(dòng)物在內(nèi)的動(dòng)物而言，指獸醫(yī))作出的個(gè)體或動(dòng)物需要治療或會(huì)從治療中獲益的判斷。這個(gè)判斷是基于護(hù)理者經(jīng)驗(yàn)范圍內(nèi)的若干因素作出的、但是所述因素包括個(gè)體或動(dòng)物由于可由本發(fā)明的化合物治療的病癥而生病或即將生病這一信息在內(nèi)。本文所用的術(shù)語"個(gè)體"是指哺乳動(dòng)物，包括動(dòng)物，優(yōu)選小鼠、大鼠、其他嚙齒動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長(zhǎng)類，最優(yōu)選人類。本文所用的術(shù)語"非人類動(dòng)物"是指任一非人類脊推動(dòng)物，鳥類并更通常指哺乳動(dòng)物(優(yōu)選靈長(zhǎng)類)、諸如豬、山羊、綿羊、驢、馬、貓、狗、兔或嚙齒動(dòng)物等的動(dòng)物(更優(yōu)選大鼠或小鼠)。術(shù)語"動(dòng)物"和"哺乳動(dòng)物"兩者明確地包括受試人，除非前面有術(shù)語"非人類"。術(shù)語"更高"、"增加"、"升高"或"提高"是例如與對(duì)照相比高于基礎(chǔ)水平的增加。術(shù)語"低"、"更低"、"降低，，或"減少"是例如與對(duì)照相比低于基礎(chǔ)水平的減少。在本申請(qǐng)中，參考了若干出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過援引全文納入本申請(qǐng)中，以更全面地描述本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域的技術(shù)狀況。就其中所包含的在該參考文獻(xiàn)所依據(jù)的句子中討論的內(nèi)容將所公開的參考文獻(xiàn)通過援引也單獨(dú)地并專門地納入本文。B.概述同AMPK—樣，PAS激酶(PASK)是一種從酵母到人類均保守的，營養(yǎng)應(yīng)答性蛋白激酶。PASK的PAS結(jié)構(gòu)域特異地與激酶催化結(jié)構(gòu)域相互作用，并使順式激酶失活(Rutter2001)。基于生化和遺傳數(shù)據(jù)，小代謝物似乎通過直接與PAS結(jié)構(gòu)域相互作用并妨礙其與激酶結(jié)構(gòu)域的相互作用來激活PASK。在所培養(yǎng)的胰腺p細(xì)胞中的研究(daSilvia2004)證實(shí)了PASK在營養(yǎng)感受和應(yīng)答中起作用。已發(fā)現(xiàn)提高培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度可引起PASK的翻譯后活化。還證實(shí)了葡萄糖刺激的胰島素表達(dá)需要PASK活性(daSilvia2004)。然而，以前沒有述及PASK在胰腺|(zhì)5細(xì)胞功能和能量?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的體內(nèi)作用。通過使用尸awt'-小鼠，已證實(shí)胰腺P細(xì)胞正常分泌胰島素確實(shí)需要PASK。還已證實(shí)PASK缺失可導(dǎo)致對(duì)高脂肪飲食導(dǎo)致的表型幾乎完全的抵抗能力，包括肥胖癥、胰島素抗性和肝臟脂肪堆積。這種保護(hù)是由于每種相關(guān)組織中AMPK表達(dá)的顯著增加。因此，PASK抑制可提供針對(duì)2型糖尿病、普通胰島素抗性和代謝綜合征的有效治療方案。因此，本文描述了針對(duì)2型糖尿病、胰島素抗性和代謝綜合征的一種新治療方案。還描述了治療1型糖尿病和若干種癌癥的方法。PASK的缺失消除了幾乎所有與高脂肪飲食有關(guān)的不良表型，這很可能是通過維持AMPK表達(dá)實(shí)現(xiàn)的(參見圖4D)。增加AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種已經(jīng)證實(shí)的治療方案，以通過增加AMPK的磷酸化和活化起作用的曱福明為例闡明。PASK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制引發(fā)類似的有益效果，但是是通過一種完全不同的機(jī)制，即增加AMPK的蛋白水平。這種互補(bǔ)的治療方案，不管是單獨(dú)還是結(jié)合使用，都可有效治療代謝疾病。本文公開了增加細(xì)胞中AMPK產(chǎn)生的方法，包括抑制PASK從而增加AMPK。這在體內(nèi)或體外都可進(jìn)行。本文還公開了增加細(xì)胞中線粒體代謝的方法，包括抑制PASK,從而增加線粒體代謝。需要PASK抑制的受試者可在治療前被識(shí)別。本文還公開了治療受試者的胰島素抗性的方法，包括選擇需要胰島素抗性治療的受試者；并給予所述受試者有效量的抑制PASK的組合物。代謝綜合征(也稱為X綜合征)的特征為具有至少三個(gè)下列癥狀胰島素抗性；腹部肥胖一在男性中，這被定義為腰圍為40英寸或更粗，在女性中，這被定義為腰圍為35英寸或更粗；高血糖水平——禁食后至少110毫克每分升(mg/dL);高甘油三酯-血流中至少150mg/dL;低DHL-少于40mg/dL;血栓形成前狀態(tài)(如血液中高纖維蛋白原或高纖溶酶原激活物抑制劑)；或血壓為130/85mmHg或以上。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在代謝綜合征和其他如肥胖癥、高血壓和高水平的LDL"壞"膽固醇的病癥之間存在關(guān)聯(lián)，所有這些病癥都是心血管病的危險(xiǎn)因子。例如，已經(jīng)顯示代謝綜合征和動(dòng)脈粥樣硬化之間的聯(lián)系有所增加?；即x綜合征的人也容易患2型糖尿病，女性還容易患PCOS(多嚢卵巢綜合征)，男性還容易患前列腺癌。如上所述，胰島素抗性可以幾種方式表現(xiàn)，包括2型糖尿病在內(nèi)。2型糖尿病是與胰島素抗性聯(lián)系最明顯的病癥。在明顯的糖尿病出現(xiàn)之前，代償性高胰島素血癥有助于維持正常的葡萄糖水平——通常達(dá)數(shù)十年。最終，胰腺p細(xì)胞不能通過高分泌克服胰島素抗性。葡萄糖水平上升，可診斷為糖尿病?；?型糖尿病的患者會(huì)保持高血胰島素，直到病情發(fā)展到后期。胰島素抗性還可包括高血壓。一半的原發(fā)性高血壓患者具有胰島素抗性和高血胰島素。有證據(jù)表明血壓與胰島素抗性的程度有關(guān)。高血脂也與胰島素抗性有關(guān)。2型糖尿病患者的脂質(zhì)分布包括降低的高密度脂蛋白膽固醇水平(一種重要的心臟病危險(xiǎn)因子)、增加的血清極低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平，并且有時(shí)還包括降低的低密度脂蛋白膽固醇水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在高密度脂蛋白水平低的人身上發(fā)現(xiàn)有胰島素抗性。胰島素水平也與極低密度脂蛋白合成和血漿甘油三酯水平有關(guān)。1G同肥胖癥一樣，動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病也與胰島素抗性有關(guān)。許多具有一種或多種上文列出的病癥的人是極度肥胖的。肥胖癥是所述綜合征的一部分，但是它是促進(jìn)胰島素抗性而不是源自胰島素抗性。其他與抗胰島素有關(guān)的異常情況包括高尿酸血癥、纖溶酶原激活物抑制劑1的水平升高和大量的小尺寸低密度脂蛋白顆粒。纖溶酶原激活物抑制劑水平較高和低密度脂蛋白顆粒直徑下降被認(rèn)為會(huì)增加患冠心病的危險(xiǎn)。本文還公開了調(diào)控PASK的測(cè)試化合物的篩選方法。這些步驟包括用測(cè)試化合物與PASK接觸；并檢測(cè)PASK與所述測(cè)試化合物的相互作化合物。下面進(jìn)一步描述了篩選方法，它可包括高通量測(cè)定系統(tǒng)，如測(cè)試化合物或PASK分子的固定化陣列。還公開了用本文公開的篩選方法識(shí)別的化合物。還公開了可調(diào)節(jié)PASK的測(cè)試化合物的篩選方法，其中PASK與測(cè)試化合物接觸；并監(jiān)測(cè)PASK的抑制，從而識(shí)別可調(diào)控PASK的化合物。下面進(jìn)一步描述了篩選方法，它可包括高通量試驗(yàn)系統(tǒng)，如測(cè)試化合物或PASK分子的固定化陣列。還公開了用本文公開的篩選方法識(shí)別的化合物。還公開了體內(nèi)篩選方法。公開的是調(diào)節(jié)PASK的測(cè)試化合物的篩選方法，包括用測(cè)試化合物與PASK缺失的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物接觸；并檢測(cè)該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中PASK水平的差異；其中PASK水平的差異標(biāo)示可調(diào)控PASK的化合物。還公開了用本文公開的體內(nèi)篩選方法識(shí)別的化合物。還公開了治療受試者的癌癥的方法，包括選擇患癌癥的受試者；并給予該受試者有效量的抑制PASK的組合物；從而治療所述受試者的癌癥。下面公開了治療癌癥的方法，以及認(rèn)為可應(yīng)用這些方法的若干癌癥。還公開了治療受試者的l型糖尿病的方法，包括選擇患l型糖尿病的受試者；并給予該受試者有效量的抑制PASK的組合物；從而治療所述受試者的l型糖尿病。本文還公開了治療受試者的胰島素抗性的方法，包括選擇需要胰島素抗性治療的受試者；并給予該受試者編碼可抑制PASK的組合物的核酸。下面公開了核酸送遞的方法。C.組合物本文公開了用于制備所公開組合物的組分，以及在本文公開的方法中所用的組合物本身。本文公開了這些和其他材料，并應(yīng)理解當(dāng)公開了這些材料的組合、子集、相互作用、分組等時(shí)，即使這些化合物中每個(gè)不同的單個(gè)和整個(gè)的組合和排列的具體含義并沒有明確地公開，但每種情況都在本文中明確地考慮和描述。因此，如果公開了一類分子A、B13和C以及一類分子D、E和F，并且還公開了組合分子的一個(gè)實(shí)例A-D，那么即使沒有單獨(dú)提到每種組合分子，但每種組合分子都被獨(dú)立和組合地考慮了，即認(rèn)為A-E、A國F、B-D、B-E、B-F、C畫D、C-E和C-F凈皮公開。類似地，這些組合分子的任何子集或組合也被公開。因此，例如，i人為子群A-E、B-F和C-E已被/>開。這一概念適用于本申請(qǐng)的全部方面，包括但不限于制造和使用所公開組合物的方法中的步驟。因此，如果有多個(gè)可實(shí)施的額外步驟，應(yīng)理解這些額外步驟中的每一步都可與所公開方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合一起實(shí)施。1.同源性/同一性應(yīng)理解，定義本文所公開的基因和蛋白的任何已知的或可能出現(xiàn)的變體和衍生物的一種方式是要通過用與具體的已知序列的同源性來定義變體和衍生物。例如SEQIDNO:5列出編碼PASK分子的具體序列，并且SEQIDNO:4列出SEQIDNO:5編碼的蛋白——PASK分子——的具體序列。本文具體地公開了本文所公開的這些和其他基因和蛋白的變體，所述變體與所述序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性。本領(lǐng)域沖支術(shù)人員容易理解如何確定兩個(gè)蛋白或核酸(如基因)的同源性。例如，可在對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)從而使同源性處于其最高水平之后計(jì)算同源性。計(jì)算同源性的另一種方式還可通過公開的算法進(jìn)行?？赏ㄟ^下述方法進(jìn)行用于比較的序列最優(yōu)比對(duì)局部同源性算法(SmithandWatermanAdv.Appl.Math.2482(1981))、同源比對(duì)算法(NeedlemanandWunsch，J.MoLBiol48443(1970))、相似性搜索(PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988))，或這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison，WI),或觀察。例如，可通過Zuker，M.244:48-52,1989;Jaegeretal.P亂A^/.5W.86:7706-7710，1989和Jaegeretal.Af"/^A183:281-306，1989中7>開的算法獲得核酸的同類型同源性，其中至少就與核酸比對(duì)有關(guān)的內(nèi)容通過引用的方式將其納入本文中。2.核酸本文7>開的多種分子是基于核酸的，包括例如編碼如PASK和本文公開的任何其他蛋白的核酸，以及多種功能性核酸。公開的核酸是由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物組成的。本文討論了這些分子和其他分子的非限制性的實(shí)例。應(yīng)理解，例如，當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所表達(dá)的mRNA—般由A、C、G和U組成。類似地，應(yīng)理解，如果例如通過如外源送遞將反義分子引入到細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中，則優(yōu)選地所述反義分子由可降低所述反義分子在細(xì)胞環(huán)境中的降解的核苷酸類似物構(gòu)成。a)核苷酸和相關(guān)分子核苷酸是一種含有一個(gè)堿基部分、一個(gè)糖部分和一個(gè)磷酸部分的分子。核苷酸可通過它們的磷酸部分和糖部分形成一個(gè)核苷間鍵從而連接在一起。核苷酸的堿基部分可是腺嘌吟-9-基(A)、胞嘧啶-l-基(C)、鳥噤呤-9-基(G)、尿嘧啶-l-基(U)和胸腺嘧啶-l-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脫氧核糖。核苷酸的磷酸部分是5價(jià)磷酸。核苷酸的一個(gè)非限制性的實(shí)例可以是3'-AMP(3，-一磷酸腺苷)或5'-GMP(5'-—磷酸鳥苷)。核苦酸類似物是一種含有對(duì)堿基、糖或磷酸部分的某種類型修飾的核苷酸。對(duì)核苷酸的修飾在本領(lǐng)域內(nèi)是為人熟知的，可包括，比如5-曱基胞嘧啶(5-me-C)、5羥曱基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤和2-氨基腺噤呤，以及在糖和磷酸部分上的修飾。核苷酸替代物是具有與核苷酸類似功能性質(zhì)但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是可通過Watson-Crick或Hoogsteen方式識(shí)別核酸，但是通過一個(gè)非磷酸部分的部分連接在一起的分子。核苷酸替代物在與合適的目標(biāo)核酸相互作用時(shí)能形成雙螺旋型結(jié)構(gòu)。核苷酸或核普酸類似物也可以連接其他類型的分子(綴合物)以加強(qiáng)例如細(xì)胞攝取。綴合物可與核苷酸或核苷酸類似物以化學(xué)鍵連接。這種綴合物包括或不限于脂質(zhì)部分如膽固醇部分(Letsingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989,86，6553-6556)。15Watson-Crick相互作用是與核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Watson-Crick界面的至少一種相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Watson-Crick界面包括基于噤呤的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、Nl和C6位和基于嘧啶的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、N3和C4位。Hoogsteen相互作用是發(fā)生在核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen界面上的相互作用，其暴露于雙鏈DNA的大溝中。Hoogsteen界面包括噤呤核苷酸的N7位和C6位上的反應(yīng)基團(tuán)(NH2或O)。b)序列有多種與例如Genbank公開的PASK以及本文公開的其他任何蛋白有關(guān)的序列，并且這些序列和其他序列以及它們中所包含的單個(gè)子序列通過援引全文納入本文中。本文提供了多種序列，且這些序列和其他序列可在網(wǎng)址為www.pubmed.gov的Genbank中找到。本領(lǐng)域的4支術(shù)人員懂得如何解決序列的差異和不同，和如何調(diào)整與具體序列相關(guān)的組合物和方法，從而使其適應(yīng)其他相關(guān)序列?？筛鶕?jù)本文公開的和本領(lǐng)域已知的信息為任何序列設(shè)計(jì)引物和/或探針。c)功能性核酸功能性核酸是具有特定功能(如與目標(biāo)分子結(jié)合或催化特定反應(yīng))的核酸分子。功能性核酸分子可被分為以下類別，這些類別并非為了作出限制。例如，功能性核酸包括反義分子、適體、核酶、三鏈形成分子和外在引導(dǎo)序列。功能性核酸分子可作為目標(biāo)分子所擁有的特定活性的影響因子、抑制因子、調(diào)節(jié)因子和刺激因子，或功能性核酸分子具有不依賴任何其他分子的完全(&mw)活性。功能性核酸分子可與任何大分子如DNA、RNA、多肽或烴鏈相互作用。因此，功能性核酸可與PASK的mRNA或基因組DNA相互作用，或它們可與PASK多肽相互作用。通常，以目標(biāo)分子和功能性核酸分子之間的序列同源性為基礎(chǔ)來設(shè)計(jì)功能性核酸以與其他核酸相互作用。在其他情況下，功能性核酸分子和目標(biāo)分子之間的特異識(shí)別不是基于功能性核酸分子和目標(biāo)分子之間的序列同源性，而是基于可使特異識(shí)別發(fā)生的三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。設(shè)計(jì)反義分子來通過標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)與目標(biāo)核酸分子相互作用。設(shè)計(jì)反義分子和目標(biāo)分子的相互作用以通過例如RNAseH介導(dǎo)的RNA-DNA雜合體降解來促進(jìn)對(duì)目標(biāo)分子的破壞。或者設(shè)計(jì)反義分子來中斷通常發(fā)生在目標(biāo)分子上的加工功能，如轉(zhuǎn)錄或復(fù)制?？苫谀繕?biāo)分子序列設(shè)計(jì)反義分子。存在多種通過找出所述目標(biāo)分子最容易達(dá)到的區(qū)域來優(yōu)化反義效率的方法。示例性方法是用DMS和DEPC進(jìn)行的體外選擇試驗(yàn)和DNA修飾研究。優(yōu)選地，反義分子與目標(biāo)分子結(jié)合的離解常數(shù)(kd)小于或等于l(T6、10—8、10—1()或10-12。有助于設(shè)計(jì)和使用反義分子的方法和技術(shù)的代表性實(shí)例可在下面非限制性的美國專利列表中找到5，135，917、5，294，533、5，627，158、5，641，754、5,691,317、5，780，607、5,786,138、5，849，卯3、5,856,103、5,919,772、5，955，5卯、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6，007，995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6，046，319和6,057,437。適體是與目標(biāo)分子相互作用的分子，優(yōu)選地以特定方式。典型地，適體是長(zhǎng)度為15-50個(gè)堿基、折疊為確定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(如莖環(huán)或G-四聯(lián)體)的小核酸。適體可與如ATP(美國專利5,631,146)和茶堿(美國專利5,580,737)的小分子結(jié)合，也可與如反轉(zhuǎn)錄酶(美國專利5，786，462)和凝血酶(美國專利5,543,293)的大分子結(jié)合。適體可4艮緊密地與目標(biāo)分子結(jié)合，離解常數(shù)小于10—12M。優(yōu)選地，適體與目標(biāo)分子結(jié)合的離解常數(shù)小于l(T6、l(T8、10"g或l(T12。適體可與目標(biāo)分子非常高度特異得結(jié)合。例如，分離了與目標(biāo)分子之間的結(jié)合親和力比與只有一個(gè)位置不同的另一個(gè)分子之間的結(jié)合親和力差10000倍的適體(美國專利5，543，293)。優(yōu)選地，適體與目標(biāo)分子的IQ比與背景結(jié)合分子的Kd低至少10、100、1000、10000或100000倍。優(yōu)選地，當(dāng)對(duì)例如一個(gè)多肽進(jìn)行比對(duì)時(shí)，背景分子是一個(gè)不同的多肽。如何制造和使用適體來結(jié)合多種不同目標(biāo)分子的代表性實(shí)例可在下面非限制性的美國專利列表中找到5,476,766、5，503，978、5,631,146、5，731，424、5,780,228、5,792,613、5，795，721、5，846，713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5，869，641、5，958，691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776和6,051,698。核酶是能夠催化分子內(nèi)或分子間化學(xué)反應(yīng)的核酸分子。因此核酶是有催化作用的核酸。優(yōu)選地，核酶催化分子間反應(yīng)。存在多種不同類型的催化核酸酶或核酸聚合酶類型反應(yīng)的核酶，所述反應(yīng)基于存在于天然系統(tǒng)中的核酶如錘頭狀核酶(例如，但不限于下列美國專利5,334,711、5,436,330、5,616,466、5，633，133、5,646,020、5，652，094、5,712,384、5，770，715、5,856,463、5，861，288、5,891,683、5，891，684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、Ludwig和Sproat的WO9858058、Ludwig和Sproat的WO9858057以及Ludwig和Sproat的WO9718312)、發(fā)夾核酶(例如，但不限于下列美國專利5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)和四膜蟲核酶(例如，但不限于下列美國專利5，595，873和5，652，107)。也存在多種并不存在于天然系統(tǒng)中、但其已經(jīng)改造來從頭催化特定反應(yīng)的核酶(例如，但不限于下列美國專利5,580,967、5,688,670、5，807，718和5,910,408)。優(yōu)選地，核酶切割RNA或DNA底物，更優(yōu)選地，切割RNA底物。核酶一般通過識(shí)別和結(jié)合然后切割核酸底物來切割所述目標(biāo)底物。通常，這種識(shí)別基本上是基于標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)相互作用。因?yàn)槟繕?biāo)底物的識(shí)別是基于目標(biāo)底物序列，所以這種性質(zhì)使核酶成為核酸的目標(biāo)特定切割特別好的候選者。如何制美國專利列表中找到5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5，869，253、5,877,021、5,877,022、5，972，699、5,972,704、5,989,906和6，017，756。具有三鏈形成功能的核酸分子是可與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當(dāng)三鏈分子與目標(biāo)區(qū)域相互作用時(shí)，就會(huì)形成一種稱為三鏈的結(jié)構(gòu)，其中三條DNA形成同時(shí)依賴Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對(duì)的復(fù)合體。三鏈分子是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛梢愿哂H和性和特異性與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，三鏈形成分子與目標(biāo)分子結(jié)合的離解常數(shù)(kd)小于io-6、io-8、10-1()或l(T12。如何制造和使用三鏈形成分子來結(jié)合多種不同目標(biāo)分子的代表性實(shí)例可在下面非限制性的美國專利列表中找到5,176,996、5,645,985、5，650，316、5,683,874、5,693,773、5，834，185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。外在引導(dǎo)序列(EGS)是與目標(biāo)核酸分子結(jié)合形成復(fù)合體的分子，且此復(fù)合體可被切割所述目標(biāo)分子的RNA酶P識(shí)別。EGS可被設(shè)計(jì)成特異地乾向所選的RNA分子。RNA酶P幫助加工細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)?？赡技?xì)菌RNA酶P,通過使用可使目標(biāo)RNA:EGS復(fù)合體模擬天然tRNA底物的EGS來切割幾乎任何RNA序列。(Yale的WO92/03566，以及ForsterandAltman，Science238:407-409(1990))。類似地，可利用真核EGS/RNAseP指導(dǎo)的RNA切割來切割真核細(xì)胞內(nèi)的所需目標(biāo)(Yuanetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8006-8010(1992);Yale的WO93/22434;Yale的WO95/24489;YuanandAltman，EMBOJ14:159-168(1995)以及Carraraetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92:2627-2631(1995))。如何制造和使用EGS分子來幫助多種不同目標(biāo)分子切割的代表性實(shí)例可在下面非限制性的美國專利列表中找到5，168，053、5，624，824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5，877，162。3.核酸送遞在本文所述的包括外源DNA給藥和攝取進(jìn)入受試者的細(xì)胞內(nèi)的方法中(即基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，其中所公開的核酸可以為棵露DNA或RNA形式，或者所述核酸可存在于用于將核酸送遞到細(xì)胞的載體中，藉此編碼抗體的DNA片段受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的那樣。所述載體可是商購制劑，如腺病毒載體(QuantumBiotechnologies,Inc.(Laval,Quebec,Canada))?？赏ㄟ^多種機(jī)制將核酸或載體送遞至細(xì)胞。作為一個(gè)實(shí)例，送遞可經(jīng)由脂質(zhì)體，使用商購脂質(zhì)體制劑如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO畫BRL，Inc.,Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.,Madison，WI)，以及根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)程序開發(fā)的其他脂質(zhì)體。另外，所公開的核酸或栽體可通過電穿孔法在體內(nèi)送遞，這種技術(shù)可使用SONOPORATION機(jī)器(ImaRxPharmaceuticalCorp.,Tucson,AZ)進(jìn)行,也可由Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)提供。