專利名稱：一種蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
RhPV是一種昆蟲病毒，特異地侵染蚜蟲，能夠控制蚜蟲的種群數(shù)量。以往對(duì)RhPV 病毒的檢測(cè)，主要采用酶聯(lián)檢測(cè)(ELISA)或通過組織免疫化學(xué)定位
(electronmicroscopical methods)的方法來分析。這些方法既耗時(shí)，同時(shí)靈敏度 和準(zhǔn)確性也偏低，特別是很難檢測(cè)到RhPV在蚜蟲寄主植物中的存在分布。
分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于包括病毒學(xué)在內(nèi)的很多領(lǐng)域的研究。 RT-PCR作為一種分子生物學(xué)技術(shù)手段被用于病毒學(xué)的研究中，但目前還沒有應(yīng)用于 RhPV病毒檢測(cè)的報(bào)道。目前對(duì)RhPV病毒的檢測(cè)，主要采用酶聯(lián)檢測(cè)及免疫組化定 位的方法，還沒有相關(guān)的快速分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法。
本發(fā)明所提供的蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法，是提取蚜蟲或植物組織 樣品的總RNA，再以核苷酸序列為序列表中序列1及核苷酸序列為序列表中序列2 的特異性引物對(duì)進(jìn)行RT—PCR反應(yīng)，若檢測(cè)擴(kuò)增得到核苷酸序列為自GENBANK Accession Number為AF022937的5'端第8316-8689位的核苷酸序列的片段，則嫁 蟲或植物感染了 RhPV病毒。
所述檢測(cè)是否擴(kuò)增得到核苷酸序列為自GENBANK Accession Number為AF022937 的5'端第8316-8689位的核苷酸序列的片段的方法為將擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳檢 測(cè)是否獲得374bp的產(chǎn)物，或者直接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否具有自 GENBANK Accession Number為AF022937的5'端第8316-8689位的核苷酸序列。
本發(fā)明所使用的特異性引物，位于RhPV全序列重的第二閱讀框(0RF2)。其中 RhPV全序列包括2個(gè)閱讀框0RFl (580 -6573)和0RF2 (7377- 9558) ， 0RF1和 0RF2分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白。與編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因相比，編碼衣殼蛋 白的基因有較高的特異性和保守性，因此選擇位于0RF2的核苷酸片斷進(jìn)行RhPV病 毒的鑒定，更具有代表性。根據(jù)RhPV全序列(GENBANK Accession N咖ber: AF022937) 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增核苷酸序列為自GENBANK Accession Number為AF022937的5'端 第8316-8689的核苷酸序列的片段RhPV—Fl: 5-GCAAACTCAGTATCTTCAGC-3 (序列
表中序列l(wèi)) ; RhPV—Rl: 5-TTTGATTTATGGCGTGGTGG-3 (序列表中序列2)作為引物。 本發(fā)明的方法利用RT-PCR方法，能夠快速，高效，精準(zhǔn)的檢測(cè)到蚜蟲及其寄主 植物中RhPV的分布和存在。本發(fā)明的方法大大縮短檢測(cè)所需時(shí)間，從收集樣品到檢 測(cè)完畢僅需4-5小時(shí)。并且本發(fā)明的方法檢測(cè)所需樣品量大大減少，同時(shí)檢測(cè)精準(zhǔn) 度大大提高，甚至可以檢測(cè)單頭蚜蟲的帶毒情況；另外以前的方法很難檢測(cè)到RhPV 在蚜蟲寄主植物中的存在情況，而采用本發(fā)明的方法，僅需采取0.5-lcm2葉片，就 可檢測(cè)到蚜蟲寄主植物攜帶病毒與否，且結(jié)果可信度高。


圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)蚜蟲中RhPV病毒感染的結(jié)果 圖2為本發(fā)明方法檢測(cè)單頭蚜蟲中RhPV病毒感染的結(jié)果 圖3為本發(fā)明方法檢測(cè)植物中RhPV病毒感染的結(jié)果
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、本發(fā)明的蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法檢測(cè)蚜蟲中RhPV病 毒感染
1. 蚜蟲樣品RNA的提取隨機(jī)從感病嫁蟲(朋c^^ ow》力咖/^(/i')種群(用攜 帶RhPV病毒的植物培養(yǎng)的岈蟲種群)中分別收集蚜蟲10只，分成2組，每組5只 作為待測(cè)樣本，使用RNeasy Plant Minikit試劑盒(Qiagen)，提取被測(cè)樣品總RNA。 具體為將取得的每組蚜蟲活蟲置于在450 W RLT緩沖液中研磨碎，混勻后轉(zhuǎn)入 QIAshredder spin column (lilac)柱(Qiagen)中，離心，13， OOOrpm， 2min后收 集上清液，加入上清l/2體積的乙醇(體積百分含量為96_100%)，立即混勻，轉(zhuǎn) 入RNeasy mini column柱(Qiagen)中，離心，10， 000 rpm， 15s，棄下層離心液， 加入500 W RPE緩沖液至RNeasy mini column柱，離心，10,000 rpm， 15s。最后 加50W去RNase酶的H20，離心，10， 000 rpm， lmin，得到蚜蟲總RNA。設(shè)置鑒定 感染病毒的蚜蟲2只為陽(yáng)性對(duì)照、鑒定未感染病毒的蚜蟲2只為陰性對(duì)照。
