專利名稱：一種生產(chǎn)l-乳酸的方法及其專用凝結(jié)芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-乳酸的方法及其專用凝結(jié)芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
乳酸(Lactic Acid)又名二羥基丙酸，是世界三大有機(jī)酸之一，廣泛應(yīng)用于 食品、化妝、制藥、紡織和化學(xué)工業(yè)上。由乳酸制成的聚乳酸具有良好的生物相容 性和生物可降解性，可制成醫(yī)用緩釋材料、生物可降解纖維和生物可降解塑料等， 并有望在不久的將來(lái)取代石油基塑料。近年來(lái)，由于石油資源的日漸短缺和人們環(huán) 保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，圍繞聚乳酸的研究也越來(lái)越多，作為聚乳酸單體的乳酸的需求 也越來(lái)越迫切。乳酸是一種手性分子，可分為L(zhǎng)-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。在聚乳 酸的生產(chǎn)過(guò)程中，聚乳酸的物理性質(zhì)和穩(wěn)定性主要受L-乳酸和D-乳酸的組成所影 響，因此在聚合反應(yīng)中需要高純度的L-乳酸和D-乳酸。
乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶合成法和發(fā)酵法三種。其中，化學(xué)法直 接合成的乳酸為DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸則需進(jìn)行光學(xué)拆分，而且由于 合成法所用的原料是乙醛和劇毒物氫氰酸，合成乳酸應(yīng)用于食品不能被廣泛接受， 此外其生產(chǎn)成本也較高。酶法生產(chǎn)可以專一性地得到光學(xué)純?nèi)樗?，但生產(chǎn)過(guò)程比較 復(fù)雜，尚未廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，可通過(guò)菌種和培養(yǎng)條 件的選擇而獲得D-乳酸、L-乳酸或是兩者一定比例的混合物，能以淀粉、纖維素等 可再生資源為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品安全性高，是生產(chǎn)乳酸的主要 方法。
目前成功應(yīng)用于乳酸發(fā)酵的微生物主要有兩類(lèi)， 一類(lèi)是霉菌中的米根霉，另一 類(lèi)是細(xì)菌中的乳桿菌。米根霉生產(chǎn)乳酸是好氧發(fā)酵，而乳桿菌可厭氧或微好氧發(fā)酵 生產(chǎn)乳酸，這兩類(lèi)菌株的共同特點(diǎn)是發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的溫度一般在30 42t:，容易污 染DL-乳酸生產(chǎn)菌(如植物乳桿菌)，因此需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滅菌，造成能量的浪 費(fèi)和營(yíng)養(yǎng)成分的損失。
嗜熱的芽孢桿菌是一種新的可用于L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的微生物。由于具有較高的 發(fā)酵溫度(45 6(TC)，大大減少了發(fā)酵過(guò)程中污染雜菌的機(jī)會(huì)，提高了L-乳酸的 光學(xué)純度。同時(shí)，以較高的溫度進(jìn)行發(fā)酵，可降低發(fā)酵液粘度，有利于后續(xù)處理步
驟的操作，可以在培養(yǎng)基不滅菌的條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，降低了能耗和L-乳酸的生 產(chǎn)成本，并為以淀粉為基質(zhì)同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸提供了基礎(chǔ)。
在專利USP 5079164中曾經(jīng)利用嗜熱的凝結(jié)芽孢桿菌(SacW7iAs coa^/h/ sDSM 5196)進(jìn)行發(fā)酵，但發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率較低，19%的初糖僅得到14%的乳酸。專利USP 7183088 B2和CN 1498265 A提到利用另外一株凝結(jié)芽孢桿菌(SaciWws coa^/7a/Ls SIM-7 DSM 14043)進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)，但產(chǎn)酸的速率較低，發(fā)酵98小時(shí)，產(chǎn)酸12. 3 %，轉(zhuǎn)化率95. 5%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株產(chǎn)L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌(5s"W^
本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌(fe 77m coa^/7^s)菌株CASH從北京門(mén)頭 溝區(qū)的某牛奶廠附近土壤中篩選并誘變得到，已于2007年09月24日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū) 大屯路)，保藏登記號(hào)為CGMCC Nq2184。
凝結(jié)芽孢桿菌(^aci"ws co3卵7朋s) CASH CGMCC N22184革蘭氏陽(yáng)性，長(zhǎng)桿 狀細(xì)胞，細(xì)胞能運(yùn)動(dòng)，形成近端卵形內(nèi)生孢子。其菌落為圓形、凸起、有光澤、透 明、表面光滑、干燥、直徑2 3mm。它可利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、阿拉伯糖、 糊精以及p-環(huán)糊精產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能利用木糖、乳糖、棉子糖、甘露醇和山梨醇， 不能利用丙酸鹽，接觸酶陽(yáng)性，不能水解明膠，不產(chǎn)生吲哚，可耐受0.02%的疊氮 化物，在有0.01X的溶菌酶時(shí)不能生長(zhǎng)，專性同型乳酸發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。其16S rDNA 序列(序列表中的序列l(wèi))與多株凝結(jié)芽孢桿菌的16S r麗A序列比對(duì)相似性達(dá)到 99%。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用凝結(jié)芽孢桿菌(v^c^7w5" cos^/7朋s)CASH CGMCC Na2184生產(chǎn)L-乳酸的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)L-乳酸的方法，是發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌(^s"1/m c朋卵7朋s) CASH CGMCC Na2184得到L-乳酸。
