專利名稱：：靶定脂肪體的蛋白質(zhì)的制作方法靶定脂肪體的蛋白質(zhì)本發(fā)明涉及通過融合將目的蛋白質(zhì)靶定至細菌細胞的胞內(nèi)疏水內(nèi)含體的方法，所述融合物包含與所述目的蛋白質(zhì)有效連接的疏水目標肽；本發(fā)明涉及通過重組細菌宿主微生物制備目的親脂化合物的方法，所述重組細菌宿主包含具有至少一種酶(其參與靶定至所述內(nèi)含體的所迷親脂化合物的生物合成)的胞內(nèi)內(nèi)含體；本發(fā)明還涉及相應(yīng)的融合物、編碼序列、表達載體及重組宿主。
背景技術(shù)：
：大多數(shù)生物能夠累積疏水化合物，如三酰甘油(TAG)、蠟酯類(waxesters,WE)、固醇酯類(sterolsesters)或聚羥基鏈烷酸酯(PHA)。這些質(zhì)和多聚體沉積為胞內(nèi)內(nèi)含物，并主要作為能量和碳儲備，或用于膜脂及固醇生物合成的前體起作用。真核生物中的初級能量貯存化合物為TAG,而大多數(shù)原核生物可以合成PHA[18，24。在細菌中，儲備TAG和WE主要限定在諾卡氏菌形放線菌(nocardioformactinomycetes)、鏈霉菌(streptomycetes)和一些革蘭氏陰性菌中[3,31。作為最顯箸的實例，富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16能夠累積高達90%其細胞干重的聚3-羥基丁酸(PHB)(Steinbtichel，[24j)。細菌的中性脂質(zhì)內(nèi)含物在結(jié)構(gòu)上與真核生物中的那些內(nèi)含物相關(guān)。兩者均由磷脂單層包圍的脂質(zhì)核心組成，其隔離內(nèi)含物與細胞質(zhì)，因而防止胞質(zhì)蛋白質(zhì)因疏水性相互作用而聚結(jié)或變性。細菌中TAG和WE內(nèi)含物的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)裝配截然不同于真核生物的脂質(zhì)內(nèi)含物。在真核生物中，推測脂質(zhì)內(nèi)含物通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)5的磷脂小葉(phospholipidleaflet)間累積脂質(zhì)并隨后通過脂肪體出芽發(fā)出。具有來自外側(cè)ER小葉的磷脂單層膜的出芽顆粒最終釋放至細胞質(zhì)中[5，18]。相反，細菌中，通過蠟酯合酶/酰基輔酶A:二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(WS/DGAT辨為結(jié)合到質(zhì)膜胞質(zhì)面的小滴上的小型酶合成TAG和WE。這些小滴凝聚成更大的結(jié)構(gòu)，推測它們在釋放至細胞質(zhì)之前被磷脂包被[ll，30]。然而在動物和大多數(shù)植物中，脂肪體單層與陷入蛋白質(zhì)(embeddedprotein)相關(guān)，已知沒有這樣的蛋白質(zhì)包圍細菌的脂質(zhì)內(nèi)含物[12，30。圍脂滴蛋白(，rilipin)是最具特征的哺乳動物脂肪體蛋白質(zhì)，并且參與細胞器的構(gòu)造及形成，并通過激素敏感性脂肪酶調(diào)節(jié)脂解作用來控制脂質(zhì)平衡[17]。三個圍脂滴蛋白同種型A、B和C由單個基因轉(zhuǎn)錄的備選剪接形式的mRNA編碼[9，16。所有圍脂滴蛋白具有共同的N末端，其也非常類似于厶DRP和IIP47的N末端，它們共同組成了PAT蛋白質(zhì)家族[15]。圍脂滴蛋白A是最大的同種型和與脂肪細胞脂肪體相關(guān)的最豐富的蛋白質(zhì)，而ADRP和TIP47具有廣泛的組織分布。圍脂滴蛋白和ADRP特異地與脂肪體表面結(jié)合，而TIP47在細胞質(zhì)中也較多[4，17]。關(guān)于PAT家族蛋白質(zhì)是在游離核蛋白體上合成還是與植物中的油質(zhì)蛋白類似，經(jīng)翻譯插入到沿ER的新生脂肪體中的報道是對立的[5，8，15，20]。油質(zhì)蛋白[1，13是在干旱耐受植物的種子中與脂肪體結(jié)合的主要蛋白質(zhì)。因為它們可以防止脂肪體在種子脫水及萌發(fā)過程中發(fā)生聚結(jié)，于是推測它們在維持脂肪體的穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用[181。推測油質(zhì)蛋白由ER上的多核糖體合成并在出芽過程中共翻譯摻合至脂肪體中。因為也已經(jīng)成功地將玉米的油質(zhì)蛋白耙定至歐洲油菜(Brassicanapus)的種子脂肪體中，并也成功地將其耙定至重纟且酵母(酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中14,26j，該ER介導(dǎo)的靶定過程看起來在真核生物中是普遍的。原核PHA內(nèi)含物，與真核WE或TAG內(nèi)含物之間在蛋白質(zhì)組成及形成方面也顯示出巨大差異。然而已知沒有特定蛋白質(zhì)與細菌TAG和WE內(nèi)含物大量結(jié)合，PHA內(nèi)含物被澤漆皂甙(phasin)包被，其代表了獨特種類的蛋白質(zhì)(？66『&Steinbiichel18c；WSltermann&Steinbiichel[31J;Steinbiichel等[24b)。代表富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16中PHA內(nèi)含物表面上關(guān)鍵澤漆皂甙的PhaPl在這些內(nèi)含物的形成及構(gòu)造中起重要作用，因為它的存在或缺失影響了細胞中內(nèi)含物的數(shù)量和大小及PHB的量(Wieczorek等[31al，P6tter等，[18dl，P(itter等[18el，York等32!)。根據(jù)最公認的模型，PHA內(nèi)含物由可溶性PHA合酶將3HB-CoA的3-羥基丁酸(3HB)聚合成PHB，以及同時釋放CoA而形成。因為PHA合i^f呆持共價連接到生長的PHB鏈上，于是形成了由親水性合酶和延長的多聚體鏈組成的兩親復(fù)合體(Gemgross等，[8a)。認為這些復(fù)合體凝聚成微團樣結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)因PHA鏈的繼續(xù)延伸而擴大成PHA顆粒。在顆粒生長過程中，認為澤漆皂甙和磷脂遷移至多聚體核的疏水面，因而在疏水核與細胞質(zhì)間產(chǎn)生界面(Stubbe&Tian，[24c)。然而，仍然不曾報道過澤漆皂甙蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并且對介導(dǎo)和影響它們靶定至PHA顆粒的因素和基序知之甚少(Pi印er-Ftirst等[18b)。與此相反并如上已描述的，TAG和WE在質(zhì)膜的細胞質(zhì)位置由蠟酯合酶/?；o酶A:二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(WS/DGAT)形成。?；o酶A:二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶是用于細菌中這些脂質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶并結(jié)合到脂滴上。這些小滴聚結(jié)成更大的結(jié)構(gòu)，其然后釋放至細胞質(zhì)并最終呈現(xiàn)為大的脂質(zhì)內(nèi)含物。需要允許將功能性多肽(例如功能性酶)靶定至例如由細菌細胞形成的脂肪體(例如TAG)的系統(tǒng)，所述功能多肽保持與所述脂肪體結(jié)合足夠長時間以在所述細胞中發(fā)揮它們的功能。發(fā)明概述上述問題令人驚奇地通過用融合的編碼序列轉(zhuǎn)化產(chǎn)生脂肪體的細菌細胞得以解決，所述融合物包含與功能多肽有效連接的目標肽，例如功能性酶。7附圖簡述圖1:(A)通過使用SDS-PAGE研究乙酰胺誘導(dǎo)對攜帶構(gòu)建表達質(zhì)粒的恥垢分枝軒菌(M,s函egniatis)中PhaPl、eGFP和C末端PhaPl-eGFP融合物的合成影響(左)，及通過使用Western印跡分析對各重組蛋白質(zhì)<fe、汰JA^m",+、頃工々疋a;i"J/v、^i"aaA/Jr二工閉rtr"j八工U-、/士HV化隊^WJ、>TI/。丌JJ^2T\KW/J/iT工W，^/U丫十、'J、JtijT0CHU，刀J主々'J、,1^泳道1，缺少乙酰胺時的恥垢分枝桿菌pJAM2::phaPl;恥垢分枝桿菌；泳道2，用0.5%(w/v)乙酰胺誘導(dǎo)的pJAM2::phaPl;泳道3，缺少乙酰胺時的恥垢分枝桿菌pJAM2::egfp;泳道4，用0.5%(w/v)乙酰胺誘導(dǎo)的恥垢分4支軒菌pJAM2::egfp;泳道5，缺少乙酰胺時的恥垢分枝桿菌pJAM2::phaPl-egfp;泳道6，用0.5%(w/v)乙酰胺i秀導(dǎo)的pJAM2::phaPl-egfp。(B)攜帶pJAM2::phaPl的恥垢分枝桿菌中重組PhaPl合成及穩(wěn)定性的時間過程分析。細胞粗提物的電泳圖(左)和在補充有0,5%(w/v)乙酰胺的銨減少MSM中生長24小時(泳道l)、48小時(泳道2)、72小時(泳道3)和96小時(泳道4)后，在對應(yīng)于SDS-PAGE的Western印跡上通過4吏用抗PhaPlIgG對PhaPl進4亍的免疫檢測(右)。(A)和(B)的SDS-PAGE凝膠中存在的蛋白質(zhì)通過考馬斯亮藍R250顯現(xiàn)。(C)通過TLC揭示不同濃度的乙酰胺對在銨減少MSM中生長72小時后的恥垢分枝桿菌中胞內(nèi)TAG積累的影響。Std，油酸甘油酯標準；泳道l，0.5%(w/v);泳道2,0.3%(w/v);泳道3，0.1%(w/v);泳道4，0.05%(w/v);泳道5，0.01%(w/v);泳道6，0.005%(w/v),泳道7，0.001%(w/v)。圖2:對細胞粗提物中PhaPl、eGFP和PhaPl-eGFP融合物，及從混濁紅球菌(R.opacus)野生型細胞和攜帶質(zhì)粒pJAM2::phaPl、pJAML:egfp或pJAM2::phaPl-egfp的各重組菌林中獲得的亞細胞部分的免疫檢測。左圖顯示粗提物和細胞部分的SDS-PAGE電泳圖，而中間和右邊的圖顯示在對應(yīng)于SDS-PAGE的Western印跡上分別使用抗PhaPlIgG和抗eGFPIgG的免疫測定。用考馬斯亮藍R250對凝膠中的蛋白質(zhì)進行染色。Std，分子量標準；泳道l;野生型細胞的粗提物；泳道2，野生型細胞的可溶性部分；泳道3，從野生型細胞中分離的TAG內(nèi)含物；泳道4，攜帶pJAM2::phaPl的細胞的粗提物；泳道5,從攜帶pJAM2::phaPl的細胞中獲得可溶性部分；泳道6，從攜帶pJAM2::phaPl的細胞中分離的TAG內(nèi)含物；泳道7，攜帶pJAM2::egfp的細胞的粗提物；泳道8，攜帶pJAML:eg印的細胞可溶性部分；泳道9，攜帶pJA!VK::egfp的細胞的TAG內(nèi)含物；泳道10，攜帶pJAM2::phaPl-eg印的細胞的細胞粗提物；泳道11，攜帶pJAM2::phaPl-egfp的細胞的可溶性部分；泳道12，從pJAM2::phaPl-egfp攜帶細胞中分離的TAG內(nèi)含物。細胞在補充有0.5%(w/v)乙酰胺的銨減少MSM中生長72小時。圖3:在(A)Stdl培養(yǎng)基和銨減少MSM中生長24小時(B)、48小時(C)或72小時(D)的混濁紅球菌的重組細胞中尼羅紅和PhaPl-eGFP融合物的熒光顯樣t定位。每一圖(panel)上方的圖像顯示相差(PH)、微分干涉相差(DIC)和將PH、尼羅紅(NR)和eGFP熒光圖像合并的三通道熒光顯微疊加圖像。每一圖下方的圖像顯示單通道eGFP和NR圖像及將NR和eGFP熒光合并的兩通道熒光顯微疊加圖像。此外，圖A顯示在Stdl中生長的混濁紅球菌的去疊合圖像，其在細胞質(zhì)膜處顯示微弱的PhaPl-eGFP熒光(箭頭)，而圖D中另一去疊合圖4象證實PhaPl-eGFP熒光位于在銨減少MSM中生長72小時的細胞中的胞內(nèi)TAG內(nèi)含物的表面。(E)從在儲存條件下生長72小時的表達phaPl-eg印的混濁紅球菌細胞中分離的TAG內(nèi)含物的PH及去疊合兩通道eGFP/NR熒光圖像，其顯示了表面上融合物的分布和通過NR對內(nèi)含物核中的脂質(zhì)進行的標記。(F)在儲存條件下生長48小時的轉(zhuǎn)化有pJAM2::egfp的混濁紅球菌細胞的PH和熒光圖像，其顯示了未融合eGFP的彌散細胞質(zhì)熒光(上圖)，而胞內(nèi)TAG內(nèi)含物在兩通道eGFP/NR熒光圖像中通過NR被清晰標記(下圖)。所有圖像均從在0.5%(w/v)乙酰胺存在的情況下培養(yǎng)的細胞獲得。除非另有說明，標尺代表liam。圖4:恥裙分枝桿菌mc2155的重組細胞中PhaPl-eGFP融合物的熒光顯微定位。左邊的圖像顯示相差圖像，而右邊的圖像顯示相應(yīng)的熒光圖像。9攜帶pJAM2::egfp的對照菌抹的細胞顯示了未融合的eGFP在整個細胞質(zhì)中的彌散熒光(A)。Stdl培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化有pJAM2::phaPl的恥垢分枝桿菌mc2155細胞在其細胞的一極顯示單個熒光TAG內(nèi)含物(B)。銨減少MSM中生長24小時(C)和48小時(D)的攜帶pJAM2::phaPl-egfp的細胞顯示標記有PhaPl-eGFP的TAG內(nèi)含物數(shù)量增加(箭頭)。所有圖像均從在缺少乙酰胺的情況下培養(yǎng)的細胞獲得。圖5:PhaPl在重組混濁紅球菌PD630中與胞內(nèi)TAG內(nèi)含物;M:膜結(jié)合。使用兔抗PhaPlIgG，隨后使用18nm金綴合山羊抗兔豬IgG(黑點)在冷凍切片上進行免疫細胞化學(xué)。在如方法部分所述進行切片制備前，細胞用pJAM2::phaPl進行轉(zhuǎn)化并且在儲存條件下生長72小時。縮寫CW，細胞壁；CY,細胞質(zhì)；TAG,TAG內(nèi)含物；標尺-200nm。圖6:從重組混濁紅球菌PD630細胞中分離的離體TAG內(nèi)含物的P-半乳糖苷酶活性。(A)從攜帶pJAM2::phaPl-lacZ的混濁紅球菌PD630細胞中分離的TAG內(nèi)含物的P-半乳糖苷酶活性。(B)如在方法部分中所述通過過濾去除TAG內(nèi)含物后分，析物(A)的P-半乳糖苷酶活性。(C)從攜帶作為對照的pJAM2::phaPl的混濁紅J求菌PD630細胞中分離的TAG內(nèi)含物的P-半乳糖苷酶活性。(D)去除TAG內(nèi)含物后分析物(C)的P-半乳糖苷酶活性。圖7:對恥垢分枝桿菌mc2155的重組細胞的蛋白質(zhì)粗提物中玉米油質(zhì)蛋白和鼠圍脂滴蛋白A表達的免疫檢測。(A)SDS-PAGE:Std，分子量標準；泳道1和3，恥垢分枝桿菌pJAM2;泳道2，恥垢分枝桿菌pJAM2::oleo呵"泳道4,恥裙分枝桿菌pJAM2::perA,。(B和C)對應(yīng)于SDS-PAGE(A)的玉米油質(zhì)蛋白(B)和鼠圍脂滴蛋白A(C)的免疫印跡檢測。圖8:圍脂滴蛋白A的eGFP融合物在重組混濁紅球菌PD630中的分布。