專利名稱：：低配料肉制品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備低配料(low-ingredient)肉制品的方法。更精確地，本發(fā)明涉及通過加入特定的酶來改良低配料肉制品的質(zhì)地和/或保水性的方法。本發(fā)明還涉及改良的低配料肉制品，以及涉及所述酶在改良低配料肉制品的質(zhì)地和/或保水性中的用途。該低配料肉制品具有低含量的鹽、磷酸鹽和/或肉。
背景技術(shù)：
：肉和肉制品構(gòu)成人類膳食中的必需營養(yǎng)源。肉是極好的蛋白源，但此外肉制品中通常還含有各種含量的脂肪、鹽、磷酸鹽等。因此，肉的食用還可能與各種疾病相關(guān)，如冠心病、高血壓和肥胖癥，這是由于例如高的鹽和脂肪含量引起的，因此對于更健康的肉制品存在著持續(xù)的需求。添加氯化鈉(NaCl)和磷酸鹽是肉類工業(yè)中用來改善肉制品的技術(shù)和感官特性的常用手段。然而，目前消費者的意向是要求減少肉制品中的鹽和其他化學(xué)添加劑。減少鹽，即NaCl的要求主要是由于其在Na-敏感性個體的高血壓發(fā)展中的作用。然而，鹽的減少很少是直截了當(dāng)?shù)模驗槌孙L(fēng)味和保存，NaCl還可改善保水性和質(zhì)地。減少鹽導(dǎo)致質(zhì)地變?nèi)鹾椭亓繐p失的增加。在肉類加工中，磷酸鹽被廣泛用于促進保水性和降低烹調(diào)損失。加入砩酸鹽來補償?shù)望}水平的負(fù)面影響，根據(jù)定義這是可接受的。然而，磷酸鹽降低人體中Ca和Mg含量從而引起骨改變的趨勢已經(jīng)形成了也要降低磷酸鹽含量的需求。為了獲得低能量的肉制品而降低肉或脂肪含量時，也產(chǎn)生了與降低的鹽和磷酸鹽制品相關(guān)的差的保水性和質(zhì)地的同類問題。Jimenez-Colmenero等(2001)已經(jīng)綜述了通過例如降低能量和鈉含量獲得更健康的肉和肉制品的策略。降低能量值用的最多的方法是降低脂肪含量，而鈉含量可以通過用鉀和鎂鹽和/或磷酸鹽替代NaCl來降低。例如，可以通過加入藻酸釣或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶來改善低鹽制品的質(zhì)地。Jimenez-Colmenero(1996)綜述了研發(fā)低能量肉制品的技術(shù)?？梢詫⑦@些方法分成三組加入非肉配料、選擇肉配料和適應(yīng)制造過程。非肉配料可以是非肉蛋白、植物油、糖類或合成的制品，或只是水。在肉制品制造中使用瘦肉導(dǎo)致低能量值，但是脂肪的同時降低降低了感覺到的咸度和特征性的風(fēng)味強度Uuusunen等，2005)。盡管在低鹽、磷酸鹽或蛋白含量的情況下來制作具有較好質(zhì)地的肉和魚制品的一種方法是使用通過形成另外的共價交聯(lián)而使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的酶。目前，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG，谷氨酰肽胺Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，EC2.3.2.13)是唯一得到廣泛研究的并可購得的用于交聯(lián)肉和魚蛋白的酶。已經(jīng)報道了TG能改善肉體系的質(zhì)地(Mugumura等，1999)和膠凝作用(DeBacker-Royer等，1992)。在熟肉制品中，已經(jīng)報道了凝膠堅固性和保水性(WHC)在高鹽(2%)制品中，而不是在低鹽制品中通過TG而增加(Pietrasik和Li-Chan，2002a)。在低鹽(1%)系統(tǒng)中，TG能夠改善產(chǎn)品的稠度(堅固性)，但是不能改善烹調(diào)損失(Dimitrakopoulou等，2005)。已經(jīng)報道了將TG用于增強豬肉香腸的膠凝強度中(Mugumura等，1999)，與大豆蛋白一起作為低鈉重構(gòu)豬肉中的粘合劑(Tsao等，2002)，與大豆和乳蛋白一起作為低磷酸鹽雞肉香腸中的粘合劑(Mugumura等，2003),以及用來提高低鹽雞肉丸的產(chǎn)量和膠凝強度(Tseng等，2000)。也已經(jīng)表明TG結(jié)合酪蛋白酸鹽、KC1和膳食纖維能改善低鹽肉制品的質(zhì)地(Ji隨ez-Colmenero等，2005;和Kuraishi等，1997)。已經(jīng)將TG和酪蛋白酸鹽一起用作豬肉、雞肉和羊肉泥中的冷凝固粘合劑(Carballo等，待出版)，以及和核桃一起用作新鮮重構(gòu)牛排中的粘合劑(Serrano等，2004)。