所述凝結(jié)芽孢桿菌(5aci7仂s co3^/7朋s) CASH CGMCC Ns2184的發(fā)酵培養(yǎng)基 每升中可含有以下五種氮源中的至少一種酵母粉5 15克，蛋白胨5 15克，大 豆肽5 15克，大豆蛋白胨5 15克，棉籽蛋白10 20克。另外每升發(fā)酵培養(yǎng)基 中還含有葡萄糖80 170克，用于調(diào)控發(fā)酵液pH的中和劑，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5 7。該發(fā)酵培養(yǎng)基不需滅菌。
其中，所述中和劑為碳酸鈣，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中每升含有50 100克。 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH具體可為5. 5 6. 5。
所述凝結(jié)芽孢桿菌(&"77ws cosgW朋s) CASH CGMCC Ns2184的發(fā)酵條件具 體可為45。C 60。C培養(yǎng)18 60小時(shí)，如50 55。C培養(yǎng)18 48小時(shí)。
所述方法中，還可將凝結(jié)芽孢桿菌(5aci^iAscoa《〃7朋s) CASHCGMCC N22184 先接入如下種子培養(yǎng)基中，在45 6(TC培養(yǎng)6 8小時(shí)，再接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基； 所述種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖60 80克，酵母粉10 15克，大豆蛋白胨5 8克，碳酸鈣30 40克，余量為水；所述種子培養(yǎng)基的pH為5. 5 6。
所述發(fā)酵的培養(yǎng)方式具體可為攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 300轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn) 半徑為33mm。
本發(fā)明的凝結(jié)芽孢桿菌(5aci"^ coa^/2朋s) CASH CGMCC Na2184以葡萄糖 為底物，在45 6(TC條件下以98 99%的糖酸轉(zhuǎn)化率高效發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純度99% 以上的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達(dá)190克/升，體積生產(chǎn)效率最高可達(dá)5. 7 克/升/小時(shí)。
本發(fā)明的生產(chǎn)L-乳酸的方法，利用高溫發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)，污染雜菌的機(jī)率小， 可不對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，減少了能量的消耗和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。


圖1為凝結(jié)芽孢桿菌(^3ci"^ coa^/2朋s) CASH CGMCC Ns2184發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過(guò)程中葡萄糖和L-乳酸的變化曲線。
圖2為凝結(jié)芽孢桿菌(^3cj77"s c朋卵^"s) CASH CGMCC Na2184發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸所得發(fā)酵液以及D-乳酸和L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品在液相手性柱下的色譜圖。A為L(zhǎng)-乳 酸標(biāo)準(zhǔn)品，B為D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，C為發(fā)酵液樣品。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的利用凝結(jié)芽孢桿菌(萬(wàn)scj7〗〃s coa^/7朋s) CASH CGMCC Na2184發(fā)酵 生產(chǎn)L-乳酸方法中涉及的步驟順序如下
(1) 斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(Sa""m coa卵7a"s) CASH CGMCC Nq2184 菌種接種于含有1. 5 2. Og/100ml的瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度45 60 °C，培養(yǎng)時(shí)間8 12小時(shí)；
(2) 種子培養(yǎng)用步驟(1)的斜面培養(yǎng)物，在無(wú)菌條件下接種到種子培養(yǎng)基
中，培養(yǎng)溫度45 6(TC，培養(yǎng)方式為利用漩渦式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，培 養(yǎng)時(shí)間6 8小時(shí)；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)以5 10%的體積比的接種量，將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基， 培養(yǎng)溫度45 6(TC，培養(yǎng)方式為攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速200 300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間 18 60小時(shí)，制得含有L-乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)液；
(4) 處理樣品取發(fā)酵液先加熱至80 10(TC，再6，000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘， 取上清液；
(5) 樣品檢測(cè)取上清液稀釋，檢測(cè)葡萄糖含量和L-乳酸、D-乳酸含量； 其中，步驟(1) 、 (2) 、 (3)中所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是50 55t:。 其中，步驟(1)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是9 10小時(shí)。
其中，步驟(2)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是6 7小時(shí)。
其中，步驟(3)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是18 48小時(shí)。
其中，步驟(2) 、 (3)中所述的菌體培養(yǎng)加入碳酸鈣控制pH為5.5 6。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1、凝結(jié)芽孢桿菌(萬(wàn)aci"z/s cos卵7朋s) CASH CGMCC Na2184的分離 誘變篩選及鑒定
1、分離誘變篩選
該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下