2. 引物的設(shè)計(jì)本發(fā)明所使用的特異性引物，位于RhPV全序列重的第二閱讀 框(0RF2)。其中RhPV全序列包括2個(gè)閱讀框0RF1(580 -6573)和0RF2(7377- 9558)， 0RF1和0RF2分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白。與編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因相比，編 碼衣殼蛋白的基因有較高的特異性和保守性，因此選擇位于0RF2的核苷酸片斷進(jìn)行 RhPV病毒的鑒定，更具有代表性。根據(jù)RhPV全序列(GENBANK Accession Number: AF022937)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增核苷酸序列為自GENBANK Accession Number為AF022937 的5'端第8316-8689的核苷酸序列的片段，引物序列為
RhPV—Fl: 5-GCAAACTCAGTATCTTCAGC-3 (序列表中序列1); RhPV—Rl: 5-TTTGATTTATGGCGTGGTGG-3 (序列表中序列2);
3. One-st印RT-PCR擴(kuò)增以岈蟲(朋opa7o^/ 力鵬/ ao7J樣品總RNA為模 板，使用One-step RT-PCR試劑盒(Invitrogen)，以RhPV—Fl和RhPV—Rl為正反 向引物，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20ul，其中10 ul Reaction Mix (包括0. 4 mM dNTP， 3.2 mM MgS04) ， 0. 4pl ThermoScriptTMPlus/ Platinum Taq， RhPV—Fl引物和 RhPV—Rl引物各0. 3 u M， 20ng上述提取的蚜蟲總RNA。
蚜蟲RNA首先被反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后在Platinum 7邵酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為先45。C 30 min ， 94 °C 2 min， 1個(gè)循環(huán)；再94°C 30 s ， 55°C 30 s ，72°C， 1 min， 35個(gè)循環(huán)； 最后72°C， 10 min， 1個(gè)循環(huán)。
4. 結(jié)果檢測(cè)取10ul擴(kuò)增產(chǎn)物，與樣品緩沖液混合均勻，點(diǎn)入2%瓊脂糖膠中， 進(jìn)行電泳，90V, 25min。電泳后EB染色10min，在UV燈下檢測(cè)結(jié)果，若擴(kuò)增得到 產(chǎn)物為374bp的條帶，則確定蚜蟲是被RhPV病毒侵染，結(jié)果如圖l所示，結(jié)果表明 兩個(gè)待測(cè)樣本蚜蟲均被RhPV病毒侵染，而陰性對(duì)照中沒有檢測(cè)到擴(kuò)增條帶。圖1中， 泳道l為分子量標(biāo)記；泳道2、 3為待測(cè)岈蟲樣品；泳道4為陽(yáng)性對(duì)照；泳道5為陰 性對(duì)照。
實(shí)施例2、本發(fā)明的蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法檢測(cè)單頭蚜蟲中RhPV 病毒感染
單頭樣品RNA的提取隨機(jī)從感病蚜蟲(處c^Wow'p力咖種群(用攜帶 RhPV病毒的植物培養(yǎng)的蚜蟲種群)中收集單頭蚜蟲，共收集5頭蚜蟲分為5組，每 組1頭，使用RNeasy Plant Minikit試劑盒(Qiagen)，分別提取單頭蚜蟲樣品總 RNA。具體為將取得的每只蚜蟲活蟲分別置于在450 W RLT緩沖液中研磨碎，混 勻后轉(zhuǎn)入QIAshredder spin column (lilac)柱(Qiagen)中，離心，13， 000rpm， 2rain后收集上清液，加入上清l/2體積的乙醇(體積百分含量為96 - 100%)，立 即混勻，轉(zhuǎn)入RNeasy mini column柱(Qiagen)中，離心，10， 000 rpm， 15s，棄下 層離心液，加入500 W RPE緩沖液至RNeasy mini column柱，離心，10， 000 rpm， 15s。最后加50W去RNase酶的H20，離心，10， 000 rpm， lmin，得到每頭頓蟲總 RNA。設(shè)置鑒定感染病毒的蚜蟲1只為陽(yáng)性對(duì)照、鑒定未感染病毒的蚜蟲1只為陰性 對(duì)照。
分別以上述蚜蟲總RNA為模板，按照實(shí)施例1的One-st印RT-PCR擴(kuò)增方法檢 測(cè)是否感染RhPV病毒，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明待測(cè)蚜蟲和陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增得到374bp的片段，即檢測(cè)到感染了RhPV病毒，而陰性對(duì)照中沒有檢測(cè)到擴(kuò)增條帶。圖
2中，泳道1-5分別為待測(cè)單頭蚜蟲樣品；泳道6為陰性對(duì)照；泳道7為陽(yáng)性對(duì)照; 泳道8為分子量標(biāo)記；
實(shí)施例3、本發(fā)明的蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法檢測(cè)植物中RhPV病 毒感染