和高壓一起使用的TG改善了低脂肪雞肉凝膠中的膠凝特性(Trespalaclos和Pla，2005)，而和k-角叉聚糖一起使用的TG改善了低肉牛肉凝膠的WHC(Pietrasik和Li-Chan，2002b)。魚(例如，虹鱒魚、沙丁魚、鯖魚、真鯛、ayu、大眼鯛魚、鯉魚、銀鰻、白眼狹鱈、白姑魚、扇貝、壞、魷魚)中的內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠進行蛋白交聯(lián)并用于例如魚糜生產(chǎn)中(An等，1996)。它通過交聯(lián)鯖魚和帶魚的肌肉蛋白來增強膠凝作用(Hsieh等，2002)。已經(jīng)報道了將添加的TG用于剝皮的鯔魚魚糜生產(chǎn)的冷凝固中(Ramirez等，2000)，用于增強來自阿拉斯加鱈魚魚糜的kamaboko凝膠的強度(Seguro等，1995)，用于改善箭齒比目魚糊的機械特性(Uresti等，2006)以及和殼聚糖一起改善竹莢魚的凝膠形成能力(Gomez-Guillen等，2005)。TG還和乳蛋白一起使用來改善來自白鰱魚的切片廢料的低鹽制品的機械特性，由此觀察到可榨出水的輕微增加(Uresti等，2004)。對飲食和健康之間的關(guān)系日益增加的關(guān)注導(dǎo)致對清淡的產(chǎn)品增長的需求，清淡的產(chǎn)品是低鹽、低磷酸鹽和/或低能量值的。然而，這些清淡的食品與質(zhì)地、保水性、風(fēng)味和貨架期不良的變化相關(guān)。盡管轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶已經(jīng)顯示出能改善低配料肉制品的質(zhì)地，但這并非在所有方面都令人滿意，例如，就保水性而言。因此，對于健康的肉和魚制品仍然存在著需求，這些產(chǎn)品具有可接受的質(zhì)地、穩(wěn)定性、保水性、外觀、可口性、口味、風(fēng)味、多汁性、加工性能和整體的可接受性。本發(fā)明滿足了這些需求。本發(fā)明是基于使用酪氨酸酶來改善低配料肉制品的特性。已經(jīng)報道了酪氨酸酶能影響幾種食品蛋白，如乳清蛋白(Thalmann和Loetzbeyer，2002)和小麥蛋白(Takasaki和Kawakishi,1997;Takasaki等，2001)。Lantto等(待出版)已經(jīng)研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、酪氨酸酶和凍干蘋果渣粉對均質(zhì)豬肉的凝膠形成和結(jié)構(gòu)的作用。酪氨酸酶不能影響所進行實驗中的凝膠形成，但它將未加熱的肉勻漿的凝膠硬度提高至一定的程度。用酶制劑處理過的豬肉勻漿含有常規(guī)含量的鹽和磷酸鹽。DE10244124公開了具有增加的粘度的含水介質(zhì)，其含有已經(jīng)用例如多酚氧化酶改良過的聚合物。可以容易地將粘性的含水介質(zhì)干燥和復(fù)水，并且在加入到食品或化妝品或藥品中時，用來改善稠度。當(dāng)加入到高的蛋白或鹽濃度的制品中時，用酪氨酸酶形成的凝膠比用漆酶形成的凝膠起的作用更好。將酶用來交聯(lián)含水介質(zhì)的聚合物，而不是食品本身。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了制備低配料肉制品的方法，所述方法包括將肉剁碎、將酪氨酸酶和可選地其他配料加入碎肉中來形成具有低含量的至少鹽、磷酸鹽或肉的含肉混合物，并溫育混合物來形成具有改良的質(zhì)地或保水性的肉制品。本發(fā)明進一步提供了低配料肉制品，其包括另外的酪氨酸酶并具有低含量的至少鹽、砩酸鹽或肉。本發(fā)明還提供了酪氨酸酶在改良具有低含量的至少鹽、磷酸鹽或肉的低配料肉制品的質(zhì)地或保水性中的用途。獨立權(quán)利要求中列出了本發(fā)明的特定實施方案。從以下的附圖、詳述和實施例將清楚本發(fā)明的其他目的、詳細(xì)內(nèi)容和優(yōu)勢。附圖簡述圖l顯示了在(a)25匸和(b)40t:測量的雞胸肌原纖維的存儲模量(G，)。處理條件為4%蛋白，50mM磷酸鈉緩沖液，pH6，0.35MNaCl，處理時間3h。圖2顯示了以最大壓力測量的未加熱的虹鱒魚勻漿凝膠的堅固性。用0、20、40、80或160nkat酪氨酸酶/g蛋白處理勻漿樣品，并在a)40X:，30分鐘、lh和4h;和b)4X:，20h下處理。圖3顯示了以最大壓力測量的酪氨酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)對加熱過的雞胸肉勻漿凝膠的堅固性的作用。