專利名稱：含有病毒的組合物以及濃縮病毒制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有病毒尤其是病毒載體、穩(wěn)定性明顯提高的組合物。本發(fā)明的組合物可用于保持病毒在保藏期間穩(wěn)定性，本發(fā)明的含病毒組合物尤其可用于治療用途如基因治療。本發(fā)明還提供了濃縮以及純化病毒制劑的新方法。
II.
背景技術(shù)：
病毒對于治療用途如疫苗接種和基因治療愈來愈重要，需要開發(fā)和制備易于保藏和運輸而仍然保持足夠安全性和功效的、穩(wěn)定的含病毒組合物。具體地說，已知在基因治療中廣泛使用病毒載體，重要的是開發(fā)和制備能夠穩(wěn)定地保存攜帶有治療轉(zhuǎn)基因的活重組病毒配方(formulation)。
此外，極其需要能夠在-80℃以上、長時間內(nèi)能夠穩(wěn)定病毒制劑的配方。含病毒組合物通常需要貯藏于-80℃而不能夠在標(biāo)準(zhǔn)冷藏溫度(例如2℃-8℃或更高)貯藏足夠長的時間。這種限制不僅對貯藏是一個嚴(yán)重的障礙，而且對生產(chǎn)、分銷和廣泛的臨床使用也是一個嚴(yán)重的障礙。
也需要開發(fā)即使暴露于冷藏溫度和經(jīng)受苛刻的條件下，如凍/融尤其是與大規(guī)模生產(chǎn)、裝卸或分銷中可能發(fā)生的慢速凍/融時，仍然能夠在長時間內(nèi)保持pH范圍約7-約8.5的含病毒組合物。因為在pH低于7.0及高于8.5時活病毒粒因物理和生物不穩(wěn)定性而易于喪失活力，所以維持pH對病毒制劑是重要的。
另外的問題是涉及增加病毒濃度的問題。尤其是高病毒濃度是病毒不穩(wěn)定性的主要原因。然而，臨床應(yīng)用需要漸增的高濃度病毒和病毒載體。所以，極其需要開發(fā)尤其是在上述苛刻條件下穩(wěn)定的較高濃度病毒的配方。此外，特別需要開發(fā)濃縮現(xiàn)有病毒制劑的新方法，以實現(xiàn)高濃度水平的穩(wěn)定制劑。如果人們試圖濃縮現(xiàn)有病毒制劑，則顯著加重與高病毒濃度有關(guān)的不穩(wěn)定性問題。其部分原因是在努力增加現(xiàn)有病毒制劑濃度的過程中會承受另外的機械剪切力所致。如果人們能夠找到濃縮病毒制劑而不會明顯損害病毒穩(wěn)定性的方法，則能夠容易地制備任何需要濃度的臨床劑量(即使使用較低濃度原料開始時)，而且更重要的是，濃縮病毒的能力能夠解決瓶頸問題以及通過使在各種加工如尺寸排阻色譜法的步驟中的物料通過量明顯增加，從而解決純化過程中的其它放大問題。
因此需要完成上述目的的材料和方法。
III.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供在含有多羥基烴、在約2℃-27℃溫度范圍內(nèi)將pH緩沖維持于約7-約8.5范圍的配方中含有病毒的穩(wěn)定組合物，從而滿足上述需要。
還提供濃縮現(xiàn)有病毒制劑的新方法，該方法使得人們易于選擇和制備寬范圍的需要濃度的臨床劑量。濃縮病毒制劑的優(yōu)選方法包括 (a)向病毒制劑中加入多羥基烴至多羥基烴終濃度約為20％或以上；以及 (b)使所述病毒制劑經(jīng)受一個過濾過程，其中對所述制劑施加壓力，以致通過濾器從病毒制劑去除稀釋劑而同時保留病毒，從而增加病毒濃度。
本發(fā)明還提供濃縮病毒制劑的方法，包括 (a)離心包括如下層的組合物包含35％-80％(v/v)濃度的多羥基烴的第一層，所述第一層上覆蓋含有5％-30％(v/v)濃度的多羥基烴的第二層，第二層上覆蓋含有病毒的第三層；和 (b)從第一層回收病毒。
而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其提高病毒濃度的新方法還具有進一步提高加工效率的優(yōu)勢(例如通過使在各種加工如尺寸排阻色譜法的步驟中的物料通過量明顯增加從而減少或消除后續(xù)純化過程中的瓶頸問題)。所以，在優(yōu)選的實施方案中，按照本發(fā)明濃縮病毒制劑的方法進一步包括后續(xù)純化步驟(例如尺寸排阻色譜法)。在這一方面，當(dāng)在離子交換色譜法后進行尺寸排阻色譜法步驟時，本發(fā)明的方法特別有用，并且在離子交換色譜法之后但是在尺寸排阻色譜法之前(按照本發(fā)明)濃縮病毒制劑。例如由陰離子交換色譜法獲得的病毒流分通常含有高濃度鹽和在濃縮過程中進一步損害病毒穩(wěn)定性的其它可能雜質(zhì)。因此，在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供純化病毒制劑的方法，包括 (a)使病毒制劑經(jīng)過陰離子交換色譜法，其中從陰離子交換色譜法的介質(zhì)中洗脫作為病毒制劑產(chǎn)品的病毒； (b)向步驟(a)病毒制劑產(chǎn)品中加入多羥基烴，使制劑中的多羥基烴濃度達到最終濃度約為25％或以上；以及 (c)通過對所述制劑施用壓力以通過濾器從病毒制劑中去除稀釋劑而保留病毒，從而提高步驟(b)病毒制劑產(chǎn)品中的病毒的濃度；和 (d)再使步驟(c)的濃縮病毒制劑產(chǎn)品經(jīng)過一次或多次另外的加工步驟。
本發(fā)明還提供通過上述方法濃縮和/或純化的病毒制劑。