營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基葡萄糖150克/升，酵母粉10克/升，碳酸鈣50克/升，pH 為6。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸鈣20克/升，瓊脂
粉10克/升，pH為6。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖150克/升，酵母粉20克/升，碳酸鈣90克/升，pH為6。 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸鈣10克/升，pH為6。
該實(shí)施例的具體操作過(guò)程如下
從北京門(mén)頭溝區(qū)的某牛奶廠附近取得土樣，每2克土樣放入50ml營(yíng)養(yǎng)液體培 養(yǎng)基中，55。C富集培養(yǎng)6 10小時(shí)。然后稀釋涂布到含營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中， 55"C培養(yǎng)24小時(shí)。待長(zhǎng)出單菌落后，挑選菌落面積和透明圈面積大的菌落，接種
到發(fā)酵培養(yǎng)基中，55t:靜置培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)定L-乳酸的產(chǎn)量，挑選產(chǎn)量最高的菌 株，用于下一步離子束誘變。
將初步挑選的菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上劃線培養(yǎng)，挑出單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基中，55i:靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，用生理鹽水洗滌后懸浮，制成菌懸液。吸 取100y L涂布于直徑為3. 5cm的無(wú)菌空白培養(yǎng)皿上，涂布直徑約1. 5cm，無(wú)菌風(fēng)吹 干制成菌膜后進(jìn)行離子注入，離子能量30keV，注入劑量分別為1X1014 ions/cm2、 5X10" ions/cm2、 10X1014 ions/cm2、 50X10" ions/cra2、 100X10" ions/cm2。離 子注入后的平皿用lmL生理鹽水洗脫。各不同注入劑量分別吸取100y L，分別接入 含5% (5g/100ml) L-乳酸鈉的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，55"C靜置培養(yǎng)24小時(shí)，只有注 入劑量為10X10"ions/cr^的培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，稀釋該培養(yǎng)液，涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)皿中，待長(zhǎng)出單菌落后，挑選菌落面積和透明圈面積大的菌落，接種到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，55。C靜置培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)定L-乳酸的產(chǎn)量，挑選產(chǎn)量最高的菌株。最終得 到產(chǎn)量最高的菌株凝結(jié)芽孢桿菌(AscW7ws coa^/73/2s) CASH CGMCC Na2184。
2、菌株的鑒定
根據(jù)"伯杰系統(tǒng)鑒定手冊(cè)(第八版)"和"常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)"(科學(xué)出 版社)提供的鑒定方法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌(萬(wàn)s"Wm co3卵2a/^) ASHCGMCCNs2184為革蘭氏陽(yáng)性，長(zhǎng)桿狀細(xì)胞，細(xì)胞能運(yùn)動(dòng)，形成近 端卵形內(nèi)生孢子。其菌落為圓形、凸起、有光澤、透明、表面光滑、干燥、直徑2 3 mm。它可利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、阿拉伯糖、糊精以及P-環(huán)糊精產(chǎn)酸不產(chǎn) 氣，不能利用木糖、乳糖、棉子糖、甘露醇和山梨醇，不能利用丙酸鹽，接觸酶陽(yáng) 性，不能水解明膠，不產(chǎn)生吲哚，可耐受0.02%的疊氮化物，在有0.01%的溶菌 酶時(shí)不能生長(zhǎng)，專性同型乳酸發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。其16S rDNA序列(序列表中的序 列1)與多株凝結(jié)芽孢桿菌的16S rDNA序列比對(duì)相似性達(dá)到99%。
基于以上特征，將本株L-乳酸生產(chǎn)菌鑒定為凝結(jié)芽孢乳桿菌(^fe^7^/s c^^/7朋s)，并將其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏號(hào)為CGMCC Na2184。
實(shí)施例2、利用凝結(jié)芽孢桿菌(萬(wàn)s"W"s coa卵7朋s) CASH CGMCC Na2184在 三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下
斜面培養(yǎng)基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉
膏10克/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/ 升，瓊脂粉15克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115'C滅菌20分鐘。
種子培養(yǎng)基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 鈣30克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115"C條件下滅菌20分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)170克/升，酵母粉(北京奧 博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01 — 013) 15克/升，碳酸鈣80克/升。 該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5。不滅菌。
該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟-
(1) 斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(5aci7"s coa《"7朋s) CASH CGMCC N22184 菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，5(TC條件下，靜止培養(yǎng)10小時(shí)；