左圖顯示相差圖像，而右邊顯示相應(yīng)的熒光圖像。(A)在儲存條件下生長24小時的pJAM2::egfp轉(zhuǎn)化混濁紅球菌PD630細胞顯示了未融合eGFP彌散的胞質(zhì)熒光。箭頭指示因胞內(nèi)無標記10TAG內(nèi)含物而排除在外的區(qū)域。(B)在表達eGFP融合物的鼠圍脂滴蛋白A的儲存條件下分別生長0、24或48小時的轉(zhuǎn)化有pJAM2::perAmur-egfp的細胞。eGFP融合物的熒光與胞內(nèi)TAG內(nèi)含物(箭頭)結(jié)合。(C)從在儲存條件下生長48小時的圍脂滴蛋白A-eGFP表達混濁紅球菌PD630細胞中分離的TAG內(nèi)含物。分離到所述TAG內(nèi)含物后，用尼羅紅對核心脂質(zhì)進行復(fù)染。圖9:TIP47的eGFP融合物在重組混濁紅球菌PD630中的分布。相差圖像示于左圖，相應(yīng)的熒光圖像示于右圖。(A)時間重疊實mt實了重組混濁紅球菌PD630中胞內(nèi)TAG內(nèi)含物的形成及TIP47-eGFP蛋白質(zhì)與這些內(nèi)含物的結(jié)合。(B)分離的TAG內(nèi)含物與攜帶結(jié)合的TIP47-eGFP融合物的尼羅紅形成對比。TAG內(nèi)含物從在脂質(zhì)儲存條件下生長48小時的培養(yǎng)細胞中分離。圖10:ADRP的eGFP融合物在重組混濁紅球菌PD630中的分布。顯示了相差圖像(左圖)和對應(yīng)的熒光圖像(右圖)。細胞用pJAM2::adrphum-egfp進行轉(zhuǎn)化并在儲存條件下生長0、24和48小時。圖11:冷凍切片并冷凍斷裂的重組混濁紅球菌PD630細胞的胞質(zhì)TAG內(nèi)含物的免疫金標記。(A)使用豚鼠抗人IgG，然后使用18nm金綴合的驢抗豚鼠IgG在冷凍切片上對TIP47進行的免疫金標記。細胞用pJAM2::tip47進行轉(zhuǎn)化并在儲存條件下生長24小時。在凹面破裂細胞(B)和凸面破裂細胞(C)中胞內(nèi)TAG內(nèi)含物的核心上對其TIP47部分的融合蛋白進行的免疫金(12nm金)標記。(D)通過它們在橫向破裂TAG內(nèi)含物的核心中的eGFP-標簽對TIP47-eGFP進行的免疫金(12nm金)標記?？s寫Cw，細胞壁；Cy,細胞質(zhì)；TAG，TAG內(nèi)含物。標尺-200mn。發(fā)明詳述1.優(yōu)選實施方案第一方面，本發(fā)明涉及將目的蛋白質(zhì)靶定至重組細菌細胞的胞內(nèi)疏水性內(nèi)含體的方法，所述方法包括在所述細菌細胞中異源表達編碼融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白包含與所述目的蛋白質(zhì)有效連接的疏水性目標肽。通常，所述內(nèi)含體是TAG、WE或HA型。它們優(yōu)選為TAG內(nèi)含體。如本方法中所用的目標肽選自原核生物或真核生物的肽，并尤其選自細菌、動物或植物來源的肽。優(yōu)選為細菌和動物來源的目標分子。具體而言，目標分子來自在其天然狀態(tài)下與原核PHA內(nèi)含體(尤其是細菌PHA內(nèi)含體)結(jié)合的蛋白質(zhì)；或來自在其天然狀態(tài)下與真核TAG或WE內(nèi)含體(尤其是動物或植物TAG或WE內(nèi)含體)結(jié)合的蛋白質(zhì)。關(guān)于目標分子的特定種類，可提及聚羥基鏈烷酸酯體結(jié)合澤漆皂甙，例如PhaPl;目標蛋白質(zhì)的PAT家族成員，尤其是圍脂滴蛋白，例如圍脂滴蛋白A、B或C;脂肪分化相關(guān)蛋白質(zhì)(ADRP)也稱為adipophilin;和尾部相互作用蛋白質(zhì)(TIP),例如TIP47。目標分子的非限定性實例選白a)PhaPl(SEQIDNO:19)b)圍脂滴蛋白A(SEQIDNO:27)c)ADRP(SEQIDNO:35)d)TIP47(SEQIDNO:31)或其功能等同物。在靶定方法的優(yōu)選實施方案中，所述目的蛋白質(zhì)為酶，例如參與疏水或親脂目的化合物的生物合成的酶。例如，所述酶可參與以下物質(zhì)的生物合成a)親脂維生素、其衍生物和前體，b)飽和或不飽和脂肪酸和脂肪族醇，尤其是長鏈脂肪酸或相應(yīng)的具有10至30或18至25個碳原子的脂肪族醇，例如多不飽和脂肪酸(PUFA),或c)調(diào)p木物質(zhì)。對于a)組化合物的非限定性實例，可提及類胡蘿卜素，例如P-胡蘿卜素、葉黃素、番癡紅素、cantaxanthine、玉米黃素、astaxantine;維生12素，例如維生素E和QIO。對于b)組化合物的非限定性實例，可提及PUFA(具有18至22個碳原子，和3至6個C二C鍵)，例如w3脂肪酸18:3w3、18:4co3、20:3co3、20:4co3、20:5(03(即二十碳五烯酸，EPA)、22:5co3、22:6co3(即二十二碳六烯酸，DHA);或w6月旨肪酸18:2co6、18:3co6、20:2co6、20:3co6(即雙高-Y-亞麻酸，DGLA)、20:4co6(即花生四烯酸，ARA)、22:30)6、22:4co6或22:5co6。對于c)組化合物的非限定性實例，可提及來自異戊烯-PP的調(diào)味化合物，例如薄荷醇。對于目的酶的非限定性實例，可提及參與類胡蘿卜素生物合成的酶，例如由基因ispA(法呢基-二磷酸合酶)、crtE(忙牛兒基忙牛兒基二磷酸合酶)、crtB(八氫番茄紅素(phytoen)合酶)和crtl(八氫番茄紅素去飽和酶)編/5馬的那些酶。親脂化合物(尤其是如上所述的那些化合物)的生物合成所需的酶為本4頁域所熟知(參閱例力口GerhardMichal，BiochemicalPathways,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,Berlin(1999);D.Schomburg和D.Stephan，EnzymeHandbook1-12，SpringerBerlinHeidelberg(1996)，特此引入作為參考)。本發(fā)明所用的細菌細胞選自具有產(chǎn)生PHA、TAG或WE型內(nèi)含體的能力的天然或重組細菌，例如尤其是產(chǎn)生TAG的諾卡氏菌形放線菌，尤其是紅球菌屬(Rhodococcus)細菌、分枝桿菌屬(Mycobacterium)細菌、諾卡氏菌屬(Nocardia)細菌、戈登氏菌屬(Gordonia)細菌、Skermania細菌和Tsukamurella細菌；及產(chǎn)生TAG的鏈霉菌；產(chǎn)生WE的不動桿菌屬細菌(Acinetobacter)和Alcanivorax細菌；及埃希氏菌屬(Escherichia)(尤其是大腸桿菌(E.coli))、棒桿菌屬(Corynebacterium)(尤其是谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum))和芽孢桿菌屬(Bacillus)(尤其是枯草芽孢桿菌(B.subtilis))的重組菌林。例如，細菌細胞選自混濁紅球菌PD630(DSM44193)和恥裙分枝桿菌mc2155(ATCC700084)。13根據(jù)所述靶定方法的其他實施方案，用包含所述融合蛋白的編碼序列的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細菌細胞，所述編碼序列在所述細菌宿主細胞中處于有效的啟動子序列的調(diào)控之下。本發(fā)明的其他方面涉及微生物產(chǎn)生目的親脂化合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)包含胞內(nèi)內(nèi)含體的重組細菌宿主，所述胞內(nèi)內(nèi)含體包含至少一種參與以上述方式乾定至所述內(nèi)含體的所述親脂化合物生物合成的酶，所述方法還包括在支持產(chǎn)生所述親脂化合物的條件下培養(yǎng)所述宿主。優(yōu)選地，分離攜帶所述目的親脂化合物的所述內(nèi)含體并從所述內(nèi)含體中回收所述目的親脂化合物。所述親脂化合物優(yōu)選選自a)親脂維生素、其衍生物和前體，b)如上定義的脂肪酸和脂肪族醇，或c)調(diào)味物質(zhì)。本發(fā)明的其他方面涉及用于將目的蛋白質(zhì)靶定至細菌細胞的胞內(nèi)疏水性內(nèi)含體的融合蛋白，所述融合蛋白包含與所述目的蛋白質(zhì)有效連接的目標肽。所述融合蛋白尤其將目的蛋白質(zhì)靶定至TAG、WE或PHA型內(nèi)含體，優(yōu)選靼定至TAG內(nèi)含體。所述目標肽優(yōu)選如上文所定義。在優(yōu)選的實施方案中，所述融合蛋白包含目標分子，所述目標分子選白a)PhaPl(SEQIDNO:19)b)圍脂滴蛋白A(SEQIDNO:27)c)ADRP(SEQIDNO:35)d)TIP47(SEQIDNO:31)或其功能等同物。在所述融合蛋白中，所述目的蛋白質(zhì)優(yōu)選為上文定義的酶。本發(fā)明的其他方面涉及編碼本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列；包含如此處定義的至少一個融合蛋白的編碼序列的表達載體，所述編碼序列處于至少一種調(diào)控序列下；重組細菌宿主細胞系，其攜帶如上文定義的表達載體。主細胞系來自如上定義的孩i生物。2.—般術(shù)語的解釋術(shù)語"油體"、"脂肪體，，或"內(nèi)含體，，此處同義4吏用，并必須廣義理解它們，其包含如上所述的TAG、WE和PHA型的那些。所述術(shù)語包括任何胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，其為生物所用以儲存能量、碳或生物合成親脂產(chǎn)物所需的化合物。如此處所用的所述術(shù)語包括任何或所有三?；视王?triacylglyceride)、磷脂、蠟酯、PHA或完整結(jié)構(gòu)中存在的蛋白質(zhì)組分。因為它們的組成和結(jié)構(gòu)，所述體可從重懸它們的不同密度的脂質(zhì)中容易并快速地分離。例如，在密度高于油體密度的水性介質(zhì)中，它們將在重力或應(yīng)用的離心力的影響下漂浮。也可通過基于大小進行分級分離的方法(例如通過使用孔徑小于它們直徑的膜濾器)從存在于溶液或懸浮液中的脂質(zhì)和其他固體中分離油體。術(shù)語"目標肽"包括與任何上述胞內(nèi)細胞器結(jié)合的任何蛋白質(zhì)或任何功能性蛋白質(zhì)(即靶定其片段)。3.本發(fā)明的其它實施方案3.1本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明不僅限于明確公開的"目標肽"或"目的蛋白質(zhì)"或其融合蛋白，也擴展到其功能等同物。具體公開的酶的"功能等同物"或類似物在本發(fā)明范圍內(nèi)為其多種多肽，其還具有期望的生物學(xué)功能或活性，例如靶定功能或酶活性。例如，"功能等同物"指在用于酶活性測驗中顯示至少20%,優(yōu)選50o/o，尤其優(yōu)選75%，特別尤其優(yōu)選高于或低于卯％如此處定義的酶的活性的酶。目標多肽的"功能等同物"是如果與此處提及的目標多肽的特定實例相比，以更高或更低效率靶定至內(nèi)含體的那些。例如，目標分子的效率可通過如此處定義的免疫方法或酶促方法來分析，并在實驗部分得以闡明。根據(jù)本發(fā)明"功能等同物，，也尤其指突變體，其在上述氨基酸序列的至少一個序列位置上具有不同于具體說明的氨基酸的氮基酸，但盡管如此還具有一種上述生物學(xué)活性。"功能等同物"因而包含通過一個或更多M酸添加、取代、缺失和/或倒置獲得的突變體，其中所述改變可在任何序列位置中發(fā)生，假如它們導(dǎo)致具有本發(fā)明性質(zhì)譜的突變體。也特別提供功能等同物，如果反應(yīng)性模式在突變體和未改變多肽間在性質(zhì)上一致，即如果例如相同底物以不同速率進行轉(zhuǎn)化。合適的M酸替代的實例示于下表中原始殘基取代實例laSer「gLyssnGin;HisspGluysSerInAsnluAsplyProisAsn;Gin3Leu;Val3ulie;Val《Arg;Gin;Gluetl_eu;lieheMet;Leu;TyrsrThrhrSer「pTyrTrp;Pheallie;Leu"功能等同物"在上述意義上也指所述多肽的"前體"，及所述多肽的"功能衍生物"和"鹽"。"前體，，在該情況下指具有或不具有期望生物學(xué)活性的多肽的天然或合成前體。表述"鹽"指本發(fā)明蛋白質(zhì)分子的羧基鹽及其氨基的酸加成鹽。鹽可以以已知方式產(chǎn)生并包含無機鹽，例如鈉、鈣、銨、<鐵和鋅鹽，和具有有機堿的鹽，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等。酸加成AAAACGGGHk::l:TMpsTTTV16鹽，例如具有無機酸的鹽，如鹽酸或硫酸，和具有有機酸的鹽，如乙酸和草酸也涵蓋于本發(fā)明中。也可使用已知技術(shù)在功能氨基酸側(cè)基上或在它們的N末端或C末端處產(chǎn)生本發(fā)明多肽的"功能等同物"。這種衍生物包含例如羧,團的脂族酯、羧脧基團的酰胺(通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)獲得)；游離氨基的N?；苌铮渫ㄟ^與?；磻?yīng)產(chǎn)生；或游離羥基的O酰基衍生物，其通過與?；磻?yīng)產(chǎn)生。"功能等同物，，也包含從其他生物獲得的多肽，及天然發(fā)生的變體。例如，可通過序列比較確定同源序列區(qū)域的范圍，并且可在本發(fā)明具體參數(shù)的^出上測定等同酶。"功能等同物"也包含片段，優(yōu)選包含本發(fā)明多肽的各結(jié)構(gòu)域或序列基序，其例如顯示了期望的生物學(xué)功能。此外，"功能等同物"為融合蛋白，其具有上述多肽序列中的一種或來自其的功能等同物，和至少一種其他在功能上不同的與功能性N末端或C末端結(jié)合的異源序列(即與融合蛋白部分之間沒有實質(zhì)上的相互功能損傷)。這些異源序列的非限定性實例是例如信號肽、組氨酸錨或酶。本發(fā)明也包括的"功能等同物，，是具體公開的蛋白質(zhì)的同源物。根據(jù)Pearson和Lipman，Proc.Natl,Acad，Sci.(美國)85(8)，1988，2444-2448的算法計算，它們與具體公開的M酸序列具有至少60%，優(yōu)選至少75%，尤其至少85%，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性。本發(fā)明同源多肽的百分比同源性尤其指氨基酸殘勤目對于一種此處具體描述的M酸序列總長度的同一性百分比。在可能的蛋白質(zhì)糖基化情況下，本發(fā)明的"功能等同物"包含去糖基化或糖基化形式;5U'務(wù)飾形式(所述形式可通過改變糖基化;漠式獲得)的上文指明類型的蛋白質(zhì)。可通過誘變(例如通過點突變、蛋白質(zhì)的延長或縮短)產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的同源物?？赏ㄟ^篩選突變體(例如截短突變體)的組合數(shù)據(jù)庫來鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的同源物。