該勻漿樣品是低肉含量(65%)、無磷酸鹽(不含添加的磷酸鹽)或低鹽含量(l%NaCl)的。圖4顯示了以重量損失測量的酪氨酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)對加熱過的雞胸肉勻漿凝膠的保水性(WHC)的作用。該勻漿樣品是低肉含量(65%)、無磷酸鹽(不含添加的磷酸鹽)或低鹽含量(1°/。NaCl)的。圖5顯示了以最大壓力測量的沒有酪氨酸酶和沒有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)的對照各自對加熱過的雞胸肉勻漿凝膠的堅固性的結(jié)果。該對照含有75%肉、0.34%焦磷酸三鈉和2%的鹽(NaCl)。NoPP不含添加的磷酸鹽；LM含有降低含量的肉(65%);而LS含有降低含量的鹽(1°/。)。圖6顯示了以重量損失測量的沒有酪氨酸酶和沒有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)的對照各自對加熱過的雞胸肉勻漿凝膠的保水性(WHC)的結(jié)果。該對照含有75%肉、0.34%焦磷酸三鈉和2%的鹽(NaCl)。NoPP不含添加的磷酸鹽；LM含有降低含量的肉(65%);而LS含有降低含量的鹽(1%)。發(fā)明詳述消費者需要高質(zhì)量的健康肉制品，并且價格可行，這導(dǎo)致對具有較低含量的配料如鹽、肉和脂肪的肉制品的需求。鹽(NaCl)影響質(zhì)地、保水性、風(fēng)味和微生物穩(wěn)定性。當(dāng)NaCl水平低時，將磷酸鹽用于肉類加工中來促進保水性和降低烹調(diào)損失。鹽(NaCl)、磷酸鹽和/或肉的減少必然使得制品的質(zhì)地和保水性變差。酪氨酸酶是極好的蛋白交聯(lián)酶，用來改善加工的肉制品中的上述兩個技術(shù)參數(shù)，即質(zhì)地和保水性，以及用來將新鮮肉制品中的肉塊粘合在一起。于底物特異性和對抑制劑的敏感性，可以將酪氨酸酶與其他酚氧化酶，即漆酶區(qū)分開來。然而，目前的區(qū)分是基于結(jié)構(gòu)特征。酪氨酸酶和漆酶在結(jié)構(gòu)上的主要差異是酪氨酸酶具有雙核銅位點，在其活性位點具有兩個III型銅，而漆酶在其活性位點一共具有四個銅原子(I和II型銅，和一對III型銅)。酪氨酸酶將各種酚化合物氧化成相應(yīng)的醌。醌是高度反應(yīng)性的并可以進一步發(fā)生非酶促反應(yīng)。酪氨酸酶的典型底物是酪氨酸(或蛋白，其使用氧作為電子受體。傳統(tǒng)上，基質(zhì)中的酪氨酸殘基)，其首先被羥基化成DOPA(二羥基苯丙氨酸或蛋白質(zhì)中的DOPA殘基)，然后進一步被酶氧化成多巴醌(或蛋白質(zhì)中的多巴醌殘基)。多巴醌可以與多種化學(xué)結(jié)構(gòu)如其他多巴醌、>5充醇和氨基發(fā)生非酶促反應(yīng)。因此，酪氨酸酶在一個相同的蛋白質(zhì)中具有兩種酶活性，即，單酚單加氧酶活性(EC1.14.18.1)和兒茶酚氧化酶活性(EC1.10.3.1)，如下所示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>酪氨酸酶的底物特異性相對寬泛，并且該酶能夠氧化多種多酚和芳香族胺。然而，與漆酶(EC1.10.3.2)相反，酪氨酸酶不能氧化丁香醛連氮。至少蛋白質(zhì)中的酪氨酸、賴氨酸和半胱氨酸殘基與活性多巴醌通過酪氨酸酶催化形成共價鍵?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的/>知技術(shù)來測量酪氨酸酶活性。L-D0PA或L-酪氨酸可以用作底物，此后可以通過分光光度法監(jiān)控多巴醌形成，或可替換地可以通過密切觀察氧消耗來監(jiān)控底物消耗。酪氨酸酶在自然界廣泛分布，并且可以在動物、植物、真菌和細(xì)菌中找到它們。尤其是能褐變的蔬菜和水果富含酪氨酸酶。目前唯一可購得的酪氨酸酶源自雙孢蘑菇(J^r/c^6"/7ori/s)。本發(fā)明中所用的酪氨酸酶可以源自任何能夠產(chǎn)生酪氨酸酶的動物、植物、真菌或微生物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，酪氨酸酶源自絲狀真菌。例如，其可以是源自里氏木霉(7Wc力Of/eriMreese/)的胞外酪氨酸酶(W02006/084953)。通過以下方法來制備低配料肉制品將肉剁碎、加入有效量的酪氨酸酶和可選地其他配料，并在適于改良其質(zhì)地和/或保水性的條件下溫育獲得的含肉混合物。如在此所用的"低配料"指的是具有降低含量的至少一種選自鹽、磷酸鹽和肉的配料的制品。