(2) 種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1環(huán)于裝 有30ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，5(TC條件下，搖床培養(yǎng)6小時(shí)，轉(zhuǎn)速120 轉(zhuǎn)/分鐘(13mm旋轉(zhuǎn)半徑)，制得種子液；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)在裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2) 的種子養(yǎng)液，5(TC條件下，搖床培養(yǎng)39小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，該搖床的轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/ 分鐘a3mm旋轉(zhuǎn)半徑)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)50次重復(fù)。每3個(gè)小時(shí)取發(fā)酵液，先加熱至80 IO(TC，再6， 000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸濃度、D-乳酸 濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率、體積生產(chǎn)效率和L-乳酸光學(xué)純度。
其中，葡萄糖的測(cè)定方法為，發(fā)酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀SBA-40C (山東省科學(xué)院)測(cè)定。
L-乳酸和D-乳酸含量的測(cè)定方法為，采用Agilent IIOO液相色譜儀，配備手 性分離柱(日本三菱化學(xué)公司，MCI GEL-CRS10 W(3u) 4.6 IDX50mm，光學(xué)異體 分離用)。具體操作條件為0.002mol/L硫酸銅作為流動(dòng)相，流量0.5ml/min，進(jìn) 樣量20uL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nra，操作溫度25。C。利用L-乳酸和D-乳酸 標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。
本發(fā)明中，作為標(biāo)準(zhǔn)品的D-乳酸為德國(guó)Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，其貨號(hào)為 L0625-25MG;作為標(biāo)準(zhǔn)品的L-乳酸為德國(guó)Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，其貨號(hào)為 L1750-IOG。在如上色譜條件下，D-乳酸保留時(shí)間為10. 150分鐘，L-乳酸保留時(shí)間 為12.293分鐘。L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液的色譜圖見(jiàn)附圖2。
光學(xué)純度(optical purity)是衡量旋光性樣品中一個(gè)對(duì)映體超過(guò)另一個(gè)對(duì)映體的量的量度，它可用對(duì)映體過(guò)量值(enantiomeric excess)表示。本發(fā)明中L-
乳酸的光學(xué)純度按以下公式計(jì)算(L-乳酸含量一D-乳酸含量)+ (L-乳酸含量+D-
乳酸含量)X100X。
糖酸轉(zhuǎn)化率定義為L(zhǎng)-乳酸產(chǎn)量(克/升)+葡萄糖的消耗量(克/升)X100X。 體積生產(chǎn)效率定義為L(zhǎng)-乳酸產(chǎn)量(克/升)+發(fā)酵時(shí)間(小時(shí))。 發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為2.3克/升±0.5克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，L-
乳酸濃度165. 1克/升±1.0克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率98.5%±0.6
% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4.2克/升/小時(shí)±0.3克/升/小時(shí)(平均值
士標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度99.3%±0. 3% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例3、利用凝結(jié)芽孢桿菌(AacW7ws co3^Wa/^) CASH CGMCC Na2184在
三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
凝結(jié)芽孢桿菌(AaciWwsco^Wa;^) CASH CGMCC Ns2184的培養(yǎng)溫度為55°C。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)118克/升，大豆蛋白胨 (北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01 — 004) 15克/升，碳酸鈣80
克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5. 5。發(fā)酵時(shí)間是24小時(shí)。其它方法均與實(shí)施例
2相同。
發(fā)酵結(jié)束，葡萄糖的濃度為3.2克/升±1. l克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳 酸濃度113.5克/升±1.9克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率98.9%±0.3% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4.7克/升/小時(shí)±0.2克/升/小時(shí)(平均值土 標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度99.3%±0.2% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例4、利用凝結(jié)芽孢桿菌(萬(wàn)aci"^ co3^/2朋s) CASH CGMCC他2184在 三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
凝結(jié)芽孢桿菌(jS3ci77wsco3gw7a; s) CASH CGMCC N22184的培養(yǎng)溫度為60°C 。 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)83克/升，大豆肽(哈 爾濱樂(lè)能生物工程股份有限公司，樂(lè)能大豆蛋白肽3#粉)15克/升，碳酸l丐80克 /升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5.5。發(fā)酵時(shí)間是24小時(shí)。其它方法均與實(shí)施例2 相同。