作為一個(gè)實(shí)例，載體送遞可通過病毒系統(tǒng)，如可包裝重組反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)(參見例如Pastanetal.，iVoc.2V//.顛AtU乂85:4486，1988;Milleretal"Mol.Cell.Biol.6:2895，1986)。重組反轉(zhuǎn)錄病毒隨后可用于感染，從而將編碼廣泛中性化的抗19體(或其活性片段)的核酸送遞到被感染的細(xì)胞。將改變的核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的精確方法為當(dāng)然不限于使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體。其他技術(shù)可廣泛地用于這一方法，包括使用腺病毒載體(Mitanietal.，Hum.GeneTher.5:941-948，1994)、腺伴隨病毒(AAV)載體(Goodmanetal.，Blood84:1492-1500，1994)、慢病毒載體(Naidinietal.，272:263-267，1996)和假型反轉(zhuǎn)錄病毒(Agrawaletal"Exper.Hematol.24:738-747，1996)。也可應(yīng)用物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，如脂質(zhì)體送遞以及受體介導(dǎo)的和其他細(xì)胞內(nèi)吞才幾制(參見例如Schwartzenbergeretal"Blood87:472-478，1996)。本文公開的組合物和方法可與這些或其他常用的基因轉(zhuǎn)移方法中的任何一種結(jié)合使用。作為一個(gè)實(shí)例，如果所述抗體編碼核酸在腺病毒載體中被送遞到受試者的細(xì)胞中，那么給予人的腺病毒的劑量可每次注射約107到109噬斑形成單位(pfu)，但可高至每次注射1012pfu(Crystal，Hum.GeneTher.8:985-1001，1997;AlvarezandCuriel，Hum.GeneTher.8:597-613，1997)。受試者可接受一次注射，或者，如果必須進(jìn)行額外注射，可以以六個(gè)月的間隔(或技術(shù)人員確定的其他合適的時(shí)間間隔)重復(fù)注射，持續(xù)時(shí)間為無限期地和/或直到確定治療效力為止。如果應(yīng)用核酸或載體的胃腸外給藥，所述胃腸外給藥的特征通常是通過注射。注射劑可制備為常規(guī)形式，如液體溶液或懸液形式、適用于注射前用液體溶成懸液的固體形式或者乳劑形式。一個(gè)最近修正的用于胃腸外給藥的方法包括使用緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)從而保持恒定的劑量。關(guān)于合適制劑和治療化合物的多種給藥途徑的額外討論，參見，如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)ed.A.R.Gennaro，MackPublishingCompany,Easton，PA1995。4.送遞組合物到細(xì)胞中有若干可用于將核酸送遞給體內(nèi)或體外的細(xì)胞中的組合物和方法。這些方法和組合物大體上可分為兩類基于病毒的送遞系統(tǒng)和非基于病毒的送遞系統(tǒng)。例如，核酸可通過若干直接送遞系統(tǒng)(如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、質(zhì)粒、病毒栽體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒)來送遞，或者通過轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)或載體(如陽離子脂質(zhì)體)來送遞。用于轉(zhuǎn)染的合適手段，包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子或物理機(jī)械方法如電穿孔或DNA直接擴(kuò)散，在例如Wolff,J.A.,etal，Science,247，1465-1468，(19卯)和Wolff，J.A.Nature,352，815-818，(1991)中有所描述。這些方法在本領(lǐng)域內(nèi)為人熟知，并且很容易被改造成適用于本文所述的組合物和方法。在某些情況下，該方法會(huì)被改進(jìn)來專門針對(duì)大DNA分子起作用。另外，可通過使用所述栽體的靶向特點(diǎn)來用這些方法耙向特定疾病和細(xì)胞群。a)基于核酸的送遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體可是任何用于將基因送遞進(jìn)細(xì)胞的核苷酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)，或作為送遞基因的一般方法的一部分，如作為重組反轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的一部分(Rametal.CancerRes.53:83-88，(1993))。如本文所用的，質(zhì)?；虿《据d體是將所公開的核酸如PASK抑制劑在不被破壞的情況下運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的介質(zhì)(agent),并且還含有使所述基因在其被送遞到的細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。病毒載體是例如腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒、辛德畢斯和其他RNA病毒，包括含有HIV骨架的這些病毒。任何具有使這些病毒適合用作載體的性質(zhì)的病毒家族也是優(yōu)選的。反轉(zhuǎn)錄病毒包括莫洛尼(氏)鼠白血病病毒、MMLV和可表達(dá)MMLV的所需性質(zhì)的作為載體的反轉(zhuǎn)錄病毒。與其他病毒載體相比，反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠攜帶更大的遺傳負(fù)載，即轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記基因，并因此是常用載體。然而，它們不能用于非增殖的細(xì)胞中。腺病毒相對(duì)穩(wěn)定并且易于操作，具有高滴度，可以氣霧劑的形式送遞，并可感染非分裂細(xì)胞。痘病毒載體很大且具有數(shù)個(gè)插入基因的位點(diǎn)，它們是熱穩(wěn)定的并可在室溫下保存。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是已經(jīng)改造從而抑制宿主生物體中由該病毒抗原引起的免疫反應(yīng)的病毒載體。優(yōu)選的這種載體將攜帶白細(xì)胞介素8或10的編碼區(qū)。病毒載體可具有比將基因引入細(xì)胞的化學(xué)或物理方法更高的處理能力(引入基因的能力)。一般病毒載體含有非結(jié)構(gòu)早期基因、結(jié)構(gòu)晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)和控制病毒基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)子。當(dāng)被改造為載體時(shí)，病毒中一般有一種或多種早期基因被除去，并在病毒基因組中插入一個(gè)基因或基因/啟動(dòng)子表達(dá)盒以取代所述被移除的病毒DNA。這種構(gòu)建體可攜帶最高21至約8kb的外源遺傳物質(zhì)。所除去的早期基因的必需功能一般由已經(jīng)被改造成可反向表達(dá)所述早期基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系提供。(l)反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一種屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科的動(dòng)物病毒，包括任何種類、亞科、屬或向性。反轉(zhuǎn)錄病毒通常描述于Verma，I.M.，Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232，Washington(1985)，所述文獻(xiàn)通過援引納入本文。將反轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因治療的方法的實(shí)例描述于美國專利No.4,868,116和4，980，286;PCT申請(qǐng)WO90/02806和WO89/07136;以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))，這些文獻(xiàn)的教導(dǎo)以引用的方式納入本文中。反轉(zhuǎn)錄病毒本質(zhì)上是一個(gè)其中包裝有核酸貨物(cargo)的包裝體(package)。所述核酸貨物帶有包裝信號(hào)，該包裝信號(hào)確保復(fù)制的子代分子能有效率地被包裝進(jìn)包裝外殼內(nèi)。除了包裝信號(hào)之外，還有用于復(fù)制以及包裝所述被復(fù)制的病毒所需的若干順式分子。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組一般含有g(shù)ag、pol和env基因，所述基因參與蛋白外殼的制造。Gag、pol和env基因一般被需要轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中的外源DNA所替換。反轉(zhuǎn)錄病毒載體一般含有用于摻入包裝外殼的包裝信號(hào)、一段指示gag轉(zhuǎn)錄單元起始的序列、反轉(zhuǎn)錄必需的元件，包括結(jié)合tRNA反轉(zhuǎn)錄引物的引物結(jié)合位點(diǎn)、在DNA合成中指導(dǎo)RNA鏈開啟的末端重復(fù)序列、作為用于DNA合成的第二鏈合成引發(fā)位點(diǎn)的富含噤呤的5，到3'長(zhǎng)末端重復(fù)序列，和接近LTR末端的可使所述插入了DNA的反轉(zhuǎn)錄病毒插入到宿主基因組的特異序列。gag、pol和env基因的移除可使得大約8kb的外源序列插入病毒基因組，被反轉(zhuǎn)錄，并在復(fù)制后被包裝到新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。該核酸量足夠用于一到多個(gè)基因的送遞，具體數(shù)目取決于每一轉(zhuǎn)錄物的大小。優(yōu)選地，插入物中包含正選擇或負(fù)選擇標(biāo)記，連同其他基因。因?yàn)榇蠖鄶?shù)反轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)除去了復(fù)制機(jī)制和包裝蛋白(gag、pol和env)，所以一般通過將載體置于包裝細(xì)胞系中生成它們。包裝細(xì)胞系是被含有復(fù)制和包裝體系但沒有任何包裝信號(hào)的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系。當(dāng)帶有選定DNA的載體被轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞系中時(shí)，含有目的基因的載體被復(fù)制并借助所述輔助細(xì)胞提供的順式(incis)機(jī)制被包裝到新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。因?yàn)樗鰴C(jī)制的基因組缺乏必要的信號(hào)，所以它們沒有被包裝。(2)腺病毒載體一些文獻(xiàn)描述了復(fù)制缺陷型的腺病毒的構(gòu)建(Berkneretal.，J.Virology61:1213-1220(1987);Massieetal"Mol.Cell.Biol.6:2872-2883(1986);Haj-Ahmadetal"J.Virology57:267-274(1986);Davidsonetal"J.Virology61:1226-1239(1987);Zhang"Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"BioTedmiqiies15:868-872(1993))。使用這些病毒作為載體的益處是它們傳播到其他細(xì)胞類型的范圍受到了限制，因?yàn)殡m然它們可在最初感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但無法形成新的可感染的病毒顆粒。已證明，重組腺病毒在直接體內(nèi)送遞至呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實(shí)質(zhì)和若干其他組織位點(diǎn)后可實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)移(Morsy，J.Clin.Invest.92:1580-1586(1993);Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92:381-387(1993);Roessler，J.Clin.Invest.92:1085-1092(1993);Moullier，NatureGenetics4:154-159(1993);LaSalle，Science259:988畫9卯(1993);Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129-25134(1992);Rich,HumanGeneTherapy4:461-476(1993》Zabner，NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch73:1201-1207(1993);Bout,HumanGeneTherapy5:3-10(1994);Zabner，Cell75:207-216(1993);Caillaud，Eur.J.Neuroscience5:1287-1291(1993);Ragot，J.Gen.Virology74:501-507(1993))。重組腺病毒通過和特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被內(nèi)化，此方式與野生型或復(fù)制缺陷的腺病毒的方式相同(ChardonnetandDales,Virology40:462-477(1970);BrownandBurlingham，J.Virology12:386-396(1973);SvenssonandPersson，J.Virology55:442-449(1985);Seth，etal"J.Virol.51:650-655(1984);Seth，etal"Mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984);Vargaetal"J.Virology65:6061-6070(1991);Wickhametal"Cell73:309-319(1993))。病毒載體可以是一種基于除去了El基因的腺病毒的載體，這些病23毒體在諸如人類293細(xì)胞系的細(xì)胞系中產(chǎn)生。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，E1和E3基因都從腺病毒基因組中被除去。(3)腺伴隨病毒載體另一種類型的病毒載體基于腺伴隨病毒(AAV)。這種缺陷型細(xì)小病毒是一種優(yōu)選的載體，因?yàn)樗梢愿腥驹S多細(xì)胞類型并且對(duì)人類來說是非致病的。AAC類型的載體可運(yùn)送約4到5kb，已知野生型AAV可穩(wěn)定地插入到染色粒19中。含有這種位點(diǎn)特異性整合性質(zhì)的載體是優(yōu)選的。這種載體的特別優(yōu)選的實(shí)施方案是Avigen，SanFrancisco,CA制造的P4.1C載體，該載體可以含有單純皰滲病毒胸苷激酶基因HSV-tk和/或標(biāo)記基因，如編碼綠色焚光蛋白GFP的基因。在另一種類型的AAV病毒中，AAV含有一對(duì)反向末端重復(fù)(ITR)，其側(cè)面至少有一個(gè)含有啟動(dòng)子的表達(dá)盒，該啟動(dòng)子可操作地與一個(gè)異源基因相連并指導(dǎo)細(xì)胞特異性表達(dá)。本文中異源是指任何不是AAV或B19細(xì)小病毒固有的核苷酸序列或基因。一般AAV和B19編碼區(qū)已被缺失，產(chǎn)生安全的無細(xì)胞毒性的載體。AAVITR或其變型，賦予感染性和位點(diǎn)特異性整合而非細(xì)胞毒性，且所述啟動(dòng)子指導(dǎo)細(xì)胞特異性表達(dá)。就與AAV載體有關(guān)的內(nèi)容將美國專利N0.6，261，834以引用的方式納入本文中。因此所公開的載體提供能夠整合進(jìn)哺乳動(dòng)物染色體的DNA分子，且基本沒有毒性。在病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒中插入的基因通常含有啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子以幫助控制所需基因產(chǎn)物表達(dá)。啟動(dòng)子通常是當(dāng)處于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)固定的位置時(shí)起作用的一段或多段DNA序列。啟動(dòng)子含有RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)生基本相互作用所需的核心元件，并可含有上游元件和響應(yīng)元件。(4)大負(fù)載病毒載體使用大人類皰療病毒的分子遺傳實(shí)驗(yàn)已經(jīng)提供了一種這樣的手段，即藉此大的異源DNA片段可以在可被皰滲病毒感染的細(xì)胞中被克隆、增殖和建立(establish)(Sunetal"Naturegenetics8:33-41，1994;CotterandRobertson,.CuirOpinMolTher5:633-644，1999)。這些大DNA病毒(單純皰滲病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(EBV))具有將大于150kb的人類異源DNA片段送遞至特定細(xì)胞的可能。EBV重組體可使大片段DNA在感染的B細(xì)胞中作為游離DNA被保持。攜帶有最長(zhǎng)至330kb的人類基因組插入物的單個(gè)克隆看起來是遺傳穩(wěn)定的。這些游離體的保持需要一個(gè)特異性的EBV核蛋白EBNAI,其在EBV感染過程中組成型表達(dá)。另外，這些載體可用于轉(zhuǎn)染，此時(shí)在體外可短暫地生成大量蛋白。皰滲病毒擴(kuò)增子系統(tǒng)也用于包裝大于220kb的DNA片段以及感染可穩(wěn)定地保持DNA作為游離子的細(xì)胞。其他有用系統(tǒng)包括，例如，復(fù)制和宿主限制的非復(fù)制牛痘病毒載體。b)不基于核酸的系統(tǒng)所公開的組合物可以多種方式被送遞至目標(biāo)細(xì)胞中。例如，所述組合物的送遞可通過電穿孔法或通過脂轉(zhuǎn)染法或通過磷酸釣沉淀法。所選的送遞機(jī)制部分取決于目標(biāo)細(xì)胞的類型，以及所述送遞發(fā)生在例如體內(nèi)還是體外。因此，除了所公開的例如核酸或載體，組合物還可含有脂質(zhì)，例如脂質(zhì)體，如陽離子脂質(zhì)體(例如DOTMA、DOPE、DC-膽固醇)或陰離子脂質(zhì)體。如果需要，脂質(zhì)體還可含有幫助靶向特定細(xì)胞的蛋白。可將包含一種化合物和一種陽離子脂質(zhì)體的組合物給予到流入靶器官的血液中，或?qū)⑵湮胫梁粑乐衼戆邢蚝粑赖哪繕?biāo)細(xì)胞。關(guān)于脂質(zhì)體，可參考文獻(xiàn)如Brighametal.Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.1:95-100(1989)、Feigneretal.Proc.Natl.Acad.SciUSA84:7413-7417(1987)、美國專利號(hào)4,897,355。另外，可將所述化合物作為微膠嚢的一組分來給藥，所述微膠嚢可靶向特定細(xì)胞類型如巨噬細(xì)胞，或其中所述化合物從所述微膠嚢的擴(kuò)散或送遞被設(shè)計(jì)用于特定速率或劑量。在本文所述的包括外源DNA的給藥和攝取進(jìn)入受試者的細(xì)胞的方法中(即基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，所述組合物可通過多種機(jī)制送遞至細(xì)胞。作為一個(gè)實(shí)例，送遞可經(jīng)由脂質(zhì)體，使用商購脂質(zhì)體制劑，如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO國BRL，Inc.,Gaithersburg,MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc"Madison,WI)，以及根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)程序開發(fā)的其他脂質(zhì)體。另外，所公開的核酸或載體可通過25電穿孔法在體內(nèi)送遞，這種技術(shù)可使用SONOPORATION機(jī)器(ImaRxPharmaceuticalCorp.,Tucson,AZ)進(jìn)行，也可由Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)提供。所述材料可能在溶液、懸液(例如被摻入微粒、脂質(zhì)體或細(xì)胞中)中。這些材料可通過抗體、受體或受體配體靶向特定細(xì)胞類型。下列文獻(xiàn)是應(yīng)用這種技術(shù)將特定蛋白靶向到腫瘤組織的實(shí)例(Senter，etal.，BioconiugateChem.,2:447-451，(1991);Bagshawe，K.D"Br.J.Cancer,60:275-281，(1989);Bagshawe，etal.，Br.J.Cancer,58:700-703，(1988);Senter,etal"BiocoiugateChem.,4:3-9，(1993);Battelli，etal"CancerImmunol.Immunother.,35:421-425，(1992);PieterszandMcKenzie.Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992》andRoffler，etal"Biochcm.Pharmacol,42:2062-2065，(1991))。這些才支術(shù)可用于多種其他特定細(xì)胞類型。載體例如"stealth"和其他抗體綴合的脂質(zhì)體(含有靶向結(jié)腸癌的脂質(zhì)介導(dǎo)的藥物)、受體通過細(xì)胞特異配體介導(dǎo)的DNA靶向、淋巴細(xì)胞指導(dǎo)的腫瘤靶向和高度特異的治療性反轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)體內(nèi)小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向。下列文獻(xiàn)是應(yīng)用這種技術(shù)將特定蛋白靶向到腫瘤組織的實(shí)例Hughesetal"CancerResearch,49:6214-6220，(1989);和LitzingerandHuang,BiochimicaetBiophysicaActa,1104:179-187，(1992)。通常，受體參與內(nèi)吞途徑，不管是組成型的還是配體誘導(dǎo)的。這些網(wǎng)格蛋白包被小窩中的受體簇，通過網(wǎng)格蛋白包被嚢泡進(jìn)入細(xì)胞，穿過受體在其中分類的酸性內(nèi)體，然后要么再次循環(huán)到細(xì)胞表面在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，要么在溶酶體中降解。所述內(nèi)化途徑具有多種功能，如營養(yǎng)的攝取、活化蛋白的移除、大分子的清除、病毒和毒素的機(jī)會(huì)進(jìn)入、配體的解離和降解，以及受體水平的調(diào)控。許多受體具有一條以上細(xì)胞內(nèi)途徑，這取決于細(xì)胞類型、受體濃度、配體類型、受體化合價(jià)和配體濃度。已有文獻(xiàn)綜述了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的分子和細(xì)胞機(jī)制(BrownandGreene,DNAandCellBiology10:6，399-409(1991))。送遞至細(xì)胞中的要整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的核酸，一般含有整合序列。這些序列通常是病毒相關(guān)的序列，特別是當(dāng)使用基于病毒的系統(tǒng)時(shí)。這些病毒整合系統(tǒng)也可被整合進(jìn)使用不基于病毒的送遞系統(tǒng)(如脂質(zhì)體)送遞的核酸，從而使得所述送遞系統(tǒng)所含的核酸可被整合進(jìn)宿主基因組。26其他用于整合進(jìn)宿主基因組的普通技術(shù)包括，例如，設(shè)計(jì)用于促進(jìn)與宿主基因組同源重組的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)一般依賴所要表達(dá)的核酸的側(cè)翼序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列有足夠的同源性，從而使得所述載體核酸和所述目標(biāo)核酸之間會(huì)發(fā)生重組，導(dǎo)致被送遞的核酸整合到宿主基因組中。本領(lǐng)域人員了解這些系統(tǒng)和所述促進(jìn)同源重組所必需的方法。C)體內(nèi)/活體外如上所述，所述組合物可用可藥用載體給藥，并可通過多種本領(lǐng)域熟知的機(jī)制(如棵露DNA的攝取、脂質(zhì)體融合、通過基因槍的DNA肌內(nèi)注射、內(nèi)吞等)被送遞至受試者體內(nèi)和/或活體外的細(xì)胞中。如果使用活體外方法，可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法取出細(xì)胞或組織并在體外培養(yǎng)。組合物可通過任何基因轉(zhuǎn)移機(jī)制(如磷酸鈣介導(dǎo)的基因送遞、電穿孔、顯微注射或蛋白脂質(zhì)體)引入細(xì)胞內(nèi)。然后轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可通過用于所述細(xì)胞或組織類型的標(biāo)準(zhǔn)方法,皮灌注或同倫移植回該受試者。已知將多種細(xì)胞移植或灌注到受試者體內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法。5.表達(dá)系統(tǒng)送遞到細(xì)胞中的核酸一般含有表達(dá)控制系統(tǒng)。例如，在病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)中插入的基因通常含有啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子來幫助控制所需基因產(chǎn)物表達(dá)。啟動(dòng)子通常是當(dāng)處于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)固定的位置時(shí)起作用的一段或多段DNA序列。啟動(dòng)子含有RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)生基本相互作用所需的核心元件，并可含有上游元件和響應(yīng)元件。