低配料制品可以具有低含量的超過一種的配料，例如，低含量的鹽和磷酸鹽兩種，或甚至低含量的鹽、磷酸鹽和肉的全部三種。通常，將約2wt-。/。的氯化鈉(NaCl)加入到常規(guī)腌制的肉制品中。根據(jù)本發(fā)明，低配料肉制品可以含有低于2.0wt-。/。的鹽，優(yōu)選低于1.5wt-%。一般認(rèn)為含有不超過1.2wt-。/。鹽的肉制品是低鹽制品。因此，本發(fā)明的肉制品優(yōu)選含有不超過1.2wt-°/。的鹽，并且根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，不超過l.Owt-。/。。如在此以單數(shù)使用的"鹽"指的是NaCl。近幾年中增加了磷酸鹽的添加，因為磷酸鹽可以用來維持低鹽制品的結(jié)構(gòu)和保水能力。目前，工業(yè)中通常給肉制品添加0.2wt-。/。磷酸鹽(以？205測量的)，這相當(dāng)于0.34wt-。/。磷酸三鈉。本發(fā)明的低配料肉制品可以含有低于0.2wt-。/。的磷酸鹽，優(yōu)選含有不超過0.lwt-。/。添加的磷酸鹽(以P2(V測量的)。最優(yōu)選，低配料肉制品是無磷酸鹽的，即，沒有添加磷酸鹽。本發(fā)明的低配料制品可以具有低的肉含量，這就是說它含有不超過68wt-%的肉，并更優(yōu)選不超過65wt-°/。。為了獲得低能量制品，可以相應(yīng)地增加含水量。當(dāng)然，肉制品的能量還取決于其脂肪含量。然而，減少脂肪可能引起技術(shù)和感官問題。使用酪氨酸酶交聯(lián)肉蛋白增強了瘦肉的使用，并減少了對另外的脂肪的需求。因此，制得的肉制品可以是含有15-18wt-%脂肪的脂肪減少的制品，或含有至多10wt-M旨肪的低脂肪肉制品，或含有至多5wt-。/。脂肪的瘦肉制品。優(yōu)選，肉制品的脂肪含量不超過18wt-°/。，優(yōu)選不超過lOwt-%，并且最優(yōu)選不超過5wt-。/?；蛏踔敛怀^3wt-%。如在此所用的"肉"包括家畜、野味(game)、家禽、魚和其他可食海洋動物的任何種類的肉。肉可以是例如豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、火雞、魚、軟體動物和貝類等。"肉制品"指的是含有肉或肉蛋白作為必需配料的任何物質(zhì)，如香腸、火腿、重構(gòu)肉制品、魚糜等。肉制品適宜含有至少20、30、40或尤其是45wt」/。肉。熟的香腸通常含有至少45wt-%肉，而發(fā)酵的香腸如意大利香腸含有至少90-95wt-%肉。重構(gòu)肉制品實際上可以含有高達(dá)100wt-。/。肉。碎肉的顆粒大小取決于待制備肉制品的類型。對于重構(gòu)肉制品的制造，將肉切成可以辨認(rèn)出的碎塊，邊緣通常為幾厘米，而通常將火腿和香腸中的肉磨碎、剁碎和/或切碎或均質(zhì)。通常，火腿含有粗碎的肉，顆粒為幾毫米至一或幾厘米，而香腸含有細(xì)碎的肉。制得的"含肉混合物"含有至少碎肉和酪氨酸酶。此外，可以含有"其他配料，，，這包括任何常規(guī)的添加劑，如NaCl、磷酸鹽和/或水。此外，術(shù)語其他配料包括，例如，NaCl和磷酸鹽以外的鹽、香辛料、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、糖、甜味劑、樹膠、粘合劑、增補劑、淀粉、糊精型糖類、動物或植物脂肪和油、脂肪替代品和/或其他非肉配料，如大豆、酪蛋白，以及乳清、小麥蛋白和其他非肉蛋白等。通過將新鮮的肉塊和酪氨酸酶結(jié)合在一起來制備重構(gòu)肉制品。沒有其他的配料是必需的，而香腸和火腿由含有其他配料的混合物制得。本發(fā)明的一個實施方案包括將肉磨碎，將酪氨酸酶和其他配料加入到碎肉中來形成含肉混合物，在足以改良質(zhì)地或保水性的條件下溫育混合物，將改良的肉混合物填入腸衣中，并任選地將包好腸衣的混合物加熱或煙熏。在典型的香腸加工中，將肉研磨并剁碎成肉糜。在剁碎過程中加入水、鹽和其他配料，或?qū)⑦@些配料加入到肉糜中。將研磨肉之后但在剁碎研磨的肉之前、之中或之后，將酪氨酸酶加入到肉混合物中。溫育后，將肉糜填入腸衣中，并蒸煮和/或煙熏。在典型的火腿加工中，將含有鹽、磷酸鹽和其他配料的囟水加入到磨碎的肉中，將肉塊翻滾，并將翻滾過的肉塊填入腸衣中，煙熏和/或蒸煮并冷卻。在翻滾之前、之中或之后加入酪氨酸酶。重構(gòu)肉制品典型地由修剪掉脂肪和結(jié)締質(zhì)地并切成碎塊的肉制成。將酪氨酸酶與肉塊混合并在冷卻器中溫育該混合物?？梢约尤臌}或其它配料，但不是必需的。然后將混合物重新成形并儲存在水箱或冷凍器中。將酪氨酸酶溶解于水溶液中。