IV.詳細描述 如上所述，本申請公開了新的含病毒組合物以及濃縮和純化含病毒組合物的新方法。
關(guān)于組合物，本發(fā)明者開發(fā)了一種新的能夠使保藏的病毒制劑穩(wěn)定性提高的緩沖配方。具體地說，該配方能夠在明顯高于-80℃的溫度下穩(wěn)定病毒制劑。更重要的是，本發(fā)明組合物能夠在通常冷藏溫度下例如2℃-8℃或更高，穩(wěn)定足夠長時間、優(yōu)選為數(shù)月或更長時間。這是非常重要的優(yōu)勢，因為，如上所述，為了滿足臨床需要，在貯藏和運輸過程中將病毒制劑冷凍于-80℃不是切實可行的。
本發(fā)明組合物的一個重要特征是加入了多羥基烴。本文所用的多羥基烴是指2個或2個以上(優(yōu)選2-6、更優(yōu)選2-4個)羥基取代的支鏈、直鏈或環(huán)形化合物。用于本發(fā)明的多羥基烴優(yōu)選為優(yōu)選具有2-7個碳原子的多羥基取代的烷基化合物(支鏈或非支鏈)，可以包括例如甘油、山梨醇和聚丙醇。特別優(yōu)選甘油。如以下提供的資料所示，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)甘油即使在標(biāo)準(zhǔn)冷藏條件下也可以用于保持長時間的令人驚奇的高水平的穩(wěn)定性。
用于本發(fā)明組合物的多羥基烴的有效量足以穩(wěn)定在本發(fā)明配方中的病毒而對病毒進一步應(yīng)用的有效性無不利影響，尤其是在所述病毒含有用于基因治療的轉(zhuǎn)基因的情況下。多羥基烴優(yōu)選存在的終濃度約20-200mg/mL。較窄范圍可以為80-120mg/mL?？梢允褂靡环N以上的多羥基烴達到本發(fā)明組合物中需要的多羥基烴總量。
本發(fā)明組合物中的多羥基烴可以任選含有醛基。具體地說，所述多羥基烴可以為雙糖如蔗糖。而且，即使選定用于所述組合物的多羥基烴不含有醛基，所述組合物也可以另含有作為穩(wěn)定劑和張力調(diào)節(jié)劑的雙糖如蔗糖。當(dāng)本發(fā)明組合物已經(jīng)含有合適的多羥基烴(例如甘油)和在優(yōu)選的實施方案中使用雙糖作為另外的穩(wěn)定劑或張力調(diào)節(jié)劑時，雙糖的優(yōu)選存在范圍為5-25mg/mL、更優(yōu)選20mg/mL，而且所述雙糖優(yōu)選蔗糖。
在本發(fā)明組合物的優(yōu)選實施方案中使用藥學(xué)上可接受的二價金屬鹽穩(wěn)定劑如鎂鹽、鋅鹽和鈣鹽。所述鹽優(yōu)選為鹽酸鹽或鎂鹽，特別優(yōu)選鎂鹽。所述鹽(例如鎂鹽)的優(yōu)選存在量約為0.1-1mg/mL、更優(yōu)選約0.4mg/mL。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中可以包含作為任選穩(wěn)定劑的藥學(xué)上可接受的一價金屬鹽穩(wěn)定劑如鉀鹽、鈉鹽、鋰鹽和銫鹽。所述鹽優(yōu)選存在量為0.6-10.0mg/mL、更優(yōu)選約5.8mg/mL的氯化鈉。
除了穩(wěn)定所述組合物外，氯化鈉可以抑制發(fā)酵副產(chǎn)物出現(xiàn)的速率和程度，使得提供因蛋白聚集使抗原性降低的藥學(xué)上的更佳形式。加入氯化鈉不會影響所述配方的pH。
本發(fā)明組合物即使當(dāng)經(jīng)受苛刻條件如冷藏和凍/融時也能夠長時間將pH維持在約7-約8.5范圍。而且，即使經(jīng)受較大規(guī)模生產(chǎn)、分銷和裝卸中可能發(fā)生的較慢速率的凍/融，本發(fā)明組合物仍然能夠保持穩(wěn)定和保持需要的pH范圍。如上所述，維持pH對病毒制劑是重要的，因為在pH低于7.0及高于8.5時活病毒?？赡茏兊貌环€(wěn)定和降解。該特定的病毒組合物使病毒難于穩(wěn)定和保存。
為了達到在苛刻條件下的pH維持，本發(fā)明優(yōu)選包括一個緩沖體系，該體系即使在貯藏于-80℃至27℃之間以及即使經(jīng)受凍/融條件也能夠?qū)H維持于約7.0至約8.5的最適范圍。因為pH隨溫度而變化，所以以下參考具體溫度范圍更具體地說明本發(fā)明的pH范圍。例如冷藏溫度(例如約2℃-8℃)時，優(yōu)選pH范圍約7.7至約8.3，更優(yōu)選約7.9至約8.2。室溫(例如約20℃-27℃，更優(yōu)選22℃-25℃)下，優(yōu)選pH范圍約7.3至約8.2，更優(yōu)選約7.4至約7.9。
本發(fā)明的優(yōu)選緩沖體系包括約0.5-10mg/mL濃度的磷酸二氫鈉二水合物和約0.5-10mg/mL濃度的氨基丁三醇。(氨基丁三醇也稱為TRIS或“Trizma”，得自Sigma Chemical Co.)。然而，其它緩沖體系也可以使用。例如，如果與酸式氨基丁三醇緩沖液配對，也可以使用磷酸氫二鈉二水合物。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述緩沖體系包括約1.7mg/mL濃度的磷酸二氫鈉二水合物和約1.7mg/mL濃度的氨基丁三醇，具有在25℃下維持所述配方在最適pH范圍約7.3至約7.9內(nèi)的能力。