a)病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子優(yōu)選的控制哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中載體轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可能從多種來源例如下述病毒的基因組多瘤病毒、猿病毒40(SV40)、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的巨細(xì)胞病毒；或從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如P肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可便利地以還含有SV病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制酶切片段形式獲得(Fiersetal.，Nature,273:113(1978))。人類巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可便利地以HindIHE限制酶切片段形式獲得(Greenway，PJ.etal.，Gene18:355-360(1982))。當(dāng)然，從宿主細(xì)胞或相關(guān)物種獲得的啟動(dòng)子也可用于本文。增強(qiáng)子一般是指在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不固定位置距離上起作用的一段DNA序列，既可在轉(zhuǎn)錄單元的5'端(Laimins，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))也可在3，端(Lusky.M丄.，etal"Mol.CellBio.3:1108(1983))。另外，增強(qiáng)子可在編碼序列本身內(nèi)(Osborne,T.F.，etal.，Mol.CellBio.4:1293(1984))也可在內(nèi)含子內(nèi)(Banerji，J丄.etal"Cell33:729(1983))。它們通常長(zhǎng)10-300bp,且它們以順式方式(incis)起作用。增強(qiáng)子的作用是增加從附近啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子也經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的響應(yīng)元件。啟動(dòng)子也經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的響應(yīng)元件。增強(qiáng)子經(jīng)常在基因表達(dá)的調(diào)控中起決定作用。盡管現(xiàn)在已知許多來自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列，但一般研究人員會(huì)將來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子用于一般表達(dá)。優(yōu)選的實(shí)例是位于SV40復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可被光或特定的觸發(fā)它們功能的化學(xué)事件特異地激活。系統(tǒng)可被如四環(huán)素和地塞米松的試劑調(diào)控。還有通過暴露于射線(例如Y射線)或烷基化化療藥物加強(qiáng)病毒栽體基因表達(dá)的方法。在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域可作為組成型啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子以使要轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單元區(qū)域的表達(dá)最大化。在某些構(gòu)建體中，所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有類型的真核細(xì)胞中都具有活性，即使它只在特定類型細(xì)胞中在特定時(shí)間表達(dá)。一種優(yōu)選的此類型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子(650個(gè)堿基)。其他優(yōu)選的啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長(zhǎng)啟動(dòng)子)和反轉(zhuǎn)錄病毒栽體LTR。已經(jīng)證明所有特異調(diào)控元件都可被克隆并用于構(gòu)建在特定類型細(xì)胞(如黑素瘤細(xì)胞)中選擇性表達(dá)的表達(dá)載體。神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子已用于選擇性在神經(jīng)膠質(zhì)源細(xì)胞中表達(dá)基因。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體也可能含有轉(zhuǎn)錄終止必需的序列，所述序列可影響mRNA的表達(dá)。這些區(qū)域被轉(zhuǎn)錄為在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中的多聚腺苷酸區(qū)段。3，非翻譯區(qū)域還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單元也包含多聚腺苷酸區(qū)域。此區(qū)域的的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其增加了所述轉(zhuǎn)錄單元會(huì)被像mRNA—樣加工和送遞的可能性。表達(dá)構(gòu)建體中多聚腺苷酸信號(hào)的識(shí)別和應(yīng)用是得到確認(rèn)的。優(yōu)選地，同源多聚腺苷酸信號(hào)被用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中。在某些轉(zhuǎn)錄單元中，所述多聚腺苷酸區(qū)域來源自SV40早期多聚腺苷酸信號(hào)，由大約400個(gè)堿基組成。同樣優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄單元只含有其他標(biāo)準(zhǔn)序列，或含有這些標(biāo)準(zhǔn)序列與上述可提高所述構(gòu)建體表達(dá)或穩(wěn)定性的序列。b)標(biāo)記病毒載體可包括編碼標(biāo)記產(chǎn)物的核酸序列。此標(biāo)記產(chǎn)物用于確定所述基因是否已被送遞到細(xì)胞和送遞后是否^皮表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記基因是編碼P半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因和綠色熒光蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記可以是一種可選擇的標(biāo)記。適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可選擇標(biāo)記的實(shí)例是二氳葉酸還原酶(DHFR)、胸苦激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和噤呤霉素。當(dāng)這些可選擇的標(biāo)記被成功地轉(zhuǎn)移進(jìn)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可在選擇壓力下存活。有兩類廣泛應(yīng)用的不同的選擇機(jī)制。第一類是基于細(xì)胞代謝和必須依賴添加培養(yǎng)基才能生長(zhǎng)的突變細(xì)胞系的應(yīng)用。兩個(gè)實(shí)例是CHODHFR-細(xì)胞和小鼠LTK-細(xì)胞。這些細(xì)胞缺少在不添加諸如胸苷或次黃噤呤的營養(yǎng)物質(zhì)的情況下就能生長(zhǎng)的能力。因?yàn)檫@些細(xì)胞缺少完整的核苦合成途徑必需的某些基因，因此若不用添加培養(yǎng)基提供缺失的核苷酸，它們就不能存活。添加培養(yǎng)基的替代方法是將完整的DHFR或TK基因引入缺少相應(yīng)基因的細(xì)胞，從而改變它們的生長(zhǎng)需求。沒有用DHFR或TK基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞個(gè)體不能在非添加培養(yǎng)基中存活。第二類是優(yōu)勢(shì)選擇，這是指一種用于任何細(xì)胞類型且不需要使用突變細(xì)胞系的選擇方案。這些方案一般用藥物阻止宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些具有新基因的細(xì)胞會(huì)表達(dá)具有藥物抗性的蛋白從而在所述選擇中存活下來。這種優(yōu)勢(shì)選擇的實(shí)例使用藥物新霉素(SouthernP.andBerg，P.，J.Molec.Apul.Genet.1:327(1982))、麥考酚酸(Mulligan，R.C.andBerg，P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.etal"MoLCell.5:410-413(1985))。這三個(gè)實(shí)例分別使用受真核系統(tǒng)調(diào)控的細(xì)菌基29因從而賦予對(duì)合適的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(麥考酚酸)或潮霉素的抗性。其他包括新霉素類似物G418和嘌呤霉素。6.肽a)蛋白變體如本文討論的，存在多種已知的且在本文考慮中的PASK蛋白的變體。除了已知的功能性PASK變體之外，還存在同樣在所公開的方法和組合物中起作用的PASK蛋白的衍生物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很好地理解蛋白變體和衍生物，它們可包括氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾一般為以下三類的一種或多種置換變體、插入變體或缺失變體。插入包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入，以及氨基和/或羧基末端的融合。插入一般是比氨基或羧基末端融合要小的插入，例如，大約一至四個(gè)殘基。免疫原性融合蛋白衍生物，如實(shí)施例中所描述的那些，是通過融合大到足以使目標(biāo)序列具有免疫原性的多肽而得到的，這一過程可通過體外交聯(lián)或通過被編碼所述融合物的DNA轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞培養(yǎng)物。缺失的特征是從蛋白序列中除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。蛋白分子內(nèi)的任一位點(diǎn)的缺失一般不超過大約2到6個(gè)殘基。制備這些變體一般是通過對(duì)編碼所述蛋白的DNA中的核苷酸進(jìn)行位點(diǎn)特異突變，從而產(chǎn)生編碼所述變體的DNA，并因此在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)DNA。用于在具有已知序列的DNA的預(yù)設(shè)位點(diǎn)上制造置換突變的技術(shù)是眾所周知的，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換一般是單殘基置換，但可以一次出現(xiàn)在多個(gè)不同的位置；插入通常為大約1到10個(gè)氨基酸殘基；缺失可在約1到30個(gè)殘基范圍內(nèi)。缺失或插入優(yōu)選地發(fā)生在相鄰的堿基對(duì)上，即缺失2個(gè)殘基或插入2個(gè)殘基。置換、缺失、插入或它們的組合可聯(lián)合使用以得到最終構(gòu)建體。突變一定不能將序列置于閱讀框以外，且優(yōu)選地不會(huì)產(chǎn)生會(huì)生產(chǎn)二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。置換變體是那些其中至少一個(gè)殘基已經(jīng)被除去且在該位置上插入一個(gè)不同的殘基的變體。這種置換通常依據(jù)下表1和2進(jìn)行，并被認(rèn)為是保守置換。表l:氨基酸縮寫30氨基酸縮寫丙氨酸Ala(A)別異亮氨酸AIle精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酸Glu(E)谷氨酰胺Gin(K)甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H)異亮氨酸He(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys(K)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)焦谷氨酸PGlu絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T)酪氨酸Tyr(Y)色氨酸Trp(W)纈氨酸Val(V)表2:氨基酸置換原始的殘基示例性保守置換，其他是本領(lǐng)域已知的。Ala;serArg^lys,ginAsn;gin;hisAsp;glu31<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>功能或免疫學(xué)性質(zhì)方面顯著變化的發(fā)生可通過選擇較表2中所列的更不保守的置換來實(shí)現(xiàn)，即選擇在維持以下方面時(shí)作用更明顯不同的殘基(a)所述置換區(qū)域中的多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)目標(biāo)位點(diǎn)上的分子的電荷或疏水性或(c)側(cè)鏈的大小。通常被認(rèn)為會(huì)對(duì)蛋白性質(zhì)產(chǎn)生最大變化的置換具有以下條件(a)親水性殘基(如絲氨酰或蘇氨酰)取代疏水性殘基(如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?；虮滨?(或被疏水性殘基取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他殘基(或被任何其他殘基取代);(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基(如賴氨酰、精氨?；蚪M氨酰)取代負(fù)電性的殘基(如谷氨?；蜷T冬氨酰)(或被負(fù)電性的殘基取代)；或(d)具有大體積側(cè)鏈的殘基(如苯丙氨酸)取代沒有側(cè)鏈的殘基(如甘氨酸)(或被沒有側(cè)鏈的殘基取代)，這種情況下，(e)增加用于硫酸化和/或糖基化的數(shù)目。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)生物學(xué)和/或化學(xué)上相似的殘基取代是保守置換。例如，保守置換可以是一個(gè)疏水性殘基取代另一個(gè)疏水性殘基，或者一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)極性殘基。取代包括組合如，Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gin;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr。每種明確/>布的序列的這些保守取代變體包含在本文提供的嵌合多肽之內(nèi)。置換或缺失突變可用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位點(diǎn)。半胱氨酸或其他不穩(wěn)定的殘基缺失也可能是合乎需要的?？赡馨l(fā)生蛋白水解的位點(diǎn)(如Arg)的缺失或置換，是通過例如缺失堿性殘基之一或?qū)⑵溆霉劝滨０孵；蚪M氨酰殘基取代實(shí)現(xiàn)的。某些翻譯后衍生化是由于重組宿主細(xì)胞對(duì)表達(dá)的多肽作用所致。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基通常在翻譯之后脫去酰胺基來形成相應(yīng)的谷氨?；烷T冬氨酰殘基。或者，這些殘基在弱酸性條件下脫去酰胺基。其他翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用；絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基基團(tuán)的磷酸化作用；賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的O-氨基基團(tuán)的曱基4匕作用(T.E.Crdghton，Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.，SanFranciscopp79-86[1983)；N-末端胺的乙酰化作用和在某些情況下，C-末端羧基的酰胺化作用。應(yīng)理解定義本文所公開蛋白的變體和衍生物的一種方法是通過用與具體的已知序列同源性/同一性來定義所述變體和衍生物。例如SEQIDNO:5是PASK的具體序列，SEQIDNO:4是PASK蛋白的具體序列。本文具體公開了本文公布的這些和其他蛋白的變體，其與所述序列具有至少70%或75%或80%或85%或卯％或95%的同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解如何確定兩個(gè)蛋白的同源性。例如，可在比對(duì)兩個(gè)序列從而使同源性處于其最高水平之后計(jì)算同源性。另一種計(jì)算同源性的方法可通過已公開的算法進(jìn)行?？赏ㄟ^下述方法進(jìn)行用于比較的序列最優(yōu)比對(duì)局部同源性算法(SmithandWatermanAdv.Appl.Math.2482(1981))、同源比對(duì)算法(NeedlemanandWunsch，J.MoLBiol48443(1970))、相似性搜索的方法(PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988))，或這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(GAP,BESTFIT，F(xiàn)ASTA，andTFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison，WI)，或通過觀察。例如，可通過Zuker，M.5We臟244:48-52，1989;Jaegeretal.iVoc.AW/.USA86:7706-7710，1989和Jaegeretal.33五/i矽/wo/.183:281-306，1989中公開的算法獲得核酸的相同類型同源性，'應(yīng)理;「對(duì)保守突變的描述和同源性可以任何組合i合起來，、例如~人曰/_Uiisl曰.1，—/\n/r=1,'広丄丄r5*hJ，J>7fcAtQ_漢巧^1、升，/fy'J升,玉//U7o鬥W、'l王ffV失孤力禾，升T"IW3C，疋'沐守突變。當(dāng)本說明書討論各種蛋白和蛋白序列時(shí)，應(yīng)理解，也公開了可編碼那些蛋白序列的核酸。這包括與一個(gè)特定蛋白序列相關(guān)的所有簡(jiǎn)并序列，即具有編碼一個(gè)特定蛋白序列的所有核酸，以及編碼所/>開的所述蛋白序列的變體和衍生物的所有核酸，包括簡(jiǎn)并核酸。因此，盡管本文可能未寫出每個(gè)具體核酸序列，應(yīng)理解，本文通過所公開的蛋白序列事實(shí)上>布和描述了每個(gè)和每一個(gè)序列。應(yīng)理解，存在很多可被摻入所公開的組合物中的氨基酸和肽的類似物。例如，有很多D型氨基酸或具有與表1和表2所示氨基酸不同的功能性取代基的氨基酸。還公開了與天然存在的肽相對(duì)應(yīng)的立體異構(gòu)體和肽類似物的立體異構(gòu)體。通過將所選氨基酸填入tRNA分子并改造遺傳構(gòu)建體可容易地將這些氨基酸摻入多肽鏈，該構(gòu)建體利用例如琥珀密碼子來以位點(diǎn)特異性的方式將所述氨基酸類似物插入肽鏈(Thorsonetal，MethodsinMolec.Biol.77:43-73(1991)、Zoller，CurrentOpinioninBiotechnology,3:348-354(1992》Ibba，Biotechnology&GeneticEngineeringReviews13:197-216(1995)、Cahilletal"TIBS,14(10):400畫403(1989);Benner，TIBTech,12:158-163(1994);IbbaandHennecke，Bio/technology,12:678-682(1994))，所有這些文獻(xiàn)中至少與氨基酸類似物有關(guān)的材料都以引用的方式納入本文中。可產(chǎn)生像肽一樣的分子，但其不是通過天然的肽鍵連接起來的。例如，氨基酸或氨基酸類似物的鍵可包括CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(順式和反式)、-COCH2-、-1(011)<:112-和-<:1111280-。這些和其他鍵可參見Spatola，A.RinChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,B.Weinstein,eds.，MarcelDekker，NewYork,p.267(1983);Spatola,A.F"VegaData(March1983)，Vol.1，Issue3，PeptideBackboneModifications(綜述)；Morley，TrendsPharmSci(1980)pp.463-468;Hudson,D.etal"IntJPeptProtRes14:177-185(1979)(-CH2NH-，CH2CH2-);Spatolaetal.LifeSci38:1243-1249(1986)34(-CHH2-S);HannJ.Chem.SocPerkinTrans.I307-314(1982)(-CH-CH-，順式和反式)；Almquistetal.J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(-COCH2-);Jennings-Whiteetal.TetrahedronLett23:2533(1982)(-COCH2-);Szelkeetal.EuropeanAppln，EP45665CA(1982):97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-);Holladayetal.Tetrahedron.Lett24:4401-4404(1983)(-C(OH)CHr)和HrubyLifeSci31:189-199(1982)(-CH2-S-)，所有這些文獻(xiàn)中的每一篇都以引用的方式納入本文中。一種特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。應(yīng)理解，肽類似物可在所述成鍵原子之間含有一個(gè)以上的原子，如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。氨基酸類似物和類似物和肽類似物經(jīng)常具有增強(qiáng)的或所需的性質(zhì)，如更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)、更好的化學(xué)穩(wěn)定性、增強(qiáng)的藥學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效力、效能等)、改變的特異性(即廣鐠生物學(xué)活性)、降低的抗原性等。D-氨基酸可用于生成更穩(wěn)定的肽，因?yàn)镈氨基酸不會(huì)被肽酶等識(shí)別。用同種D-氨基酸系統(tǒng)性取代共有序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如D-賴氨酸取代L-賴氨酸)可用于生成更穩(wěn)定的肽。半胱氨酸殘基可用于環(huán)化兩個(gè)或多個(gè)肽或?qū)⑵溥B接在一起。這有益于將肽限制為具體構(gòu)象(RizoandGieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992),通過引用納入本文)。7.抗體1)抗體概述本文所用的術(shù)語"抗體"是廣義的，包括多克隆和單克隆抗體兩者。除了完整的免疫球蛋白分子，術(shù)語"抗體"還包括那些免疫球蛋白分子的片段或多聚體，以及人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要它們是因具有與PASK相互作用從而抑制PASK的能力而被選擇?？墒褂帽疚拿枋龅捏w外測(cè)定或通過相似的方法檢驗(yàn)抗體的所需活性，然后根據(jù)已知的臨床檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)它們的體內(nèi)治療和/或預(yù)防疾病的活性。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"是指源自基本同源的抗體群的抗體，即所述群內(nèi)的抗體個(gè)體是等同的，除了一小部分抗體分子中可能存在的天然存在的突變外。本文的單克隆抗體特別包括"嵌合，，抗體以及這類抗體的片段其中部分重鏈和/或輕鏈與來源于一種具體物種或?qū)儆谝环N具體抗體類或子類的抗體中的相應(yīng)序列是等同或同源的，而所述一條或多條鏈的剩余部分與來源于另一具體物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或子類的抗體中相應(yīng)的序列是等同的或同源的，只要它們表現(xiàn)出所需的對(duì)抗活性(參見美國專利4,816,567和Morrisonetal"iVoc.iV"".&丄t/^/4，81:6851-6855(1984))。所公開的單克隆抗體可用任何生產(chǎn)單克隆抗體的方法制備。例如，所7>開的單克隆抗體可用雜交瘤方法制備，如在KohlerandMilstein，A^"，256:495(1975)中所描述的那些方法。在雜交瘤方法中，一般用免疫試劑免疫小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物以誘導(dǎo)生成或能生成抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體能與所述免疫試劑特異性地結(jié)合?；蛘?，所述淋巴細(xì)胞可在體外被免疫，如用本文描述的HIVEnv-CD4共受體復(fù)合體。單克隆抗體也可通過重組DNA方法制備，如美國專利4，816，567(Cabillyetal.)中所述的那些方法。編碼所/>開單克隆抗體的DNA可使用常規(guī)方法容易地分離和測(cè)序(如使用能夠與編碼鼠類的抗重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？贵w或活性抗體片段庫也可通過用噬菌體展示技術(shù)生成和篩選，如美國專利5，804,440(Burtonetal.)和美國專利6，096，441(Barbasetal.)所述的那些噬菌體展示技術(shù)。體外方法也適用于制備單價(jià)抗體。消化抗體產(chǎn)生其抗體片段特別是Fab片段，可使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)完成。例如，可使用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化。木瓜蛋白酶消化的實(shí)例在1994年12月22日公布的WO94/29348和美國專利4，342，566中有所描述?？贵w的木瓜蛋白酶消化一般產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原片段，稱為Fab片段，其中每個(gè)片段都具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)殘留Fc片段。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段，其仍然能與抗原交聯(lián)。所述片段，不管是否與其他序列連接，都還可包括特定區(qū)域或特定氨基酸殘基的插入、缺失、置換或其他選定的修飾，只要所述抗體或抗體片段的活性與未修飾抗體或抗體片段相比沒有顯著改變或受損。這些修飾可提供一些附加性質(zhì)，如除去/增加能夠與二硫化物結(jié)合的氨基酸、增加其生物學(xué)壽命、改變其分泌特征等。