至少20、40、80、160、320或640nkat/g肉蛋白的含量通常足以改良含肉混合物的質(zhì)地和/或保水性。通常使酪氨酸酶在約4H0。C的溫度下反應(yīng)至少IO分鐘至24小時或更長時間。當(dāng)然，低溫下的溫育需要更長的溫育時間，反之亦然。在4°C，至少1小時至至少18h的溫育時間是適宜的，而在401C,至少10分鐘至4小時的反應(yīng)時間是有效的。含肉混合物在酪氨酸酶存在下的溫育改善了終產(chǎn)品的質(zhì)地和/或保水性。溫育后，將肉混合物成形成易于操作、易于切成薄片，且具有理想的外觀和風(fēng)味的產(chǎn)品?？梢詫a(chǎn)品新鮮銷售或作為熱^理過的產(chǎn)品銷售。換句話說，酪氨酸酶可以用于加工的低配料肉制品的制造中，如用于香腸和火腿中，以及用于重構(gòu)鮮肉制品中，如來自例如低價值分割肉的可口牛排。香腸的質(zhì)地和保水性是影響產(chǎn)品可口性和消費者接受性的主要技術(shù)因素。可以看到酪氨酸酶對肉蛋白的作用，例如，作為肌原纖維蛋白的聚合作用。可以看到酪氨酸酶的質(zhì)地改良作用，例如，作為肌原纖維或肉勻漿凝膠的存儲模量(G，)的增加。還可以例如作為改善的肉制品凝膠的堅固性看到酪氨酸酶的質(zhì)地改良作用。此外，酪氨酸酶改善了肉制品的保水性，這還可以作為肉制品增加的保水性(WHC)看到，這意味著真空包裝存儲過程中降低的滴液損失，或降低的烹調(diào)損失和改善的多汁性。這與使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶獲得的結(jié)果相反。通過以下的非限制性實施例說明了本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，以上的描述中和實施例中給出的實施方案只是為了說明的目的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以有各種變化和改進。實施例1酪氨酸酶催化的分離自雞胸肌肉的肌原纖維蛋白的交聯(lián)通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析了由里氏木霉酪氨酸酶引起的雞胸肌原纖維的分離的鹽溶性蛋白(SSP)的分子量和遷移率的變化。根據(jù)Xiong和Brekke(1989)來分離SSP。將SSP懸浮于50mM磷酸鈉緩沖液(pH6，含有0.6MNaCl)中至3mg/ml的蛋白濃度。每克蛋白質(zhì)加入60、120和240nkat的酪氨酸酶。將反應(yīng)混合物在40X:溫育。在5分鐘、l小時、3小時和18小時的時間點取樣。試驗性地鑒定由酪氨酸酶催化的SDS-PAGE上的蛋白條帶的主要變化。酪氨酸酶引起了以下的可檢測電泳變化l)孔下出現(xiàn)了大分子蛋白，2)肌球蛋白重鏈消失，和3)肌鉀蛋白T條帶消失，和4)肌球蛋白輕鏈消失。這些結(jié)果表明酪氨酸酶能夠催化分離自雞胸肉的蛋白之中/之間的交聯(lián)形成。實施例2酪氨酸酶催化的分離自虹鱒魚魚片的肌原纖維蛋白的交聯(lián)通過SDS-PAGE分析了由里氏木霉酪氨酸酶催化的虹蜂魚魚片的分離肌原纖維蛋白的分子量和遷移率的變化?；旧弦耘c實施例1中雞胸肌原纖維相同的方式來分離肌原纖維蛋白。將分離的肌原纖維懸浮于含有S。/。蔗糖的水中，以便將蛋白質(zhì)保持于溶液中。沒有調(diào)節(jié)懸浮液的pH。首先用不同含量的酪氨酸酶處理肌原纖維蛋白(3mg/ml)，以便評價酶的交聯(lián)效率。每克蛋白加入20、40、80、160、320和640nkat酪氨酸酶。將反應(yīng)混合物在40。C溫育2小時，此后將反應(yīng)混合物的樣品在SDS-PAGE上跑膠。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，選擇160和640nkat/g的酪氨酸酶劑量用于進一步的研究。接著，研究酪氨酸酶在不同處理條件中交聯(lián)虹鱒魚肌原纖維蛋白的效率。將蛋白在40C處理30分鐘、l小時和4小時，以及在41C處理24小時。在SDS-PAGE上評價交聯(lián)效率。試驗性地鑒定由酪氨酸酶引起的蛋白質(zhì)的主要變化。酪氨酸酶引起了以下的可檢測電泳變化1)孔下出現(xiàn)了大分子蛋白，2)肌球蛋白重鏈消失，和3)肌鈣蛋白T條帶消失。這些結(jié)果表明酪氨酸酶能夠催化分離自虹鱒魚魚片的蛋白之中/之間的交聯(lián)形成。實施例3酪氨酸酶對雞肉肌原纖維的凝膠形成的改善研究了酪氨酸酶在4%的雞肉肌原纖維懸浮液中形成交聯(lián)的能力，作為存儲模量(G')的產(chǎn)生測量低變形下由酪氨酸酶引起的凝膠形成改善。