發(fā)酵結(jié)束，葡萄糖的濃度為2. 1克/升±0.5克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳 酸濃度79. 0克/升± 1. 5克/升(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率98. 8。％ ± 0. 3 % (平 均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率3.3克/升/小時(shí)±0.2克/升/小時(shí)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)
差)，L-乳酸光學(xué)純度99. 1%±0. 1% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例5、利用凝結(jié)芽孢桿菌(^a""i/s coa卵7朋s) CASH CGMCC Na2184在 三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
凝結(jié)芽孢桿菌(fecj77i/scoa卵7朋s) CASHCGMCCNa2184的培養(yǎng)溫度為45°C。 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)120克/升，棉籽蛋白(北 京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)20克/升，碳酸鈣80克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的 初始pH為6。發(fā)酵時(shí)間是27小時(shí)。其它方法均與實(shí)施例2相同。
發(fā)酵結(jié)束，葡萄糖的濃度為2.5克/升±0.6克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳 酸濃度116.0克/升±1.5克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率98.7%±0.4% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4.3克/升/小時(shí)±0.3克/升/小時(shí)(平均值土 標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳酸光學(xué)純度99.2%±0.2% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例6、利用凝結(jié)芽孢桿菌(&ciL^s co3^/7a^s) CASH CGMCC Na2184在 三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
凝結(jié)芽孢桿菌(^aciW^ c朋卵7朋s) CASH CGMCC Na2184的發(fā)酵培養(yǎng)基的組 成為葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)118克/升，蛋白胨(北京奧博星生物技 術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01 — 001 — 2) 15克/升，碳酸鈣80克/升。該發(fā)酵培 養(yǎng)基的初始pH為7。發(fā)酵時(shí)間是28小時(shí)。其它方法均與實(shí)施例2相同。
發(fā)酵結(jié)束，葡萄糖的濃度為2.7克/升±0.3克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳 酸濃度113.5克/升±1.7克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率98.5%±0.4% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4.1克/升/小時(shí)±0.2克/升/小時(shí)(平均值土 標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度99.3%±0.2% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例7、利用凝結(jié)芽孢桿菌(&d'"ws coa^^朋s) CASH CGMCC Na2184在5 升發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下
斜面培養(yǎng)基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉 膏10克/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸l丐15克/ 升，瓊脂粉15克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115。C滅菌20分鐘。
種子培養(yǎng)基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 鈣30克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115。C條件下滅菌20分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)125克/升，酵母粉(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01 — 013) 9.8克/升，大豆蛋白胨(北京 奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01—004) 5克/升，碳酸鈣100克/升。 該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5。不滅菌。
該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟
(1) 斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(&ciWiAs c朋gw2朋s) CASH CGMCC Nq2184 菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，5CTC條件下，靜止培養(yǎng)10小時(shí)；
(2) 種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝 有100ml種子培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，50。C條件下，搖床培養(yǎng)6小時(shí)，轉(zhuǎn)速120 轉(zhuǎn)/分鐘(13mm旋轉(zhuǎn)半徑)，制得種子液；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BIOSTAT B， B. Braun) 5升發(fā)酵罐中加入3升發(fā) 酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入300ml種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘
(33mm旋轉(zhuǎn)半徑)，50。C條件下發(fā)酵21小時(shí)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)10次重復(fù)。按照實(shí)施例2 的方法每3個(gè)小時(shí)取發(fā)酵液，先加熱至80 10(TC，再6，000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘， 取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸濃度、D-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率、 體積生產(chǎn)效率和L-乳酸光學(xué)純度。
發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為3.4克/升±0.6克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳酸濃度120克/升±1.8克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率99.0% ±0.5% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率5.7克/升/小時(shí)±0.4克/升/小時(shí)(平均值士 標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度99.2%±0. 1% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例8、利用凝結(jié)芽孢桿菌(&ci"^ co3^^朋s) CASH CGMCC Na2184在5 升發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下
斜面培養(yǎng)基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉 膏10克/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/ 升，瓊脂粉15克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115。C滅菌20分鐘。
種子培養(yǎng)基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 鈣30克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115。C條件下滅菌20分鐘。
發(fā)酵初始培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)122克/升，蛋白胨(北 京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01 —001 — 2) 5克/升，大豆肽(哈 爾濱樂(lè)能生物工程股份有限公司，樂(lè)能大豆蛋白肽3#粉)12.8克/升，碳酸i丐IOO
克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5。不滅菌。
該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟
(1) 斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(feci"ws coa卵7朋s) CASH CGMCC Ns2184 菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，55。C條件下，靜止培養(yǎng)10小時(shí)；
(2) 種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝 有100ml種子培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，55。C條件下，搖床培養(yǎng)6小時(shí)，轉(zhuǎn)速120 轉(zhuǎn)/分鐘(13rara旋轉(zhuǎn)半徑)，制得種子液；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BIOSTAT B， B. Braun) 5升發(fā)酵罐中加入3升發(fā) 酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入300ml種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/ 分鐘(33mm旋轉(zhuǎn)半徑)，55。C條件下共發(fā)酵39小時(shí)。其中，發(fā)酵到15小時(shí)(經(jīng)檢 測(cè)，此時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為30克/升)，按照每升發(fā)酵液中補(bǔ)加42克葡萄 糖的量補(bǔ)加葡萄糖，即每個(gè)發(fā)酵罐中再加入126克葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公 司)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)10次重復(fù)。按照實(shí)施例2的方法取發(fā)酵液，先加熱至80 10(TC， 再6,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸濃度、D-乳酸濃度、 葡萄糖濃度，計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率、體積生產(chǎn)效率和L-乳酸光學(xué)純度。
結(jié)果表明發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為4.6克/升±0.7克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn) 差)，L-乳酸濃度160克/升±3.2克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率98.5% ±0.4% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4. 1克/升/小時(shí)±0.3克/升/小時(shí)(平 均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度99.2%±0.2% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。
實(shí)施例9、利用凝結(jié)芽孢桿菌(&""ws c朋卵h/Ls) CASH CGMCC N22184在5 升發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
凝結(jié)芽孢桿菌(^3cj77wscm卵^3/js) CASHCGMCC Ns2184的培養(yǎng)溫度為60°C， 發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)83克/升，酵母粉(北 京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01 — 013) 10克/升，大豆肽(哈爾 濱樂(lè)能生物工程股份有限公司，樂(lè)能大豆蛋白肽3#粉)5克/升，碳酸鈣80克/升。 該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為7。發(fā)酵時(shí)間是18小時(shí)。其它方法均與實(shí)施例7相同。