1.植物樣品RNA的提取隨機(jī)被岈蟲為害的小麥植株，剪取葉片0. 5-lcm2，取 3個(gè)樣本(每株小麥取一個(gè)樣本)。分別取一株被帶毒蚜蟲危害的小麥葉片0. 5-lcm2 用做陽(yáng)性對(duì)照， 一株未帶毒蚜蟲為害的小麥葉片0.5-lcm2用作陰性對(duì)照。將取的待 測(cè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，使用RNeasy Plant Minikit試劑盒(Qiagen)，提取 被測(cè)樣品總RNA。具體為將取得的葉片置于在450 14 RLT緩沖液中研磨碎，混勻 后轉(zhuǎn)入QIAshredder spin column (lilac)柱(Qiagen)中，離心，13， OOOrpm， 2min 后收集上清液，加入上清l/2體積的乙醇(體積百分含量為96 - 100%)，立即混 勻，轉(zhuǎn)入RNeasy mini column柱(Qiagen)中，離心，10， 000 rpm， 15s，棄下層離 心液，加入500 (4 RPE緩沖液至RNeasy mini column柱，離心，10， 000 rpm， 15s。 最后加50 14去RNase酶的H20,離心，10， 000 rpm， lmin，得到小麥葉片總RNA。 同時(shí)，將上述取過樣品的小麥用組織免疫化學(xué)定位的方法檢測(cè)是否感染RhPV病毒。
分別以上述蚜蟲總RNA為模板，按照實(shí)施例1的One-st印RT-PCR擴(kuò)增方法檢 測(cè)是否感染RhPV病毒，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明待測(cè)小麥植株中有一株的取樣中 擴(kuò)增得到374bp的片段，即檢測(cè)到感染了RhPV病毒，其他均未擴(kuò)增得到條帶，另外 陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增得到374bp的片段，而陰性對(duì)照中沒有擴(kuò)增得到擴(kuò)增條帶。該結(jié)果與 組織免疫化學(xué)定位的方法檢測(cè)的結(jié)果一致。圖3中泳道1為分子量標(biāo)記；泳道2為 陽(yáng)性對(duì)照；泳道3為陰性對(duì)照；泳道4-6為待測(cè)小麥樣品擴(kuò)增結(jié)果。
序列表
<160〉 2
<210〉 1
<211> 20
<212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉 〈223〉
<■> 1
gcaaactcag tatcttcagc
〈210> 2
〈211> 20
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉 <223〉
<400〉 2
tttgatttat ggcgtggtgg
權(quán)利要求
1、一種蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法，是提取蚜蟲或植物組織樣品的總RNA，再以核苷酸序列為序列表中序列1及核苷酸序列為序列表中序列2的特異性引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，若檢測(cè)擴(kuò)增得到核苷酸序列為自GENBANK AccessionNumber為AF022937的5′端第8316-8689位的核苷酸序列的片段，則蚜蟲或植物感染了RhPV病毒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)是否擴(kuò)增得到核苷酸序 列為自GENBANK Accession Number為AF022937的5'端第8316-8689位的核苷酸 序列的片段的方法為將擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測(cè)是否獲得374bp的產(chǎn)物，或者直 接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否具有自GENBANK Accession Number為 AF022937的5'端第8316-8689位的核苷酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述RT—PCR反應(yīng)為一步RT — PCR反應(yīng)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述一步RT—PCR反應(yīng)的反應(yīng)程 序?yàn)橄?5。C 30min，94。C 2 min， 1個(gè)循環(huán)；再94°C 30 s ， 55°C 30 s ， 72°C ， 1 min， 35個(gè)循環(huán)；最后72。C， 10 min， 1個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蚜蟲或植物感染RhPV病毒的檢測(cè)方法。該方法，是提取蚜蟲或植物組織樣品的總RNA，再以核苷酸序列為序列表中序列1及核苷酸序列為序列表中序列2的特異性引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，若檢測(cè)擴(kuò)增得到核苷酸序列為自GENBANK號(hào)為AF022937的5′端第8316-8689位的核苷酸序列的片段，則蚜蟲或植物感染了RhPV病毒。本發(fā)明的方法利用RT-PCR方法，能夠快速，高效，精準(zhǔn)的檢測(cè)到蚜蟲及其寄主植物中RhPV的分布和存在；并且大大縮短檢測(cè)所需時(shí)間，從收集樣品到檢測(cè)完畢僅需4-5小時(shí)，檢測(cè)所需樣品量大大減少，同時(shí)檢測(cè)精準(zhǔn)度大大提高。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101168782SQ20071017625
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日
發(fā)明者曲魯江, 班麗萍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)