使用Bohlin雨流變儀(BohlinReologi,Und，Sweden)在25。C和40'C加熱的過程中進行測量(圖1)。根據(jù)Xiong和Brekke(1989)分離雞胸肌原纖維，從分離緩沖液中省去EDTA和NaN3。將分離的肌原纖維懸浮于50mM磷酸鈉緩沖液(0.35MNaCl，pH6)中至4%的蛋白濃度。用0、30、60、120和240nkat里氏木霉酪氨酸酶/g蛋白質(zhì)將肌原纖維懸浮液的樣品在25T和40匸處理3小時。結(jié)果表明在酪氨酸酶處理過的肌原纖維懸浮液中的G，比只在緩沖液中處理的那些有所增加。此外，處理溫度的升高強化了凝膠形成。因此，通過酪氨酸酶在雞胸肌原纖維基質(zhì)中形成交聯(lián)。實施例4酪氨酸酶對虹鱒魚勻漿凝膠的堅固性的改善為了證明酪氨酸酶催化的交聯(lián)對虹鱒魚蛋白凝膠具有正向質(zhì)地影響，用酪氨酸酶(O、20、40、80和160nkat/g蛋白)在不同的處理條件中處理了由90%的虹鱒魚魚片、10%的水和1.8%的鹽(NaCl)制得的勻漿(圖2)。添加酪氨酸酶后，使勻漿樣品在4'C靜置IO分鐘，此后將樣品在40X:溫育30分鐘、lh或4h以及在4C溫育20h。處理后，將樣品的溫度調(diào)節(jié)至室溫并使用質(zhì)地分析儀(TA-XTA，StableMicroSystems,Surrey,GreatBritain)測量凝膠堅固性。結(jié)果表明酪氨酸酶能夠增加未加熱的虹鱒魚勻凈凝膠的堅固性。實施例5酪氨酸酶對雞胸肉勾漿凝膠的堅固性的改善在里氏木霉酪氨酸酶(0nkat、20hkat或120nkat/g蛋白)的存在下，由無可見脂肪的修剪的雞胸肉在含氧水中制得雞胸肉勻漿混合物，該混合物含有不同含量的肉(65%或75%)、磷酸三鈉(0%或0.34°/。)，或鹽(1%或2%)。當(dāng)時只減少了一種配料，而另外兩種配料沒有減少。加入酪氨酸酶后，立刻將肉勻漿樣品(酪氨酸酶處理的和對照樣品)填入圓柱狀鋼管(直徑30mm，高度45mm)中，并使其在4'C靜置1小時，此后將它們轉(zhuǎn)移至40t:的水浴中。當(dāng)樣品的內(nèi)部溫度達(dá)到4ox:時(這需要花費約io分鐘)，將樣品在4ox:溫育i小時。將樣品轉(zhuǎn)移至77。C的水浴中。IO分鐘后，樣品的內(nèi)部溫度是72X:，將樣品轉(zhuǎn)移至25C的水浴，持續(xù)30分鐘，此后內(nèi)部溫度降至251C。調(diào)節(jié)至25匸后，立即測量樣品的凝膠堅固性。結(jié)果顯示于圖3，左欄中。酪氨酸酶增加了低肉勻漿(肉含量從75°/。降至65%)的凝膠堅固性。此外，結(jié)果表明酪氨酸酶能夠增加無添加的磷酸鹽(磷酸鹽含量從0.34%降至0%)的勻漿的凝膠堅固性。酪氨酸酶在測試的劑量對低鹽勻漿只具有非常有限的作用。為了比較，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行了相似類型的程序，其劑量為0、20或200nkat/g蛋白。與酪氨酸酶不同，添加的水沒有氧化。結(jié)果顯示于圖3，右欄中。分別用酪氨酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶獲得的絕對作用是不可比的，因為是在不同的情況下以及對存儲不同時間的材料進行的測試。此外，也不能分別比較酪氨酸酶和TG的酶活性，因為這兩種酶具有完全不同的反應(yīng)機理，因此使用不同的模型底物測定了它們的活性(nkat/g蛋白)。無論如何，可以從圖3看出酪氨酸酶催化的交聯(lián)形成對凝膠堅固性具有正面作用，并且這種作用與TG的作用相似。使用"mML-DOPA(Sigma,USA)作為底物在pH7和室溫下根據(jù)Robb(1984)測定了酪氨酸酶活性。使用0.2MN-苯甲氧甲酰(CBZ)-L-谷氨酰-甘氨酸(Sigma,USA)作為底物在pH6下(Folk,1970)測定了TG活性。以納開特(nkat)表示酶活性。將lnkat定義為每秒鐘轉(zhuǎn)化lnmol在測試條件中所用底物的酶活性量。酶劑量nkat/g蛋白表示按照活性計算的和每克肉蛋白所給予的酶量。還進行了沒有酶的對照，其中一種對照由含有75%肉、2%鹽和0.3竹。焦磷酸三鈉的肉勻漿組成。無磷酸鹽對照(NoPP)含有75%肉、2%鹽和0%磷酸三鈉；低肉對照(LM)含有65%肉、2%鹽和0.34%焦磷酸三鈉；低鹽對照(LS)含有75%肉、1%鹽和0.34%焦磷酸三鈉。結(jié)果顯示于圖5中。左欄顯示了在酪氨酸酶實驗中的無酶對照，右欄是在TG實驗中的無酶對照?？梢钥闯鋈?、鹽和磷酸鹽中任一種的減少都會導(dǎo)致凝膠堅固性的降低。