本發(fā)明配方的另一優(yōu)勢是能夠在上述苛刻條件下(例如冷藏溫度和凍/融加工)穩(wěn)定高濃度的病毒。更具體地說，本發(fā)明配方能夠維持病毒濃度范圍高至1×1013粒/mL的穩(wěn)定性。用于本發(fā)明的病毒濃度優(yōu)選范圍為1×109至1×1013粒/mL，更優(yōu)選高至1×1012粒/mL，例如1×109(或1×1010)至1×1012。
本文所用的術(shù)語“稀釋劑”可以包括溶劑(例如水，優(yōu)選無菌水)或溶劑混合物和其它成分例如另外的溶劑、另外的穩(wěn)定劑、另外的緩沖劑和/或不會負面影響所述配方的安全性、功效和穩(wěn)定性的其它物質(zhì)。關(guān)于稀釋劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑等，參考例如Remington的Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。
在本發(fā)明組合物中可以任選包括表面活性劑、優(yōu)選非離子洗滌劑如聚氧乙烯脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇酐，如得自ICI Americas，Inc.，Wilmington Delaware的Polysorbate 20、Polysorbate 40、Polysorbate60或Polysorbate 80，或得自Sigma，St.Louis，Mo.的吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫80)。所述非離子洗滌劑優(yōu)選聚氧乙烯脂肪酸酯，而所述聚氧乙烯脂肪酸酯優(yōu)選可以用作本發(fā)明組合物中的穩(wěn)定劑的Polysorbate 80。非離子洗滌劑的濃度范圍優(yōu)選0.03-0.3mg/mL；更優(yōu)選0.15mg/mL。
本發(fā)明組合物還可以包括一種或多種“傳遞增強劑”?！皞鬟f增強劑”是指增強治療基因如腫瘤抑制基因傳遞至癌組織或器官的任何因子。這類傳遞增強劑的實例包括但不限于洗滌劑、醇、二元醇、表面活性劑、膽鹽、肝素拮抗劑、環(huán)氧合酶抑制劑、高滲鹽溶液和乙酸鹽。
洗滌劑(作為本文所用的術(shù)語)可以包括陰離子洗滌劑、陽離子洗滌劑、兩性離子洗滌劑和非離子洗滌劑。典型的洗滌劑包括但不限于?；悄懰猁}、脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、十六烷基吡啶、benalkonium鹽酸鹽、ZWITTERGENT3-14洗滌劑、CHAPS(3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol]-1-丙磺酸鹽水合物，Aldrich)、BigCHAP、Deoxy Big CHAP、TRITON-X-100洗滌劑、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷、PLURONIC-F68洗滌劑、TWEEN20洗滌劑和TWEEN80洗滌劑(CALBIOCHEMBiochemicals)。
傳遞增強劑的使用詳細描述于同時待審的1997年7月8日提交的美國專利申請U.S.S.N.08/889,335和1997年7月17日的國際申請公布WO 97/25072號以及1998年7月8日申請的美國專利申請U.S.SN.09/112,074號、國際申請PCT/US 98/14241。另外，聯(lián)合使用鈣蛋白酶抑制劑和病毒載體以增強轉(zhuǎn)導(dǎo)效率描述于1998年10月15日申請的美國專利申請U.S.S.N.09/172,685和60/104321中。
各種病毒可以用于本發(fā)明組合物中，包括但不限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、皰疹病毒、乳多空病毒、副粘病毒、正粘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、輪狀病毒等(參見例如Anderson，Science(1992)256808-813)；特別優(yōu)選腺病毒。所述病毒優(yōu)選為重組病毒，但是可以包括臨床分離物、減毒疫苗株等。因此，可用于本發(fā)明組合物中的典型重組腺病毒是公開于PCT專利申請WO 95/11984號中的AC/N/53。
本發(fā)明的配方非常適用于穩(wěn)定用于基因治療用途的重組病毒如活的重組腺病毒(或“病毒載體”)。用于本發(fā)明的病毒含有例如腫瘤抑制基因如野生型p53基因或Rb基因(例如p110RB或p56RB)，以及帶有轉(zhuǎn)基因的腫瘤抑制基因如已經(jīng)插入病毒載體中的野生型p53，所以本發(fā)明的組合物可以用作治療癌癥的藥用組合物。
在該方面，本發(fā)明配方的一個值得注意的能力是能夠維持活病毒尤其是已經(jīng)插入編碼轉(zhuǎn)基因如p53的核苷酸序列的病毒載體的活力。該特征使得所述病毒保持其感染靶細胞的能力，從而可以足量產(chǎn)生由所插入的轉(zhuǎn)基因編碼的治療蛋白。