在任何情況下，所述抗體或抗體片段必須具有一種生物活性，如與其同源抗原的特異性結(jié)合。所述抗體或抗體片段的功能性或活性區(qū)域的識(shí)別可通過對(duì)所述蛋白特定區(qū)域進(jìn)行誘變，然后表達(dá)并對(duì)所表達(dá)的多肽進(jìn)行檢驗(yàn)。這些方法對(duì)本領(lǐng)域的36技術(shù)人員來說是很容易明白的，并可包括對(duì)所述編碼抗體或抗體片段的核酸的位點(diǎn)特異性誘變(Zoller，MJ.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354，1992)。本文中所用的術(shù)語"抗體"或"抗體群，，也可指人類抗體和/或人源化抗體。許多非人抗體(如那些源自小鼠、大鼠或兔的抗體)是人類的天然抗原，并因此在將其給予人類時(shí)會(huì)產(chǎn)生不需要的免疫反應(yīng)。因此，所述方法中人類或人源化抗體的使用起到減少給予人類的抗體引起不需要的免疫反應(yīng)的機(jī)會(huì)的作用。2)人類抗體所公開的人類抗體可用任何技術(shù)制備。人單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)的實(shí)例包括那些由Cole等人(Mo"oc/ow"/CWicc77rc"/^，AlanR.Liss，p.77，1985)和Boerner等人(//附附"歸/.，147(1):86曙95，1991)所描述的技術(shù)。人類抗體(及其片段)也可使用噬菌體展示庫生產(chǎn)(Hoogenboometal"/Afo/.J5,W"227:381，1991;Marksetal"/Afo/.^W"222:581，1991)。所公開的人類抗體也可獲自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，有關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)描述了能夠響應(yīng)免疫接種生產(chǎn)全套人類抗體的轉(zhuǎn)基因突變小鼠(參加如Jakobovitsetal"尸亂胸/.顛AUSA，90:2551-255(1993);Jakobovitsetal"7Vfl^/re，362:255-258(1993》Bruggermannetal"l^i/*/w/附附w朋/.，7:33(1993))。特別地，這些嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(J(H))基因的純合缺失使內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制，且將人類種系抗體基因陣列成功地轉(zhuǎn)移到這種種系突變小鼠使生產(chǎn)人類抗體可在抗原攻擊下進(jìn)行。使用本文所述Env-CD4共受體復(fù)合物來選擇具有理想活性的抗體。3)人源化抗體抗體人源化技術(shù)一般包括使用重組DNA技術(shù)來對(duì)編碼抗體的分子一條或多條多肽鏈的DNA序列進(jìn)行操作。因此，人源化形式的非人抗體(或其片段)是嵌合抗體或抗體鏈(或其片段，如抗體的Fv、Fab、Fab'或其他抗原結(jié)合部分)，其含有整合到人類(受體)抗體框架中的非人(供體)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分。37要形成人源化抗體，受體(人類)抗體分子的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被供體(非人類)抗體分子的一個(gè)或多個(gè)CDR的殘基取代，已知供體抗體分子具有所需的抗原結(jié)合特性(如對(duì)目標(biāo)抗原具有一定水平的特異性和親和性)。在某些情況下，人類抗體的Fv框架(FR)殘基被對(duì)應(yīng)的非人殘基取代。人源化抗體也可含有既不在受體抗體也不在受損CDR或框架序列中存在的殘基。通常，人源化抗體具有一種或多種從非人源引入的氨基酸殘基。實(shí)際上，人源化抗體一般是其中某些CDR殘基以及可能某些FR殘基被嚙齒類動(dòng)物抗體的相似位點(diǎn)的殘基所取代。人源化抗體一般至少含有抗體恒定區(qū)(Fc)的一部分，通常是人類抗體的恒定區(qū)(Jonesetal，A^i/"re，321:522-525(1986)、Reichmannetal"胸騰,332:323-327(1988)和Presta，CW.5^*"".fi/o/,2:593-596(1992))。用于人源化非人抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如，可按照Winter及其同事的方法(Jonesetal"胸歸，321:522-525(1986)、Riechmannetal"7V"/Mre，332:323-327(1988》Verhoeyenetal"*SWece，239:1534-1536(1988))用嚙齒類動(dòng)物的CDR或CDR序列取代人類抗體的對(duì)應(yīng)序列來生成人源化抗體。可用于生產(chǎn)人源化抗體的方法同樣在美國專利4，816，567(Cabillyetal.)、美國專利5，565，332(Hoogenboometal.)、美國專利5，721，367(Kayetal.)、美國專利5，837，243(Deoetal.)、美國專利5，939，598(Kucherlapatietal.)、美國專利6,130,364(Jakobovitsetal.)和美國專利6，180，377(Morganetal.)中也有描述。4)抗體的給藥抗體的給藥可按照本文所公開的進(jìn)行。也存在用于抗體送遞的核酸途徑。廣泛中性化的抗PASK抗體及抗體片段也可以編碼抗體或抗體片段的核酸制劑的形式(如DNA或RNA)給予患者或受試者，從而使該患者或受試者自身的細(xì)胞攝取所述核酸，并生成和分泌所編碼的抗體或抗體片段。核酸的送遞可通過任何方法，例如本文所公開的方法。8.藥用載體/藥用產(chǎn)物的送遞如上所述，所述組合物也可用可藥用載體形式給予到體內(nèi)。"可藥用"是指物質(zhì)并非是在生物學(xué)或其它方面不合需要的，即所述物質(zhì)可與核酸或載體一起給予受試者，且不引起任何不想要的生物學(xué)效果，或者不以有害方式與包含所述物質(zhì)的藥用組合物的任何其他組分相互作用。所述載體會(huì)從天然材料中選擇以使活性成分的任何降解最小化，并且使受試者體內(nèi)的任何有害副作用最小化，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的那樣。所述組合物可通過口服、胃腸外(如靜脈內(nèi))、通過肌內(nèi)注射、通過腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮、體外、局部等方式給藥，包括局部鼻內(nèi)給藥或吸入給藥。如本文所用的，"局部鼻內(nèi)給藥，，是指通過一個(gè)或兩個(gè)鼻孔將所述組合物送遞至鼻和鼻道中，并可包括通過噴霧機(jī)制或微滴機(jī)制送遞，或通過核酸或載體的煙霧化作用送遞。所述通過吸入方式的組合物給藥可通過噴霧或微滴機(jī)制經(jīng)過鼻或嘴送遞。也可通過插管直接送遞到呼吸系統(tǒng)的任何區(qū)域(如肺部)。所需組合物的精確量會(huì)隨著受試者的不同而變化，取決于受試者的種族、年齡、體重和一般情況、所要治療的過敏性疾病的嚴(yán)重程度、所使用的具體核酸或載體、給藥方式等。因此，不可能為每種組合物指定精確的量。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在考慮本文的教導(dǎo)的情況下僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可確定恰當(dāng)?shù)牧俊Ｈ绻褂盟鼋M合物的胃腸外給藥，所述胃腸外給藥的特征通常是注射。注射劑可制備為常規(guī)形式，如液體溶液或懸液形式、適用于注射前用液體溶成懸液的固體形式或乳劑形式。一個(gè)最近修正的用于胃腸外給藥的方法包括使用緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)從而保持恒定的劑量。參見如美國專利3，610，795，其以引用的方式納入本文中。所述材料可在溶液、懸液(例如被摻入微粒、脂質(zhì)體或細(xì)胞中)中。這些材料可通過抗體、受體或受體配體靶向特定細(xì)胞類型。下列文獻(xiàn)是應(yīng)用這種4支術(shù)將特定蛋白耙向到肺瘤組織的實(shí)例Senter，etal.，BioconiugateChem"2:447-451，(1991);Bagshawe，K.D"Br.J.Cancer,60:275-281，(1989);Bagshawe,etal"Br.J.Cancer,58:700-703，(1988);Senter,etal"BioconiugateChem"4:3-9，(1993);Battelli，etal"C犯ccrImmunol.Immunother.,35:421-425,(1992);PieterszandMcKenzie.Immunolog.Reviews,129:57-80，(1992);Roffler，etal"Biochem.Pharmacol,42:2062-2065，(1991)。載體例如"stealth"和其他抗體綴合物的脂質(zhì)體(含有靶向結(jié)腸癌的脂質(zhì)介導(dǎo)的藥物)、受體通過細(xì)胞特異配體介導(dǎo)的DNA靶向、淋巴細(xì)胞指導(dǎo)的腫瘤靶向和高度特異的治療性反39轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)體內(nèi)鼠類膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向。下列文獻(xiàn)是應(yīng)用這種技術(shù)將特定蛋白靼向到腫瘤組織的實(shí)例Hughesetal.，CancerResearch,49:6214-6220，(1989);和LitzingerandHuang，BioehimicaetBiophysicaActa,1104:179-187，(1992)。通常，受體參與內(nèi)吞途徑，不管是組成型的還是配體誘導(dǎo)的。這些網(wǎng)格蛋白包被小窩中的受體簇，通過網(wǎng)格蛋白包被嚢泡進(jìn)入細(xì)胞，穿過受體在其中分類的酸性內(nèi)體，然后要么再次循環(huán)到細(xì)胞表面在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，要么在溶酶體中降解。所述內(nèi)化途徑具有多種功能，如營養(yǎng)攝取、活化蛋白的移除、大分子的清除、病毒和毒素的機(jī)會(huì)進(jìn)入、配體的解離和降解，以及受體水平的調(diào)控。許多受體具有一條以上細(xì)胞內(nèi)途徑，這取決于細(xì)胞類型、受體濃度、配體類型、受體化合價(jià)和配體濃度。已有文獻(xiàn)綜述了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的分子和細(xì)胞機(jī)制(BrownandGreene,DNAandCellBiology10:6，399-409(1991))。a)可藥用載體149.組合物——包括抗體——可與可藥用載體聯(lián)合用于治療。合適的載體和它們的制劑在ie附/"g似"5We"cejP/rnr附flqv(19thed.)ed.A.R.Gennaro，MackPublishingCompany,Easton，PA1995中有所描述。通常，合適量的可藥用鹽被用于所述制劑中，以使所述制劑具有等滲透性。可藥用載體的實(shí)例包括但不限于鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述溶液的pH優(yōu)選地為大約5到大約8,更優(yōu)選地為大約7到大約7.5。其他載體包括持續(xù)釋放制劑，如含有抗體的固體疏水性多聚物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成型制品的形式，如膜、脂質(zhì)體或微粒。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，根據(jù)例如給藥途徑和所給予的組合物的濃度，某些載體可能為更優(yōu)選的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解可藥用載體。這些最具代表性的載體是用于將藥物給予人的標(biāo)準(zhǔn)載體，包括溶液如無菌水、鹽水和生理pH的緩沖溶液。所述組合物可通過肌內(nèi)或皮下給藥。其他化合物將會(huì)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)方法給藥。除了所選分子，藥用組合物還可包括載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖液、防腐劑、表面活性劑等。藥用組合物還可包括一種或多種活性成分如殺菌劑、抗炎劑、麻醉劑等。藥用組合物可通過多種方式給藥，取決于需要局部還是全身治療，以及需要治療的位置。給藥方式可是局部(包括眼部、陰道、直腸、鼻40內(nèi)給藥)、口服、吸入或胃腸外(例如靜脈滴注法)，皮下、腹腔內(nèi)或肌內(nèi)注射。所公開的抗體可通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或經(jīng)皮給藥。用于胃腸外給藥的制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。含水載體包括水、酒精/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充液、電解質(zhì)補(bǔ)充液(如基于林格氏葡萄糖的補(bǔ)充液)等。還可存在防腐劑和其他添加劑，如殺菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。用于局部給藥的制劑可包括軟膏、洗液、霜?jiǎng)?、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體、水基、粉劑或油基(aqueous、poweroroilybase)、增稠劑等是必須或合乎需要的。用于口服給藥的組合物包括粉劑或細(xì)粒、水或非水介質(zhì)的懸液或溶液、膠嚢、嚢劑或片劑。還需要增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或結(jié)合劑。某些組合物可以可藥用酸加成鹽或堿加成鹽的形式給藥，這些鹽是通過與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有機(jī)酸如曱酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸和富馬酸反應(yīng)形成的；或通過與無機(jī)堿如氫氧化鈉，氫氧化銨，氫氧化鉀和有機(jī)堿如單烷基胺、雙烷基胺、三烷基胺和芳胺和取代乙醇胺反應(yīng)形成的。b)治療應(yīng)用用于所述組合物給藥的有效劑量和方案可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，這種確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。所述組合物給藥的劑量為大至足以產(chǎn)生對(duì)癥狀有效的理想效果的劑量。所述劑量不應(yīng)該大至導(dǎo)致有害副作用，如不需要的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等。通常，所述劑量會(huì)隨患者的年齡、狀況、性別和疾病程度、給藥途徑或方案內(nèi)是否包括其他藥物而變化，其可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。在有任何禁忌癥的情況下，各個(gè)醫(yī)生可調(diào)整劑量。劑量可變動(dòng)，并可以每天一劑或多劑給予一或數(shù)天。文獻(xiàn)中可查到對(duì)用于給定類別的藥用產(chǎn)品的合適劑量的指導(dǎo)。例如，關(guān)于41選擇抗體合適劑量的指導(dǎo)可在關(guān)于抗體治療應(yīng)用的文獻(xiàn)中找到，如HandbookofMonoclonalAntibodies,Ferroneetal"eds.，NogesPublications,ParkRidge，NJ.，(1985)ch.22andpp.303-357;Smithetal"AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy,Habei*etal"eds.，RavenPress,NewYork(1977)pp.365-389。單獨(dú)使用的抗體每日劑量一般可在每天約1jig/kg體重至最高達(dá)100mg/kg體重或更高，取決于上面提到的因素。用于治療、抑制或防止胰島素抗性、癌癥或者其他疾病或障礙的所公開組合物(如抗體)給藥之后，所述治療抗體的效能可通過技術(shù)人員熟知的多種方法評(píng)估?？深A(yù)先將本文7>開的抑制PASK或降低PASK產(chǎn)生的組合物給予有患胰島素抗性或代謝綜合征危險(xiǎn)的患者或受試者。其他與PASK相互作用但不具有特別藥學(xué)功能但可用于例如追蹤細(xì)胞染色體內(nèi)變化或用于送遞例如診斷工具的分子，可按照與所述藥用產(chǎn)品相似的方式送遞。所公開的組合物和方法也可用作例如分離和檢驗(yàn)用于多種胰島素和代謝物相關(guān)疾病的新藥物候選物的工具。9.芯片和微陣列本文公開了其中至少一個(gè)地址是本文所公開的任一核酸序列中給出的序列或序列的一部分的芯片。還公開了其中至少一個(gè)地址是本文所公開的任一肽序列中給出的序列或序列的一部分的芯片。還公開了其中至少一個(gè)地址是本文所公開的任一核酸序列中給出的序列或序列的一部分的變體的芯片。還公開了其中至少一個(gè)地址是本文所公開的任一肽序列中給出的序列或序列的一部分的變體的芯片。10.計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)應(yīng)理解，所公開的核酸和蛋白可以被表示為由氨基酸的核苦酸組成的序列。有多種方式可顯示這些序列，例如核苷酸鳥嘌呤核苷可用G或g表示。類似地，氨基酸纈氨酸可用Val或V表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何用多種已存在方法中的任何一種來顯示和表示任何核苷酸或蛋白序列，這些方法的每一種都在本文中被考慮并公開。本文特別考慮到的是，這些序列在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的顯示，如商購軟盤、磁帶、芯片、硬盤、光盤、電視唱片或其他計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。本文還公開了所公42開序列的二進(jìn)制代碼。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解什么是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。因此，核酸或蛋白序列被記錄、儲(chǔ)存或保存在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上。本文公開了含有與本文所示序列有關(guān)的序列和信息的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。11.通過用所公開的組合物/組合化學(xué)篩選識(shí)別的組合物a)組合化學(xué)物以所期望的^式相i作用的^子或大分子。同樣公開的i通過組l技術(shù)或篩選技術(shù)識(shí)別的組合物，其中本文所公開的組合物或其部分被用作組合或篩選方案的目標(biāo)。應(yīng)理解，當(dāng)在組合技術(shù)或篩選方法中使用所公開的組合物時(shí)，具有特定的所需性質(zhì)(例如抑制或刺激目標(biāo)分子的功能)的分子(如大分子)會(huì)被識(shí)別。本文還公開了使用所公開的組合物識(shí)別和分離的分子，如與PASK相互作用的組合物。因此，使用包括所公開組合物(如PASK)的組合或篩選方法得到的產(chǎn)物也被認(rèn)為在本文中被考慮并公開。應(yīng)理解，所公開的用于識(shí)別可抑制例如PASK的分子的方法可使用例如高通量的方法進(jìn)行。例如，可通過快速識(shí)別相互作用的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)識(shí)別推定抑制劑。所述技術(shù)的理論基礎(chǔ)是，當(dāng)兩個(gè)分子在空間上接近時(shí)，即在超過背景的水平上相互作用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生信號(hào)或湮滅信號(hào)。那么，可進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)，包括如加入推定抑制劑。如果所述抑制劑與兩個(gè)信號(hào)分子之間的相互作用竟?fàn)?，所述信?hào)會(huì)在空間上互相遠(yuǎn)離，這會(huì)導(dǎo)致信號(hào)降低或增加，取決于所用信號(hào)的類型。該信號(hào)的降低或增加可與推定抑制劑的存在或缺少關(guān)聯(lián)起來?？墒褂萌魏涡盘?hào)傳導(dǎo)方法。例如，本文公開了識(shí)別任何兩個(gè)所公開分子之間相互作用的抑制劑的方法，包括在存在推定抑制劑的條件下使第一種分子和第二種分子接觸，其中所述第一種分子或第二種分子含有熒光供體，其中所述第一分子或第二分子(通常所述分子不含所述供體)含有熒光受體；并在存在和缺少推定抑制劑的條件下測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),其中在存在推定抑制劑的條件下與缺少推定抑制劑的條件下相比，F(xiàn)RET測(cè)量值的降低說明推定抑制劑抑制這兩種分子之間的結(jié)合。這種方法也可用細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行。43組合化學(xué)包括但不限于用于分離小分子或大分子的所有方法，其中所述大分子能夠與一個(gè)小分子或另一個(gè)大分子結(jié)合，一般以反復(fù)的方式。蛋白、寡核苷酸和糖是大分子的實(shí)例。例如，具有給定功能(催化或配體結(jié)合)的寡核苷酸分子可從已被稱為"體外遺傳學(xué)"的隨機(jī)寡核苷酸的復(fù)合混合物中分離出來(Szostak，TIBS19:89，1992)。有人合成了一個(gè)巨大的分子庫，所述分子帶有隨機(jī)序列和確定序列，并使復(fù)合混合物(例如100嗎的100個(gè)核苦酸RNA中的大約1015個(gè)獨(dú)立序列)經(jīng)受某種選擇和富集處理。通過親和色謙的重復(fù)循環(huán)和與所述柱上配體結(jié)合的分子的PCR擴(kuò)增，Ellington和Szostak(19卯)估計(jì)101()個(gè)RNA分子中的一個(gè)以這種方式折疊，從而與一個(gè)小分子染料結(jié)合。具有這種配體結(jié)合行為的DNA分子也已被分離出來(EllingtonandSzostak，1992;Bocketal，1992)。存在用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的小有機(jī)分子、蛋白、抗體和其他大分子的旨在相似目的的技術(shù)。不管是基于小有機(jī)文庫、寡核苷酸還是基于抗體，對(duì)具有所需活性的分子的系列篩選被廣泛地稱為組合化學(xué)。組合技術(shù)特別適合于定義分子之間的結(jié)合相互作用，并適合于分離具有特異性結(jié)合活性的分子，當(dāng)所述大分子為核酸時(shí)這種分子經(jīng)常被稱為適體。有若干種分離蛋白的方法，所述蛋白具有全新活性或改進(jìn)活性。例如，噬菌體展示文庫已被用于分離可與特定目標(biāo)相互作用的多種肽。(參見例如美國專利6,031,071;5,824,520;5，596，079和5,565,332,這些文獻(xiàn)中至少與噬菌體展示和組合化學(xué)有關(guān)的方法有關(guān)的材料以引用的方式納入本文中。)Roberts和Szostak描述了一種用于分離具有給定功能的蛋白的優(yōu)選方法(RobertsR.W.andSzostakJ.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997)。該組合化學(xué)方法將蛋白的功能性和核酸的遺傳性結(jié)合起來。生成一種RNA分子，其中噤呤霉素分子共價(jià)連接至所述RNA分子的3'末端。這種修飾的RNA分子的體外翻譯生成被所要翻譯的RNA編碼的正確蛋白。另外，由于噤呤霉素(一種不能延伸的肽基受體)的結(jié)合，生長(zhǎng)中的肽鏈要結(jié)合在結(jié)合于所述RNA上的噤呤霉素上。因此，所述蛋白分子就結(jié)合在編碼它的遺傳物質(zhì)上?，F(xiàn)在可完成正常體外選擇過程以分離功能性肽。一旦完成用于肽功能的選擇程序，就可進(jìn)行傳統(tǒng)核酸操作程序以擴(kuò)增編碼所選功能性肽的核酸。在對(duì)所述遺傳物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增之后，新的3'末端帶有噤呤霉素的RNA被轉(zhuǎn)錄，新肽被翻譯，并進(jìn)行另一輪的功能選擇。因此，可以重復(fù)的方式進(jìn)行蛋白選擇，其類似于核酸選擇技術(shù)。被翻譯的肽受到結(jié)合在嘌呤霉素上的RNA序列的控制。此序列可以是來源自經(jīng)改造用于進(jìn)行最優(yōu)化翻譯(即沒有終止密碼子等)的隨機(jī)序列的任何序列；或其可以是已知RNA分子的簡(jiǎn)并序列，以尋找已知肽的改進(jìn)或改變的功能。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知核酸擴(kuò)增和體外翻譯的條件，優(yōu)選地以Roberts和Szostak的方法進(jìn)行(RobertsR.W.andSzostakJ.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997-302(1997))。Cohen等人描述了用于旨在分離肽的組合方法的另一種優(yōu)選方法(CohenB.A.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(24):14272-7(1998))。此方法利用和改進(jìn)了雙雜交技術(shù)。酵母雙雜交系統(tǒng)用于蛋白蛋白相互作用的檢測(cè)和分析。所述雙雜交系統(tǒng)(最初使用釀酒酵母(5VlCcAflTWW^C^Sce"v/s/M)),是一種強(qiáng)有力的用于識(shí)別特異性針對(duì)目的蛋白的新調(diào)控分子的分子遺傳技術(shù)(FieIdsandSong,A^"^340:245-6(1989))。Cohen等人改造了此技術(shù)，使合成或改造的肽序列之間的新的相互作用可被識(shí)別，所述序列可與所選分子結(jié)合。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是選擇在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中完成的。此方法利用了與酸性活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合的肽分子的文庫。所選的肽(例如PASK的胞外部分)結(jié)合于轉(zhuǎn)錄活化蛋白(如Gal4)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上。通過在這種系統(tǒng)中使用雙雜交技術(shù)，可識(shí)別結(jié)合于PASK胞外部分的分子。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，結(jié)合多種組合文庫，技術(shù)人員可分離和表征那些與所需目標(biāo)結(jié)合或相互作用的小分子或大分子?？杀容^這些化合物的相對(duì)結(jié)合親和力，并通過竟?fàn)幮越Y(jié)合研究識(shí)別優(yōu)選化合物，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知建立和篩選組合文庫以分離與所需目標(biāo)結(jié)合的分子的技術(shù)。