結(jié)果表明發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為3.2克/升±0.4克/升(平均值士標(biāo)準(zhǔn) 差)，L-乳酸濃度為78.5克/升±0.9克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn)化率為 98. 4% ±0.3。％ (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4.4克/升/小時(shí)±0. 1克/升/ 小時(shí)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度為99.2%±0. 1% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。 實(shí)施例10、利用凝結(jié)芽孢桿菌(萬(wàn)scj77m co3卵J朋s) CASH CGMCC Ns2184在 5升發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下
斜面培養(yǎng)基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉 膏10克/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/ 升，瓊脂粉15克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115'C滅菌20分鐘。
種子培養(yǎng)基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸 鈣30克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115'C條件下滅菌20分鐘。
發(fā)酵初始培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)122克/升，酵母粉(北 京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01—013) 5克/升，棉籽蛋白(北京 康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)20克/升，碳酸鈣100克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初 始pH為6.5。不滅菌。
該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟
(1) 斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(fed7Jws co3卵7a/Ls) CASH CGMCC Ns2184 菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，55"C條件下，靜止培養(yǎng)10小時(shí)；
(2) 種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝 有100ml種子培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，55"C條件下，搖床培養(yǎng)6小時(shí)，轉(zhuǎn)速120 轉(zhuǎn)/分鐘(13rara旋轉(zhuǎn)半徑)，制得種子液；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BIOSTAT B, B. Braim) 5升發(fā)酵罐中加入3升發(fā) 酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入300ral種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/ 分鐘(33mm旋轉(zhuǎn)半徑)，55。C條件下共發(fā)酵48小時(shí)。其中，發(fā)酵到18小時(shí)(經(jīng)檢 測(cè)，此時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為16克/升)，按照每升發(fā)酵液中補(bǔ)加76克葡萄 糖的量補(bǔ)加葡萄糖、按照每升發(fā)酵液中補(bǔ)加3克酵母粉的量補(bǔ)加酵母粉、按照每升 發(fā)酵液中補(bǔ)加6克棉籽蛋白的量補(bǔ)加棉籽蛋白和按照每升發(fā)酵液中補(bǔ)加30克碳酸 鈣的量補(bǔ)加碳酸鈣；即每個(gè)發(fā)酵罐中再加入228克葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公 司)、9克酵母粉(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01—013)、 18克棉籽蛋白(北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)和90克碳酸然。實(shí)驗(yàn)共設(shè) IO次重復(fù)。按照實(shí)施例2的方法取發(fā)酵液，先加熱至80 10(TC，再6，000轉(zhuǎn)/分 鐘離心5分鐘，取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸濃度、D-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計(jì) 算糖酸轉(zhuǎn)化率、體積生產(chǎn)效率和L-乳酸光學(xué)純度。
結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌(^aci"〃s cos卵7朋s) CASH CGMCC Ns2184發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸過(guò)程中葡萄糖和L-乳酸的變化曲線如圖1所示，表明通過(guò)補(bǔ)料葡萄糖可迅速 轉(zhuǎn)化為高濃度的L-乳酸。發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為5.0克/升±0.8克/升(平 均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，L-乳酸濃度190克/升±5.2克/升(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，糖酸轉(zhuǎn) 化率98. 2% ±0.3% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，體積生產(chǎn)效率4.0克/升/小時(shí)±0.4克/ 升/小時(shí)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，卜乳酸光學(xué)純度99.5%±0.2% (平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)。