關(guān)于p53和其用途，特別值得注意的是p53基因突變是人類癌癥中最常見的遺傳變化(Bartek(1991)Oncogene，61699-1703，Hollstein(1991)Science，253，49-53)。在缺乏內(nèi)源性野生型p53蛋白的哺乳動物癌細胞中導(dǎo)入野生型p53可以抑制這些細胞的腫瘤表現(xiàn)型(參見例如美國專利5,532,220)。
在以下的實施例中，所述病毒為含有野生型p53基因的活重組腺病毒。用于這些實施例中的特定病毒載體構(gòu)建物稱為“A/C/N/53”。A/C/N/53(也稱為“ACN53”)是描述于1994年10月25日申請的共同待審申請USSN 08/328,673和WO 95/11984(1995年5月4日)(特別通過引用結(jié)合到本文中)中的特別優(yōu)選的病毒載體構(gòu)建物。
含有Polysorbate 80的本發(fā)明優(yōu)選實施方案的典型配方如下 典型配方 活性物質(zhì)A/C/N/531×109-1×1013顆粒/mL 緩沖劑 磷酸二氫鈉 0.5-10mg/mL 氨基丁三醇 0.5-10mg/mL 穩(wěn)定劑/張力劑 蔗糖5-25mg/mL 穩(wěn)定劑 甘油20-200mg/mL 氯化鎂 0.1-1mg/mL Polysorbate 80 0.03-0.3mg/mL 溶劑注射用水加至足量1mL (該組合物通常以1.0mL劑量保藏。上述配方中的“加至足量”是指加入足夠的溶劑至1mL總體積)。
四個特別優(yōu)選的實施方案如下。(在實施例1和2中存在Polysorbate 80，但是在實施例3和4中不存在)。實施例1 實施例2 A/C/N/53 7.5×1011顆粒/mL7.5×1010顆粒/mL 磷酸二氫鈉二水合物 1.7mg/mL1.7mg/mL 氨基丁三醇 1.7mg/mL1.7mg/mL 氯化鎂六水合物 0.4mg/mL0.4mg/mL 蔗糖 20mg/mL 20mg/mL Polysorbate 80 0.15mg/mL 0.15mg/mL 甘油 100mg/mL100mg/mL 注射用水加至足量 1mL 1mL pH 7.4-7.8 7.4-7.8實施例3 實施例4 A/C/N/53 7.5×1011顆粒/mL7.5×1010顆粒/mL 磷酸二氫鈉二水合物 1.7mg/mL1.7mg/mL 氨基丁三醇 1.7mg/mL1.7mg/mL 氯化鎂六水合物 0.4mg/mL0.4mg/mL 蔗糖 20mg/mL 20mg/mL 甘油 100mg/mL100mg/mL 注射用水加至足量 1mL 1mL pH 7.4-7.9 7.3-7.8 以下成分得自例如EM Industries，INC.，7 Skyline Drive，Hawthorne，New York 10532磷酸二氫鈉二水合物、氨基丁三醇、氯化鎂六水合物、蔗糖和甘油。Polysorbate 80得自例如ICI Americas，Inc.，Wilmington Delaware，19897。
可以在凝膠過濾色譜柱純化所述病毒過程中，將所述成分(不包括Polysorbate-80)在凝膠過濾柱中以需要的濃度混合，從而制備本發(fā)明的組合物。(關(guān)于凝膠過濾方法例如可以參考如以下第V部分)。然后，如果需要稀釋所述濃度的病毒或加入Polysorbate-80，然后可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備稀釋液。說明性實施例如下 在配有攪拌器的不銹鋼容器中，于室溫下，將磷酸二氫鈉二水合物、氨基丁三醇、蔗糖、氯化鎂六水合物和甘油加入并溶解于約75％每批體積的注射用水中。用注射用水將所得的該批稀釋液加至終體積。校驗pH。計算所需要的A/C/N/53(含有作為轉(zhuǎn)基因的野生型p53的腺病毒)藥物懸浮液(Drug Substance in Suspension)體積以及制備A/C/N/53注射劑的所需要的稀釋液體積。如果最終的A/C/N/53注射劑將含有Polysorbate 80，則制備含有10％以上Polysorbate 80的稀釋液的儲備溶液。將計算量的A/C/N/53藥物懸浮液和稀釋液加入到不銹鋼容器中并混合。需要時，根據(jù)10％的A/C/N53的總注射批體積在加入所有稀釋液前加入Polysorbate 80溶液。通過滅菌濾膜(0.22μm或相當(dāng))無菌過濾所述懸浮液。過濾后測試所述濾膜的完整性。收集并將滅菌懸浮液裝入合適體積的管制瓶中。加蓋并密封管制瓶。
實施例1、2、3和4的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分別在下表1、2、3和4中給出。
在下表中，抗增殖測定是用來測定產(chǎn)品抑制癌細胞的能力的生物測定，而且一般是以Wills等(1994，Human Gene Therapy，51079-1088)所用的方法為基礎(chǔ)。所列出的數(shù)字表示活性，而所述對照無活性。