例如，可在核酸水平上通過組合誘變(例如通過S^1連接合成寡核苷酸的混合物)來產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的多樣數(shù)據(jù)庫。有很多方法可用于從簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在同源物的數(shù)據(jù)庫?？稍谧詣覦NA合成儀中進行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后可將合成的基因連接到合適的表達載體中。使用簡并基因組使得以混合物的形式提供所有序列成為可能，所述序列編碼期望組的潛在蛋白質(zhì)序列。合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等，(1984)Science198:1056;Ike等(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。在現(xiàn)有技術(shù)中，已知若干技術(shù)用于篩選組合數(shù)據(jù)庫(其通過點突變或截短產(chǎn)生)的基因產(chǎn)物，并用于篩選cDNA文庫尋找具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)可適用于快速篩選由本發(fā)明的同源物組合誘變產(chǎn)生的基因庫。所述^L術(shù)最經(jīng)常用于篩選大的基因庫，其基于高流通量分析，包括在可復(fù)制的表達載體中克隆基因庫、用所得載體數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化合適的細胞并在期望活性的檢測有利于載體分離(所述載體編碼其產(chǎn)物被檢測的基因)的條件下表達組合基因。增加數(shù)據(jù)庫中功能突變體頻率的技術(shù)RecursiveEnsembleMutagenesis(REM)可用于與篩選實驗組合以鑒定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。3.2編碼核酸序列本發(fā)明還涉及編碼此處定義的融合蛋白的核酸序列。本發(fā)明還涉及與此處明確公開的序列具有某些程度"同一性"的核酸。兩核酸間的"同一性，，指在每種情況下核酸全長范圍內(nèi)核苷酸的同一性，尤其是通過Informax公司(美國)的VectorNTISuite7.1程序，使用ClustalMethod(HigginsDG，SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989年4月；5(2):151-1)，在下面設(shè)置下計算的同一性18多重比對參數(shù)空位開方文罰分10空位延伸罰分10空位分離罰分范圍8空位分離罰分關(guān)比對延遲的％同一性40殘基特異性空位關(guān)親水殘基空位關(guān)轉(zhuǎn)換權(quán)衡0配對比對參數(shù)FAST算法開K-tuple大小1空位罰分3窗孔大小5最佳對角線的數(shù)目5可以以已知方式通過從核苷酸結(jié)構(gòu)單元化學(xué)合成(例如通過雙螺旋各自重疊互補的核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮聚)來產(chǎn)生此處提及的所有核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。例如可以以已知方式通過phosphoamidite方法進行寡核苷酸的化學(xué)合成(Voet，Voet，第二版，WileyPress,NewYork,第896-897頁)。合成寡核苦酸的積累、通過DNA聚合酶Klenow片段填補空位、連接反應(yīng)及一般克隆技術(shù)描述于Sambrook等(1989)中，參閱下文。本發(fā)明還涉及編碼一種上述多肽及它們功能等同物的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其例如可使用人工核普酸類似物獲得。本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)或其生物活性的區(qū)段，還涉及核酸片段，其例如可用于鑒定或擴增本發(fā)明編碼核酸的雜交探針或引物。本發(fā)明的核酸分子此外含有來自編碼遺傳區(qū)域3'和/或5'末端的非翻譯序列。本發(fā)明還涉及與具體描述的核苷酸序列或其區(qū)段互補的核酸分子。本發(fā)明的核苷*列使得產(chǎn)生探針和引物成為可能，所述探針和引物可用于鑒定和/或克隆其他細胞類型和生物中的同源序列。此類探針或引物通常包含核苷酸序列區(qū)域，其在"嚴格"條件(見下文)下與本發(fā)明核酸序列的有義鏈或相應(yīng)的反義鏈的至少約12個，優(yōu)選至少約25個，例如約40、50或75個連續(xù)核苷酸上雜交。"分離的，，核酸分子是從存在于所述核酸天然來源中的其他核酸分子中分離的，此外，如果它由重組技術(shù)產(chǎn)生，則基本上沒有其他細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或如果它是化學(xué)合成的，則沒有化學(xué)前體或其他化學(xué)品。可通過分子生物學(xué)的標準技術(shù)和本發(fā)明提供的序列信息來分離本發(fā)明的核酸分子。例如，可使用一種作為雜交探針的具體公開的完整序列或其區(qū)段及標準雜交技術(shù)從合適的cDNA文庫中分離cDNA(例如在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述)。此外，可使用在該序列基礎(chǔ)上構(gòu)建的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)來分離包含一種公開序列或其區(qū)段的核酸分子。以該方式擴增的核酸可在合適的載體中克隆，并可通過DNA測序?qū)ζ溥M行表征。本發(fā)明的寡核苷酸也可通過合成的標準方法(例如使用自動DNA合成儀)來產(chǎn)生。例如可通過常用的雜交技術(shù)或PCR技術(shù)從其他細菌(例如經(jīng)基因組或cDNA文庫)中分離本發(fā)明的核^列或其衍生物、這些序列的同源物或部分。這些DNA序列與本發(fā)明的序列在標準條件下進行雜交。"雜交"指多核苷酸或寡核苷酸在標準條件下結(jié)合幾乎互補序列，而在這些條件下，在非互補配偶體間并不發(fā)生非特異性結(jié)合的能力。為此，這些序列可以90-100%互補。例如在Northern印跡或Southern印跡或20PCR或RT-PCR中使用互補序列能夠特異性結(jié)合其他一條序列的性質(zhì)。保守區(qū)域的短寡核苷酸有利地用于雜交。然而，使用本發(fā)明核酸的較長片段或完整序列用于雜交也是可能的。這些標準條件根據(jù)用于雜交的核酸(寡核苷酸、較長片段或完整序列)或根據(jù)使用哪種類型的核酸-DNA或RNA而不同。例如，DNA:DNA雜交體的解鏈溫度比相同長度DNA:RNA雜交體的解鏈溫度低約10。C。例如，根據(jù)特定的核酸，標準條件指濃度在0.1至5xSSC(1XSSC=0.15MNaCl、15mM檸檬酸鈉，pH7.2)的水性緩沖液中溫度為42至58。C，或額外地在5(T/。曱酰胺存在下在5xSSC,50%甲酰銨中為42°C。有利地，DNA:DNA雜交體的雜交條件是0.1xSSC，溫度約為20。C至45匸，優(yōu)選約在20'C至45X:間。對于DNA:RNA雜交體，雜交條件有利地為0.1xSSC，溫度約為30。C至55。C，優(yōu)選約在45。C至55'C間。這些用于雜交的所述溫度是長度約100個核苷酸并且在不存在甲酰胺、G+C含量約50%的情況下核酸的計算的解鏈溫度值的實例。用于DNA雜交的實驗條件描述于相關(guān)遺傳教科書，例如Sambrook等，1989中，并可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的公式，例如根據(jù)核酸的長度、雜交體類型或G+C含量來計算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可從以下教科書中獲得進一步的雜交信息Ausubel等(編輯)，1985,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork;Haines和Higgins(編輯)，1985，NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(編輯)，1991，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。尤其可在嚴格條件下進行"雜交"。這種雜交條件例如描述于Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch，E.F"Maniatis，T"MolecularCloning(ALaboratoryManual),第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第9.31-9.57頁或CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。"嚴格"雜交條件尤其指在42。C，由50%曱酰胺、5xSSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%葡聚糖硫酸酯和20g/ml變性剪切鮭精DNA組成的溶液中溫育過夜，然后在65。C用O.lxSSC洗滌濾膜。本發(fā)明還涉及具體公開的或衍生的核酸序列的衍生物。因此，本發(fā)明的其他核酸序列可來自此處明確公開的序列，并且可通過一個或幾個核苷酸的添加、取代、插入或缺失而不同，此外還編碼具有期望性質(zhì)"^普的多肽。本發(fā)明還包括核酸序列，其包含所謂的沉默突變，或與具體所述的序列相比根據(jù)特定起源或宿主生物的密碼子選擇已經(jīng)發(fā)生改變的變體，及天然發(fā)生的變體，例如其剪接變體或等位變體。它還涉及可通過保守核苷酸替代獲得的序列(即所述氨基酸被相同電荷、大小、極性和/或溶解性的氨基酸替換)。本發(fā)明還涉及通過序列多態(tài)性來自具體公開的核酸的分子。這些遺傳多態(tài)性因天然變異而存在于群體中的個體間。這些天然變異通常在基因核苷酸序列中產(chǎn)生1%至5%的變異。本發(fā)明核酸序列的衍生物指例如等位變體，其在來源氨基酸水平上具有至少60%同源性，優(yōu)選在整個序列范圍內(nèi)具有至少80%同源性，非常特別優(yōu)選至少卯％同源性(關(guān)于氨基酸水平上的同源性，應(yīng)該參考上文給出用于多肽的細節(jié))。有利地，所述同源性在序列部分區(qū)域范圍內(nèi)可以更高。此外，也可以將衍生物理解為本發(fā)明核酸序列的同源物，例如動物、植物、真菌或細菌同源物、截短序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。例如，在DNA水平上，同源物在此處明確-&開的序列中給定的完整DNA區(qū)域范圍內(nèi)具有至少40%,優(yōu)選至少60%，尤其優(yōu)選至少70%，非常特別優(yōu)選至少80%的同源性。此外，將衍生物理解為例如具有啟動子的融合物。添加至所述核苷酸序列上的啟動子可通過至少一個核苷酸交換、至少一個插入、倒置和/或缺失(但不損害所述啟動子的功能或效力)修飾。此外，啟動子的效力可通過改變它們的序列來提高，或甚至用不同屬生物的更有效啟動子來進行完全交換。3.3本發(fā)明的構(gòu)建體本發(fā)明還涉M達構(gòu)建體，其含有在調(diào)節(jié)核酸序列遺傳控制下的核酸序列，所述核酸序列編碼本發(fā)明的多肽或融合蛋白；還涉及包含至少一種這些表達構(gòu)建體的栽體。根據(jù)本發(fā)明"表達單元，，指具有表達活性的核酸，其包含如此處定義的啟動子，其在與待表達的核酸或基因功能性連接后調(diào)節(jié)表達，即該核酸或該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此在該上下文中，其也^f皮稱作"調(diào)節(jié)性核,列"。除啟動子外，也可存在其他調(diào)節(jié)元件，例如增強子。根據(jù)本發(fā)明"表達盒"或"表達構(gòu)建體"指表達單元，其與待表達的核酸或待表達的基因功能性連接。與表達單元相反，表達盒因而不僅包含調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸序列，還包含因轉(zhuǎn)錄和翻譯而表達為蛋白質(zhì)的核酸序列。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"表達"或"過表達"描述了微生物中一種或更多種酶的胞內(nèi)活性的產(chǎn)生或提高，所述酶由相應(yīng)的DNA編碼。為此，例如在生物中插入基因、用另一個基因替換現(xiàn)有基因、增加所述一個基因或多個基因的拷貝數(shù)、使用強啟動子或使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶的基因，并且任選地將這些措施組合是可能的。此類本發(fā)明構(gòu)建體優(yōu)選包含來自各編碼序列的5'上游啟動子，和3'下游終止子序列，并任選地包含其他常用調(diào)節(jié)元件，在每種情況下其與編碼序列功能連接。才艮據(jù)本發(fā)明"啟動子"、"具有啟動子活性的核酸，，或"啟動子序列"指與待轉(zhuǎn)錄的核酸功能性連接的核酸，其調(diào)節(jié)該核酸的轉(zhuǎn)錄。在該上下文中，"功能"或"有效，，連接指例如具有啟動子活性的一種核酸和待轉(zhuǎn)錄的核酸序列，及任選地其他調(diào)節(jié)元件(例如使核酸能夠轉(zhuǎn)錄的核酸序列),和例如終止子以每個調(diào)節(jié)元件在所述核酸序列轉(zhuǎn)錄中可以行使其功能的方式連續(xù)排列。這并不必須需要化學(xué)意義上的直接連接。遺傳控制序列(如增強子序列)也可在來自更遠位置或甚至來自其他DNA分23子的耙序列上行使它們的功能。優(yōu)選其中將待轉(zhuǎn)錄的核酸序列置于啟動子序列之后(即在3'末端處)的排列，這使得兩條序列彼此共價結(jié)合。啟動子序列和待經(jīng)轉(zhuǎn)基因表達的核列間的距離可以少于200bp(堿基對)，或少于100bp或少于50bp。除啟動子和終止子外，可提及的其他調(diào)節(jié)元件的實例是目標序列、增強子、多腺苷酸化信號、可選標記、擴增信號、復(fù)制起點等。合適的調(diào)劑序歹'j例如描述于Goeddd，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。本發(fā)明核酸構(gòu)建體尤其包含選自此處明確提及的那些序列或其衍生物和同源物，及來自此處明確提及的氨基酸序列的核酸序列，其有利地與一個或多個用于控制(例如提高)基因表達的調(diào)節(jié)信號有效或功能性連接。除了這些調(diào)節(jié)序列外，這些序列的天然調(diào)節(jié)仍可存在于天然結(jié)構(gòu)基因之前，并任選地已經(jīng)被遺傳改變，使得天然調(diào)節(jié)關(guān)閉并且所述基因的表達已4皮提高。