代表性的技術(shù)和方法可在下列美國專利中找到，但不限于此5，084，824、5,288,514、5，449，754、5,506,337、5，539，083、5，545，568、5，556，762、5,565,324、5，565，332、5,573,905、5,618,825、5,619,680、5,627,210、5,646,285、5,663,046、5,670,326、5，677，195、5,683,899、5,688,696、5,688,997、5,698,685、5,712,146、5,721,099、5,723,598、5,741,713、5,792,431、5，807，683、5,807,754、5，821，130、5,831,014、455,834,195、5,834,318、5，834，588、5，840，500、5,847,150、5，856，107、5，856，496、5，859，1卯、5，864，010、5，874，443、5,877,214、5,880,972、5,886,126、5,886,127、5,891,737、5，916，899、5,919,955、5,925,527、5，939，268、5,942,387、5,945,070、5,948,696、5,958,702、5，958，792、5,962,337、5,965,719、5,972,719、5,976,894、5,980,704、5,985,356、5，999，086、6，001，579、6,004,617、6,008,321、6,017,768、6，025，371、6,030,917、6,040,193、6,045,671、6,045,755、6,060,596和6,061,636?？墒褂萌舾刹煌暮铣煞椒ㄓ么罅糠肿咏⒔M合文庫。例如，含有融合2，4-嘧啶二酮(美國專利6，025，371)、二氫苯并吡喃(美國專利6，017，768和5,821,130)、酰胺醇(美國專利5，976，894)、羥基氨基酸酰胺(美國專利5，972，719)、碳水化合物(美國專利5,965,719)、1，4-苯并二氮-2，5-二酮(美國專利5，962，337)、環(huán)狀化合物(美國專利5,958,792)、聯(lián)芳氨基酸酰胺(美國專利5,948,696)、噻吩(美國專利5,942,387)、三環(huán)四氫喹啉(美國專利5，925，527)、苯并呋喃類(美國專利5,919,955)、異喹啉(美國專利5,916,899)、乙內(nèi)酰脲和乙內(nèi)酰硫脲(美國專利5，859，1卯)、丐l咮(美國專利5,856,496)、咪唑-吡咬-丐l咮和咪唑-吡咬-苯并噻吩(美國專利5,856,107)、取代2-曱撐-2，3-二氫噻唑(美國專利5,847,150)、喹啉(美國專利5,840,500)、PNA(美國專利5，831，014)、含有標(biāo)簽(美國專利5,721,099)、多聚乙酰(美國專利5,712,146)、嗎啉代亞基(美國專利5，698，685和5,506,337)、硫酰胺(美國專利5,618,825)和苯并二氮類(美國專利5,288,514)的文庫。本文使用的組合方法和文庫包括傳統(tǒng)篩選方法和文庫，以及在反復(fù)過程中使用的方法和文庫。12.篩選方法本文公開了調(diào)控PASK的測(cè)試化合物的一種篩選方法，包括用測(cè)試化合物與PASK接觸；并檢測(cè)PASK與所述測(cè)試化合物的相互作用；物。本文還公開了調(diào)控PASK的測(cè)試化合物的一種篩選方法，包括用測(cè)試化合物與PASK缺失的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物接觸；并檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中PASK水平的差異；其中PASK水平的差異標(biāo)示可調(diào)控PASK的化合物。46此調(diào)節(jié)可包含PASK或下游活性的增加。"增加，，是指測(cè)試化合物存在時(shí)的活性大于測(cè)試化合物不存在時(shí)的活性。此調(diào)節(jié)也可包含PASK或下游活性的降低。"降低，，是指測(cè)試化合物存在時(shí)的活性小于測(cè)試化合物不存在時(shí)的活性?？稍诖嬖诙喾N濃度的測(cè)試化合物的情況下測(cè)量AMPK或下游活性的應(yīng)答。測(cè)量步驟也可包含在存在多種濃度的測(cè)試化合物的情況下測(cè)量應(yīng)答。例如，所述測(cè)試化合物的濃度可從lnM到1000jiM。本發(fā)明所考慮的測(cè)定包括結(jié)合測(cè)定和活性測(cè)定；這些測(cè)定可以傳統(tǒng)或高通量的形式進(jìn)行。調(diào)節(jié)子篩選被設(shè)計(jì)用于識(shí)別刺激或抑制試劑。要篩選的可能試劑的來源包括天然來源如細(xì)胞提取物(如無脊推動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞和植物細(xì)胞)和合成來源，如化學(xué)化合物文庫或生物學(xué)文庫(如抗體物質(zhì)或肽文庫)。篩選試劑是根據(jù)刺激或抑制所述活性的能力。結(jié)合測(cè)定用于檢測(cè)活性水平?；钚缘墓δ芎徒Y(jié)合測(cè)定可很容易地被改造成適于篩選調(diào)節(jié)子如激動(dòng)劑(刺激)和拮抗劑(抑制)化合物。本文考慮到了許多用于篩選和識(shí)別調(diào)節(jié)子的測(cè)定，如PASK活性(及下游活性)的激動(dòng)劑和拮抗劑。在一個(gè)實(shí)例中，PASK分子是固定的，并檢測(cè)到與一個(gè)候選調(diào)節(jié)子的相互作用。在另一個(gè)實(shí)例中，測(cè)試化合物是固定的，且PASK是被溶解的。在另一個(gè)實(shí)例中，通過溶液測(cè)定評(píng)估PASK和所述測(cè)試化合物之間的相互作用。另一個(gè)考慮在內(nèi)的測(cè)定包括雙雜交測(cè)定的變化方案，其中蛋白/蛋白相互作用的調(diào)節(jié)子是通過對(duì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中的陽性信號(hào)的檢測(cè)來識(shí)別。本發(fā)明考慮在內(nèi)的用于篩選的候選調(diào)節(jié)子包括任何化學(xué)化合物，其中包括化學(xué)化合物的文庫。存在若干用于識(shí)別小分子調(diào)節(jié)子的不同文庫，包括(l)化學(xué)文庫，(2)天然產(chǎn)物文庫和(3)由隨機(jī)肽、寡核苷酸或有機(jī)分子組成的組合文庫?；瘜W(xué)文庫由隨機(jī)化學(xué)結(jié)構(gòu)或已知化合物的類似物或在以前的藥物發(fā)現(xiàn)篩選中已被識(shí)別為"命中物"或"先導(dǎo)物"的化合物的類似物組成，其中的一些可能得自天然產(chǎn)物或得自不定向合成有機(jī)化學(xué)。天然產(chǎn)物文庫是微生物、動(dòng)物、植物或海洋生物的集合，所述集合用于形成用于通過如下步驟篩選的混合物(l)發(fā)酵和提取取自土壤、植物或海洋微生物的肉湯或(2)提取植物或海洋生物。天然產(chǎn)物文庫包括多聚乙酰、非核糖體肽及其(非天然存在的)變體。綜述見Science47282:63-68(1998)。組合文庫由大量肽、寡核苷酸或有才幾化合物的混合物組成。通過傳統(tǒng)自動(dòng)合成方法、PCR、克隆或合成方法制備這些文庫相對(duì)容易。特別值得關(guān)注的是非肽組合文庫。其他目的文庫包括肽、蛋白、擬肽、多平行合成集合、重組和多肽文庫。組合化學(xué)及其所建文庫的綜述，見Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8:701-707(1997)。通過使用本文描述的多種文庫識(shí)別調(diào)節(jié)子可允許改造所述候選的"命中物"(或"先導(dǎo)物，，)以優(yōu)化"命中物，，調(diào)節(jié)活性的能力。本發(fā)明考慮在內(nèi)的候選調(diào)節(jié)子可被設(shè)計(jì)并包括可溶解形式的結(jié)合伴隨蛋白及其嵌合或融合蛋白。本文使用的"結(jié)合伴隨蛋白"廣泛地包括非肽調(diào)節(jié)子、肽調(diào)節(jié)子(如神經(jīng)肽變體)、抗體(包括單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能/雙特異性抗體、人源化抗體、人類抗體和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植抗體(包括包含CDR和/或特異性識(shí)別本發(fā)明多肽的抗原結(jié)合序列的化合物))、抗體片段和含有對(duì)所述表達(dá)產(chǎn)物免疫特異的抗體結(jié)構(gòu)域的修飾化合物。測(cè)量化合物與目標(biāo)蛋白的結(jié)合或相互作用的測(cè)定包括識(shí)別可抑制目標(biāo)蛋白不折疊或變性的化合物的測(cè)定、通過親和超濾然后進(jìn)行離子噴射質(zhì)i瞽/HPLC方法或其他物理和分析方法、毛細(xì)管電泳測(cè)定和雙雜交測(cè)定來分離與目標(biāo)蛋白結(jié)合的化合物的測(cè)定。美國專利5,585,277描述了一種這樣的篩選方法，其識(shí)別測(cè)試配體與目標(biāo)蛋白的直接結(jié)合，此專利以引用的方式納入本文中。此方法的原理是蛋白一般以折疊和不折疊狀態(tài)的混合物的形式存在，并持續(xù)在所述兩種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。當(dāng)測(cè)試配體結(jié)合于折疊形式的目標(biāo)蛋白時(shí)(即當(dāng)所述測(cè)試配體是所述目標(biāo)蛋白的配體時(shí))，被配體結(jié)合的所述目標(biāo)蛋白分子保持其折疊狀態(tài)。因此，當(dāng)結(jié)合目標(biāo)蛋白的測(cè)試配體存在時(shí)，折疊目標(biāo)蛋白存在的比例比缺少配體時(shí)更大。所述配體與所述目標(biāo)蛋白的結(jié)合可通過任何能夠區(qū)分目標(biāo)蛋白的折疊和非折疊狀態(tài)的方法測(cè)定。此測(cè)定的實(shí)施并不需要知道所述目標(biāo)蛋白的功能。實(shí)際上任何試劑都可作為測(cè)試配體通過此方法評(píng)估，包括但不限于金屬、多肽、蛋白、脂質(zhì)、多糖、多核苷酸和小有機(jī)分子。Wieboldtetal"AnalChem.，69:1683-1691(1997)中描述了用于識(shí)別目標(biāo)蛋白的配體的另一種方法，該文獻(xiàn)以引用的方式納入本文中。此技術(shù)在液相中一次可對(duì)20-30種試劑的組合文庫就其與目標(biāo)蛋白的結(jié)合48進(jìn)行篩選。通過單膜清洗可將與目標(biāo)蛋白結(jié)合的試劑從其他文庫組分中分離出來。保留在過濾器中的特異性選擇的分子隨后被從目標(biāo)蛋白中釋放出來，并且用HPLC和氣動(dòng)助力電噴射(離子噴射)離子質(zhì)語進(jìn)行分析。此過程篩選與所述目標(biāo)蛋白具有最大的親和力的文庫組分，尤其適用于小分子文庫?；蛘?，通過使用下述文獻(xiàn)中所述的酵母雙雜交系統(tǒng)間接地測(cè)定這種結(jié)合相互作用Fieldsetal.，Nature,340:245-246(1989)和Fieldsetal.，TrendsinGenetics,10:286-292(1994)所述，這兩篇文獻(xiàn)都以引用的方式納入本文中。所述雙雜交系統(tǒng)是一種檢測(cè)兩種蛋白或多肽之間相互作用的遺傳測(cè)定。其可用于識(shí)別與已知目的蛋白結(jié)合的蛋白，或用于描述對(duì)于相互作用關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域或殘基。已經(jīng)開發(fā)出這種方法的變化方案用來克隆編碼DNA結(jié)合蛋白的基因、識(shí)別與蛋白結(jié)合的肽以及篩選藥物。雙雜交系統(tǒng)利用一對(duì)相互作用的蛋白使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域接近DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力且雙雜交系統(tǒng)一般在酵母中工作，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一個(gè)報(bào)告基因的上游激活序列(UAS)上。所述測(cè)定需要構(gòu)建兩個(gè)雜交基因，其分別編碼(l)與第一蛋白融合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(2)與第二蛋白融合的激活結(jié)構(gòu)域。所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒌谝粋€(gè)雜交蛋白靶向報(bào)告基因的UAS;但是，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白缺少激活結(jié)構(gòu)域，此DNA結(jié)合雜交蛋白不激活所述報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。含有激活結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)雜交蛋白，不能自己激活報(bào)告基因的表達(dá)因?yàn)槠洳慌cUAS結(jié)合。然而，當(dāng)兩個(gè)雜交蛋白都存在時(shí)，第一個(gè)和第二個(gè)蛋白的非共價(jià)相互作用將激活結(jié)構(gòu)域連接到UAS，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。a)作為結(jié)合調(diào)節(jié)子的針對(duì)受體的抗體采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成針對(duì)受體的多克隆或單克隆抗體，并生成其有用的抗原結(jié)合片段或其變體。這些方案可在例如Sambrooketal.，MolecularCloning:aLaboratoryManual.SecondEdition,ColdSpringHarbor,N,Y.:ColdSpringHarborLaboratory(1989);Harlowetal.(Eds),AntibodiesALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,N.Y.(1988)中找到。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組多肽(或含有這種多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜)被用作生產(chǎn)抗體的抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有與受體的免疫原性部分相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)肽被用作抗原。優(yōu)選對(duì)應(yīng)受體胞外部分特別是胞外疏水部分的肽。所述抗原可與佐劑混合或連接半抗原以增加抗體產(chǎn)量。多克隆和單克隆抗體、嵌合(如人源化的)抗體、抗體片段及本文公開的抗體分子的所有其他形式整個(gè)都被稱為抗體產(chǎn)物。(1)多克隆或單克隆抗體作為一個(gè)示例性的方案，重組多肽或其合成片段被用于免疫小鼠以生成單克隆抗體(或免疫更大的哺乳動(dòng)物，如兔，用于生成多克隆抗體)。為增加抗原性，才艮據(jù)廠商建i義將肽綴合至KeyholeLympetHemocyanin(Pierce)。對(duì)初次注射，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化并進(jìn)行皮下注射。間隔兩到三周后，再次將另一份抗原用弗氏完全佐劑乳化并進(jìn)行皮下注射。最后的加強(qiáng)注射之前，從所述免疫小鼠中取得血清樣品并用蛋白質(zhì)印跡測(cè)定以確定與多肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體的存在。從所述免疫動(dòng)物中取得的血清可被用作多克隆抗血清或用來分離可識(shí)別受體的多克隆抗體?；蛘撸幩浪鲂∈蟛⑷〕鏊鼈兊钠⑴K以生產(chǎn)單克隆抗體。一個(gè)生產(chǎn)單克隆抗體的實(shí)例如下將脾臟置于10ml不含血清的RPMI1640中，通過在添加有2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素和100嗎/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco，Canada)的無血清RPMI1640中研磨脾臟形成單細(xì)胞懸液。將所述細(xì)胞懸液過濾并通過離心洗滌，并懸浮于無血清RPMI中。用相似的方法從三只首次接受實(shí)驗(yàn)的Balb/c幼鼠中獲得胸腺細(xì)胞并用作滋養(yǎng)層。將NS-I骨髓瘤細(xì)胞——在融合之前在含有10%FBS(HycloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)的RPMI中保持對(duì)數(shù)期三天——離心和清洗。一個(gè)生產(chǎn)雜交瘤融合體的實(shí)例如下將取自所述免疫小鼠的脾細(xì)胞與NS-I細(xì)胞結(jié)合并離心，然后吸取上清液。通過輕拍試管移出細(xì)胞沉淀物，在沉淀物中攪拌加入2ml370C的PEG1500(50%的溶于75mMHEPES的溶液，pH8.0)(Boehringer-Maimheim)，然后加入不含血清的RPMI。隨后，將所述細(xì)胞離心并將其重懸于含有15%FBS、100jiM次黃嘌呤鈉鹽、0.4nM氨喋呤、16nM胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT)(Gibco)、25單位/mlIL-6(Boehringer國Mannheim)和1.5X106胸腺細(xì)胞/ml的RPMI中,然后置入10個(gè)Corning平底96孔組織培養(yǎng)板(Corning，CorningN.Y.)中。50在融合后的第2、4和6天，從融合板的孔中中取出100nl培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基置換。在第8天，通過用ELISA測(cè)試與受體多肽結(jié)合的小鼠IgG的存在來篩選所述融合體。所選融合體通過稀釋進(jìn)一步克隆，直到獲得產(chǎn)生抗受體抗體的單克隆培養(yǎng)物。(2)來源自噬菌體展示的受體-中和抗體受體中和抗體可通過噬菌體展示技術(shù)生成，如Aujameetal.，HumanAntibodies,8(4):155-168(1997);Hoogenboom，TIBTECH，15:62-70(1997)和Raderetal"Curr.Opin.Biotechnol.,8:503-508(1997)中所描述的那些，所有這些文獻(xiàn)都以引用的方式納入本文中。例如，將以Fab片段形式存在的抗體可變區(qū)或連接的單鏈Fv片段融合到絲狀噬菌體次要外殼蛋白pIII的氨基末端。融合蛋白的表達(dá)和其摻入成熟噬菌體外殼產(chǎn)生了在其表面存在抗體和含有編碼所述抗體的遺傳物質(zhì)的噬菌體顆粒。將含有這種構(gòu)建體的噬菌體文庫在細(xì)菌中表達(dá)，并使用帶有標(biāo)a特異性的噬菌體抗體，(3)來源自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的受體中和抗體受體中和抗體是由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如小鼠生成的，這主要在Bruggemannetal"Immunol.Today17(8):391-97(1996)和Bruggemaimetal，Curr.Opin.Biotechnol.8:455-58(1997)中有所描述。將攜帶種系構(gòu)造中的V基因區(qū)段并在其淋巴組織中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，使用傳統(tǒng)免疫方法用多肽組分免疫。雜交瘤是通過傳統(tǒng)方法由免疫小鼠的B細(xì)胞生成的，并篩選所述雜交瘤來識(shí)別分泌抗受體抗體的雜交瘤(例如，如上所述)。(4)用于藥物發(fā)現(xiàn)的高通量篩選(HTS)系統(tǒng)所述文獻(xiàn)有很多在用于藥物發(fā)現(xiàn)的HTS結(jié)合測(cè)定中應(yīng)用放射性標(biāo)記的配體的實(shí)例(參見Williams,Med.Res.Rev.11:147-184(1991);Sweetnametal"J.Nat.Prod.56:441-455(1993)，這些文獻(xiàn)中關(guān)于高通量篩選的教導(dǎo)全部以引用的方式納入本文中)。也可能在HTS結(jié)合篩選中用放射性標(biāo)記的配體篩選新的神經(jīng)再生化合物。HTS結(jié)合測(cè)定優(yōu)選重組受體的其他原因包括更好的特異性(更高的相對(duì)純度)和生成大量51受體材料的能力(參見Hodgson,Bio/Technology10:973-980(1992))。許多異源系統(tǒng)可用于表達(dá)重組蛋白并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。這種系統(tǒng)包括細(xì)菌(Strosbergetal"TrendsinPharm.Sci.13:95-98(1992))、酵母(Pausch，TrendsinBiotech.15:487-494(1997))、幾種昆蟲細(xì)胞(VandenBroeck，Intl.Rev.Cytol.164:189-268(1996))、兩棲動(dòng)物細(xì)胞(Jayawickremeetal"Curr.Opin.Biotechnol.8:629-634(1997))和幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(CHO，HEK293,COS等；參見Gerhardtetal.,Eur.J.Pharmacol.334:1-23(1997);Wilsonetal"Brit.J.Pharmacol.125:1387-1392(1998))。這些實(shí)例不排除應(yīng)用其他可能的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，包括從線蟲獲得的細(xì)胞系(WO98/37177)。(5)基于反應(yīng)的受體HTS系統(tǒng)PASK、下游產(chǎn)物或PASK基因的抑制可導(dǎo)致多種生物學(xué)反應(yīng)，其一般受到宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的調(diào)控。所述蛋白可以是宿主細(xì)胞的天然成分，也可以是通過廣為人知的重組技術(shù)引入的。它們也可以是自然變體的突變。所述蛋白可以是完整的或嵌合的。也可使用熒光的改變監(jiān)控配體誘導(dǎo)的膜電位或細(xì)胞內(nèi)pH的改變；有文獻(xiàn)基于這些目的描述了適用于HTS的自動(dòng)系統(tǒng)(Schroederetal.，J.Biomol.Screening1:75-80(1996))。在可被這些測(cè)定識(shí)別的調(diào)控子中有天然配體化合物；天然配體的合成類似物和衍生物；抗體、抗體片段和/或源自天然抗體或類抗體組合文庫的類抗體化合物；和/或通過文庫的高通量篩選識(shí)別的合成化合物；和業(yè)內(nèi)已知的其他文庫。結(jié)合PASK的所有調(diào)控子均可用于識(shí)別組織樣品中類PASK的多肽(如用于診斷目的，病理目的和其他本領(lǐng)域中已知的目的)。出于本文所述目的，可分別使用激動(dòng)劑和拮抗劑調(diào)節(jié)子上調(diào)控和下調(diào)控PASK活性。可使用單一假定調(diào)節(jié)子進(jìn)行所述測(cè)定；它們也可能使用已知激動(dòng)劑結(jié)合候選拮抗劑進(jìn)行(反之亦然)?？墒褂玫目蓹z測(cè)分子包括但不限于可通過光鐠、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)、電子、放射和光學(xué)方法檢測(cè)的分子，其中光學(xué)方法包括但不限于生物發(fā)光法、磷光法和熒光法。這些可檢測(cè)分子應(yīng)該是生物相容的分子，且不應(yīng)該影響所述分子的生物學(xué)功能，且一定不能影響所述可檢測(cè)分子被檢測(cè)的能力。優(yōu)選的可檢測(cè)分子是光學(xué)可檢測(cè)的分子(包括光學(xué)可檢測(cè)的蛋白)，從而它們可被化學(xué)地、52機(jī)械地、電子地或放射地被激發(fā)以發(fā)出熒光、磷光或生物發(fā)光。更優(yōu)選的可檢測(cè)分子是固有的熒光分子，如熒光蛋白，包括例如綠色熒光蛋白(GFP)。所述可檢測(cè)分子可利用Barak等描述的方法(美國專利5，891，646和6,110,693)綴合到GRK蛋白上。所述可檢測(cè)分子可綴合在前端，末端或者中間。b)核酸檢測(cè)本發(fā)明的另一個(gè)特征是本文7>開的DNA序列的表達(dá)。如本領(lǐng)域中公知的，可通過將DNA序列與合適的表達(dá)載體中的表達(dá)控制序列可操作地連接并使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的單細(xì)胞宿主來表達(dá)所述DNA序列。多種宿主/表達(dá)載體的組合可用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。有用的表達(dá)載體可由例如染色體的、非染色體的和合成DNA序列的區(qū)段組成。合適的載體包括SV40衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9及它們的衍生質(zhì)粒如RP4;噬菌體DNA，例如噬菌體X的多種f汙生物如NM989，和其他噬菌體DNA,例如M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA;酵母質(zhì)粒如2.11111.質(zhì)粒或其衍生物；用于真核細(xì)胞的載體如用于昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體；源自質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體，如已經(jīng)修飾以使用噬菌體DNA或其他表達(dá)控制序列的載體等等。多種表達(dá)控制序列——控制與它可操作地連接的DNA序列表達(dá)的序列——的任一種，均可用于這些載體以表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這種可用的表達(dá)控制序列包括，例如，SV40、CMV、牛痘病毒、多瘤病毒或腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、LTR系統(tǒng)、噬菌體1的主要操作子和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子(如Pho5)、酵母a-交配因子的啟動(dòng)子，和其他已知可控制原核或真核細(xì)胞或它們的病毒基因表達(dá)的序列，以及其多種組合。多種單細(xì)胞宿主細(xì)胞也可用于本發(fā)明DNA序列的表達(dá)。這些宿主包括廣為人知的真核和原核宿主，如大腸桿菌菌林、假單胞菌屬、桿狀菌屬、鏈霉菌屬、真菌如酵母、植物細(xì)胞、線蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，如HEK-293、CHO、Rl.l、B-W和L-M細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆蟲細(xì)胞(如Sf9)以及組織53培養(yǎng)物中的人類細(xì)胞和植物細(xì)胞。c)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)所公開的組合物可用作任何分子建模技術(shù)的目標(biāo)以識(shí)別所公開組/乂用的分子，如小分子。