“噬菌斑測定”通過計算隨稀釋度而變化的病毒噬菌斑數(shù)從而測量培養(yǎng)物中的病毒粒，而且一般是以描述于Graham，F(xiàn).L.和Prevec，L.，Methods in Molecular Biology，第7卷Gene Transfer and ExpressionProtocols，E.J.Murray編輯(Humana Press Imc.，Clifton NJ)第109-128頁(1991)；此外參見Graham，F(xiàn).L.，Smiley，J.，Russel，W.C.和Nairn，R.，J.Gen.Virol.，第36卷，第59-74頁(1977)的方法為基礎(chǔ)。
“FACS”測定顯示病毒感染細胞的能力，這些測定結(jié)果一般基于描述于例如國際專利申請PCT/US97/11865(WO 98/01582，1998年1月15日公布)中的方法。在向右的一欄中，在表目“濃度”下提供的數(shù)字是總病毒粒數(shù)的濃度。最后，在表目“顆粒/FACS比率”下的數(shù)字是總病毒粒數(shù)與感染病毒粒數(shù)的比率，由此表明所述病毒制劑的相對效價。
按指示光散射的波長A320/A260的UV吸光度比所示，在表目“UV”下的數(shù)據(jù)表示病毒粒的聚集?；旧?，320nm波長的吸光度測量光散射量，而260nm波長的吸光度與DNA量有關(guān)。
在“條件“下的表第二欄所列的溫度為貯藏溫度。生理測定在37℃下進行，在最后一欄中是在室溫約25℃下測定的pH。
表1 實施例1的穩(wěn)定性數(shù)據(jù) *重復(fù)試驗9個月UV樣品6.89×1011顆粒/mL；A320/A260＝0.28。
表2 實施例2的穩(wěn)定性數(shù)據(jù) *因檢測干擾而不能確定。
**重復(fù)試驗9個月UV樣品7.37×1010顆粒/mL；A320/A260＝0.24。
表3 實施例3的穩(wěn)定性數(shù)據(jù) 表4 實施例4的穩(wěn)定性數(shù)據(jù) *因檢測干擾而不能確定。
實施例5 實施例5的配方A/C/N/53(7.5×1011顆粒/mL)、氨基丁三醇(TRIS)(1.7mg/mL)、磷酸二氫鈉二水合物(1.7mg/mL)、蔗糖(20mg/mL)、氯化鎂六水合物(0.4mg/mL)、甘油(100mg/mL)、氯化鈉(5.8mg/mL)，灌裝體積＝10mL。
表5 實施例5的穩(wěn)定性數(shù)據(jù) 在某些情況下，于4℃貯藏期間在所述配方中觀察到顆粒形成。
經(jīng)SDS-PAGE分析顆粒表明，所述顆粒含有少量雜質(zhì)(即其他蛋白和部分未成熟病毒顆粒)，因此這些顆粒不影響所述配方的活力。盡管如此，在進一步使所述配方澄清(防治可能的顆粒形成)的優(yōu)選實施方案中，可以進行一個任選的微量過濾步驟以去除任何潛在顆粒而少丟失病毒顆粒。(當(dāng)進行微量過濾時，值得注意的是，關(guān)鍵是單位過濾體積有足夠的微量過濾膜表面面積以避免隨著顆粒去除而丟失病毒)。
此外，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)攪拌作用能夠加速顆粒形成，所以它是澄清過程中的另一個任選步驟。因此，輕輕攪拌(例如用磁性攪拌棒于10℃攪拌過夜)，然后微量過濾表明，可以去除顆粒以致在再攪拌時不再有顆粒形成。
還發(fā)現(xiàn)在重復(fù)攪拌期間凍/融循環(huán)能夠促進顆粒形成。因此，在另一個優(yōu)選方法中，可以任選進行一個或多個凍/融循環(huán)，然后攪拌、微量過濾以防止所述病毒成品在冷藏溫度(例如4℃)下貯藏期間的顆粒形成。
濃縮以及純化含病毒組合物的方法 本申請還公開了一種新的使用切向流過濾(此后有時稱為“TFF”)穩(wěn)定地濃縮現(xiàn)有病毒制劑的方法，該方法使人們易于選擇和制備各種需要濃度的臨床劑量。濃縮病毒制劑的新方法包括 (a)將多羥基烴加入病毒制劑中至多羥基烴終濃度約為20％或以上；和 (b)使所述病毒制劑經(jīng)過一個過濾過程，其中對所述制劑施加壓力，以致通過濾器使稀釋劑從病毒制劑中去除而保留病毒，從而提高病毒濃度。
本發(fā)明方法適用于各種病毒，包括但不限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、皰疹病毒、乳多空病毒、副粘病毒、正粘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、輪狀病毒等；特別優(yōu)選腺病毒。所述病毒優(yōu)選為重組病毒，但是可以包括臨床分離物、減毒疫苗株等。本發(fā)明特別適用于濃縮攜帶用于基因治療的異種轉(zhuǎn)基因的重組病毒。這類病毒特別易受潛在的去穩(wěn)定力的損害，如另外的伴隨濃縮病毒制劑方法的剪切機械力。能夠用本發(fā)明方法濃縮的典型重組腺病毒是A/C/N/53，它公開于PCT專利申請WO 95/11984號中。