所述核酸構(gòu)建體也可以是更簡單的設(shè)計，即在編碼序列前面不插入任何額外的調(diào)節(jié)信號，而且不除去天然啟動子及其調(diào)節(jié)。相反，將所述天然調(diào)節(jié)序列沉默，使得不再發(fā)生調(diào)節(jié)，基因表達得以提高。優(yōu)選的核酸構(gòu)建體有利地也含有一個或多個上述與啟動子功能連接的增強子序列，其允許所述核酸序列增強表達。額外的有利序列(如其他調(diào)節(jié)元件或終止子)也可插入到所述DNA序列的3，末端。在構(gòu)建體中可含有一個或多個拷貝的本發(fā)明核酸。構(gòu)建體也可含有任選地用于在構(gòu)建體上進行選擇的其他標記(如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型補體基因)。啟動子或在入P^啟動子(其在革蘭氏陰性菌中有利擴增)涵蓋的合適的調(diào)節(jié)序列的實例如cos-、tac畫、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7陽、T5-、T3畫、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaPBAD)SP6-、入-Pr-。在例如革蘭氏陽性菌啟動子中涵蓋的其他有利的調(diào)節(jié)序列是ace、amy和SP02中，在酵母或真菌啟動子中涵蓋的是ADC1、MFoc、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人工啟動子也可用于調(diào)節(jié)。為了表達，將核酸構(gòu)建體插入到宿主生物中，有利地插入載體中(例如允許基因在宿主中最優(yōu)表達的質(zhì)?；蚴删w)。除了質(zhì)粒和噬菌體外，也將載體理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有其他載體，例如病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬菌粒、粘粒，和線性或環(huán)狀DNA。這些載體在宿主生物中可自主復(fù)制或在進行染色體復(fù)制。這些載體代表本發(fā)明的另一實施方案。合適的質(zhì)粒是，例如大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223畫3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-Bl、入gtll或pBdCI;諾卡氏菌形放線菌中的pJAM2;鏈霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361;桿菌中的pUB110、pC194或pBD214;棒桿菌中的pSA77或pAJ667;真菌中的pALSl、pIL2或pBB116;酵母中的2aM、pAG誦l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述質(zhì)粒代表了可能質(zhì)粒的少量選項。其他質(zhì)粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并例如將見于教科書CloningVectors中(PouwelsP.H.等編輯Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。在栽體的其他實施方案中，含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的核酸的載體可有利地以線性DNA的形式插到微生物中并通過異源或同源重組整合到宿主生物的基因組中。該線性DNA可包含線性化的載體(如質(zhì)粒)，或僅包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸。為了異源基因在生物中的最優(yōu)表達，根據(jù)生物中使用的特定密碼子選擇來改變核酸序列是有利的?？稍谒錾锏钠渌阎虻挠嬎銠C評估基礎(chǔ)上容易地確定密碼子選擇。本發(fā)明表達盒的產(chǎn)生基于合適的啟動子與合適的編碼核苷酸序列及終止子信號或多腺苷酸化信號融合。為此使用常見的重組和克隆技術(shù)，如在T，Maniatis,E.RFritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)及T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)及Ausubel，F(xiàn).M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中描述的。將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體有利地插入宿主特異性載體中用于在合適的宿主生物中表達，以允許基因在宿主中進行最優(yōu)表達。載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并將見于例如"CloningVectors"(PouwelsP.H.等，Publ.Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)。3.4根據(jù)本發(fā)明可使用的宿主根據(jù)上下文，術(shù)語"微生物"指初始樣史生物(野生型)或根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的微生物，或指這兩者。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"野生型"指相應(yīng)的初始微生物，并且不需要必須對應(yīng)于天然發(fā)生的生物。通過本發(fā)明的載體，可產(chǎn)生重組孩t生物，其例如已經(jīng)轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的至少一個栽體，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。有利地，上文描述的本發(fā)明重組構(gòu)建體插入到合適的宿主系統(tǒng)中并在其中進行表達。優(yōu)選地，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的常見克隆和轉(zhuǎn)染方法(例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等)以保證所述核酸在各表達系統(tǒng)中的表達。合適的系統(tǒng)描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等，Publ.WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual.笫二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中。原則上，可i/v為所有原核生物是本發(fā)明核酸或核酸構(gòu)建體的重組宿主生物。有利地j吏用細菌作為宿主生物。它們優(yōu)選選自天然的或重組細菌，所述細菌具有產(chǎn)生PHA、TAG或WE型內(nèi)含體的能力，尤其是產(chǎn)生TAG的諾卡氏菌形放線菌，尤其是紅球菌屬、分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬、戈登氏菌屬、Skermania和Tsukamurella;及產(chǎn)生TAG的鏈霉菌；產(chǎn)生WE的不動桿菌屬和Alcanivorax;及埃希氏菌屬(尤其是大腸桿菌)、棒桿菌屬(尤其是谷氨酸棒菌)和桿菌屬(尤其是枯草桿菌)的重組菌抹。這樣，本發(fā)明的意指或多種宿主生物優(yōu)選含有至少一種該發(fā)明中描述的核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體，其編碼(產(chǎn)生)根據(jù)上文定義的酶活性。根據(jù)宿主生物，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方式生長或培養(yǎng)本發(fā)明方法中所用的生物。通常，微生物在液體培養(yǎng)基中生長，所述液體培養(yǎng)基含有通常是糖形式的碳源、通常是氮的有機來源形式的氮源(如酵母提取物或鹽，如硫酸銨)、微量元素(如鐵、錳和鎂鹽)和任選地維生素，溫度在0'C至100。C之間，優(yōu)選在10。C至60。C之間，并進行氧通氣。液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH可維持在固定值，即在生長過程中接受調(diào)整或不接受調(diào)整?？煞峙?、半分批式或持續(xù)進行生長?？稍诎l(fā)酵開始，或隨后半持續(xù)或持續(xù)提供營養(yǎng)物。3.5重組產(chǎn)生親脂化合物本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)產(chǎn)生融合蛋白的微生物(其表達本發(fā)明的融合蛋白)并從培養(yǎng)物中分離期望的化合物來制備本發(fā)明親脂化合物的方法，其中在允許酶促產(chǎn)生所述親脂化合物的條件下進行培養(yǎng)。也可以在工業(yè)規(guī)模上以該方式制備所述化合物，如果想要的話。所述微生物可表達一種或更多種融合蛋白，所述融合蛋白提供所需的酶活性或用于合成期望的親脂化合物的活性。由于酶活性和脂肪體的非常接近，預(yù)計所產(chǎn)生的親脂產(chǎn)物將與脂肪體結(jié)合(即摻入和/或吸附到所述脂肪體中)。這將改變酶促反應(yīng)的平衡以進一步向期望的產(chǎn)物方向進行。此外，與脂肪體結(jié)合的產(chǎn)物可更容易地從大批生物質(zhì)中分離，并通過常規(guī)純化方法(例如提取和色鐠)進行純化。在開始生物合成期望的親脂產(chǎn)物之前，注意在細菌細胞內(nèi)提供充足的脂肪體當然是有益的。這可通過在所謂的儲存條件(例如在所附實施例中對特定菌林闡明的條件)下培養(yǎng)細胞方便地(conviently)完成。然后同時誘導(dǎo)所需融合蛋白的重組表達，使得具有足夠酶促活性靶定至脂肪體。在細菌細胞不能(完全不能或不能以足夠量)產(chǎn)生酶促產(chǎn)生期望的親脂終產(chǎn)物所需的底物和/或共同底物的情況下，可向培養(yǎng)基中加入所需離析物。可以用分批法或補料分配式方法或重復(fù)補料分配式方法連續(xù)或不連續(xù)地培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明所用的微生物。培養(yǎng)的已知方法的綜述將見于Chmiel(Bioprocesstechnik1.EinftihrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))的教科書或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden,1994》的教科書。待使用的培養(yǎng)基必須以適當方式滿足特定菌林的需要。在"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"oftheAmericanSocietyforBacteriology手冊(WashingtonD.C.,美國，1981)中給出了對用于多種微生物的培養(yǎng)基的描述?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的這些培養(yǎng)基通常包含一種或更多種碳源、氮源、無才幾鹽、維生素和/或^:量元素。優(yōu)選碳源是糖，如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。糖也可以通過絡(luò)合物(如糖蜜)或來自糖精煉的其他副產(chǎn)物添加到培養(yǎng)基中。添加多種碳源的混合物也是有益的。碳的其他可能來源是油和脂肪(如大豆油、葵花子油、花生油和椰子油)、脂肪酸(如軟脂酸、硬脂酸或亞油酸)、醇(如甘油、甲醇或乙醇)和有機酸(如醋酸或乳酸)。氮源通常是有機或無機氮化合物或含有這些化合物的物質(zhì)。氮源的實例包括氨氣或銨鹽(如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨)、硝酸鹽、尿素、氨基酸或氮的復(fù)合物來源(如玉米漿、豆粉、大豆蛋白質(zhì)、酵母提取物、肉膏等)。氮源可單獨使用或作為混合物使用?？稍谂囵B(yǎng)基中存在的無機鹽化合物包含釣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。不僅無4幾含石克化合物(例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物)，而且有機硫化合物(如硫醇和巰基化合物)可用作石危源。磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽可用作辨源。28可將螯合劑加入培養(yǎng)基中以維持溶液中的金屬離子。尤其合適的螯合劑包含二羥基苯酚(dihydroxyphenol)(如兒茶酚或原兒茶酸鹽)，或有機酸(如檸檬酸)。根據(jù)本發(fā)明所用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常也含有其他生長因子(如維生素或生長促進劑)，其包括例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡噴醇。生長因子和鹽通常來自培養(yǎng)基的復(fù)雜成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。此外，可將合適的前體加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中化合物的精確組成主務(wù)農(nóng)賴于特定的實驗，并且必須根據(jù)每一特殊情況單獨確定。關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可見于教科書"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury，IRLPress(1997)第53-73頁，ISBN0199635773)。也可從商業(yè)供應(yīng)商(如Standard1(Merck)或BHI(Brainheartinfusion,DIFCO)等)獲得生長培養(yǎng)基。通過加熱(1.5巴，121°C,20分鐘)或通過過濾除菌將培養(yǎng)基的所有成分滅菌。所述組分可一起進行滅菌，或如果需要可單獨進行滅菌。培養(yǎng)基的所有成分在生長的開始時就存在，或任選地可連續(xù)或通過補料分配式加入。培養(yǎng)物的溫度通常在15。C至45。C之間，優(yōu)選在25'C至40X:之間，并可保持恒定或在實驗過程中變化。培養(yǎng)基的pH值應(yīng)該在從5至8.