應(yīng)理解，當(dāng)在建模技術(shù)中使用所公開的組合物時(shí)，分子如大分子會(huì)被識(shí)別，這些分子具有特別想要的性質(zhì)，如抑制或刺激所述目標(biāo)分子的功能。本文還公開了使用所公開的組合物識(shí)別和分離的分子，如PASK抑制劑。因此，一種分離與所選分子結(jié)合的分子的途徑是通過合理設(shè)計(jì)。這可通過結(jié)構(gòu)信息和計(jì)算機(jī)建模達(dá)成。計(jì)算機(jī)建模技術(shù)使選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)以及將與所述分子相互作用的新化合物的合理設(shè)計(jì)可視化。所述三維結(jié)構(gòu)一般基于選定分子的x射線結(jié)晶學(xué)分析或NMR成像的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要力場(chǎng)數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)可預(yù)測(cè)新化合物如何連接至目標(biāo)分子，并可對(duì)化合物結(jié)構(gòu)和目標(biāo)分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作以達(dá)到理想的結(jié)合特異性。當(dāng)分子-化合物一者或兩者中出現(xiàn)小的變化時(shí)，對(duì)于該分子-化合物相互作用是什么的預(yù)測(cè)需要分子力學(xué)軟件和計(jì)算方面強(qiáng)有力的計(jì)算機(jī)，所述計(jì)算機(jī)通常與分子設(shè)計(jì)程序和使用者之間的用戶友好的菜單驅(qū)動(dòng)界面偶聯(lián)。分子建模系統(tǒng)的實(shí)例為PolygenCorporation,Waltham，MA的CHARMm和QUANTA程序。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)造、圖像建模和分子結(jié)構(gòu)分析。QUANTA允許對(duì)分子彼此之間的行為進(jìn)行可交互式構(gòu)造、修飾、可視化和分析。若干文獻(xiàn)綜述了藥物與特異性蛋白之間相互作用的計(jì)算機(jī)建模，如Rotivinen,etal"1988Jc/fli^flr/Mflcew/ZciiFe朋/cfl97，159-166;Ripka，iV嫌54-57(June16，1988);McKinalyandRossmaim，1989iev.^P/ror附ac0/.7bx/ciV/.29，111-122;PerryandDavies，OSARiQuantitativeStructure-ActivityRelationshipsinDrugDesign卯.189-193(AlanR.Liss，Inc.1989);LewisandDean,1989及.Soc.丄om/.236，125-140and141-162;并且關(guān)于核酸組分的模型酶的Askew,etal.，1989/爿附.Soc.Ill,1082-10卯。其他篩選和圖解化學(xué)藥品54的計(jì)算機(jī)程序可由BioDesign，Inc.,Pasadena,CA.;Allelix，me，Mississauga,Ontario,Canada和Hypercube,Inc.,Cambridge,Ontario等公司提供。盡管這些主要是設(shè)計(jì)用于特異性針對(duì)特定蛋白的藥物，但是一旦DNA或RNA特定區(qū)域被識(shí)別，它們也可被改造為適用于設(shè)計(jì)與所述DNA或RNA特定區(qū)域特異性相互作用的分子。盡管上文描述了可改變結(jié)合的化合物的設(shè)計(jì)和生成，人們也可從已物，其中已知化合物包括天然產(chǎn)物或合成化學(xué)藥品且生;活性材料包括蛋白。13.試劑盒試劑盒可包括本文所討論的任何試劑或試劑組合，或可被理解為實(shí)施所公開方法時(shí)所必需的或有益的試劑或試劑組合。例如，公開了治療受試者的胰島素抗性的試劑盒，包含本文公開的組合物。D.《吏用所述組合物的方法1.使用所述組合物作為研究工具的方法所/>開組合物可以多種方式用作研究工具。例如，所/〉開組合物可用于通過例如用作結(jié)合抑制劑來研究PASK及其下游基因之間的關(guān)系。2.基因修飾和基因中斷的方法所7〉開組合物和方法可用于在任何可經(jīng)歷這些事件的動(dòng)物體內(nèi)的目標(biāo)基因的中斷和修飾。基因修飾和基因中斷是指以選擇性除去或改變動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)體內(nèi)基因或染色體段為主的方法、技術(shù)和組合物，其方式為通過哺乳動(dòng)物種系來傳播所述修飾。一般，細(xì)胞是用設(shè)計(jì)來與例如本文所述的細(xì)胞內(nèi)特定染色體區(qū)域同源重組的載體轉(zhuǎn)化的。這一同源重組事件可產(chǎn)生已引入外源DNA的染色體，例如所述基因被引入閱讀框內(nèi)，周圍是DNA。。這種方案允許在細(xì)胞內(nèi)的基因組中引入非常特異的突變，如點(diǎn)突變。本文公開了進(jìn)行這種同源重組的方法。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行同源重組的優(yōu)選特點(diǎn)之一是所述細(xì)胞能夠被培養(yǎng)，因?yàn)樾枰闹亟M事件發(fā)生的頻率較低。一旦通過本文所述的方法生產(chǎn)出所述細(xì)胞，那么就可通過干細(xì)胞技術(shù)或克隆技術(shù)從此細(xì)胞中產(chǎn)生動(dòng)物。例如，如果所述核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是生物體的干細(xì)胞，那么此細(xì)胞在轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)后可用于生產(chǎn)會(huì)在種系細(xì)胞中含有基因修飾或中斷的生物體，該生物體隨后可被用于生產(chǎn)另一只在其所有細(xì)胞中含有所述基因修飾或中斷的動(dòng)物。在其他用于生產(chǎn)在其所有細(xì)胞中含有基因修飾或中斷的動(dòng)物的方法中，可使用克隆技術(shù)。這些技術(shù)一般取出所述被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核，并通過融合或置換使該被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核與卯母細(xì)胞融合，所述卵母細(xì)胞又可經(jīng)過處理以產(chǎn)生動(dòng)物。使用克隆方法代替ES技術(shù)的方法的好處是該細(xì)胞而非ES細(xì)胞可被轉(zhuǎn)染。例如，非常易于培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞可用作被轉(zhuǎn)染且具有基因修飾或中斷事件發(fā)生的細(xì)胞，繼而源自此細(xì)胞的細(xì)胞可用于克隆整只動(dòng)物。3.治療癌癥的方法所公開組合物可用于治療任何其中發(fā)生不受控制的細(xì)胞增殖的疾病，如癌癥。不同類型癌癥的非限制性的列表如下淋巴瘤(Hodgkins和非Hodgkins)、白血病、癌、固態(tài)組織癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、高度神經(jīng)膠質(zhì)瘤、母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、黑素瘤、腺瘤、低氧瘤、骨髓瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤或肉瘤、轉(zhuǎn)移癌或普通癌癥可用所公開組合物治療的癌癥的代表性但非限制性列表如下淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉芽肺、何杰金氏病、髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、腦癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、頭頸部癌、頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤/膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、黑色素瘤，口腔、咽、喉和肺的鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌、宮頸癌、乳腺癌和上皮癌、腎癌、泌尿生殖道癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌癥;睪丸癌;結(jié)腸和直腸癌、前列腺癌、或胰腺癌。本文公開的化合物也可用于治療初癌期病癥如子宮頸和肛門發(fā)育異常、其他發(fā)育異常、嚴(yán)重發(fā)育異常、超常增生、非典型增生和瘤形成。E.實(shí)施例提出下列實(shí)施例以向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供關(guān)于如何制造和評(píng)價(jià)本文要求保護(hù)的化合物、組合物、物品、設(shè)備和/或方法的完整公開和描述，僅意在示例而并非意在限制本公開內(nèi)容。關(guān)于數(shù)字(如量、溫度等)，已經(jīng)努力保證精確性，但也有一些誤差和偏差。除非另外說明，份數(shù)為重56量份數(shù)，溫度以-c表示或?yàn)槭覝?，壓力為大氣壓或接近大氣壓?.實(shí)施例l:PAS激酶通過抑制AMPK表達(dá)調(diào)控能量?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定a)尸ASXM、鼠中胰島素分泌和作用的分析為了檢查iMSA^小鼠體內(nèi)葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)，測(cè)量了腹膜內(nèi)葡萄糖注射前后的血漿胰島素水平。如圖la中所示，在葡萄糖注射后5分鐘和45分鐘時(shí)，iM5X、J、鼠體內(nèi)的胰島素水平都明顯低于野生型(WT)同窩出生仔畜。這種胰島素分泌缺陷在分離到體外的朗格罕胰島中也非常明顯。通過使用胰島表面灌流實(shí)驗(yàn)，證明/M5X^胰島在GSIS方面有缺陷，尤其在高葡萄濃度時(shí)(圖lb)。在這些實(shí)驗(yàn)中7M^A^胰島分泌的胰島素總量只占野生型胰島分泌的胰島素總量的56%。為了評(píng)估這種血內(nèi)胰島不足是否會(huì)損害全身葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進(jìn)行了葡萄糖耐受測(cè)試(GTT)，其中在葡萄糖注射之后的一段時(shí)間里監(jiān)測(cè)血漿葡萄糖水平。/M5X、鼠表現(xiàn)輕微但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不明顯的葡萄糖耐受不良(圖lc)，與中度低胰島素血癥表型一致。胰島素敏感度一一通過胰島素耐量測(cè)試(ITT)測(cè)定——在WT和/M5X、J、鼠之間沒有明顯不同(圖ld)。已知當(dāng)喂以高脂飲食時(shí)(HFD)，C57BL/6J小鼠會(huì)發(fā)展出肥胖癥和一系列代表代謝綜合征的癥狀，包括胰島素抗性(Surwit1988)。為了檢查在胰島素需求增加的條件下/M57^小鼠的胰臟p細(xì)胞的功能，它們被從12周齡起喂以HFD并對(duì)其進(jìn)行GTT和ITT實(shí)驗(yàn)。喂以HFD的/MS、J、鼠表現(xiàn)出比WT同窩出生仔畜更好的葡萄糖耐受(圖le)和更高的胰島素敏感度(圖lf)。事實(shí)上，喂以HFD可導(dǎo)致WT小鼠體內(nèi)的葡萄糖耐受和胰島素敏感度發(fā)生缺陷，但對(duì)iMSA^小鼠幾乎沒有或沒有作用(圖lc對(duì)圖le,圖ld對(duì)圖lf)。正如根據(jù)胰島素敏感性的增加所作出的預(yù)期一樣，喂以HFD的/M5X、J、鼠的禁食胰島素水平低于WT小鼠的一半。b)/M5X、鼠可避免患飲食誘導(dǎo)的肥胖癥除了可避免患胰島素抗性，iM5X〃小鼠也可避免患HFD誘導(dǎo)的肥胖癥。喂以NCD的WT和/M5JrM、鼠增加了差不多的重量(圖2a)，但喂以HFD的iMSA^小鼠的重量增加明顯少于WT同窩出生仔畜(圖2b)的重量增加。喂以HFD8周后，/M5X^小鼠的體重與年齡一致的喂以NCD的7MS^-小鼠差不多。用雙能X-線吸收儀對(duì)身體組分的分析確認(rèn)，總體57重的不同完全是由于iM5X、J、鼠體內(nèi)的脂肪含量減少。飲食誘導(dǎo)的肥胖癥一般伴隨著周緣組織中甘油三酯積聚的增加，所述甘油三酯積聚與胰島素抗性的發(fā)生密切相關(guān)(Voshol2003)。肝臟甘油三酯含量通過組織學(xué)染色(圖2c)和酶法定量(圖2d)檢測(cè)。在這兩種情況下，iM5^-小鼠都被證實(shí)可完全避免肝臟中脂質(zhì)積聚的增加，所述增加已在喂以HFD和NCD的WT小鼠體內(nèi)觀察到。實(shí)際上，喂以HFD的iM5JTA小鼠的肝臟甘油三酯水平與喂以NCD的WT或iM5i^小鼠的肝臟甘油三酯水平幾乎不能辨別。c)iHSX、卜鼠的代謝速率加快肥胖癥是由于能量攝入(形式為喂養(yǎng))和能量消耗(形式為生理活動(dòng)和基礎(chǔ)代謝)之間的不平衡所致(Spiegelman2001)。為了確定PASIC、J、鼠中無脂肪表型的機(jī)理，用代謝室通過間接量熱法測(cè)量了食物攝入、自發(fā)活動(dòng)、02消耗和C02排出。食物攝入和自發(fā)活動(dòng)在iM5"ifi^小鼠和WT同窩出生仔畜中是類似的，但是iM^f〃小鼠在白天和夜間都消耗更多的02、排出更多的C02并且產(chǎn)生更多的熱量(圖3a)。PAWTM、鼠中的這種代謝亢#型在透化比目魚肌纖維中也很明顯，其中iMSA^肌肉的最大ATP產(chǎn)生速率較WT肌肉的高(圖3b)。一種對(duì)所觀察到的代謝亢進(jìn)表型和增加的ATP合成的解釋是線粒體數(shù)目或/MSA^肌肉的增加。然而，比目魚肌的電子顯微照片(圖3c)和隨后的定量顯示/MSA^和WT比目魚肌之間的線粒體數(shù)量/質(zhì)量沒有明顯增加。另外，檸檬酸合酶(一種線粒體密度的標(biāo)記物(Leek2001))的活性在尸ASX^和WT比目魚肌提取物中是相等的(圖3d)。d)在iMAfi^組織中AMPK的表達(dá)和活性是上調(diào)的。在PASK一小鼠中研究了AMPK的表達(dá)和活性。如圖4a所示，取自尸ASA^-小鼠的肝臟提取物中的AMPK蛋白水平有顯著上升。這種總蛋白水平的變化似乎導(dǎo)致AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。我們觀察到磷酸化或活性形式的AMPK強(qiáng)烈增加。還觀察到乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化增加，該酶是一種已知的AMPK的直接磷酸化目標(biāo)(Shaw，2004)。另外，我們還，見察到已知的AMPK應(yīng)答的mRNA的增加。我們檢測(cè)了腓腸肌、比目魚骨骼肌和胰島中的AMPK水平。在所有這三種情況下，/M5X、且織都表現(xiàn)出AMPK蛋白水平的增加(圖4b)。為了確定所觀察到的AMPK增加是響應(yīng)于PASK缺失的繼發(fā)或生理學(xué)適應(yīng)性反應(yīng)的概率，檢查了在所培養(yǎng)的細(xì)胞中PASK的急性敲低(knockdown)的影響。在HEK293細(xì)胞和L6肌細(xì)胞中，PASK抑制都導(dǎo)致AMPK表達(dá)的強(qiáng)烈增加(圖4c)。由于在同樣培養(yǎng)條件下所培養(yǎng)的細(xì)胞可再現(xiàn)AMPK水平的增加，因此可得出結(jié)論其不是由于尸AWT、鼠體內(nèi)的激素或營養(yǎng)條件改變所引起的繼發(fā)反應(yīng)。之前就已證實(shí)HFD的維持可導(dǎo)致骨骼肌中AMPK表達(dá)降低(Liu，2006)。這暗示了AMPK的這種損失對(duì)與該飲食方案有關(guān)的代謝異常的發(fā)病機(jī)理中有重要作用。為了確定PASK在調(diào)控這些作用中的潛在作用，檢查了喂以NCD或HFD的WT和尸AWr、鼠的腓腸肌中的AMPK水平。觀察到喂以HFD的WT小鼠體內(nèi)的AMPK水平相對(duì)于喂以NCD的小鼠體內(nèi)的AMPK水平有所下降。然而這種下降在尸A^r、卜鼠中完全消失。因此，PASK是在喂以HFD的小鼠的骨骼肌中觀察到的AMPK的丟失所必需的。e)討論本文已描述了一系列與小鼠體內(nèi)PASK基因缺失有關(guān)的組織特異性代謝表型。還已經(jīng)觀察到AMPK蛋白水平的增加，其似乎在每種這些組織中都導(dǎo)致了所述表型。AMPK過表達(dá)與體外和體內(nèi)胰臟p細(xì)胞中胰島素產(chǎn)生和分泌的降低有關(guān)(daSilva2003，Richards2005)。肝臟脂質(zhì)積聚也已經(jīng)被證明因AMPK激活而改善(Winder1999)。最后，AMPK激活牽涉到骨骼肌中氧化代謝的增加(Hardie2003)。因此，所描述的每種細(xì)胞和組織特異性表型均是由于細(xì)胞AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活所致。PASK-AMPK相互作用代表一種細(xì)胞代謝傳感途徑之間相互干擾的清楚實(shí)例。PASK被胰腺p細(xì)胞中的刺激性葡萄糖濃度所激活，且PASK作為細(xì)胞自發(fā)營養(yǎng)物或代謝充分傳感器。f)方法動(dòng)物。/MSA^小鼠的基因型如文獻(xiàn)所述(Katschinski2003)。在C57BL/6J(Jackson實(shí)驗(yàn)室)的第5代回交之后，12周齡到24周齡的雄性小鼠用于所有實(shí)驗(yàn)，除了胰島表面灌流研究是用雌性進(jìn)行。小鼠用普通飲食喂養(yǎng)(HarlanTeklad3080)或從12周齡開始用高脂飲食(按卡路里計(jì)算45%的脂肪，ResearchDiets,D12451)艱養(yǎng)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，年齡一59致的野生型同窩出生^f子畜用作iM5Jr、卜鼠的對(duì)照。體內(nèi)葡萄糖/胰島素耐受試驗(yàn)和胰島素分泌。對(duì)于GTT和血漿胰島素測(cè)量，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食6小時(shí)，然后腹膜內(nèi)注射葡萄糖(lg/kg體重)。在指定的時(shí)間，對(duì)尾靜脈血取樣用血糖儀(BayerCorp.)測(cè)定葡萄糖或用SensitiveRatInsulinRIAKit(LincoResearch)測(cè)量胰島素。對(duì)于ITT,向隨意喂養(yǎng)的小鼠^M內(nèi)給藥人類重組胰島素(NovoNordisk,0.75U/kg體重)，并在指定的時(shí)間測(cè)定血液葡萄糖水平。胰島分離和表面灌流。用前人所述的導(dǎo)管釋放酶胰島(Roche)消化法從胰臟分離朗格罕胰島(Cooksey2004)。如文獻(xiàn)所述，15-17個(gè)尺寸匹配的胰島是經(jīng)過單獨(dú)挑選的，并用于所述的表面灌流實(shí)驗(yàn)。作為表面灌流緩沖液一部分的葡萄糖和所釋放的胰島素分別用葡萄糖分析儀(BeckmanInstruments)和SensitiveRatInsulinRIAKit(LincoResearch)領(lǐng)'J量。肝臟甘油三酯含量測(cè)定。肝臟甘油三酯含量的定量分析通過用乙醇KOH皂化肝臟來進(jìn)行，如文獻(xiàn)所述(Norris2003)。在用MgCl2中和之后，在水解作用中產(chǎn)生的甘油用FreeGlycerolReagent和GlycerolStandardSolution(Sigma)通過比色試驗(yàn)來測(cè)定。組織學(xué)和電鏡學(xué)。為進(jìn)行油紅O染色，將冰凍肝臟樣品包埋到OTC試劑(Tissue-Tek)中并在恒冷切片機(jī)中切成8fim。將冰凍切片固定在50°C的曱醛蒸汽中，在0.5%油紅0的異丙醇溶液中孵育，并用蘇木精(Sigma)負(fù)染。為進(jìn)行EM,3對(duì)WT和尸AS"J^-比目魚肌被固定，在梯度乙醇中脫水并包埋于PolyBed塑性樹脂中用于切片，如文獻(xiàn)所述(Leone2005)。比目魚肌線粒體數(shù)目是以盲方式用電子顯微圖片定量的，放大倍數(shù)為8000X,并標(biāo)準(zhǔn)化為Z線數(shù)目。4義謝室研究。用四室Oxymax系統(tǒng)(ColumbusInstmments)進(jìn)行間接量熱法。使動(dòng)物在代謝室中適應(yīng)4小時(shí)，然后每15分鐘測(cè)量一次單獨(dú)圏養(yǎng)小鼠的V02、VC02、熱產(chǎn)生、食物和水的攝取以及活動(dòng)，連測(cè)3天。將從6pm到6am的平均數(shù)據(jù)表示為夜間值，而從6am到6pm的數(shù)據(jù)表示為日間值。線粒體呼吸實(shí)驗(yàn)。比目魚肌纖維被分離并用皂普透化處理。通過將纖維與lmM外源ADP接觸測(cè)定最大(ADP刺激的)ATP產(chǎn)生速率，如文獻(xiàn)所述(Leone2005)。琥珀酸鹽用作底物。檸檬酸合成酶活性測(cè)定。用分光光度法測(cè)量CS活性，如文獻(xiàn)所述(Boudiim2005)。簡(jiǎn)而言之，將冰凍的比目魚肌在冰上勻漿，然后通過凍融所述勻漿物將檸檬酸合成酶從線粒體中釋放出來。通過將草酸乙酰鹽加入1ml的用含有乙酰輔酶A的反應(yīng)緩沖液稀釋的勻漿物中來啟動(dòng)反應(yīng)，然后用Ultrospec3000分光光度計(jì)(Amersham)在412nm處監(jiān)測(cè)3分鐘。RNA干擾和腺病毒產(chǎn)生。用Invitrogen網(wǎng)站軟件設(shè)計(jì)含有乾向人類、小鼠和大鼠PASK基因的序列和亂序shRNA的shRNA寡核苷酸雙鏈，并克隆到腺病毒shRNA載體pAdshRNA/hU6中。根據(jù)廠商指示，使用AdEasyTMAdenoviralVectorSystem(Stratagene)用這些構(gòu)建體生產(chǎn)腺病毒。shRNA序列PASK#1-GATGCCAAGACCACAGAGA(SEQIDNO:1)、PASK#2-GCGCAGACAAGCTCAAAGA(SEQIDNO:2)和亂序的畫GCGCAGACAAGCTCAAAGA(SEQIDNO:3)。蛋白質(zhì)印跡。在進(jìn)行勻漿化和超聲之后用裂解緩沖液制備組織(分離的胰島、塌夂腸肌和比目魚肌以及肝臟)或細(xì)胞(HEK293細(xì)胞、大鼠L6肌細(xì)胞)的裂解產(chǎn)物。將取自每個(gè)樣品的大約50照蛋白質(zhì)一一用AdvancedProteinAssayReagent(Cytoskeleton，Inc)測(cè)定--用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Fisher)上，并按照生產(chǎn)商的說明書與所示抗體雜交。AMPK、Phospho-AMPK(T172)、ACC和Phospho誦ACC(S79)購自CellSignallingInc。實(shí)時(shí)定量RT-PCR。才艮據(jù)生產(chǎn)商i兌明，用RNAStat60試劑(Tel-TestInc.)從100mg肝臟樣品中提取總RNA，并用RNeasyMiniKit(Qiagen)純化。用SuperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。用基于SYBRGreen的方法在RocheLightCycler上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,如文獻(xiàn)所述(Cooksey2004)。包括熔解曲線分析和模擬反轉(zhuǎn)錄對(duì)照，以確保擴(kuò)增子的特異性。用于所示轉(zhuǎn)錄物的引物序列可按要求制得。統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值士s.e.m形式表示。兩尾等方差t檢驗(yàn)用于比較WT和尸AW^-同窩出生仔畜之間的不同，且無效假說在0.05水平被拒絕。2.實(shí)施例2:PAS激酶是正常細(xì)胞能量平衡所必需的a)總結(jié)代謝綜合征，一系列與肥胖癥和糖尿病有典型聯(lián)系的復(fù)雜表型，對(duì)全球公眾健康威脅越來越大?；旧?，代謝綜合征是由于正確感覺和應(yīng)答細(xì)61胞代謝信號(hào)失敗導(dǎo)致的。使用iM5X、鼠研究了細(xì)胞代謝感應(yīng)器PAS激酶(PASK)在代謝病的發(fā)病機(jī)制中的作用。發(fā)現(xiàn)由尸AMT缺失導(dǎo)致的組織特異性代謝表型與其作為代謝感應(yīng)器的作用一致。特別是，尸vl^^小鼠表現(xiàn)出肝臟中甘油三酯儲(chǔ)量發(fā)生變化以及在骨骼肌中代謝率增加。此夕卜，iM5X缺失使得完全避免了高脂飲食的有害作用，包括肥胖癥和胰島素抗性。與其在代謝感應(yīng)上的作用一致，肝臟中PASKmRNA由再飼嚴(yán)重豫導(dǎo)。還證明，這些效果，即氧化代謝率增加和PASKmRNA祠喂調(diào)控，出現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞中。因此似乎PASK以細(xì)胞自主方式維持細(xì)胞能量?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定且是潛在的代謝病治療目標(biāo)。b)前言由于飲食和生活方式的變化，肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)急劇增加。當(dāng)胰腺p-細(xì)胞不能分泌足夠的胰島素以補(bǔ)償外周胰島素抗性時(shí)就出現(xiàn)2型糖尿病。2型糖尿病現(xiàn)在廣泛被認(rèn)為是一種被稱為代謝綜合征的更為廣泛的基礎(chǔ)代謝疾病的表現(xiàn)其特征在于高血糖、高胰島素血癥、血脂障礙、高血壓、內(nèi)臟型肥胖和心血管病(Reaven1988)。世界衛(wèi)生組織估計(jì)這10年將見證糖尿病在世界范圍內(nèi)發(fā)生率增加46%(從1.51億增加到2.21億)，其中這種增長(zhǎng)的絕大部分是由于代謝綜合征相關(guān)的2型糖尿病所致(Zimmet2001)。細(xì)胞能量和營養(yǎng)感應(yīng)器決定細(xì)胞如何對(duì)過度的營養(yǎng)和異常的營養(yǎng)作出應(yīng)答，并且能量感應(yīng)是對(duì)代謝綜合征發(fā);^作用的因素(Lindsley2004;Marshall2006)。AMP活化蛋白酶(AMPK)和雷帕霉素的哺乳動(dòng)物耙標(biāo)(mTOR)是兩種研究較好的和進(jìn)化保守的細(xì)胞能量和營養(yǎng)感應(yīng)器。AMPK耗轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP生產(chǎn)(Hardie1998)。與AMPK不同，mTOR可通過足量細(xì)胞能量或者養(yǎng)分，尤其是氨基酸來激活(Proud2002)。mTOR的激活通過核糖體S6激酶(S6K)和elF4E結(jié)合蛋白(4E-BP)的磷酸化增加蛋白合成來刺激細(xì)胞生長(zhǎng)(Gingras2001)。AMPK活性的降低和mTOR活性提高與肥胖癥、糖尿病和癌癥有關(guān)(Winder1999;Manning2004;Inoki2005)。和AMPK與mTOR—樣，PAS激酶(PASK)是從酵母到人類都保守的養(yǎng)分應(yīng)答性蛋白激酶。PASK的PAS結(jié)構(gòu)域與激酶催化結(jié)構(gòu)域特異62性相互作用，并以順式方式失活所述激酶(Rutter2001)?；谏突驍?shù)據(jù)，已經(jīng)提出這樣一個(gè)模型，其中一個(gè)小的代謝物通過直接與PAS結(jié)構(gòu)域相互作用激活PASK,并干擾其與所述激酶結(jié)構(gòu)域的相互作用(Amezcua2002;Rutter2002)。