用來按照本發(fā)明方法濃縮病毒的過濾方法可以包括任何過濾方法(例如超濾)，其中加壓使稀釋劑通過一個濾器，該方式使得所述稀釋劑從所述病毒制劑中去除，而所述病毒不能通過濾器而由此以濃縮形式留存于所述病毒制劑中，從而提高病毒濃度。在例如微量過濾和超濾原理和應(yīng)用，L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekkar，Inc.，New York，NY，1996)中有關(guān)于超濾的詳細描述。特別優(yōu)選的過濾方法是描述于例如MILLEPORE目錄標(biāo)題為“Pharmaceutical ProcessFiltration Catalogue”第177-202頁(Bedford，Massachusetts，1995/96)中的切向流過濾(“TFF”)。優(yōu)選的TFF裝置包括Millipore公司，80 AshbyRd.，Bedford，Massachusetts(國際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址www.millipore.com)的Pellicon II或Pellicon XL過濾系統(tǒng)，特別優(yōu)選Pellicon XL系統(tǒng)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法在約2℃-27℃溫度范圍內(nèi)進行。
可以使用其它濃縮方法來濃縮按照本發(fā)明的病毒制劑。例如，可以有利地使用多羥基烴來通過離心濃縮病毒制劑。因此，本發(fā)明也提供濃縮病毒制劑的方法，包括 (a)離心包括如下層的組合物包含35％-80％(v/v)濃度的多羥基烴的第一層，所述第一層上覆蓋含有5％-30％(v/v)濃度的多羥基烴的第二層，第二層上覆蓋含有病毒的第三層；和 (b)從第一層回收病毒。
例如，可以采用Beckman離心機的吊桶式轉(zhuǎn)子以3,200g低速離心濃縮腺病毒制劑。為此，將所述病毒制劑放入多個5ml試管中，每一試管在管底的第一層中含有6.25％體積的70％甘油，其上為2.5％體積的20％甘油，最上層為病毒制劑。然后，以3,200g于4℃離心所述制劑約16小時，以把濃縮的病毒沉淀入甘油層，然后將新濃縮的病毒制劑從第一層回收。用上述方法濃縮的病毒具有良好的光散射特性以及合適的感染特性。
關(guān)于用于本發(fā)明方法中的多羥基烴，“多羥基烴”是指2個或2個以上(優(yōu)選2-6、更優(yōu)選2-4個)羥基取代的支鏈、直鏈或環(huán)狀化合物。多羥基烴的有效量是足以穩(wěn)定病毒抗?jié)撛谌シ€(wěn)定力如在濃縮過程中產(chǎn)生的機械剪切力的量。在本發(fā)明濃縮病毒方法中的多羥基烴最低濃度最好為20％，更優(yōu)選25％。用于本發(fā)明的多羥基烴優(yōu)選為優(yōu)選具有2-7個碳原子的多羥基取代的烷基化合物(支鏈或直鏈)，可以包括甘油、山梨醇和聚丙醇。特別優(yōu)選甘油。
本發(fā)明人提高病毒濃度的新方法的另外一個優(yōu)勢是例如通過使在各種加工步驟如尺寸排阻色譜法中的物料通過量明顯增加從而解決瓶頸問題，提高加工效率。所以，在優(yōu)選的實施方案中，濃縮按照本發(fā)明的病毒制劑的方法適用于純化病毒的方法，其中在陰離子交換色譜法后進行尺寸排阻色譜法步驟(例如凝膠過濾)。在該實施方案中，對病毒穩(wěn)定性的另外的威脅不僅來自在限制速率的尺寸排阻色譜法步驟前濃縮病毒需要的機械剪切力，而且由于這樣的事實從陰離子交換色譜法步驟洗脫的病毒制劑通常含有高濃度鹽和其它進一步危及病毒穩(wěn)定性的可能雜質(zhì)。因此，在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供純化病毒制劑的方法，包括 (a)使病毒制劑經(jīng)過陰離子交換色譜法，其中從陰離子交換色譜的介質(zhì)中洗脫作為病毒制劑產(chǎn)品的病毒； (b)向步驟(a)病毒制劑產(chǎn)品中加入多羥基烴，使制劑中的多羥基烴濃度達到最終濃度約25％或以上；以及 (c)通過對所述制劑施以壓力，以致通過濾器從病毒制劑中去除稀釋劑而保留病毒，從而提高步驟(b)病毒制劑產(chǎn)品中的病毒的濃度；和 (d)再使步驟(c)的濃縮病毒制劑產(chǎn)品經(jīng)過一次或一次以上另外的加工步驟。
在以上關(guān)于陰離子交換色譜法的優(yōu)選實施方案中，最小甘油濃度為25％(而不是在本發(fā)明濃縮方法的普通應(yīng)用中的20％最小濃度)，因為該特定應(yīng)用必須考慮從陰離子交換柱洗脫的產(chǎn)物中的高鹽濃度對穩(wěn)定性造成的另外的威脅。加入25％甘油(優(yōu)選30％)使含鹽的DEAE合并部分(pool)在例如4℃下穩(wěn)定10天以上；所以病毒濃縮和/或凝膠過濾的后續(xù)步驟可以在具有顯著靈活性的10天時間內(nèi)的不同時間進行。將會認識到的是，當(dāng)所述病毒制劑因其它加工條件含鹽量高時，25％或以上較高濃度的多羥基烴也可以用于本發(fā)明的方法中。
V.本發(fā)明方法的實施例 以下實施例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案；不能認為本發(fā)明范圍受其限制。
簡要綜述-用來自發(fā)酵回收的冷凍粗病毒物質(zhì)開始成批濃縮。在一個實施方案中，首先用陰離子交換色譜法純化腺病毒制品。然后，在將所述制劑加樣至尺寸排阻柱之前，在30％(v/v)甘油存在下經(jīng)切向流過濾(TFF)可以濃縮陰離子交換合并部分。或者，在另一實施方案中，所述TFF濃縮步驟可以在尺寸排阻色譜法之后，在存在20％(v/v)或以上(優(yōu)選25％)甘油的情況下進行。