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選在7.0左右?？稍谏L過程中通過添加堿性化合物(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)來控制用于生長的pH值。消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)可用于控制發(fā)泡。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可向培養(yǎng)基中加入具選擇作用的合適物質(zhì)(例如抗生素)。向培養(yǎng)物中加入氧氣或含氧氣體混合物(例如環(huán)境空氣)以維持有氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常為20。C至45°C。連續(xù)培養(yǎng)直至已形成最大量的期望產(chǎn)物。這通常在10小時至160小時內(nèi)完成。任選地可通過高頻超聲；高壓(例如在弗氏壓碎器中)；滲透；去污劑、分解酶或有機溶劑的作用；通過勻漿器或通過若干種所列方法的組合來破碎細胞。以下實施例僅用于闡明本發(fā)明。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的多數(shù)可能變型也在本發(fā)明范圍內(nèi)。實驗部分1.材料和方法a)菌林、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件大腸桿菌菌林XL1blue細胞(Stratagene)和S17-l細胞(Simon等22a])在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中進行常規(guī)培養(yǎng)(Sambrook等[21)?；鞚峒t球菌PD630細胞(DSM44193，Alvarez等[2)和恥垢分枝桿菌mc2155細胞(ATCC700084，Snapper等[23)在StandardI(Stdl)培養(yǎng)基(Merck)中進行培養(yǎng)。為了促進TAG的生物合成和內(nèi)含物的形成，將細胞轉(zhuǎn)移至含有0.1gr1NH4C1的無機鹽培養(yǎng)基(MSM)中并培養(yǎng)24、48和72小時(Schlegel等，[22)。此外，恥垢分枝桿菌mc2155也在Sauton，s培養(yǎng)基(SM)(Darzins，1958)中進行培養(yǎng)。為了促進SM中TAG的積累，將磷酸鉀濃度降至0.05gr1。對于混濁紅球菌PD630或恥垢分枝桿菌mc2155，分別以葡糖酸鈉或葡萄糖(10g1")向MSM和SM中提供碳。為了維持質(zhì)粒pJAM2和衍生物，根據(jù)Sambrook等[21]以50照ml"的終濃度^f吏用卡那霉素。通過向各培養(yǎng)物中添加0.5%(w/v)乙酰胺實現(xiàn)對pJAM2和衍生物乙酰胺酶(ace)啟動子的誘導(dǎo)(Triccas等[29])。所有液體培養(yǎng)均在裝配有擋板的Erlenmeyer搖瓶中分別于37°C(大腸桿菌)或30°C(混法紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155)進行。通過加入18gl"瓊脂來制備固體培養(yǎng)基。b)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備在2550型電轉(zhuǎn)化儀(Eppendorf畫Netheler畫Hinz,Hamburg,德國)中通過電穿孔將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155中。對于混濁紅球菌PD630,如Kalscheuer等[IO]描述進行電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備，對于恥垢分枝桿菌mc2155，如Snapper等[23]描述進行電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備。c)細胞粗提物、可溶性部分和TAG內(nèi)含物的制備混濁紅球菌和恥垢分枝桿菌的細胞在如上述具有降低銨濃度的MSM中生長，離心(20分鐘，6000xg,4°C)收集并重懸于兩倍體積的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中。三次經(jīng)過弗氏壓碎器(1000MPa)后，獲得粗提物。為了獲得可溶性部分，通過在4。C,16000xg離心30分鐘，隨后在SorvallDiscovery90SE超速離心機中4。C，100000xg離心90分鐘從粗提物中除去細胞碎片。通過100000xg超速離心步驟沉淀膜碎片，并隨后在O.lmM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中洗滌后重懸于相同的緩沖液中。通過向不連續(xù)甘油梯度頂部加入l-2ml粗提物來制備TAG內(nèi)含物。不連續(xù)甘油梯度由用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)配制的22、44和88%(v/v)的甘油各3ml組成。梯度在4'C,170000xg離心1小時。抽取TAG內(nèi)含物并隨后在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中洗滌兩次用于進一步分析。d)在分離的TAG內(nèi)含物上測定P-半乳糖普酶活性如上文描述，制備分離自作為對照的攜帶pJAM2::phaPl-lacZ或pJAM2::phaPl的混濁紅球菌PD630細胞的TAG內(nèi)含物。將內(nèi)含物(10mg濕重)重懸于100]iil的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，隨后加入由17ml0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、3ml鄰硝苯基-(5-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)溶液(8%,w/v)、1mM氯化鎂、45mM卩-巰基乙醇和4plSDS溶液(20%，w/v)組成的650pl反應(yīng)溶液。試樣(assay)在37°C溫育30分鐘。為了終止反應(yīng)，加入400|^11M碳酸鈉。其后，通過過濾從試樣中除去TAG內(nèi)含物，并在405nm處測定過濾物的吸光度以分析剪接的ONPG的量。為了計算酶活性，4.6mM_1cm"的s405nm用于各產(chǎn)物ONP(鄰位硝基苯酚)。由于去除所述內(nèi)含物后，試樣中不會發(fā)生ONPG的進一步剪接，因此測定的P-半乳糖苷酶活性基本上與TAG內(nèi)含物相關(guān)。e)免疫印跡分析根據(jù)相當?shù)鞍踪|(zhì)濃度，將已知量的細胞裂解物或亞細胞部分溶解在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中，并根據(jù)Towbin等[28]的方法將其轉(zhuǎn)移到聚偏乙烯(PVDF)膜上。用麗春紅S將膜上的蛋白質(zhì)染色并31分別使用多克隆雞抗玉米油質(zhì)蛋白IgG[19、多克隆兔抗鼠PATIgG(C.Londos惠贈)、在豚鼠中針對代^ATIP47(GP30;ProgenBiotechnik)的N末端(氨基酸1-16)的合成多肽產(chǎn)生的多克隆抗體、多克隆兔抗PhaPlIgG(Wieczorek等，[31a)和針對代表人ADRP(AP125;ProgenBiotechnik)的N末端(^J^酸5-27)的合成肽的小鼠單克隆抗體進行免疫分析。分別使用山羊抗兔、抗鼠或抗雞IgG堿性磷酸酶綴合物，并將5-溴_4-氯-3-丐1咮-磷酸二鉀/氯化硝基四氮唑藍(Sigma)轉(zhuǎn)化成不溶的深色產(chǎn)物來使IgG在免疫印跡上可見。f)顯微鏡檢查通過在含有0.5照ml"尼羅紅(二甲基亞砜中儲存液0.5照ml")的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中于4。C溫育樣品30分鐘來制備尼羅紅標記的細胞和分離的TAG內(nèi)含物。標記后，細胞和內(nèi)含物通過在4°C,16000xg離心而沉淀，并重懸于O.lM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中。通過靜電作用將細胞和TAG內(nèi)含物附著到載玻片上，所述載玻片通過聚(a-L-賴氨酸)(PL)氬溴化物(hydrobromide)的吸附而帶正電荷。為了用PL氬溴化物包被玻璃表面，用自來水徹底沖洗干凈的載玻片，將其浸入甲醇中，并用軟化水再次沖洗。然后加入一滴0.01%(w/v)PL氫溴化物溶液。在空氣中干燥后，用軟化水沖洗載玻片，并加上一滴細胞懸浮液或TAG內(nèi)含物。15分鐘后，用軟化水沖洗包被的載玻片，以去除松弛附著的細菌或TAG內(nèi)含物，并將其轉(zhuǎn)移至熒光顯微鏡下。在配有l(wèi)OOx/1.4NA油浸Plan-Apochromat物鏡和4x或2.5x輔助鏡筒透鏡(auxiliarytubelens)的ZeissAxioImagerMl正置寬視野熒光顯微鏡上以相差(PH)或微分干涉差(DIC)模式檢查載玻片。通過使用peltier冷卻AxioCamMRm16比特數(shù)字單色電荷耦合器件照相機(CCD)來采集圖像。2/3"大小的CCD芯片由1388(H)x1040(V)像素組成，每一個大小為6.45x6.45nm。使用ZeissHBO103W/2高壓汞弧燈來激發(fā)尼羅紅和eGFP熒光。通過使用發(fā)射帶通濾色片在EX/EM470±40/525±50nm處對eGFP進行單通道和多通道熒光圖像的記錄，并在EX/EM550±3225/605±70nm處對尼羅紅進行單通道和多通道熒光圖像的記錄。通過使用高精確度可移動的xyz鏡臺在以0.275pm增量區(qū)分的聚焦位置處采集圖像來產(chǎn)生圖像疊層(該圖像疊層由覆蓋整個z軸光學(xué)切面的45-96個位面組成)。才艮據(jù)樣品和萸光通道，曝光時間在50到1000毫秒間變動以獲得適于去疊合的足夠飽和的圖像。為了減少光漂白，通過Zeiss高速開閉器裝置來控制光照。小心避免待記錄的區(qū)域曝光于熒光光源直至已經(jīng)開始記錄并且已經(jīng)調(diào)整好照相機以提供最佳圖像。將圖像存儲為zvi數(shù)據(jù)格式用于其后的圖像數(shù)據(jù)處理。使用ZeissAxiovision4.5軟件獲得(aquired)所有圖像。其中指出，使用ZeissAxioVision3D去疊合模塊進行所獲(aquired)圖像的限制性反復(fù)去疊合。所有圖像處理均在Siemens2.8GHzLineCelsiusR630工作站上進4亍。g)冷凍斷裂、冷凍切片和免疫金標記對于冷凍切片，通過加入等體積的用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)配制的4%(w/v)低聚甲醛預(yù)先固定細胞懸浮液5分鐘。細胞在相同緩沖液中短暫洗滌并在4%(w/v)低聚甲醛中進一步固定l小時，隨后在含有作為冷凍保護劑的0.9M蔗糖和90%(w/v)聚乙烯吡咯酮25(用50mM碳酸鈉(pH7.0)進行緩沖)的4%(w/v)低聚甲醛中溫育l小時。通過離心將細胞濃縮，置于小體積冷凍保護劑中的針上，并凍于液氮中。如Tokuyasu[17]描述制作超薄切片。對于冷凍斷裂，通過在4°C,6，000xg離心30分鐘沉淀細胞懸浮液(700ml)，重懸于30%(w/v)甘油中(<30秒)，固定在用液氮冷卻的Freon22中，并在-100°C，BA310冷凍斷裂單元(BalzerAG)中冷凍斷裂。通過在38。和卯°角度處鉑碳的電子束蒸發(fā)立即制備新斷裂細胞的復(fù)制物，并使厚度為2到20rnn。所述復(fù)制物在5%(w/v)SDS中溫育過夜以除去除直接附著到復(fù)制物上的那些分子之外的細胞物質(zhì)，在蒸餾水中洗滌，并在免疫染色之前在5%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)中短暫溫育。對于冷凍斷裂復(fù)制物和冷凍切片的免疫染色，使用如上面提及的相同第一抗體，隨后分別使用驢抗豚鼠18nm金綴合物、山羊抗鼠12nm金綴合物或山羊抗兔12nm金綴合物(均來自JacksonImmunoresearch)。此外，為了通過它們的eGFP標簽揭示eGFP融合蛋白的細胞分布，使用在兔中產(chǎn)生的針對eGFP的第一抗體(BDBiosciences)。在沒有第一抗體情況下制備的對照樣品上基本沒有金顆粒。2.合成實施例合成實施例1:phaPl編碼構(gòu)建體的制備a)克隆pJAM2的ace啟動子下游的phaPl使用標準的分子生物學(xué)方案(Sambrook等，[21)。首先將所有聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物克隆至TA載體(pGEM-TEasy;Promega)中。連接產(chǎn)物首先通過DNA測序進行控制，然后在將它們克隆至表達載體pJAM2(其代表含1.5kbpace啟動子區(qū)(SEQIDNO:17)的大腸桿菌-分枝桿菌/紅球菌穿梭載體)之前用適當?shù)南拗泼赶尫?Triccas等，[29])。對于亞克隆，將限制酶識別位點(下劃線，見下文)摻入寡核苷酸的序列中。使用寡核苷酸phaP1-5'(5'-AAAGGATCCATCCTCACCCCGGAACAAG丌-3')(SEQIDNO:1)和phaP1-3'(5'畫AAAGGATCCCGATATGCTTTGCCAACGGAC-3')(SEQIDNO:2).，通過PCR從富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16基因組DNA中擴增不含天然起始密碼子和終止密碼子(582bp)的PhaPl(SEQIDNO:18)的編碼區(qū)。隨后，將PCR產(chǎn)物共線性克隆至pJAM2ace啟動子的BamHI位點中。由此產(chǎn)生與amiE基因前6個密碼子有功能的框內(nèi)融合，生成pJAM2::phaPl。構(gòu)建的融合物中phaPl基因缺少其自身的終止密碼子，但在pJAM2的His6-標簽接頭后含有終止密碼子。因此，氨基酸SRHHHHHH出現(xiàn)在所述蛋白質(zhì)的C末端區(qū)。b)構(gòu)建phaPl-eg印和phaPl-lacZ融合表達質(zhì)粒使用攜帶天然終止密碼子(雙下劃線)的PCR引物egfp-5'(5'-AAATCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3')(SEQIDNO:3)和egfp-3'〖5'AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG曙3')(SEQIDNO:4),，從質(zhì)粒pEGFP-N3(BDBioscienceClontech)中擴增不^^始密碼子的720-bp片段，所述片段代表來自7jc母(Aequoriavictoria,SEQIDNO:20)的完整eGFP基因。