序列表
<160> 1
<210〉 1 <211〉 612 <212〉 DNA
〈213〉凝結(jié)芽孢桿菌(5ac272ws coa^/7a/7s)
〈400〉 1
agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgtgc60
ggaccttttaaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggc120
aacctgcctgt朋gactgggataacgccggg3犯CCggggctaataccggatcgtttttt180
cctccgcatggaggaaaaaggaaaggcggcttcggctgccacttacagatgggcccgcgg240
cgcattagctagttggcggggtaacggccc8cca^ggc肌cgatgcgtagccgacctgag300
agggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta360
gggaatcttccgcaMggacgaaagtctgacggagcaacgctgcgtgagtgaagaaggcc420
ttcgggtcgtaaasctctgttgccggggaagaacaagtgccgttcgaacagggcggcgcc480
ttgacggtacccggccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaa^3cgt540
aggtggcaeigcgttgtccggaattattgggcgtsa^gcgcgcgc娜cggcttcttaagt600
ctgatgtgaaat61權(quán)利要求
1、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH，其保藏號(hào)為CGMCC №2184。
2、 一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，是發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌(&ci^ws cos^/7朋s) CASH CGMCC N22184得到L-乳酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述凝結(jié)芽孢桿菌(53 7A^ coa^/7朋"CASH CGMCC N。_2184的發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有以下五種氮源中的至少一種 酵母粉5 15克，蛋白胨5 15克，大豆肽5 15克，大豆蛋白胨5 15克，棉籽蛋 白10 20克；所述發(fā)酵培養(yǎng)基每升中還含有葡萄糖80 170克，用于調(diào)控發(fā)酵液 pH的中和劑，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5 7。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述中和劑為碳酸鈣，所述發(fā)酵 培養(yǎng)基中每升含有50 100克。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基不滅菌。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述凝結(jié)芽孢桿菌(^feci'7J"s coa卵J朋s) CASH CGMCC Ns2184的發(fā)酵條件為45。C 60。C培養(yǎng)18 60小時(shí)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為50 55t:。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)時(shí)間為18 48小時(shí)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，將凝結(jié)芽孢桿 菌(fecy"〃s c朋卵7朋s) CASH CGMCC Ns2184先接入如下種子培養(yǎng)基中，在45 60 。C培養(yǎng)6 8小時(shí)，再接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基；所述種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖60 80克，酵母粉10 15克，大豆蛋白胨5 8克，碳酸鈣30 40克，余量為水；所述 種子培養(yǎng)基的pH為5. 5 6。
10、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的培養(yǎng)方式為攪拌 培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 300轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為33mm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)L-乳酸的方法及其專用凝結(jié)芽孢桿菌。本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌是凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184。培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184即可得到L-乳酸。該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有以下五種氮源中的至少一種酵母粉5～15克，蛋白胨5～15克，大豆肽5～15克，大豆蛋白胨5～15克，棉籽蛋白10～20克；另外每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有葡萄糖80～170克(初糖含量)，碳酸鈣50～100克，余量為水；該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5～7。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC № 2184以葡萄糖為底物，在45～60℃條件下以98～99％的糖酸轉(zhuǎn)化率高效發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純度99％以上的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達(dá)190克/升，體積生產(chǎn)效率最高可達(dá)5.7克/升/小時(shí)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101173242SQ200710176060
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2007年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日
發(fā)明者波 于, 秦加陽(yáng), 平 許, 博 趙, 馬翠卿 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所