·在TFF之前經(jīng)陰離子交換色譜法制備原料 在優(yōu)選的實施方案中，制備腺病毒陰離子交換合并部分用于如下濃縮。解凍得自發(fā)酵以及回收步驟的冷凍病毒物質(zhì)，通過0.45μm親水性膜過濾。加入4 M氯化鈉調(diào)節(jié)濾液的鹽濃度。然后將該原料液加樣于Fractogel EMD DEAE-650M柱，該柱已經(jīng)用50mM磷酸鈉pH 7.5、260mM氯化鈉、2mM氯化鎂、2％(w/v)蔗糖(緩沖液A)預(yù)平衡。腺病毒結(jié)合到陰離子交換樹脂上，而大部分介質(zhì)和宿主細胞雜質(zhì)通過柱，成為廢料。該柱開始用4體積的緩沖液A洗滌，然后用8柱床體積的94％緩沖液A和6％緩沖液B(50mM磷酸鈉pH 7.5、600mM氯化鈉、2mM氯化鎂、2％(w/v)蔗糖)第二等度洗液洗滌，以去除另外的雜質(zhì)。用30柱床體積的線性梯度的6％-100％緩沖液B從所述柱洗脫出病毒。收集通過A280確定的洗脫分布的腺病毒峰部分。向所述DEAE合并部分中加入甘油至終濃度為30％(v/v)以進一步加工。
·采用切向流過濾濃縮DEAE合并部分 采用Millipore TFF單元(Pellicon XL System)，帶有1,000,000分子量截留Biomax膜將DEAE合并部分(按以上所述制備)濃縮至10-20倍。該過程在2-10℃或室溫(25℃)下進行。該方法中使用以下過濾參數(shù)平均入口壓力＝14磅/平方英寸；平均滲透壓＝0磅/平方英寸；平均流速＝13升/小時-平方米。腺病毒終濃度約1.0-2.0×1013顆粒/ml。根據(jù)Resource Q-HPLC和UV吸光度(A260)分析，濃縮步驟的回收率高于80％，并具有明顯的聚集(用A320/A260進行光散射測定)。
·經(jīng)尺寸排阻色譜法(凝膠過濾)進行緩沖劑交換 將濃縮的腺病毒制劑加樣于用20mM磷酸鈉pH 8.0、100mM氯化鈉、2mM氯化鎂、2％(w/v)蔗糖、10％甘油(緩沖液C)或11mM磷酸鈉、14mM Tris、2mM氯化鎂、2％(w/v)蔗糖、10％甘油pH 7.8(緩沖液D)預(yù)平衡的Superdex-200尺寸排阻柱上。用平衡緩沖液洗脫柱。收集并合并通過A280確定的洗脫分布的腺病毒峰部分。將所濃縮的腺病毒制劑于2-10℃通過0.2μm親水性Durapore膜(Stericup，Millipore)過濾，并可貯藏于-80℃或較高的室溫(如2-10℃)下。
·用切向流過濾濃縮Superdex-200合并部分 如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括在陰離子交換色譜法之后，但是在凝膠過濾之前濃縮病毒。然而，在另一實施方案中，所公開的濃縮病毒制劑的方法也可以在凝膠過濾步驟之后使用(即使在陰離子交換步驟和凝膠過濾步驟之間不使用病毒濃縮步驟)。在這種情況下，過濾參數(shù)與濃縮DEAE合并部分的過濾參數(shù)相同，不同的是向Superdex-200合并部分加入的多羥基烴(例如甘油)的終濃度可以低至20％(v/v)，因為不必再處理DEAE合并部分中的高鹽濃度。在該方面，應(yīng)該注意的是，在加入多羥基烴被推遲至凝膠過濾之后的情況下，DEAE合并部分應(yīng)該立即加樣于凝膠過濾柱(因為含有高濃度鹽，DEAE合并部分易受損害)。由此可見，向DEAE合并部分(按照本發(fā)明)加入多羥基烴的另外的優(yōu)勢是增加了陰離子交換色譜法和后續(xù)加工之間的時間間隔和貯藏條件選擇方面的靈活性。
濃縮病毒制劑的方法可以與各種純化方法結(jié)合使用。對于其它純化方法的資料，可以參考例如Huyghe等，Human Gene Therapy，第6卷，第1403-1416頁(1995)和美國專利申請系列號08/989,227，所述文獻特別通過引用結(jié)合到本文中。
VI.用切向流過濾濃縮病毒制劑的方法的穩(wěn)定性數(shù)據(jù) 如以下實驗數(shù)據(jù)所示，本發(fā)明的方法盡管存在濃縮病毒的機械剪切力以及苛刻的條件如DEAE合并部分中的高鹽濃度，但是可以顯著增強病毒穩(wěn)定性。所以，本發(fā)明方法尤其可用于(1)預(yù)制備任何需要濃度的臨床劑量(甚至使用較低濃度的原料開始時)，(2)提高加工效率(例如通過使在尺寸排阻色譜法期間的物料通過量明顯提高)，以及(3)使含鹽DEAE合并部分在2-10℃下穩(wěn)定保藏10天以上，由此使得病毒濃縮和/或凝膠過濾的后續(xù)步驟可以在具有顯著靈活性的10天內(nèi)的不同時間進行。
A.在DEAE色譜法后濃縮病毒 在以下3個實施例中，通過在30％甘油中濃縮DEAE合并部分(按照本發(fā)明方法)制備穩(wěn)定濃度的腺病毒。然后使所述制劑經(jīng)Superdex-200凝膠過濾色譜法進一步純化，獲得供測試的最終配方。實施例D-1 最終配方20mM NaPi，100mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖，10％ 甘油，pH 8，2-10℃。