實施例6酪氨酸酶對雞胸勻漿凝膠的保水性(WHC)的改善在里氏木霉酪氨酸酶(0nkat、20nkat或120nkat/g蛋白)的存在下，由無可見脂肪的修剪的雞胸肉制得雞肉勻漿混合物，該混合物含有不同含量的蛋白(65%或75%)、鹽(1%或2%)和焦磷酸三鈉(0%或0.34%)。當(dāng)時只減少了一種配料，其他配料沒有減少。按照實施例5中所述的處理勻漿樣品，并測量重量損失。將樣品加熱至721C的核心溫度并隨后冷卻至25X:之后，根據(jù)Hermansson和Lucisano(1982)通過"凈重測試(nettest)"測定肉勻漿樣品的重量損失。將樣品在490xg20°C離心10分鐘(BiofugeStratos，轉(zhuǎn)子號為3047，HeraeusInstruments,USA)。通過在離心后稱重測定釋放的液體含量。從以下的公式計算重量損失重量損失(％)=(液相的重量/樣品的重量)xlOO結(jié)果顯示于圖4，左欄中。可以看出酪氨酸酶減少了重量損失，即，增加了低肉系統(tǒng)(肉含量從75%降至65%)和低鹽系統(tǒng)(鹽含量從2。/。降至l。/。NaCl)中的WHC。此外，結(jié)果表明酪氨酸酶能夠?qū)o添加的磷酸鹽(即，磷酸鹽含量從0.34%降至0%)的雞肉勻漿中的WHC維持在對照水平上。為了比較，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(O、20或200nkat/g蛋白)替代酪氨酸酶進行了相似的程序。結(jié)果顯示于圖4，右欄中。分別用酪氨酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶獲得的絕對作用是不可比的，因為是在不同的情況下以及對存儲不同時間的材料進行的測試。此外，酪氨酸酶和TG各自的酶活性也不能比較，因為這兩種酶具有完全不同的反應(yīng)機理，因此使用不同的模型底物測定了它們的活性(nkat/g蛋白)。無論如何，可以從圖4中看出，與TG相反，酪氨酸酶處理正面地影響保水性。酪氨酸酶減少了低肉和低鹽勻漿中的重量損失，并維持無磷酸鹽的勻漿中的WHC，而TG具有相反的作用，即，它增加了在所有三種情況下的重量損失。還進行了沒有酶的對照，其中一種由含有75%肉、2%鹽和0.34%焦礴酸三鈉的肉勻漿組成。無磷酸鹽對照(NoPP)含有75°/。肉、2%鹽和0%焦磷酸三鈉；低肉對照(LM)含有65%肉、2%鹽和0.34%焦砩酸三鈉；低鹽對照(LS)含有75°/4肉、1%鹽和0.34%焦磷酸三鈉。結(jié)果顯示于圖6中。左欄顯示了在酪氨酸酶實驗中的無酶對照，右欄是在TG實驗中的無酶對照?？梢钥闯鋈?、鹽和磷酸鹽中任一種的減少都會導(dǎo)致增加的重量損失。參考文獻An,H.，Peters,M.Y.，andSeymour,T.A.1998.Rolesofendogenousenzymesinsurimigelation.TrendsFoodSd.Technol.7,321-327,Carballo,丄，Ayo,J,andJlm6nezColmenero,F,Microbialtransglutaminaseandcaselnateascoldsetbinders:Influenceofmeatspeciesandchillig.storage,LWT/FoodSci.Technol,(inpress)DeBacker-Royer,C.,Traor6,F.,andMeunier'丄C.1992.Polymerizationofmeatandsoybeanproteinsbyhumanplacentalcalcium~activatedfactorXIII.丄Agric.FoodChem.40,2052-2056.DimitrakopoulOLi,M,A.,Ambrosiadis,丄A.,Zetou,F.K,,andBloukas,丄G.2005.Effectofsaltandtransglutaminase(TG)levelandprocessingconditionsonqualitycharacteristicsofphosphate-free,cooked,restructuredporkshou!der.MeatScl.70，743-749.Folk,丄E.1970.Transglutaminase(guineapigliver).MethodsEn-zymol.17A，幼9^8&4G6meZ"Guil冶n,M.C,，Montero,P,,Solas,M.T,，andP6rez-Mateos,M.2005.Effectofchitosanandmicrobialtransglutaminaseonthegelformingabilityofhorsemackerel(Trac/iurusspp.)muscleunderhighpressure.FoodRres.Int.38,103-110.Hermansson，A.M.,andLucisano,M.1982.Gelcharacteristics-Waterblndl叩propertiesofbloodplasmagelsandmethodologicalaspectsonthewaterblndlngofgelsystems.