然后將PCR產(chǎn)物共線性克隆至pJAM2::phaPlace啟動子，以及phaPl下游的Xbal位點中，生成pJAM2::phaPl-egfp。為了研究對照實驗中未融合的eGFP的表達和分布，通過BamHI限制酶切和重新連接將pJAM2::phaPl-egfp的phaPl部分從表達質(zhì)粒上釋放，生成pJAM2::egfp。對于pJAM2::phaPl-lacZ的構(gòu)建，使用攜帶天然終止密碼子(雙下劃線)的PCR引物lacZ-5'(5'-AAATCTAGAACCATGATTACGGATTCACTGG-3')(SEQIDNO:5)和lacZ-3'(5'-AAATCTAGATTATTTTTGACACCAGACCAACTG畫3')(SEQIDNO:6)從E.coliS17-l的基因組DNA中擴增lacZ的不含天然起始密碼子的3075-bp編碼區(qū)。然后將PCR產(chǎn)物共線性克隆至pJAM2::phaPlace啟動子，以及phaPl下游的Xbal位點中。合成實施例2:制備編碼圍脂滴蛋白A、tip47、ADRP、油質(zhì)蛋白和油質(zhì)蛋白D的構(gòu)建體a)克隆pJAM2ace啟動子下游的增強gfp(egfp)使用標準的分子生物學(xué)方案[21]。首先將所有聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物克隆至TA載體(pGEM-TEasy;Promega)中，通過DNA測序進行控制，然后在將它們克隆至表達載體之前用適當?shù)南拗泼赶尫?見下文)。為了利于亞克隆，將限制酶識別位點(下劃線，見下文)摻入寡核苷酸序列中。通過^f吏用攜帶天然終止密碼子(雙下劃線)的PCR引物印fp-5'(5'-AAATCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3')(SEQIDNO:3)和egfp畫3'，〖5'AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG陽3')(SEQIDNO:4)從pEGFP-N3(BDBioscienceClontech)中擴增不^^始密碼子的720個堿基對(bp)的片段，其含有egfp(SEQIDNOJ0)的完整編碼序列。然后將PCR產(chǎn)物共線性克隆至pJAM2(其為含有1.5-kbpace啟動子區(qū)[29](SEQIDNO:17)的大腸桿菌-分枝桿菌/紅球菌穿梭載體)ace啟動子的Xbal35位點中，以產(chǎn)生與amiC基因前6個密碼子有功能的框內(nèi)融合，并生成pJAM2::egfp。b)構(gòu)建脂肪體蛋白質(zhì)-eGFP融合物表達質(zhì)粒擴增各蛋白質(zhì)不含其天然起始密碼子和終止密碼子的編碼區(qū)，以利于產(chǎn)生功能融合物構(gòu)建體。使用寡核苷酸perA-5'(5'畫AAAAGTACTTCAATGAACAAGGGCCCAACC-3')(SEQIDNO:7)和perA-3'(5'-AAAAGTACTGCTCTTCTTGCGCAGCTGGC-3')(SEQIDNO:8).通過PCR從攜帶鼠圍脂滴蛋白AcDNA[8的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pSRaMSVtkneo中擴增鼠圍脂滴蛋白A編碼區(qū)(1551bp)(SEQIDNO:26)。使用寡核苷酸t(yī)ip47-5'(5'-AAAGGATCCTCTGCCGACGGGGCAGAGGC畫3')(SEQIDNO:9)和tip47-3'(5'-AAAGGATCCTTTCTTCTCCTCCGGGGCTT-3')(SEQIDNO:10).從質(zhì)粒pQE31[7]中擴增人TIP47cDNA(1302bp)(SEQIDNO:30)。使用寡核苷酸adrp-5'(5'-AAAAGTACTAGTTTTATGCTCAGATCGCTGG-3')(SEQIDNO:11)和adrp-3'(5'-AAAAGTACTGCATCCGTTGCAGTTGATCCAC-3')(SEQIDNO:12).從C.Londos(細胞與發(fā)育生物學(xué)實驗室，國家健康研究所(Laboratoryofcellularanddevelopmentalbiology,NationalInstitutesofHealth)，Bethesda)提供的ADRPcDNA片段中擴增人ADRPcDNA(1311bp)(SEQIDNO:34)。將包含PAT家族基因的每一PCR產(chǎn)物共線性克隆至pJAM2::egfpegfp區(qū)域上游ace啟動子的BamHI或Seal位點中，分別產(chǎn)生pJAM2::perAmur-egfp、pJAM2::tip47hum-egfp和pJAM2::adrphum-egfp。使用寡核苷酸oleo-5'(5'-AAAGGATCCGCGGACCGCGACCGCAGCGG-3')(SEQIDNO:13)和oleo-3'(5'-AAAGGATCCCGAGGAAGCCCTGCCGCCG-3')(SEQIDNO:14)從質(zhì)粒pL2土[19中擴增代表18kDa玉米油質(zhì)蛋白(SEQIDNO:38)的cDNA編碼區(qū)的567bp片段，然后將其克隆至pJAM2::egfp的BamHI位點中，產(chǎn)生pJAM^:oleo呵s-egfp。類似的，使用寡核苷酸0leoHD-5'(5'-AAAGGATCCGCGCTGACGGTGGCGACGCTG國3')(SEQIDNO:15);和oleoHD-3'(5'-AAAGGATCCCGCCGTGTTGGCGAGGCACGT-3').(SEQIDNO:16)通過PCR構(gòu)建與截短的玉米油質(zhì)蛋白融合的eGFP，所述截短的玉米油質(zhì)蛋白僅代表其中間疏水結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:39的第48-113位^J^酸)。該質(zhì)粒凈皮稱為pJAM2::oleoHD-egfp。然后，通過Xbal限制酶和重新連接從每一構(gòu)建的表達質(zhì)粒上釋放每一個融合物的egfp部分，分別產(chǎn)生pJAM2::perA隨、pJAM2::tip47hum、pJAM2::adrphum、pJAM2::oleomays和pJAM2::oleoHD。因為每一個構(gòu)建的融合物中的脂肪體蛋白質(zhì)基因缺少其自身的終止密碼子，但在pJAM2的His6-標簽接頭序列之后含有一個終止密碼子，所以氨基酸SRHHHHHH添加到各蛋白質(zhì)的C末端。3.表達實驗A.使用phaPl的實驗實施例Al:phaPl在恥垢分枝桿菌mc2155和混濁紅球菌PD630的重組菌林中的表達和翻譯產(chǎn)物在亞細胞部分中的分布為了測定egfp、phaPl和phaPl-egfp在重組;故線菌中的異源表達，通過在方法部分中描述的SDS-PAGE和Western印跡分析在銨減少條件下生長72小時的細胞的細胞粗提物和細胞部分。當用0.5%(w/v)乙酰胺誘導(dǎo)時，攜帶pJAM2::phaPl的恥垢分枝桿菌細胞的電泳圖顯示出表觀分子量為25kDa的額外蛋白質(zhì)。該分子量(MW)很好地對應(yīng)于His6-標記的PhaPl的計算分子量。使用抗PhaPlIgG在相應(yīng)的Western印跡上容易地識別His6-標記的PhaPl。然而，His6-標記的PhaPl的合成相比于合成52kDaPhaPl-eGFP融合物和未融合的27kJDAeGFP的菌林顯著較少，所述未融合的27kDAeGFP通過使用抗PhaPl和抗eGFPIgG也在Western印跡上得以證實。所有IgG在未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細胞粗提物中未識別到蛋白質(zhì)，說明在恥垢分枝桿菌中重組蛋白質(zhì)的合成受添加乙酰胺的嚴格調(diào)控。因為在攜帶pJAM2::phaPl和pJAM2::egfp的細胞的電泳圖和Western印跡中37沒有檢測到較低MW的產(chǎn)物，所以這些蛋白質(zhì)似乎對細胞質(zhì)中的蛋白水解是穩(wěn)定的。然而，在恥垢分枝桿菌pJAM2::phaPl-egfp的粗提物上應(yīng)用抗PhaPl和抗eGFPIgG揭示了融合蛋白發(fā)生微弱的剪接。此外，恥垢分枝桿菌細胞粗提物的所有SDS-PAGE電泳圖顯示了44kDa的額外蛋白質(zhì)，其很可能代表了當用0.5%(w/v)乙酰胺誘導(dǎo)細胞時染色體編碼的乙酰胺酶(圖1A)。通過延長表達時間至96小時也證實了重組恥垢分枝桿菌中PhaPl的胞內(nèi)穩(wěn)定性(圖1B)。我們設(shè)法確定PhaPl在恥垢分枝桿菌重組細胞的亞細胞部分中的分布。不幸的是，甚至當乙酰胺濃度降至0.05%時，用乙酰胺誘導(dǎo)細胞也會導(dǎo)致TAG積累和TAG內(nèi)含物數(shù)量的嚴重減少(圖1C)。這可能是因為染色體編碼的乙酰胺酶對誘導(dǎo)物進行剪接，因而為細胞生長提供了足夠的銨。為在如方法部分中描述的SM中磷酸鹽受限的條件下實現(xiàn)TAG內(nèi)含物的足夠積累的嘗試因發(fā)育不全和很少的脂質(zhì)積累而失敗(數(shù)據(jù)未顯示)。為了繞過該障礙，隨后將所有構(gòu)建的質(zhì)粒引入至混濁紅球菌中。與恥垢分枝桿菌相反，混濁紅球菌相應(yīng)重組菌林的粗提物的SDS-PAGE電泳圖揭示與從在銨減少MSM中生長72小時的野生型(甚至在用0.5%(w/v)乙酰胺誘導(dǎo)的細胞)獲得的粗提物相比，沒有額外的可見蛋白質(zhì)條帶，說明由恥垢分枝桿菌ace啟動子控制的基因表達在混法紅球菌中顯著較低。然而，根據(jù)在重組恥垢分枝桿菌中獲得的結(jié)果，抗PhaPlIgG在Western印跡中識別從攜帶pJAM2::phaPl的細胞粗提物中獲得的25kDa蛋白質(zhì)，雖然澤漆皂戒的免疫識別顯著低于在重組恥垢分枝桿菌中的識別。與在恥垢分枝桿菌中類似，在混濁紅球菌中沒有檢測到澤漆皂甙的降解產(chǎn)物。類似地，如通過應(yīng)用抗eGFPIgG證實，分別在攜帶pJAML:egfp和pJAM2::phaPl-egfp的細胞粗提物的Western印跡上容易地識別eGFP和PhaPl-eGFP融合物(圖2)。與恥垢分枝桿菌相反，向培養(yǎng)物中添加0.5%(w/v)乙酰胺并不影響混濁紅球菌中TAG的積累(未顯示)。為了研究PhaPl、eGFP和PhaPl-eGFP融合物在混濁紅球菌中的細胞分布，將誘導(dǎo)細胞的粗提物分級分離為可溶性級分、膜級分和代表TAG內(nèi)含物的級分。在混濁紅球菌pJAM2::phaPl各級分的Western印跡上，在代表TAG內(nèi)含物的級分中通過抗PhaPlIgG識別澤漆皂戒，然而在可溶性級分中沒有信號出現(xiàn)。這表明在重組混濁紅球菌中PhaPl與TAG內(nèi)含物結(jié)合。也通過在攜帶pJAM2::phaPl-eg印的菌林的Western印跡上使用抗eGFPIgG對PhaPl-eGFP融合物進行定位，證實了混濁紅球菌的細胞部分中PhaPl分布結(jié)果。在該重組菌林中，所述融合蛋白也只出現(xiàn)在代表TAG內(nèi)含物的級分中。我們也設(shè)法在所述重組菌林的總膜級分的電泳圖中定位PhaPl和其eGFP融合物，但失敗了(數(shù)據(jù)未顯示)。如期望，未融合的eGFP僅定位在攜帶pJAM2::egfp的對照菌林的可溶性級分中(圖2)。實施例A2:PhaPl-eGFP融合蛋白在重組混濁紅球菌PD630和恥祐分枝桿菌mc2155中的分布。為了證實混濁紅球菌中PhaPl-eGFP與TAG內(nèi)含物的結(jié)合，通過熒光顯微鏡，在Stdl培養(yǎng)基中生長并也當細胞質(zhì)中發(fā)生大的胞內(nèi)TAG內(nèi)含物形成時允許TAG積累的條件下，在銨減少MSM中生長24、48和72小時的細胞中研究了融合蛋白的分布。所述融合蛋白的熒光在它們形成的所有階段均主要與TAG內(nèi)含物結(jié)合。然而在Stdl培養(yǎng)基中生長的細胞中，熒光與質(zhì)膜處的新生TAG內(nèi)含物結(jié)合，而在銨減少MSM中生長24、48和72小時的細胞中它主要與細胞質(zhì)中的成熟TAG內(nèi)含物結(jié)合(圖3A-D)。如從Stdl生長細胞獲得的圖像的限制性重復(fù)去疊合(deconvolution)揭示，焚光也以相同程度出現(xiàn)在細胞壁和質(zhì)膜區(qū)域。然而，當與胞內(nèi)TAG內(nèi)含物的熒光相比時，這些區(qū)域的熒光弱得多(見圖3A中的去疊合圖像)。在銨減少MSM中72小時后，細胞內(nèi)充滿明亮的熒光TAG內(nèi)含物。實際上，去疊合后，這些細胞中大的TAG內(nèi)含物經(jīng)常顯示熒光環(huán)，表明融合蛋白在內(nèi)含物表面上的定位(圖3D)。融合蛋白的熒光在TAG積累的所有階段始終與尼羅紅焚光可區(qū)分，其除了標記TAG內(nèi)含物，也清楚地標記細胞膜(圖3A-D)。細胞破碎后，觀察到PhaPl-eGFP的熒光與分離的TAG內(nèi)含物結(jié)合，39表明融合蛋白與所述內(nèi)含物穩(wěn)定結(jié)合。與在完整細胞中的觀察結(jié)果類似，在去疊合圖像中，分離的內(nèi)含物在它們外周顯示綠色熒光環(huán)(圖3E)。與此相反，當在沒有尼羅紅標記的情況下進行觀察時，來自表達未融合eGFP的細胞的TAG內(nèi)含物顯示沒有熒光(未顯示)。表達未融合eg印的細胞(其作為陰性對照)在整個細胞質(zhì)中顯示彌散的綠色焚光，然而通過它們的尼羅紅熒光可容易地檢測到胞內(nèi)TAG內(nèi)含物(圖3F)。表達未融合eg印的恥垢分枝桿菌mc2155細胞在細胞質(zhì)中顯示彌散的熒光，這與在混濁紅球菌PD630中觀察到的現(xiàn)象類似(圖4A)。對應(yīng)于重組混濁紅球菌PD630中的結(jié)果，在不用乙酰胺誘導(dǎo)的攜帶pJAM2::phaPl-egfp的恥垢分枝桿菌mc2155細胞中，在它們形成的任何階段的TAG內(nèi)含物位置上觀察到熒光，表明澤漆皂甙也靶定至內(nèi)含物。然而，因為恥垢分枝桿菌mc2155中TAG內(nèi)含物的數(shù)量和大小從未達到混濁紅球菌PD630中那些內(nèi)含物的數(shù)量和大小，TAG內(nèi)含物僅作為熒光離散點出現(xiàn)在細胞質(zhì)中(圖4B-D)。相反，在乙酰胺誘導(dǎo)的細胞中，在細胞中出現(xiàn)非常強的熒光，其可能與亞細胞結(jié)構(gòu)無關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。這4艮可能是因為細胞中高豐度的融合蛋白。實施例A3:冷凍切片的免疫金標記為了研究PhaPl-eGFP僅靶定至混濁紅球菌PD630中TAG內(nèi)含物的表面還是也靶定至細胞的其他成分，通過包埋后免疫金標記將融合蛋白固定在冷凍切片上。從在儲存條件下生長72小時的重組細胞中制備超薄冷凍切片。為了免疫金標記冷凍切片，兔抗PhaPlIgG與山羊抗兔IgG金綴合物組合使用。在冷凍切片的混濁紅球菌PD630細胞中，TAG內(nèi)含物呈現(xiàn)為內(nèi)部結(jié)構(gòu)很少的近乎球形、電子半透明的區(qū)域。在內(nèi)含物的表面發(fā)現(xiàn)了PhaPl-eGFP的強標記，而在細胞質(zhì)中幾乎沒有觀察到標記。在質(zhì)膜處也檢測到標記。