結(jié)果顆粒/FACS＝24 光散射(A320/A260)＝0.22 濃度＝1.6×1013顆粒/ml 實施例D-2 最終配方14mM Tris堿，11mM NaPi，2mM MgCl2，2％蔗糖， 10％甘油，pH 7.8，2-10℃。
結(jié)果顆粒/FACS＝1 7 光散射(A320/A260)＝0.25 濃度＝1.5×1013顆粒/ml 實施例D-3 最終配方20mM NaPi，100mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖， 10％甘油，pH 8，2-10℃。
結(jié)果顆粒/FACS＝24 光散射(A320/A260)＝0.25 濃度＝1.3×1013顆粒/ml B.在凝膠過濾后濃縮病毒 實施例S-1 在以下實施例中，于凝膠過濾后在20％甘油中濃縮病毒制劑。
最終配方16mM NaPi，80mM NaCl，1.6mM MgCl2，1.6％蔗糖， 20％甘油，pH 8，2-10℃。
結(jié)果顆粒/FACS＝72 光散射(A320/A260)＝0.26 濃度＝1.66×1013顆粒/ml 本發(fā)明所引用的所有公開出版物、專利和專利申請整體通過引用結(jié)合到本文中，其引用程度與單獨將各個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾堃媒Y(jié)合的程度相同。
對本發(fā)明進行的各種改進和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。本文所述的具體實施方案僅僅作為實例給出，不能認為本發(fā)明受其限制。
權(quán)利要求
1.濃縮病毒制劑的方法，包括
(a)向病毒制劑中加入多羥基烴至多羥基烴終濃度約20％或以上；以及
(b)使所述病毒制劑經(jīng)過一個過濾過程，其中對所述制劑施加壓力，以致通過過濾器從病毒制劑中去除稀釋劑而保留病毒，從而增加病毒濃度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述過濾方法包括超濾。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述過濾方法包括切向流過濾。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒為重組病毒。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒為攜帶有用于基因治療的治療轉(zhuǎn)基因的重組病毒。
6.純化病毒制劑的方法，包括
(a)使病毒制劑經(jīng)過陰離子交換色譜法，其中從陰離子交換色譜法的介質(zhì)中洗脫作為病毒制劑產(chǎn)品的病毒；
(b)向步驟(a)病毒制劑產(chǎn)品中加入多羥基烴，使制劑中的多羥基烴濃度達到約25％或以上；以及
(c)通過對所述制劑施用壓力，以致通過過濾器從病毒制劑中去除稀釋劑而保留病毒，從而提高步驟(b)病毒制劑產(chǎn)品中的病毒的濃度；以及
(d)使步驟(c)的濃縮病毒制劑產(chǎn)品經(jīng)過一次或多次另外的加工步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述另外的加工步驟包括尺寸排阻色譜法。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述步驟(c)的方法包括切向流過濾。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述步驟(c)的方法采用包括PelliconXL過濾系統(tǒng)的裝置來實施。
10.用權(quán)利要求1的方法濃縮的病毒制劑。
11.用權(quán)利要求6的方法純化的病毒制劑。
12.濃縮病毒制劑的方法，包括
(a)低速離心包括如下所述的層的組合物包含35％-80％(v/v)濃度的多羥基烴的第一層，所述第一層上覆蓋含有5％-30％(v/v)濃度的多羥基烴的第二層，第二層上覆蓋含有病毒的第三層；和
(b)從第一層回收所述病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了濃縮病毒制劑的方法，包括向病毒制劑中加入多羥基烴至多羥基烴終濃度約20％或以上，以及使所述病毒制劑經(jīng)過一個過濾過程，其中對所述制劑施加壓力，以致通過濾器從病毒制劑中去除稀釋劑而保留病毒，從而增加病毒濃度。本發(fā)明還公開了純化病毒制劑的方法，以及用本發(fā)明方法濃縮和純化的病毒制劑。
文檔編號C12NGK101164623SQ20071016708
公開日2008年4月23日 申請日期1999年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月17日
發(fā)明者A·弗雷, H·K·H·克萬, V·E·桑德維斯, G·J·維勒坎普, P·-H·袁, 小L·L·邦多克, F·W·波爾特爾四世, J·C·-T·唐, P·伊納特 申請人:先靈公司