丄FoodSci.47,1955-1964.Hsieh,丄F,,Tsai,G丄andJiang,S.T,2002.Microbialtransglutaminaseandrecombinantcystatinaffectsonimprovingthequalityofmackerelsurimi,丄FoodSci.67'312(W125.Jim6nezColmenero,F.1996.Technologiesfordevelopinglow-fatmeatproducts.TrendsFoodScl.Technol.7，41-48.Jim6nez-Colmenero,F.，Carballo,丄，andCofrad沐S.2001.Healthiermeatandmeatproducts:theirroleasfunctionalfoods.Review.MeatSci.59,5"13.Jim6nezColmenero,F.,Ayo,M.丄，andCa巾allo,丄2005.Physico-chemicalpropertiesoflowsodiumfrankfurterwithaddedwalnut:effectoftransglutaminasecombinedwithcaseinate，KCIanddietaryfibreassaltre-placere.MeatScf.69,781-788.Kuraishi,C.,Sakamoto,丄，Yamazakl，K.,Susa，Y.,Kuhara，C,andSoeda,T.1997.Productionofrestructuredmeatusingmicrobialtransglutaminasewithoutsaltorcooking.丄FoodScl.62,488>490，515.Lantto,R.,Plathln,P.，Ntemist3，M.,Buchert,丄，3ndAutto,(CEffectsoftra闊lutamlnase,tyrosinaseandfreeze-driedsplepomacepowderongelformingandstructureofpolkmeat.LWT/FoodSci,Technol.(inpress).Mugumura，M.，Tsuruoka，K.,Fujino,H.,Kawahara，S"YamaucW,K.,Matsumura,S.，andSoecfa,T,1卿.Gelstrengthenhancementofsausagesbytreatingwrthmicrobialtransglutaminase.InProc,4581Int.Congr.MeatSci.Technol.1卿；Yokohama,Japan,Vol,1.，pp.138~139.Mugumura,M.,Tsuruoka，K>,-Katayama,K,Erwanto,Y.,Kawa-hara，S.,Yamauchi,K.，Sathe，S.K,andSoeda,T.2003.SoybeanandmilkproteinsmodifiedbytransglutaminaseImproveschickensausagetextureevenatreducedlevelsofphosphate.MeatSci.63,191-197,Ptetrasik,Z.'andU-Chan,E,C.Y.2002a,Responsesurfacemeth"odologystudyontheeffectsofsatt,microbialtransglutaminaseandheatingtemperatureonporkbattergelproperties.FoodRes.Int.,35,387-398.Ptetrasik,Z.,andLi-Chan,E.C.Y.2002b.Bindingandtextura，propertiesofbeefgelsasaffectedbyprotein,K-carrageenanandmicrobialtransglutaminaseaddition.FoodR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