用所培養(yǎng)的胰腺卩-細(xì)胞進(jìn)行的研究支持PASK在營養(yǎng)感應(yīng)中的作用。尤其，已證明PASK可由葡萄糖在翻譯后和基因表達(dá)水平上調(diào)控(daSilvaXavier2004)。PASK在葡萄糖和能量?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的體內(nèi)作用在本研究中講述。通過使用/M5JrM、鼠(Katschinski2003)，已證明PASK缺失導(dǎo)致對(duì)高脂飲食引起的表型(包括肥胖癥，胰島素抗性和肝甘油三酯的積聚)的抗性。這種保護(hù)可能是由于7MSA^小鼠體內(nèi)與AMPK、mTOR和PGC-1的活性無關(guān)的代謝率和能量支出增加所致。一旦由RNAi急劇敲低PASK，則還可在所培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到氧化代謝和ATP生成增加。除了以前觀察到的翻譯后激活，肝臟和經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞中的PASK基因表達(dá)在再伺時(shí)被刺激。這些細(xì)胞作用_一重現(xiàn)了體內(nèi)觀察的效果_一支持了PASK作為細(xì)胞能量平衡的細(xì)胞自主調(diào)節(jié)器起作用這一假說。c)結(jié)果(l)喂以HFD的iM5X、J、鼠體內(nèi)葡萄糖耐受得到改善、胰島素敏感性和^巴胖癥抗性增加為了評(píng)估iMSI是否是用于維持葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的，進(jìn)行了葡萄糖耐受測(cè)試(GTT)，其中在注射葡萄糖后隨時(shí)間監(jiān)測(cè)血漿葡萄糖水平。iM57rM、鼠表現(xiàn)輕微地但在統(tǒng)計(jì)上不明顯的葡萄糖耐受不良(圖1C)。胰島素敏感性——通過胰島素耐量測(cè)試(ITT)來測(cè)量——在WT和7M5X、J、鼠中是一致的(圖1D)。當(dāng)飼喂高脂飲食(HFD)時(shí)，C57BL/6J鼠出現(xiàn)肥胖癥以及一系列代表代謝綜合征的癥狀，包括胰島素抗性(Surwit1998)。為了檢測(cè)在該應(yīng)激條件下的葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，用飼喂HFD的WT和1M5X小鼠進(jìn)行GTT和ITT實(shí)驗(yàn)。雖然祠喂HFD的WT小鼠表現(xiàn)出葡萄糖耐受不良和胰島素抗性，而/M5X、鼠完全避免該影響(圖1E、1F)。如預(yù)料一樣，飼喂HFD的iMS、卜鼠的禁食胰島素水平明顯低于WT小鼠的禁食胰島素水平(圖8)。iM5X、卜鼠也沒有患HFD誘導(dǎo)的肥胖癥。喂以NCD的WT和/MSA^小鼠具有類似的重量(圖2A)，但是喂以HFD的/M5^z-小鼠的增重明顯低于WT同窩出生的小鼠的增重(圖2B)。在飼喂HFD8周后，/MSJT^小鼠的體重與飼喂NCD的WT或者iM5X、J、鼠類似。通過兩能X-射線吸光測(cè)定法對(duì)身體組分的分析證明在HFD祠喂的WT和iM5X、J、鼠之間總體重的差異完全是在于iMSA^小鼠的脂肪含量降低所致(圖8)。(2)/M5XM、鼠表現(xiàn)出整體能量支出增加以及骨骼肌代謝率增加據(jù)猜測(cè)/M5X。肖瘦表型是由于葡萄糖耐受性和胰島素敏感性改善所致；因此要尋找該表型的基礎(chǔ)。肥胖癥是由于能量攝取(形式為飼喂)和能量支出(形式為身體活動(dòng)和基礎(chǔ)代謝)不平衡所致(Spiegelman2001)。接下來使用代謝室測(cè)量02消耗，C02產(chǎn)生，食物攝入和自發(fā)活動(dòng)。食物攝入和自發(fā)活動(dòng)是類似的，但是/MSA^小鼠比WT同窩鼠消耗了更多的02,產(chǎn)出了更多的C02并產(chǎn)出了更多的熱(圖3A)。iMSM、鼠的這種代謝亢進(jìn)表型在透化比目魚肌纖維中也很明顯，這里我們觀察到iMSJ^肌肉中由琥珀酸鹽的ATP生產(chǎn)增加(圖3B)。觀察到的氧化代謝增加的一個(gè)可能的解釋是7M5X八肌肉中線粒體質(zhì)量的增加。但是，比目魚肌電子顯微照片(圖3C)和接下來的對(duì)線粒體數(shù)量和區(qū)域的量化證明iM5J^和WT比目魚肌之間沒有差異(圖3D)。此夕卜，檸檬酸鹽合酶(線粒體密度的標(biāo)記物)的活性(Leek2001)在7M5^rA和WT比目魚肌提取物上是相等的(圖3E)。未觀察到PGC-1a或者PGC-1p——線粒體生物發(fā)生的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子——的mRNA水平有差異(Leone2005;Puigserver1998)。得出結(jié)論iM5X缺失導(dǎo)致線粒體代謝增加和ATP產(chǎn)量增加，且ATP產(chǎn)量不依賴線粒體生物發(fā)生的增加。(3)/MSA^小鼠表現(xiàn)出肝臟甘油三酯積聚減少飲食誘導(dǎo)的肥胖癥通常伴有外圍組織中脂質(zhì)積聚的增加，這與胰島素抗性形成密切相關(guān)(Unger2002;Vosho12003)。通過組織學(xué)油-紅-O染色(圖2C)并通過酶學(xué)甘油三酯定量檢測(cè)肝臟脂質(zhì)含量(圖2D)。在這兩種情況下，飼喂HFD的iM5X、卜鼠完全避免了在飼喂HFD的WT小鼠上觀察的脂質(zhì)積聚增加。AMPK活性增加和mTOR路徑活性降低導(dǎo)致對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖癥的抗性，這可以使用轉(zhuǎn)基因和藥理方法證實(shí)(Um2004;Zhou2001)。已知它們作為養(yǎng)分感應(yīng)器的關(guān)鍵作用，研究了PASK缺失是影響AMPK活性還是mTOR活性。使用識(shí)別磷-AMPK(Thrl72)和砩-S6K(Thr389)的抗體對(duì)取自飼喂NCD和飼喂HFD的小鼠的WT和7M5"i^肝臟樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，所述磷-AMPK(Thrl72)和磷-S6K(Thr389)分別^皮廣泛作為AMPK和mTOR活性的標(biāo)記物。如圖5A中所示，我們，見察到在這些組間沒有差異。還觀察到腓腸肌中磷-AMPK和磷-S6K沒有變化，表明PASK的功能是不依賴AMPK或者mTOR路徑的活性變化。還測(cè)定了與飼喂HFD的WT和飼喂HFD的iMSIT、卜鼠的肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物水平。iMSA^肝臟中的硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)(Flowers2006)、長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶(FAE)(Matsuzaka2002)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(FAT或者CD36)(Schaffer2002)以及脂質(zhì)應(yīng)答細(xì)胞核激素受體PPARy(Matsusue2003)的水平全都顯著降低(圖5B)。這些基因中的每種基因的較低表達(dá)與肝臟脂質(zhì)合成和甘油三酯積聚的降低是一致的。其他涉及脂肪酸代謝的基因的轉(zhuǎn)錄物(包括/^y、JCC-J和S/^E^尸-Zc)在WT和尸ASX^肝臟之間沒有表現(xiàn)差異(表3)。在7M5JT"肝臟中觀察到的脂質(zhì)積聚和基因表達(dá)模式的變化雖然相反，但是與在肝臟中表達(dá)具有組成型活性的孕烷X受體(PXR)的轉(zhuǎn)基因小鼠上觀察到的結(jié)果驚人地相似(Zhou2006)。這就產(chǎn)生了肝臟中對(duì)脂質(zhì)代謝的PASK-依賴性的影響可能通過PXR表達(dá)或功能的降低來介導(dǎo)的可能性。事實(shí)上，觀察發(fā)現(xiàn)在iM5"A^-肝臟中為人熟知的PXR耙基因CYP3All(Goodwin2002)的mRNA水平降低。尸A7基因自身的表達(dá)不因缺失而變化(圖5B)。因此，如果PASK不調(diào)控PXR的活性，那么它也會(huì)通過不同于基因表達(dá)的機(jī)制來這樣做。(4)急劇PASK沉默增加了所培養(yǎng)的細(xì)胞中的氧化代謝為了解釋在小鼠的骨骼肌中觀察到的代謝亢進(jìn)表型是響應(yīng)于PASK缺失的繼發(fā)或適應(yīng)性應(yīng)答的可能性，形成了兩個(gè)獨(dú)立的L6成肌細(xì)胞系，其中在去除多西環(huán)素時(shí)使用shRNA使PASK表達(dá)急劇沉默。如圖6A中所示，相比亂序shRNA對(duì)照，這兩個(gè)克隆的PASKmRNA都在多西環(huán)素去除時(shí)表現(xiàn)了約50%的降低。PASK敲低時(shí)，我們觀察到葡萄糖和棕櫚酸鹽氧化大量增加(圖6B和6C)。在該底物新陳代謝增加的同時(shí)，伴有ATP的穩(wěn)態(tài)水平增加，這大概是由于線粒體ATP產(chǎn)量增加的緣故(圖6D)。同時(shí)形成了帶有PASK組成型敲低的L6源性細(xì)胞，并觀察到葡萄糖氧化和ATP水平增加。這些培養(yǎng)細(xì)胞中的數(shù)據(jù)表明，PASK損失導(dǎo)致在線粒體代謝和ATP生成產(chǎn)生急劇和細(xì)胞自主的增加。65(5)PASK表達(dá)受祠喂?fàn)顟B(tài)調(diào)節(jié)已經(jīng)有人提議PASK作為細(xì)胞代謝狀態(tài)的變構(gòu)感應(yīng)器。為了測(cè)定PASK表達(dá)是否也受體內(nèi)代謝狀態(tài)的調(diào)節(jié)，測(cè)量了取自禁食19小時(shí)的小鼠和禁食12小時(shí)然后再飼喂7小時(shí)的小鼠的各組織中的PASKmRNA水平。如圖7A中所示，相對(duì)禁食水平，肝臟中的PASKmRNA水平在再伺喂后增加了3倍。但是在脂肪組織中，PASKmRNA水平不隨飼喂?fàn)顟B(tài)而變化。SREBP-lc(—個(gè)已知的再飼喂誘導(dǎo)基因(Gosmain2005))在這些動(dòng)物的肝臟和脂肪組織中均上調(diào)了3-4倍。肝臟中PASKmRNA的誘導(dǎo)類似于飼喂HFD的小鼠，且骨骼肌中的PASK表達(dá)也是通過再飼喂誘導(dǎo)的。研究了飼喂?fàn)顟B(tài)對(duì)PASK基因表達(dá)的影響是否是細(xì)胞自主養(yǎng)分感應(yīng)應(yīng)答。在不同"飼喂"方案下測(cè)量人體肝癌H印G2細(xì)胞系中的PASKmRNA水平。如圖7B中所示，在缺乏葡萄糖和血清的培養(yǎng)基中挨餓31小時(shí)會(huì)將PASKmRNA水平減少約3倍。在挨餓24小時(shí)后，用葡萄糖或者血清培養(yǎng)7小時(shí)將PASKmRNA水平恢復(fù)到接近挨餓前水平，在既有葡萄糖又有血清的條件下培養(yǎng)也是如此。PASK蛋白水平與PASKmRNA同樣受影響，如對(duì)同樣處理細(xì)胞的蛋白印跡所示(圖7C)。d)討論本文描述了PASK在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物能量平衡中的生理作用。/MS/i^小鼠可避免患HFD誘導(dǎo)的肥胖癥和其他伴隨HFD誘導(dǎo)的肥胖癥的代謝干擾。喂以HFD的尸AwrM、鼠的胰島素敏感度和葡萄糖耐受幾乎與喂以NCD的WT或/MSX,小鼠相等。生物體能量和葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的這些變化似乎是各個(gè)細(xì)胞和組織中的代謝調(diào)控的基礎(chǔ)變化的表現(xiàn)。我們觀察到尸AyiT、鼠可顯著避免HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性。這伴有SCD-1、FAE、CD36和PPARy轉(zhuǎn)錄水平的明顯下降。SCD-1是單不飽和脂肪酸合成的速率限制酶，單不飽和脂肪酸是甘油三酯合成的主要底物(Dobryzn2005)。SCD-r"突變小鼠表現(xiàn)出肝臟甘油三酯積聚和脂肪酸生物合成的降低，并可避免患HFD諸導(dǎo)的肥胖癥(Miyazaki2000;Ntambi2002)。脂肪酸延長(zhǎng)酶(FAE)對(duì)脂肪酸的從頭合成是必需的(Jakobsen2006)。CD36(還可稱為脂肪酸移位酶即FAT)是一種推定的脂肪酸運(yùn)載體。值得注意的是，CZX56是PPARy的目標(biāo)基因(Tontonoz1998),因此aX6表達(dá)降低可能是/M5X^肝臟中PPARY較低表達(dá)的繼發(fā)反應(yīng)。已證明表達(dá)在多種小鼠模型中均與肥胖癥正相關(guān)(Memon2000)。肝臟中這些基因的每一種的表達(dá)降低均與在iM5X、鼠中觀察到的脂質(zhì)含量的降低一致。這些基因表達(dá)的改變，特別是CYP3A11表達(dá)的降低與iM5X^肝臟中PXR活性的降低一致31。然而，PX/的表達(dá)不同，這暗示PASK可能通過改變PXR激動(dòng)劑豐度或通過其他機(jī)制經(jīng)由直接磷酸化調(diào)控PXR?；蛘撸琍XR旁系同源物CAR——它激活一系列重疊的基因——可在/M5X缺失時(shí)被向下調(diào)控。iM^iT缺失導(dǎo)致生物體代謝亢進(jìn)，如通過02消耗、C02產(chǎn)生和熱形成所測(cè)量的。這種代謝亢進(jìn)也表現(xiàn)在經(jīng)分離的透化骨骼肌中，其中可觀察到ATP產(chǎn)生的增加。若干小鼠模型均表現(xiàn)類似的代謝亢進(jìn)。iM^WT"表型的三個(gè)方面使其不同尋常。第一，升高的代謝速率不是由代謝效率受損和伴隨的底物需求增加引起的。事實(shí)上，我們觀察到在經(jīng)分離的^R45X",骨骼肌中和急劇iMSiT敲低后的培養(yǎng)細(xì)胞中ATP產(chǎn)生均增加。另外，能量壓力不明顯，因?yàn)樵贓45X,小鼠肝臟或骨骼肌中AMPK未高度激活，這是通過AMPK或ACC磷酸化測(cè)量的(圖5A)。第二，在線粒體質(zhì)量或數(shù)目或者PGC-la或p表達(dá)沒有變化的情況下，出現(xiàn)線粒體氧化代謝增加。第三，這種表型似乎是細(xì)胞個(gè)體的性質(zhì)，因?yàn)槠湓诩眲∏玫蚷M5^TmRNA后的L6肌細(xì)胞中再現(xiàn)。戶AMT損失后的氧化代謝的增加似乎是由于線粒體的變化?；铙w外比目魚肌ATP測(cè)量是在測(cè)量線粒體ATP產(chǎn)生的條件下進(jìn)行的。另外，葡萄糖和棕櫚酸鹽氧化在B4WT敲低后都有所增加，這一觀察結(jié)果表明，所述改變位于這兩種代謝途徑會(huì)聚之處的下游，即處于線粒體TCA循環(huán)的水平。PASK是在翻譯后由經(jīng)培養(yǎng)的p細(xì)胞中的葡萄糖介質(zhì)的提高激活的，很可能是通過其調(diào)控PAS結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)調(diào)控?，F(xiàn)已證明，肝臟和培養(yǎng)細(xì)胞兩者中的PASK也在基因表達(dá)的水平上被有利的營養(yǎng)條件所激活。綜上，結(jié)論是PASK聯(lián)合多個(gè)信號(hào)來監(jiān)測(cè)細(xì)胞能量狀態(tài)。從功能性表型缺失推斷，PASK激活的作用似乎是細(xì)胞型特異的，并且是被分析的每種細(xì)胞型的合適營養(yǎng)反應(yīng)的一部分。肝細(xì)胞中的PASK激活增加了儲(chǔ)存脂質(zhì)如甘油三酯的合成和積聚。骨骼肌中的PASK激活導(dǎo)致由碳水化合物和脂肪酸氧化產(chǎn)生的ATP產(chǎn)量降低。因此給出了這樣一種模型，其中PASK用作代謝充分信號(hào)的感應(yīng)器、整合器和轉(zhuǎn)換器。PASK的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游是67細(xì)胞類型特異的，但至少在骨骼肌中降低了線粒體氧化代謝和ATP產(chǎn)生。當(dāng)人工使PASK缺失時(shí)，這種代謝充分信號(hào)不被轉(zhuǎn)導(dǎo)，且結(jié)果是線粒體代謝緩慢升高，從而避免患異位HFD誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚。如同其他熟知的代謝感知激酶AMPK和mTOR—樣，PASK是一種重要的人類代謝疾病的調(diào)控因子。e)方法動(dòng)物。如文獻(xiàn)所述制備基因型iM5X、鼠(Katschinski2003)。在與C57BL/6J(CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室)回交五次之后，將12周齡到24周齡的雄性小鼠用于所有實(shí)驗(yàn)。小鼠用普通飲食喂養(yǎng)(HarlanTeklad3080)或從12周齡開始用高脂飲食(按卡路里計(jì)算45%的脂肪，ResearchDiets,D12451)喂養(yǎng)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，年齡匹配的野生型同窩出生仔畜用于iMS/^-小鼠的對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)。大鼠L6成肌細(xì)胞是ScottSummers博士(猶他大學(xué))提供的，人類HepG2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。兩種細(xì)胞都在37。C下、在5%C02的條件下在添加有10。/。胎牛血清(Hyclone)、0.1mg/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素(LifeTechnologies)的DMEM中培養(yǎng)。葡萄糖/胰島素耐受試驗(yàn)和血清胰島素測(cè)量。對(duì)于GTT和血漿胰島素測(cè)量，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食6小時(shí)；之后向腹膜內(nèi)注射葡萄糖(lg/kg體重)。在指定的時(shí)間，對(duì)尾靜脈血取樣以用血糖測(cè)計(jì)儀(BayerCorp.)測(cè)定葡萄糖或用SensitiveRatInsulinRIAKit(LincoResearch)測(cè)定胰島素。對(duì)于ITT，向隨意喂養(yǎng)的小鼠腹腔內(nèi)注射人類重組胰島素(NovoNordisk,0.75U/kg體重)，并在指定時(shí)間測(cè)定血液葡萄糖水平。代謝室研究。用四室Oxymax系統(tǒng)(ColumbusInstruments)進(jìn)行間接量熱法。使動(dòng)物可在代謝室中適應(yīng)4小時(shí)，然后每15分鐘測(cè)量一次單獨(dú)圏養(yǎng)小鼠的V02、VC02、熱產(chǎn)生、食物和水的攝取以及活動(dòng)，連測(cè)3天。將從6pm到6am的平均數(shù)據(jù)表示為夜間值，而從6am到6pm的數(shù)據(jù)表示為日間值。線粒體呼吸實(shí)驗(yàn)。比目魚肌纖維被分離然后用皂苷透化。通過將纖維暴露于1mM外源ADP和琥珀酸鹽中測(cè)定最大(ADP刺激的)ATP產(chǎn)生速率，如文獻(xiàn)所述(Leone2005)。檸檬酸合成酶活性測(cè)定。用分光光度計(jì)測(cè)定檸檬酸合成酶活性，如文獻(xiàn)所述(Boudina2005)。簡(jiǎn)而言之，將冰凍的比目魚肌在冰上勻漿，然后通過凍融所述勻漿物將檸檬酸合成酶從線粒體中釋放出來。通過將草酸乙酰鹽加入1ml的用含有乙酰輔酶A的反應(yīng)緩沖液稀釋的勻漿物中來啟動(dòng)反應(yīng)，然后用Ultrospec3000分光光度計(jì)(Amersham)在412nm處監(jiān)測(cè)3分鐘。組織學(xué)分析。為進(jìn)行電子顯微鏡分析，將比目魚肌在EM固定劑中固定，在梯度乙醇中脫水并包埋在PolyBed塑性樹脂中用于切片，如文獻(xiàn)21所述。比目魚肌線粒體數(shù)目是以盲方式用電子顯微圖片定量的，放大倍數(shù)為8000X，并標(biāo)準(zhǔn)化為Z線數(shù)目。為進(jìn)行油紅O染色，將冰凍肝臟樣品包埋進(jìn)OTC試劑(Tissue-Tek)中并在恒冷切片機(jī)中切成8jim。將冷凍切片在50。C的甲醛蒸汽中固定，在0.5%油紅O的異丙醇溶液中孵育并用蘇木精(Sigma)負(fù)染。在蒸餾水中沖洗之后，用永久水性封固介質(zhì)Gel/Mount(Biomeda公司)將肝臟切片封片，并用光學(xué)顯微鏡在40X放大倍數(shù)下照相。所有圖像都是在猶他大學(xué)的成像中心研究室(ImagingCoreFacility)獲得的。肝臟甘油三酯含量測(cè)定。肝臟甘油三酯含量的定量分析通過用乙醇KOH皂化肝臟來進(jìn)行，如文獻(xiàn)所述(Norris2003)。在用MgCl2中和之后，在水解作用中產(chǎn)生的甘油用FreeGlycerolReagent和GlycerolStandardSolution(Sigma)通過比色試驗(yàn)來測(cè)定。蛋白質(zhì)印跡。用Tissue-Tearer轉(zhuǎn)子在細(xì)胞裂解緩沖液(CellSignalingTechnology,Inc)中將50-100mg快速冷凍的肝臟切片勻漿，從而制備肝臟裂解產(chǎn)物。在4。C下以14000rpm離心30分鐘之后，收集上清液然后用AdvancedProteinAssayReagent(Cytoskeleton，Inc)觀寸定蛋白濃度。通過SDS-PAGE從每個(gè)樣品中分離出大約50jig蛋白質(zhì)，并將該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Fisher),并按照生產(chǎn)商的說明書與指示抗體雜交。磷畫AMPK(T172)、磷-S6K(Thr389)和微管蛋白購于CellSignallingTechnologyInc。通過直接向6孔板中的細(xì)胞中加入200jil1XSDS-PAGE上樣緩沖液來制備HepG2細(xì)胞裂解產(chǎn)物，所述細(xì)胞已用PBS洗滌并在液氮中冷凍。渦旋和煮沸之后，將40jil各樣品上樣，并如上所述用hPASK和微觀蛋白抗體進(jìn)行免疫印跡。實(shí)時(shí)定量RT-PCR。才艮據(jù)生產(chǎn)商說明，用RNAStat60試劑(Tel-TestInc.)從組織或細(xì)胞提取總RNA,并用RNeasyMiniKit(Qiagen)純化。用SuperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。用基于SYBRGreen的方法在RocheLightCycler上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，如文獻(xiàn)所述(Cooksey2004)。包括熔解曲線分析和模擬反轉(zhuǎn)錄對(duì)照，以確保擴(kuò)增子的特異性?？烧T導(dǎo)PASK敲低細(xì)胞的產(chǎn)生。pRevTet-Off-IN反轉(zhuǎn)錄病毒載體購自Clontech，并才艮據(jù)廠商i兌明書用Fugene轉(zhuǎn)染試劑(RocheAppliedScience)和Phoenix-Ampho反轉(zhuǎn)錄裝配細(xì)胞系(ATCC)生產(chǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒。在存在6mg/ml聚凝胺(polybrene)存在的條件下，用產(chǎn)生的Tet-Off反轉(zhuǎn)錄病毒感染L6細(xì)胞，感染48小時(shí)之后將G418加入培養(yǎng)基中，終濃度為200照/ml。選擇2周之后，用克隆圓筒(Corning)獨(dú)立收集抗G418-抗性克隆，并用pRevTRE-Luc(Clontech)病毒就可誘導(dǎo)性對(duì)其進(jìn)行篩選。用Invitrogen網(wǎng)站軟件設(shè)計(jì)含有耙向大鼠PASK基因的序列和亂序shRNA的shRNA寡核苷酸雙鏈，并將其克隆到四環(huán)素調(diào)節(jié)的反轉(zhuǎn)錄病毒SIN-TREmiR30-PIG(TMP)載體(OPENBiosystems)中。形成了表達(dá)所述可誘導(dǎo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄病毒，并將其用來感染高度可誘導(dǎo)的Tet-Off克隆，這通過熒光素酶測(cè)定確認(rèn)。最后，使用2照/ml嘌呤霉素以及2照/ml多西環(huán)素，并如上所述分離嘌呤霉素抗性克隆。通過在不存在和存在多西霉素的情況下對(duì)PASKmRNA水平進(jìn)行qRT-PCR分析來對(duì)PASK敲低克隆進(jìn)行篩選。PASK靶向的發(fā)夾序列GATGCCAAGACCACAGAGA(SEQIDNO:l)和GCGCAGACAAGCTCAAAGA(SEQIDNO:2)。亂序序列:GCGCAGACAAGCTCAAAGA(SEQIDNO:3)。葡萄糖和棕櫚酸鹽氧化測(cè)定。才艮據(jù)前述方法(Antinozzi1998)測(cè)定葡萄糖氧化速率。簡(jiǎn)而言之，在24孔板中將三份L6細(xì)胞樣品與500fil含有5mM未標(biāo)記葡萄糖、2jiCi[U少C葡萄糖(MPBiochemicals)和0.4%BSA(w/v)的氧合Krebs-Ringer緩沖液一起孵育。用真空油酯和膠帶(adhesivesheet)封閉UniFilter-24GF/B板(PackardInstruments)，并且在每個(gè)過濾器上滴上200jil10X的氬氧海胺(PerkinElmerSciences)以捕獲C02。最后，用橡膠墊圏封閉24孔板。在37。C下輕搖醉育所述裝置2小時(shí)，并通過在每孔中注射100nllM高氯酸終止所述實(shí)驗(yàn)。移去過濾器，并且用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定所捕獲的14co2。每塊板都包括沒有細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物。對(duì)于棕櫚酸鹽氧化，使用同樣的方法，除了使用含有1mM葡萄糖、0.5mM未標(biāo)記棕櫚酸鹽、ljiCi[l-"q棕櫚酸鹽(MPBiochemicals)和1mM肉堿的KRB緩沖液。細(xì)胞ATP含量測(cè)量。將L6細(xì)胞使用PBS沖洗，通過胰蛋白酶消化收獲，并通過離心收集沉淀。接著將所述細(xì)胞在1M水冷的高氯酸中裂解以使細(xì)胞蛋白沉淀。14000rpm離心10min后，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新試管中并用等體積的IMKOH中和。根據(jù)廠商說明書用ATPDeterminationKit(Invitrogen)測(cè)定ATP含量。統(tǒng)計(jì)分析。除非另外指明，否則數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。兩尾等方差t檢驗(yàn)用于比較差異，且無效假說在0.05水平被拒絕。表3.1<:0肝臟中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄物水平(WT設(shè)為1)轉(zhuǎn)錄物KO平均值(WT=1、標(biāo)準(zhǔn)差P值(相對(duì)于KT)Glut20.920.170,37G6Pase0,660.340.16PEPCK0.880,230.38PG01cx0朋0.170.24PGC-1P1.000.141,00PPARa0,900,120,17LXRa1.020,130.82SREBP-1c0.750.260.32FAS0.740.300,53ACL0.930.520.85MCAD0.790,420.46LCAD1.000.141.00VLCAD1.030.150.70Kakn，B,B.