然而，細胞周圍的PhaPl-eGFP標記的濃度低于TAG內(nèi)含物表面處的濃度(圖5)。球菌PD630中TAG內(nèi)含物上的固定一旦證實了天然PhaPl及PhaPl-eGFP融合物與TAG內(nèi)含物的結(jié)合，則研究PhaPl是否可用作在TAG內(nèi)含物表面固定活性酶的錨定物。為此，將作為報告基因的大腸桿菌LacZ與phaPl的3，末端區(qū)的融合物構(gòu)建到質(zhì)粒pJAM2中。將所得質(zhì)粒pJAM2::phaPl-lacZ轉(zhuǎn)移至混濁紅球菌PD630中，并將細胞培養(yǎng)72小時。隨后，分離所述TAG內(nèi)含物并用于ONPG的酶促轉(zhuǎn)化。對于對照實驗，攜帶pJAM2::phaPl的細胞以相同方式使用。含有對照菌林的TAG內(nèi)含物的樣品僅顯示低的P-半乳糖苷酶活性。因為混濁紅球菌PD630也表達染色體編碼的P-半乳糖苷酶，預(yù)計在對照樣品中也具有低的酶活性。此外，顯示多種胞質(zhì)蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合TAG內(nèi)含物，所述蛋白質(zhì)然后與所述內(nèi)含物共純化(Kalscheuer等[10a];Waitermann&Steinbtichel[31])。然而，在含有從phaPl-lacZ表達菌林中分離的TAG內(nèi)含物的樣品中酶活性顯著很高。當從分析物中去除TAG內(nèi)含物時，ONPG的轉(zhuǎn)化在所有實驗中立即結(jié)束。該結(jié)果排除了游離P-半乳糖苷酶分子的參與，其通過純化步驟不能被去除(圖6)。這些數(shù)據(jù)證實LacZ通過PhaPl作為錨定物穩(wěn)定固定于細菌TAG內(nèi)含物上。表達實施例的討論-部分A在實驗的該部分中，顯示轉(zhuǎn)化有富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16phaPl基因的混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155重組菌林的細胞合成澤漆皂戒PhaPl。這些實驗的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是所述澤漆皂武在細胞中保持穩(wěn)定，并且該PhaPl和PhaPl融合蛋白靶定至TAG內(nèi)含物。這是關(guān)于澤漆皂戒蛋白質(zhì)結(jié)合TAG內(nèi)含物的第一例報道。在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16中，PhaPl與PHB顆粒部分嚴密結(jié)合，并且它的表達因轉(zhuǎn)錄抑制物PhaR施加的調(diào)控作用而與PHB合成高度相關(guān)(P6tter等[18d])。仍然不曾鑒定到將澤漆皂甙靶定至富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16中PHB顆粒的PhaPl的基序。然而，PHB顆粒及TAG內(nèi)含物分別具有聚酯或脂質(zhì)的疏水核，認為所述核被單層磷41月旨包圍(deKoning&Maxwell[6b；Hocking&Marchessault[9a；Mayer&Hoppert[16a];WSltermann等[30)。該常見結(jié)構(gòu)允許PhaPl耙定至PHB顆粒，并也明顯地粑定至如這些實驗中證實的TAG內(nèi)含物。因此，本數(shù)據(jù)表明PhaPl靶定至富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16中PHB顆粒很可能不受澤漆皂甙與顆粒中多聚物的直接相互識別的介導(dǎo)。該結(jié)果表明PhaPl明顯具有結(jié)合任何類型疏水內(nèi)含物的能力，與PHA或不同疏水性化合物是否存在于所述內(nèi)含物的核心無關(guān)。此外，參與PHA代謝的其他還未鑒定的組分介導(dǎo)PhaPl靶定至內(nèi)含物也是不太可能的，因為該組分在我們的研究所用的菌林中應(yīng)該是不存在的。最可能的是，PhaPl與內(nèi)含物的結(jié)合僅受兩親界面(amphiphilicinterphase,所述界面由內(nèi)含物和周圍細胞質(zhì)之間的單層膜組成)的存在、或核的疏水表面的存在、或兩者組合的介導(dǎo)。電子顯微鏡和包埋后免疫細胞化學(xué)組合揭示PhaPl主要分布在TAG內(nèi)含物的兩親表面上。然而，與其在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16中PHB顆粒表面上的唯一分布相反，證明了一些PhaPl也存在于混濁紅球菌PD630細胞中的質(zhì)膜和細胞壁區(qū)域。該分布也由Pieper-Fiirst等在研究赤紅球菌(Rhodococcusruber,其也能夠合成等量的TAG和聚(3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酉旨(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))共聚物)中14kDa澤漆皂戒的細胞分布時報道[18a。雖然還不知道赤紅球菌TAG和聚(3HB-co-3HV)是單獨出現(xiàn)在內(nèi)含物中還是同時出現(xiàn)在內(nèi)含物中，但證明了在該菌林中澤漆皂甙出現(xiàn)在細胞中任何內(nèi)含物的表面上，并也出現(xiàn)在質(zhì)膜的胞質(zhì)位點處。根據(jù)最近提出的模型，原核生物中TAG內(nèi)含物的起源是質(zhì)膜的胞質(zhì)位點(Waitermann等[31])。因此，澤漆皂甙與合成位點處的新生TAG內(nèi)含物的結(jié)合是對該分布最可能的解釋。在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16中，PHB的量和顆粒的數(shù)量直接受細胞中澤漆皂甙的量的影響(Wieczorek等[31a；Piitter等[18d)。澤漆皂甙的存在既不改變混濁紅球菌PD630中TAG的量，也不影響TAG內(nèi)含物的大小或數(shù)量。如本表達分析所揭示，細胞中PhaPl的總量非常低，因為蛋白質(zhì)的表達受質(zhì)粒pJAM2的ace啟動子的限制。大量澤漆皂甙的存在是否42影響細胞中的TAG代謝有待于闡明。證實了用PhaPl-LacZ融合物標記的TAG內(nèi)含物顯示體外P-半乳糖苷酶活性。酶和其他種類的蛋白質(zhì)在表面或確定的顆粒上的固定提供了令人感興趣的應(yīng)用。一個實例是功能化納米顆粒(例如用于分析目的的這種運輸抗體，或激素和其他治療劑)的合成。這種納米顆粒易于從細胞粗提物中純化。Moldes等[17a]使用PHA顆粒作為基質(zhì)和來自惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的澤漆皂戒PhaF的N末端作為連接物建立了用于合成并純化酶的系統(tǒng)。此外，已經(jīng)成功地證明重組大腸桿菌中PHB顆剪接親和標記作為用于目標蛋白質(zhì)純化的基質(zhì)(Banki等[3a)。Moloney[17c;17d]也使用TAG內(nèi)含物作為酶純化的基質(zhì)。該作者通過油質(zhì)蛋白將目標酶附著到油體上建立了基于植物細胞的系統(tǒng)。上文描述的兩個純化系統(tǒng)均取得專利權(quán)并可通過商業(yè)途徑獲得(Prieto等ES專利200102240[18fJ;Moloney:美國專利5650554[17bj和6924363[17e])。此外，通過PhaPl標簽將酶和其他蛋白質(zhì)錨定至TAG內(nèi)含物上提供了在胞內(nèi)TAG內(nèi)含物的單層表面上建立備選生物改造途徑的重要可能性。B.利用原核生物脂肪體蛋白質(zhì)的實驗實施例B1:原核脂肪體蛋白質(zhì)在重組放線菌中的表達將鼠圍脂滴蛋白A(SEQIDNO:26)、人ADRP(SEQIDNO:34)、人TIP47和玉米油質(zhì)蛋白(SEQIDNO:38)基因的編碼區(qū)作為His6-標記的融合物克隆至大腸桿菌-紅球菌/分枝桿菌穿梭載體pJAM2中。使用在材料和方法部分中列出的抗體，通過SDS-PAGE和免疫印跡分析各轉(zhuǎn)化的恥垢分枝桿菌mc2155和混濁紅球菌PD630細胞粗提物中圍脂滴蛋白A、ADRP、TIP47和油質(zhì)蛋白的表達。所有抗體均不識別未轉(zhuǎn)化的紅球菌/分枝桿菌細胞中的任何蛋白質(zhì)。雞抗玉米油質(zhì)蛋白IgG容易地識別轉(zhuǎn)化有pJAM2::okOmays的恥垢分枝桿菌mc2155細胞中的19-kDa蛋白質(zhì)(圖7)。然而，即使與不經(jīng)乙酰胺誘導(dǎo)的恥垢分枝桿菌mc2155細胞比較，在攜帶pJAM2::oleomays的混濁紅球菌PD630細胞中表達很低并僅在曝光過度的免疫印跡上觀察得到(未顯示)。該19-kDa蛋白質(zhì)應(yīng)該是來自pJAM2::oleomaize中玉米基因的His6-標記的油質(zhì)蛋白。在混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155中沒有檢測到較低Mr的蛋白水解降解產(chǎn)物，表明所述蛋白質(zhì)相對于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解作用是穩(wěn)定的。攜帶質(zhì)粒pJAM2::perA,.的恥垢分枝桿菌mc2155和混濁紅球菌PD630中His6-標記的鼠圍脂滴蛋白A的表達導(dǎo)致在免疫印跡上有58kDa的單個信號(與重組油質(zhì)蛋白表達的信號具有類似的強度)，表明所述蛋白質(zhì)也是穩(wěn)定的，并且細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解并沒有出現(xiàn)(圖7)。在分別攜帶pJAM2::tip47hum或pJAM2::adrphum的恥裙分枝桿菌mc2155和混濁紅球菌PD630的粗提物中，在免疫印跡上沒有檢測到可見的合成蛋白質(zhì)。使用尼羅紅作為染料的薄層色譜和熒光顯樣t術(shù)揭示與不存在乙酰胺的野生型相比，質(zhì)粒的存在和蛋白質(zhì)的表達并不改變細胞的脂質(zhì)含量或脂質(zhì)內(nèi)含物的數(shù)量、性狀或大小。與此相反，當向培養(yǎng)物中加入多于0.01%(w/v)的乙酰胺時，恥垢分枝桿菌mc2155的細胞中含有量顯著減少的TAG和數(shù)量顯著減少的脂質(zhì)內(nèi)含物(未顯示)。實施例B2:PAT蛋白質(zhì)和油質(zhì)融合物在重組混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155中的熒光定位進行實驗以通過免疫印跡分析在重組混濁紅球菌PD630的亞細胞部分中定位圍脂滴蛋白A和玉米油質(zhì)蛋白，但因合成的蛋白質(zhì)量少并且免疫印跡測定的靈敏度低而失敗了。為了揭示PAT蛋白質(zhì)和油質(zhì)蛋白的亞細胞定位和與細菌TAG內(nèi)含物的結(jié)合性質(zhì)，脂肪體蛋白質(zhì)在重組菌株中作為與eGFP的融合物變得可見。轉(zhuǎn)化有各PAT蛋白質(zhì)eGFP融合物表達質(zhì)粒的混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155細胞在儲存條件下培養(yǎng)0、24和48小時，并檢查它們的熒光才莫式。攜帶表達未融合eGFP的質(zhì)粒pJAM2::egfp的細胞作為陰性對照。在這些條件下及這些時期過程中，細胞增加了它們的脂質(zhì)含量并在細胞質(zhì)中積累了大量的脂質(zhì)內(nèi)含物，根據(jù)早44期的觀察所述脂質(zhì)內(nèi)含物來自周邊脂質(zhì)區(qū)域[6，30。未融合的eGFP在混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155的整個細胞質(zhì)中顯示出廣泛并彌散的熒光。然而，相比于從混濁紅球菌PD630獲得的那些圖像，從恥垢分枝桿菌mc2155獲得的圖像因其顯著的匯合生長而顯得弱，樹艮好地對應(yīng)于在混濁紅球菌PD630的重組菌林中獲得的所有結(jié)果。從脂質(zhì)積累晚期出現(xiàn)的大的脂質(zhì)內(nèi)含物中排除所述熒光(圖8A)。相反，攜帶pJAM2::perAmui-egfp的菌林僅在脂質(zhì)積累的早期階段在附著到質(zhì)膜的小脂質(zhì)內(nèi)含物中顯示熒光。在進行中的TAG積累及胞質(zhì)脂質(zhì)內(nèi)含物的形成過程中，圍脂滴蛋白A-eGFP熒光看起來與胞質(zhì)脂質(zhì)內(nèi)含物結(jié)合，并經(jīng)常作為圍繞所述內(nèi)含物的外周環(huán)而被觀察到(圖8B)。為了揭示該熒光才莫式不是產(chǎn)生于脂質(zhì)內(nèi)含物的圍脂滴蛋白A-eGFP熒光的單純排除，從各重組混濁紅球菌PD630菌林中分離脂質(zhì)內(nèi)含物并在熒光顯孩i鏡下進行研究。此外，用尼羅紅對內(nèi)含物核中的脂質(zhì)進行染色。來自圍脂滴蛋白A-eGFP表達細胞的分離的內(nèi)含物在它們的表面顯示出清晰的環(huán)狀熒光，伴隨有因摻合的尼羅紅染料引起的脂質(zhì)核心的紅色熒光(圖8C)。相反，表達未融合eGFP的細胞中的脂質(zhì)內(nèi)含物當不用尼羅紅標記進行觀察時顯示沒有熒光。這些數(shù)據(jù)表明圍脂滴蛋白A-eGFP與重組混濁紅球菌PD630中脂質(zhì)內(nèi)含物的表面緊密結(jié)合，并且在細胞破碎過程中也保持穩(wěn)定結(jié)合。也進行檢測分別攜帶pJAM2::adrphum-egfp或pJAM2::tip47h圓-eg印的重組混濁紅球菌PD630菌林中ADRP-eGFP和TIP47-eGFP的亞細胞定位的時間重復(fù)實驗。兩種重組菌林均合成與在野生型及圍脂滴蛋白A-eGFP表達菌林中觀察到的那些相似的脂質(zhì)內(nèi)含物。與免疫印跡分析相反，在攜帶pJAM2::tip47hum-egfp的混濁紅球菌PD630和恥裙分枝桿菌mc2155中觀察到清晰的熒光。這些熒光在脂質(zhì)積累的開始僅定位于胞內(nèi)周邊脂質(zhì)區(qū)域中。在儲存條件下24和48小時后，大的胞質(zhì)脂質(zhì)內(nèi)含物出現(xiàn)。與在合成圍脂滴蛋白A-eGFP的混濁紅球菌PD630中獲得的結(jié)果類似，TIP47-eGFP熒光經(jīng)常以圍繞大的脂質(zhì)內(nèi)含物的環(huán)的形式被觀察到(圖9A)。該標記方式也在分離的TIP47-eGFP標記的內(nèi)含物上得以證實(圖459B)。在攜帶pJAM2::adrph咖-egfp的菌林中，熒光在脂質(zhì)積累的早期階段非常弱，但可清楚地與用野生型混濁紅球菌PD630進行的對照實驗中的自發(fā)熒光區(qū)分開。ADRP-eGFP在脂質(zhì)積累24和48小時后的脂質(zhì)內(nèi)含物中清晰可見。然而，也觀察到背景熒光，這可能是因為在圖像記錄過程中延長的曝光時間(圖10)。實施例B3:重組混濁紅球菌PD630的冷凍切片和冷凍斷裂復(fù)制物的免疫金標記。