，A，quier,T,，Carting,D,&Haxdie，D.G,AMP-activatedproteinkinase:ancientenergygaugeprovidesduestomodemunderstandingofrnetabolismxCellMetab1，15-25(2005)'Shaw，R,J.al.TheturnoTsuppressorLKBikinasedirectlyactivatesAMF舊tiv3化dkinaseandregulatesapoptosisinresponsetoenergystress.ProcNatlAcadSciUSA10〗，3329-35(2004).Liu，Y"Wan，Q,，Guan,Q"Ga0sL,&Zhao，JLHigh-fatdietfeedingimpairsbotittheexpressionandactivityofAMPKainrats,skeletalnrnscle,BiochernBiophysResCommon339，701-7(2006).SilvaXavie「G.etal.RoleforAMP"aetivatedproteinkinaseinglucose-stimulatedinsulinsecretionandpreproinsu〗ingeneexpressi亂BioctenJ371，761-74(2003),Richards,S,K.,Parttm，L.E.,Leckrc，L，Rutter，G.A.&Smith,R,MOver《xpressionofAMP-ac1ivatedproteinkinaseimpairspanereatie{beta}*cdlfunctioninvivo.JEndocrinol187，225-35(2005),Hardie，D.G.Minireview:theAMP-activatedprofeinki腦ecascade:thekeysensorofcellularenergystatus'Endocrinology144，5179*83(2003).Cooletal.IdentificationandcharacterizatbnofasmallmoleculeAMPKactivatorthattreatskeycomponentsoftype2diabetesandthenietaboUesyndrome.CellMetabolism3，船6416(2006).Rhodes,C丄Type2diabetes-amatterofbeta《eUHfeanddeathSbie"c^,307，，4,(2005).Lazar，M*A,Howobesitycausesdiabetes:notatalltale,307，3735,(2005).Reaven，G,M.Bantingketure1988,Roleofinsulinresistanceinhumandisease,Z)/"^We5,37，1595607,(l鄉(xiāng)).Zimm織，P，Alberti，K'G,&Shaw，J,Globalandsodeta!impiicatioc^ofthediabetesepidemk.i^m/re,414，782-7,(2001),Lmdsitey，J.E.&Rutter,J.Ntttdentsensingandmetabolicdecisions,Co挑p^k^/e銜i^j^o/5丑^)e》e銜A/o/說W139，343-59,(2004).Marshall,S.Roleofinsulin,adipocytehormones，andnutrient-sensingpathwaysinregulatingfiielmetabolismandenergyhomeostasis:anutritionalperspectiveofdiabetes,obesity,andcancer.Sc/SJKE,2006，re7.(2006),I'Iardie，D,G.，Cariing，R&CMson，M*TheAMP《tivated/SNFlproteinkinasesubf誦ily:metabolksensorsoftheeukaryoticcellJ鵬認(rèn)/Jev細(xì)沐o/Woc^em&^y67，821-55(1998).Ptoud，C*G*RegtilatkmofmammaUatitrans!attenfactorsbynutrieiits.J沒^x^忍柳269，533849.(2002).Gingras,A.CX，Rau^ht,B,&Sone11be3rg，N,RegulationoftransbtioninitiationbyFRAP/mTOILGene《D《v,15，807-26.(2001).Winder,W*W,&Hardie，D,dAMP-activateclproteinki腿e，ametabolic:masterswitch:possiblero!esintype2diabetes.Jm//%^'^,277,El-10,(1999).Maiming,B'D,BalancingAktwithS6K:implicationsforbothmetabdicdiseasesandtonorigeiiesis,JC《//編,167，399403.(2004),Inoki，KL，Corra<ktti,MN.&Guan，K丄,DysregulationoftheTSC-mTORpathwayinhumandisease,胸G組37，19-24.(2005).Rutte"J.，Miehnoff,C.H，Harper,S.M"Gardner,K,HL&McKnight，S丄.PASkin,:AnevolutionarilyconservedPASdomain-regulatedserine/threoninekinase,iVo卿淑gs#/fcM^TO/Jm^fe考，C/附tef^toesq/^附grim紹，8991-8996(200".AmezcuEjC,A,，Harper，S,M,，Rutter，J'&Gardner,K.H.StructureandinteractionsofPASkiimseN-化iminalPASdomain:modeiforin紋amoleeiilarkinaserggukticm,Anic加^^C^招&j10，1349*61.(2002).Ru敝，J,Essay:Aniarsh謡BiosciencesandSciencePrize,PASdonminsand隱tabdiestatussignaling.298,1567-8,(2002》'daSilvaXaviei;Ruttor，J,&Rimer,G,A.!iwolvementafPer-Am"Sim(PAS)kinaseinthestimuiatkmofprepminsutoandp隱織ticduoden鵬hmneofeox1geneexpressionbyglucose*M^Mead101,8319-24，Epub2004May17.(2004).Katscliiiiski，D.M,aLTargeteddisruptionofthemousePASdomainserine/threoniiiekinasePASKIN,AfoZCM飾/23,6780-9(2003),Surwit,R.S.，Kuhn，C.M,，Cochrane,C,，McCubbin，J.A.&Fdnglos，M,N,Diet4ndueed妙eIIdiabetesinC57BL/6Jmice.D!'"&to,37，1163-7*(1988),Spiegdman,B.M.&Flier3J,S,ObesityandtheregulationofeueirgybaJanee，Ce/A104，531-43.(2001),Leek，B.T.，Mudaliar，S'R*，Henry,R.，Matfiieu-Costdlo，O,&Richardsori,R.S.Effectofacuteexefdseoncitratesynthaseactivityinuntrainedandtrainedhumanskdetalmuscle.爿/kJPJty^o/itegw//&grC呻280，腿1-7,(2001),Leotie，T,C,atal,PGC4alphadefickneyea應(yīng)smuiti"systemenergymetabolicde腿g纖ents:muscledysfimction,abnomialwdghtcontrolandhepaticsteatosis,/^oSS/o/,3e101,Epub2005Mat15.(2005).Pdperver，P,al，Acold-induciblecoactivatorofnudearreceptorslinkedtoadaptivethermogenesis.92，829-39,(l卿》Unger，R,H.Lipotoxkdiseases,及ev^yfed53，319-36.(2002).Voshol，P.J.etal.Increasedhepaticinsulinsemitivitytogetherwithdecre認(rèn)ec！bepatktriglyceridestoresinhormone-sensitivelipase-deficientmice.J"AwTi'wotogy*144，3456*62,(2003).Um，etal.AbsenceofS6K1protectsagainstage-anddiet-inducedobesitywhUeenhandnginsudmsensitivity.Afe"re.431，200-5.Epub2004AugiL(2004).Zhou，G*etd，RoleofAMP-activatedproteinkinaseinmechanismofmetforminaction,/C//wftves,108，1167-74,(2001).Fto沐e(cuò)rs，M.T,，Miyazaki，M丄，Liu，X,&Ntambi，J'M'ProbingtheroleofstearoyKoAdesa加rase墨linhepaticinsulinresistance,/C7,'"116，1478-8L(2006),Ntosuzdca，T,Cloningandeharacterizatioiiofamammalianfattyacyl-CoAdongaseasalipogenk73enzymeregulatedbySREBPs.《，911-20.(2002),Schaffer，J.E*Fattyacidtmnsport:theroadstaken,爿附Ji^j^b/￡n6toe"'o/Me/"fc282,E239~46.(2002),Malsusue，K.al,Liver"spedfkdisruptionofPPARgarmiiainleptin-deikieatmiceimprovesfettyliverbutaggravatesdiabeticphenotypes.*/Cfi"111,73747-(2003),Zhou，丄etal.AnovelpregnaneXreceptor-mediatedandsterolregulatorydement-biadmgprotein-independentlipogetikpatfway,J編Cfe肌281，15013-20.Epub2006Mar23,(2006).Goodwin，B，Redinbo,MR.&KHewer，S,A,Regulationofcyp3agenetranscriptionbyttepregnanexreceptor.爿n〃w/2ev/^ar附aco/7bx/co,.42，1—23,(2002),Gosnmin，Y,etal.RegulationofSREBP-1expressionandtranscripUonalacdoncmHKIIandFASgenesduringfastingandrefeedinginrattissues+/i^zVfites.46，697-705.Epub2005Jan1,(2005),Dobrzyn，A'&Ntambi，J.M.Stearoyl-CoAdssaturaseasanewdrugtargetforobesitytreatmentiev,6，169-74.(2005),Miyazaki，M,,Kkn，Y,C,,Gray-KdJer，M'P.，Attie，A.D,&NtamW，J.M.Thebiosynthesisofhepaticcholesterolestersandtriglyceridesisimpairedinmicewithadisruptionofthegeneforstearoyl-CoAdesatumseLJ說o/Cfe附.275，30132-8,(2000),Ntambi,J,M.etal.Lossofstearoyl-CoAdesaturase-1fimctionprotectsmiceagainstadiposity.iVa//爿c"d&i'W，11482-6,Epub2002Aug12.(2002).Jakobsson,A.，WesterbergR.&Jacobsscm，A，F(xiàn)attyacidekmgasesinmammds:theirregufetionandroksinmetabolism,4S,23749*Epub2006Mar6,(2006》Tontonoz，P*，Na啟，L，Aivar^，J,G.，Thomazy，VKA,&Ev纖，R*M,PPARgammapromotesnioiiQeyte/maerophagedififerenti敏ionanduptakeofoxidizedLDLCe//.93，241-52,(1998).Memon，R.A.etal,Up-regulationofperoxisomeproliferator-activatedreceptors(PPAR-alpha)andPPAR-gammamessengerribonucleicacidexpressionintheliverinmurineobesity:trDglitazoneinducesexpressionofPPAR-^mma-responsiveadiposetissue-specificgenesinflieliverofobesediabeticmice,層織W柳.141，4021-31.(2000).Boucliaa，S,al.Reducedmitochondrialoxidativecapacityandincreasedmitochondrialuncouplingimpairmyocardialenergetksinobesity,Cto/亂112，2做-95.(2005》.Norris，A,W.etal.Musde-specificPPAR^mnm-defkieiitmicedevelopincreasedadiposityandinsuHnresistancebutrespondtothiazolidiiiediones.JCft"/ve^.112，608-18.(2003)*Cooksey，R-C.etOxidativestress,beta《el1apoptosis，anddecreasedinsulinsecretorycapacityinmousemodelsofbemochromatosis.五"dWz"o/柳,145，5305-12,Epub2004Aug12,(2004),Antinozzi，P.A"Segall,L.，Prentki,M"MeGany，J,D,&Newgard，C.B.Molecularorpharmacologicperturbationofthelinkbetweenglucoseandlipidmel^bdisniiswithouteffectonghieose-stimulatedinsulinsecretion.Are-cvaluationofthelcmg《hairiacyi-CoAhypothesis.J5'o/Cte附.273,16146-54.(1998).序列SEQIDNO:1PASK#1GATGCCAAGACCACAGAGASEQIDNO:2PAS腿GCGCAGACAAGCTCAAAGASEQIDNO:3亂序GCGCAGACAAGCTCAAAGASEQIDNO:4人PASKVPGEAPNGQGCLHPGDPRLLTSSEQIDNO:5人PASKcDNACCTTCTTCCCATGGAGGACGGGGGCTTAACAGCCTTTGAAGAGGACCAGAGATGCCTTTCCCAGAGCCTCCCC丌GCCAGTGTCAGCAGAGGGCCCAGCTGCACAGACCACTGCTGAGCCCAGCATATTTGTACAAGTAAAC化CACTgccctgctgcccctgagcacacggacccgtccgaaccgcggggcagtgtgtcctgctgctccctgctgcgggg3ctgtcctc3gggtggtcctcacctctgcttccggcccctgtgtgc3accct33c3aggccatcttcacggtggatgcc33g3ccacag3g3tcctGgttgctaacgac333gcttgcgggctcctggggt3c3gc3gccagg3cctg3ttggccagaagctcacgcagttctttctgaggtcagattctgatgtggtggsggccctcagcgaggagcacatggaggccg3cggccacgctgcggtggtgtttggcacggtggtgg3c3tc3tc3Gccgtagtgggg3ga3gattcc3gtgtctgtgtgg3tgaag3gg3tgcggc鄉(xiāng)3gcgccgcctatgctgcgtggtggtcctgg3gcccgtgg3g柳gtctcg3cctgggtcgctttccagagcgatggcaccgtcacgtcatgtgacagtctctttgctcatcttcacgggtacgtgtctggggaggacgtggctgggc3gc3tatcac3g3cctgatcccttctgtgcagctccctccttctggccagc3c3tccc333gaatctc33g3ttcag鄉(xiāng)tctgttgg33gagcc3gggacggtacc3ccttccctctg鄰ctta33gctg3a3tccc幼ccc3gcagcg3gg卿cgaccaccggtgaggcggcccctgtgagcggctaccgggcatctgtctgggtgttctgcaccatcagtggcctc3tcaccctcctgccggatgggaccatccacggcatcaaccacagcttcgcgctgacactgtttggttacggaaagacggagctcctgggcaagaatatcactttcctgattcctggtttctacagctacatggaccttgcgtacaacagctcattacagctccC3gacctggcc3gctgcctgg3cgtcggca3tg3gagtgggtgtgggg3g3g33ccttgg3cccgtggcagggcc3gg3cccagctgaggggggccaggatccaaggattaatgtcgtgcttgctggtggccacgttgtgccccgagatgagatccggaagctgatggaaagccaagacatcttcaccgggactcagactgagctgattgctggaggccagctcctttcctgcctctcacAsSATs"iQTPGuK一cQpEEVisDDQAV_cY75ctC3gcctgctcC3ggggtggaC3atgtccC3g33gg33gcctgcc3gtgc3Cggtg33C3ggcgctgccc33gg3CC3gcaaatcactgccttggggagagaggaacctgtggcaatagsgagccccggacaggatettctgggagaaagcaggtctga3cc3gtgg3tgtg33gcc她gcttcctgcg33gattctg33gctcc3gtcccagctg3ggatgggggc3gtg3tgctggcatgtgtggcctgtgte8g朋ggcccagctagagcggatgggagtcagtggtcccagcggttC3gacctttgggctggggctgccgtggcc33gccccaggcc3柳gtc3gctggcggggggc3gcctectg3tgc3ctgcccttgctetggg3gtg3atggggcttgtggtggcgaagCc柳acttggcccccagcccctctgggatggc鄉(xiāng)cctctegtttgggacacctactctagatgagccgtggctgggagtggaaaacgaccgagaagagctgcagacctgcttgattaaggagcagctgtcccagttgagccttgcAggagccctggatgtcccccacgccgaactcgttccgacagagtgccaggctgtcaccgctcctGtgtcGtcctgcgatctgggaggcagagacctgtgcggtggctgcacgggcagctcctcagcctgctatgccttggccacggacctccctgggggcctggaagcagtggaggGCcaggaggttgatgtgaattcgttttcctggaacctcaaggaactctttttcagtgaccagacagaccaaacgtcatcaaattgttcctgtgctacgtctgaactcagagagacaccctcttccttggcagtgggctccgatccagatgtaggcagtctccaggaacaggggtcgtgtgtcctggatgacagggagctgttactactgaccggcac卿gttgaccttggccaaggccgacggttccgggagagctgtgtgggacatgatccaacagaaccgcttgaggtttgtttggtgtcctctgagcattatgcagcaagcgacagagaaagcccGggacacgttccttccaCgttggatgctggccctgaggacacgtgcccatcagc3g3ggagccaaggctga8cgtoc柳teacctccacgcccgtgatcgtgatgcgcggggctgctggcctgcagcgggagatcc柳agggtgcctactccgggagctgcCaccatcg3gaTggcttecggctgagtat3cagtttg鄉(xiāng)tg3ggcgggtggagctccagggcccc3C3cctctgttctgctgctggctggtg333g3Cctcctccac3gccaacgcgactcagccgccaggacccgcctgttccttgccagcctgcccggctccacccactctaccgctgctgagctcaccggacccagcctggtggaagtgctcagagccagaccctggtttgaggagccccccaaggctgtggaactggaggggttggcggcctgtg3gggcg3gtactccc3333gtac3gt3cc3tg3gcccgctgggc3gtggggccttcggcttcgtgtgg3ctgctgtgg3c33Ag3333333c33gg3ggtggtggtg33gttt3tt33g3柳3g3柳tcttgg柳3ttgttgg3ttg柳3tccc333cttggg333gttacttt3g3g3tcgc33ttct3tcc3gggtgg3gc3cgcc3at3tc3tc33ggtettgg3tat3tttg3333cc33gggttcttcc3gcttgtg3tgg3g33gc3cggctccggcct8g3cctcttcgctttc3tcg3ccgccaccccaggctggatgagcccctggcgagctacatcttccgacaactagtgtcagcagtgggatacctgcgcttgaaggacatcatcc8ccgtgacatcaaggatgagaacategtgatcgctgaggacttcacaatcaagctgatagactttggctcggccgcctacttggaaaggggaaaattattttatactttttgtgggaccatcgagtactgtgcaccggaagttctcatgggg3atccct3cag3gggccgg3gctgg3gatgtggtctctggg3gte3ctctgtecacgctggtctttg3gg3g33ccccttctgtgagctggaggagaccgtggaggctgccatacacccgccatacctggtgtccaaagaactcatgagccttgtgtctgggctgctgcagccagtccctgagagacgcaccaccttggagaagctggtgacagacccgtgggtaacacagcctgtgaatcttgctg3ct3tac3tggg33g3ggtgtgtcg3gt333c33gcc3g333gtgg3gttctgtccgctgcg8gcctgg3g3tggggaac柳agcctg3gtg3tgtggcccaggctcaggagc卿gggggccccgttcc3ggcg3ggctcct3atggcC3鄉(xiāng)ctgtttgc3tcccggggatccccgtctgctgacc3gctaa8cacc33tttcttcctgcttttctcc3cttggtttgg3333tC3C3C3gttttC3ggCtCC3tctgtttgg3g3a33t3C3ttctg33gC3tCCCC33ttC3CCttCt33333Ctc卿gcaggtttgataaacacc8gaacagaagacagtgatgctgGattattttagatttattacatagatttgga3ttcacttttttcatgacctagaaaaaaacattccagtgttcaactgttttatattattaaagggcttttaatttgtgaacttctga柳catgagtgttttctctttctacttttgtatatgtgcatg卿tttcctctgacttggtatatgctcatetgagtgacggatatgtgaaatttgtagaactggttagteaaatggccagactatttcattaatttatttccteaaatgcttttC333tta33gC3CCtttgttagta33C3gtt3333333333幼3333333333333朋33337權(quán)利要求1.一種治療受試者體內(nèi)的胰島素抗性的方法，包括a.選擇需要胰島素抗性治療的受試者；b.給予該受試者有效量的抑制PASK的組合物。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述受試者患有代謝綜合征。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述受試者患有肥胖癥。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述受試者患有糖尿病。5.—種增加細(xì)胞中線粒體代謝的方法，包括抑制PASK，從而增加線粒體代謝。6.—種篩選可調(diào)節(jié)PASK的測(cè)試化合物的方法，包括a.用測(cè)試化合物與PASK接觸；并b.檢測(cè)PASK與所述測(cè)試化合物的相互作用；其中所述測(cè)試化合物和PASK之間的相互作用標(biāo)示可調(diào)節(jié)PASK的化合物。7.權(quán)利要求6的方法，其中大多數(shù)測(cè)試化合物在高通量測(cè)定系統(tǒng)中與PASK接觸。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述高通量測(cè)定系統(tǒng)含有測(cè)試化合物的固定化陣列。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述高通量測(cè)定系統(tǒng)含有PASK分子的固定化陣列。10.—種通過權(quán)利要求6的方法識(shí)別的化合物。11.一種篩選調(diào)節(jié)PASK的測(cè)試化合物的方法，包括a.用測(cè)試化合物與PASK缺失的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物接觸；并b.檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中PASK水平的差異；其中PASK水平的差異標(biāo)示可調(diào)控PASK的化合物。12.—種通過權(quán)利要求11的方法識(shí)別的化合物。13.—種治療受試者體內(nèi)的癌癥的方法，包括a.選擇癌癥受試者；并b.給予所述受試者有效量的抑制PASK的組合物，從而治療所述受試者的癌癥。14.一種治療受試者體內(nèi)的I型糖尿病的方法，包括a.選擇I型糖尿病受試者；并b.給予所述受試者有效量的抑制PASK的組合物，從而治療所述受試者的I型糖尿病。15.—種治療受試者體內(nèi)的胰島素抗性的方法，包括a.選擇需要胰島素抗性治療的受試者；b.給予所述受試者編碼抑制PASK的組合物的核酸。全文摘要本發(fā)明公開了涉及PAS激酶(PASK)及與此相關(guān)的多種疾病和病癥的組合物和方法。包括治療胰島素抗性、癌癥和糖尿病的方法，包括給予抑制PAS激酶的組合物。還包括用于識(shí)別調(diào)節(jié)PASK激酶的測(cè)試化合物的方法，其中包括高通量篩選方法。文檔編號(hào)C12N9/12GK101501188SQ200780029222公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年6月7日優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日發(fā)明者J·拉特,W·斯威爾泰克,郝淮湘申請(qǐng)人:猶他大學(xué)研究基金會(huì)