為了證實通過熒光顯微研究揭示的PAT家族蛋白質(zhì)在混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155中胞內(nèi)TAG內(nèi)含物上的唯一定位，使用針對在材料和方法部分中列出的PAT家族蛋白質(zhì)和eGFP標簽產(chǎn)生的抗體在冷凍切片上進行包埋后免疫金標記。然而，免疫金標記的混濁紅球菌PD630和恥垢分枝桿菌mc2155重組細胞(其表達圍脂滴蛋白A或ADRP的eGFP融合物)的冷凍切片與各對照實驗無法區(qū)分，其中在ADRP的情況下，可能是因為合成的蛋白質(zhì)的量低。僅使用豚鼠抗人TIP47抗體的實驗產(chǎn)生了可信并精確的結(jié)果，并對應(yīng)于我們先前的觀察，TIP47-eGFP在攜帶pJAM2::tip47humr-egfp的混濁紅球菌PDMO中僅與TAG內(nèi)含物結(jié)合(圖IIA)。因為細菌中TAG內(nèi)含物的形成是乳狀液聚集驅(qū)動過程(其可引起脂質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)膠嚢化進入脂質(zhì)核心)，所以進行冷凍斷裂實驗以揭示PAT家族蛋白質(zhì)在重組細胞中TAG內(nèi)含物的表面及核心上的分布。通常，當將細菌細胞冷凍斷裂，斷裂平面出現(xiàn)在細胞膜的兩個小葉之間。有時，斷裂平面跨越細胞和胞內(nèi)脂質(zhì)內(nèi)含物，使得能夠?qū)?nèi)含物的核心有橫面斷裂的視角。在混濁紅球菌PD630的冷凍斷裂復(fù)制物(其為一系列緊密壓縮的、不同深度的備選定向脂質(zhì)層)出現(xiàn)在TAG內(nèi)含物的斷裂核心，這與先前在橫面斷裂的真核和原核TAG內(nèi)含物中觀察到的類似[20，30。認為這些層的最外層來自周圍磷脂層。為了對冷凍斷裂復(fù)制物中PAT蛋白質(zhì)進行免疫金標記，混濁紅球菌PD630的重組細胞在儲存條件下生長48小時。對應(yīng)于在冷凍切片上進行的標記實驗，混濁紅球菌PD630的ADRP和圍脂滴蛋白A表達細胞的標記復(fù)制物沒有顯示出可信結(jié)果，并且與各對照無法區(qū)分。然而，在對從攜帶pJAM2::tip47h畫的菌林獲得復(fù)制物進行標記后，脂質(zhì)內(nèi)含物中的許多種位置被標記(圖11B+C)。沒有獲得細胞外周、細胞質(zhì)和質(zhì)膜的不同面的顯著標記。也在表達eGFP-標記的TIP47的各菌林的復(fù)制物上證實了TIP47在重組混濁紅球菌PD630中的分布，其中使用兔抗eGFPIgG作為第一抗體進行標記(圖11C)。表達實施例的討論-部分B在實驗的該部分中，證實了哺乳動物脂肪體蛋白質(zhì)圍脂滴蛋白A、ADRP和TIP47在TAG積累放線菌中的合成及它們靶定至胞內(nèi)TAG內(nèi)含物。先前發(fā)現(xiàn)圍脂滴蛋白和ADRP僅與真核細胞中的脂肪體結(jié)合，但將它們靶定至脂肪體的機制仍不清楚[5]。在該研究中，定位實驗的一個最有趣的結(jié)果是預(yù)先存在的脂肪體通過細胞質(zhì)在體內(nèi)發(fā)生PAT蛋白質(zhì)的包被。此外，PAT家族蛋白質(zhì)必須與脂質(zhì)直接相互作用，因為其他特異蛋白質(zhì)介導(dǎo)的間接錨定因它們在原核系統(tǒng)中不存在而被去除。在文獻中已經(jīng)報道了用于靶定少數(shù)脂滴蛋白質(zhì)的序列。例如，推測圍脂滴蛋白的靶定和錨定受蛋白質(zhì)的中心25%區(qū)域中的三個疏水序列的介導(dǎo)，雖然精確的靶定機制仍待于闡明[25。冷凍斷裂免疫金標記顯示TIP47不僅存在于兩親表面上，還存在于重組混濁紅球菌PD630中TAG內(nèi)含物的疏水核中。該分布模式很可能是因為細菌中脂質(zhì)內(nèi)含物形成的特歹iW幾制。在細菌中，TAG合成為小的結(jié)合WS/DGAT的小滴在質(zhì)膜處形成oleogenous乳化層，其凝^/聚結(jié)成脂質(zhì)前體，并然后得以釋放以在進行的脂質(zhì)合成過程中形成細胞質(zhì)定位的脂質(zhì)內(nèi)含物[30。通過PAT蛋白質(zhì)與未包被的脂質(zhì)結(jié)合，在脂質(zhì)的凝聚/聚結(jié)過程中發(fā)生PAT蛋白質(zhì)的膠嚢化，導(dǎo)致將PAT蛋白質(zhì)被捕獲在所述內(nèi)含物的疏7JC核中。因而，本發(fā)現(xiàn)證實了目前用于細菌中中性脂質(zhì)內(nèi)含物形成的模型。本實驗證實了在細菌脂質(zhì)內(nèi)含物的形成上的研究，并且將真核脂肪體47蛋白質(zhì)靶定至這些脂質(zhì)內(nèi)含物是揭示它們潛在機制的合適工具。此外，目標分子(像PAT家族蛋白質(zhì))可用作細菌脂質(zhì)內(nèi)含物表面上錨定物生物技術(shù)相關(guān)酶的接頭，其可特制用于多種生物技術(shù)應(yīng)用。后面的表列出了本說明書和權(quán)利要求中涉及的所有氨基酸和核酸序列。序列列表<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>AA:氨基,列號NA:核酸序列號本發(fā)明不限于上述特定序列。應(yīng)當理解本發(fā)明也包括來自上文的額外序列。根據(jù)本發(fā)明，除非另有說明，"衍生"序列(例如衍生的氨基酸和核酸序列)指與原始序列具有至少80%和至少卯％，尤其91%、92%、93%、94°/0、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。參考文獻1.Abell，B.M.,L.A.Holbrook,M.Abenes，D.J.Murphy,M.J.Hills，和M.M.Moloney.1997.Roleoftheprolineknotmotifinoleosinendoplasmicreticulumtopologyandoilbodytargeting.PlantCell9:1481-14932.Alvarez，H.M.，F(xiàn).Mayer,D.Fabritius，和A.Steinbchel.1996.FormationofintracytoplasmiclipidinclusionsbyRhodococcusopacusPD630.Arch.Microbiol.165:377-3863.Alvarez,H.M.，和A.Steinbchel.2002.Triacylglycerolsinprokaryoticmicroorganisms.Appl.Microbiol.Biotechnol.60:367-3763a.Banki,M.R.,Gerng腦，T.U.&WoodD.W.(2005).Novelandeconomicalpurificationofrecombinantproteins:Intein-mediatedproteinpurificationusinginvivopolyhydroxybutyrate(PHB)matrixassociation.Prot.Sci.14，1387-1395.4.Barbero，P"E.Buell，S.Zulley,和S.R.Pfeffer.2001.TIP47isnotacomponentoflipiddroplets.J.Biol.Chem.276:24348-243515.Brown,D.A.2001,Lipiddroplets,proteinsfloatingonapooloffat.Curr.Biol.11:446-4496.Christensen，H.，N.J.Garton，R.W.Horobin，D.E.Minnikin，和M.R.Barer.1999.Lipiddomainsofmycobacteriastudiedwithfluorescentmolecularprobes.Mol.Microbiol.31:1561-15726a.Darzins，E.(1958).Thebacteriologyoftuberculosis.Minneapolis,MN:UniversityofMinnesotaPress.6b.deKoning，G.J.M.&MaxwellI.A.(1993).Biosynthesisofpoly畫(R)畫3-hydroxyalkanoate:anemulsionpolymerization.J.Environ.49Degrad.1,223-226.7.Diaz，E.，和S.R.Pfeffer.1998.TIP47:acargoselectiondeviceformannose6-phosphatereceptortrafficing.Cell93:433-4438.Garcia，A.,A.Sekowski,V.Subramanian,和D.L.Brasaemle.2003.ThecentraldomainisrequiredtotargetandanchorperilipinAtolipiddroplets.丄Biol.Chem.278:625-6358a.Gerngross,T.U.，Reilly,P.,Stubbe,J.，Sinskey,A.J.&Peoples,O.P.(1993).Immunocytochemicalanalysisofpoly-P-hydroxybutyrate(PHB)synthaseinAlcaligeneseutrophusH16:LocalizationofthesynthaseenzymeatthesurfaceofPHBgranules.J.Bacteriol.175，5289-5293.9.Greenberg，A.S.，J.J.Egan，S.Wek，M.C.Moos,C.Londos，和A.R.Kimmel.1993.IsolationofcDNAsofperilipinAandpeiiipinB-sequenceandexpressionoflipid畫dropletassociatedproteinsofadipocytes.Proc.Nat,Acad.Sci.USA90:12035-120399a.Hocking,P.J.&Marchessault，R.H.(1994).Biopolyesters.InChemistryandtechnologyforbiodegradablepolymers,第48-96頁.由Griffin編輯.London:ChapmanandHall.10.Kalscheuer,R.，M.Arensk6tter，和A.Steinbtichel.1999.EstablishmentofagenetransfersystemforRhodococcusopacusPD630basedonelectroporationanditsapplicationforrecombinantbiosynthesisofpoly(3-hydroxyalkanoicacids).Appl.Microbiol.Biotechnol.52:508-51510a.Kalscheuer,R.，WSltermann，M.，Alvarez,H.M.&SteinbiichelA.(2001).PreparativeisolationoflipidinclusionsfromRhodococcusopacusPD630andRhodococcusruberandidentificationofgranule-associatedproteins.Arch,Microbiol.177，20-28.11.Kalscheuer,R.，和A.Steinbiichel.2003.Anovelbifunctionalwaxestersynthase/acyl-CoA:diacylglycerolacyltransferasemediateswaxesterandtriacylglycerolbiosynthesisinAcinetobactercalcoaceticusADPl.50J.Biol.Chem.287:8075-808212.Kalscheuer，R.，T.St6veken，H.Luftmann，U.Malkus，R.Reichelt，和A.Steinbchel.2005.Neutrallipidbiosynthesisinengineeredfcj4nlm■l■1、Il-^I、1pv—r▲、、r一4drtj、、^—'^~~.r，r，一j>%^*。1ILSGlICICUI1;tiUJUtmVVitACSICISUUUiit"Ja"uuuiyi^Y[jp屋，Environ.Microbiol.72:1373-137913.Lacey，D.J.，J.Wellner,F.Beaudoin,J.A.Napier,和P.R.Shewry.1998.Secondarystructureofoleosinsinoilbodiesisolatedfromseedsofsafflower(CarthamustinctoriusL.)andsunflower(HelianthusannuusL.).Biochem.J.334:469-47714.Lee,W.S.，J.T.C.Tzen，J.C.Kridl，S.E.Radke，和A.H.C.Huang.1991.MaizeoleosiniscorrectlytargetedtoseedoilbodiesinBrassicanapustransformedwiththemaizeoleosingene.Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:6181-618515.Londos,C"D.L.Brasaemle，C.J.Schultz，J.P.Segrest，和A.R.Kimmel.1999.perilipins,ADRP，andotherproteinsthatassociatewithintracellularneutrallipiddropletsinanimalcells.Semin.CellDev.Biol.10:51-5816.Lu，X.，J.Grucia-Gray，N.G.Copeland，D.J.Gilbert,N.A.Jenkins,C.Londos，和A.R.Kimmel.2001.Themurineperilipingene:thelipid-droplet-associatedperilipinsderivefromtissue-specific,mRNAsplicevariantsanddefineagenefamilyofancientorigin.Mamm.Genome12:741-74916a.Mayer，F(xiàn).&Hoppert,M.(1997).DeterminationofthethicknessoftheboundarylayersurroundingbacterialPHAinclusionbodies,andimplicationformodelsdescribingthemoleculararchitectureofthislayer.J.BasicMicrobiol.37,45-52.17.Miura，S.,J.W.Gan,J.Brzostowski，M.J.Parisi，C.J.Schultz,C.Londos，B.Oliver,和A.R.Kimmel.2002.Functionalconservationfor51lipidstoragedroplet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