專利名稱：一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培養(yǎng)方法
一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培養(yǎng)方法 技術領域i本發(fā)明涉及降解毒性有機污染物的微生物的篩選與培養(yǎng)方法，特別是一株對河道底泥中硝基苯化合物具有特異降解能力的微球菌(M/crococc附 平)的篩選和培養(yǎng)方法。
背景技術：
硝基苯類化合物是美國國家環(huán)?？偸?EPA)優(yōu)先控制污染物名 錄中的典型物質(zhì)，對人體具有顯著的神經(jīng)和消化毒性，雖然硝基苯在生物體內(nèi)一般不會累積，但一些研究結果表明在硝基苯濃度較高的場合，通過食物鏈攝入，可能會導致誘發(fā)惡性腫瘤。因此，采用各種方法嚴格限制環(huán)境介質(zhì)中的硝基苯含 量，對保證人類健康具有重要意義。硝基苯類化合物通^具有一定的揮發(fā)性， 一般由化工、炸藥、制藥等行業(yè)產(chǎn) 生，并隨廢水排放至地表水體，如河流。硝基苯進入河水后，隨著水流紊動，一 部分將揮發(fā)至大氣中，另一部分可吸附在泥沙顆粒上，沉入河道底部，進入河底 污泥層。由于污泥層中的有機質(zhì)含量較高，污泥層內(nèi)的顆粒更加細，因此硝基苯 趨向于與污泥更加牢固地吸附，形成累積。當水力條件適宜時，會重新進入水體， 或逸入大氣，造成生物毒害。硝基苯類化合物的生物降解性較差，傳統(tǒng)上通常采取首先進行臭氧氧化或者 鐵碳微電解方法處理，使硝基苯的苯環(huán)在化學力作用下打開，降低其生物毒性， 然后采用微生物好氧處理的方法進一步降解，使其成為低分子量無害物質(zhì)。這種 方法的優(yōu)點是能確保苯環(huán)開環(huán)，降低硝基苯對微生物的毒性，提高后續(xù)生化處理效率；缺點是流程過長，工藝復雜，成本較高。為了解決傳統(tǒng)處理方法存在的不足，研究者開始嘗試尋求利用特異微生物一 次完成硝基苯降解的新途徑，而實現(xiàn)這一途徑必須要首先解決特異微生物的篩選 與培養(yǎng)問題。河道底泥中的硝基苯形態(tài)穩(wěn)定，不易脫附，為微生物發(fā)揮定向降解 作用提供了較好的條件。但遺憾的是，到目前為止，.尚沒有以河道底泥硝基苯為 降解對象，建立對硝基苯具有特異降解能力的微球菌培養(yǎng)方法的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培養(yǎng) 方法，該方法具有流程短、工藝簡單、和成本低的特點。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先設計一種富集分離培養(yǎng)基，從河道底泥中分離
出一種硝基苯優(yōu)勢降解細菌并進行純化培養(yǎng)，其具體步驟如下1、 配制富集分離培養(yǎng)基富集分離培養(yǎng)基由NaCl、 K2S04、 MgS(V7H20、 維生素B、硝基苯和水組成，pH為7.0-7.2，先準備5個三角瓶，分別標記為A 瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶，每個瓶都裝等量的富集分離培養(yǎng)基，其中NaCl、 K2S04、 MgSCV7H20和維生素B的含量是固定的，它們是(質(zhì)量百分比)0.5% NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04.7H20， 0.01%維生素B，在A瓶、B瓶、C瓶、 D瓶和E瓶中，硝基苯的含量依次為(質(zhì)量百分比)0.5%、 0.4%、 0.3%、 0.2% 和0.1%，水的含量依次為(質(zhì)量百分比):97.69%、 97.79%、 97.89%、 97.99% 和98.09%。然后將富集分離培養(yǎng)基于lirC下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用。2、 富集分離培養(yǎng)首先，按照上述富集分離培養(yǎng)基質(zhì)量的5%取河道底泥， 接種到A瓶中，置28'C-3(TC空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h-48h;培養(yǎng)完成后， 在A瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到B瓶中，置28r-30°?？諝庠≌鹗幣囵B(yǎng)箱中培 養(yǎng)24h - 36h;培養(yǎng)完成后，在B瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到C瓶中，置28°C - 30°C 空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;培養(yǎng)完成后，在C瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到D 瓶中，置28'C - 3(TC空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;培養(yǎng)完成后，在D瓶內(nèi)取 5ml培養(yǎng)液，接種到E瓶中，置28'C-30'C空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。這樣 便獲得最終富集培養(yǎng)液。3、 配制純化培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.1%牛肉膏，0.5%葡 萄糖，0.5%NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04-7H20， 0.01%維生素B, 0.1%硝 基苯，1.5-2.0%瓊脂，95.49% - 95.99%水，pH = 7.0-7.2，于111。C下濕熱滅菌 30min，然后將純化培養(yǎng)基分別傾倒入8個培養(yǎng)皿中，冷卻至常溫，使每個培養(yǎng) 皿底部均形成均勻的薄層凝固層。4、 純化培養(yǎng)a、取富集分離培養(yǎng)得到的最終富集培養(yǎng)液lml接種到一個形 成純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中，置28°C - 30'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h， 在純化培養(yǎng)基表面形成若干乳黃色菌苔；b、選取形態(tài)相同且數(shù)量居多數(shù)的菌苔， 用接種環(huán)挑取微量，在另一個形成純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中劃線，置 28X:-3(TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基表面形成形態(tài)基本相同的菌苔； c、按上述b步驟重復操作6次，最終獲得純菌株，即對硝基苯具有特異降解能 力的微球菌，于4'C保存。5、 配制擴大繁殖培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.2%-0.3%牛肉 膏，0.5% - 1.0%葡萄糖，0.4% - 0.6% NaCl， 0.6% - 0.8% K2S04， 0.3% - 0.6%MgS04.7H20， 0.01%-0.03%維生素B， 96.67% - 97.99%水，pH = 7.0-7.2，置于 三角瓶中，于1lrC下濕熱滅菌30min,冷卻至常溫備用。6、擴大增殖培養(yǎng)a、在無菌條件下，取擴大繁殖培養(yǎng)基200ml置于三角瓶 中；b、用接種環(huán)取兩環(huán)微球菌菌苔，接種于盛有200ml擴大繁殖培養(yǎng)基的三角 瓶中，于28'C -3(TC空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h-48h后，靜置10min，待培 養(yǎng)液中的渾濁物全部沉淀于三角瓶底部后，倒出三角瓶中50ml - 100ml上層清 液；c、在無菌條件下，向該三角瓶中補充與倒出上層清液等體積(50ml-100ml) 的擴大繁殖培養(yǎng)基，置28t:-3(rC空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，所獲培養(yǎng)液 即為擴大增殖的微球菌菌液。本發(fā)明首次從河道底泥中篩選出對硝基苯具有特異降解能力的微球菌。該位 球菌的篩選、分離、純化和擴大培養(yǎng)方法簡單、可靠，各培養(yǎng)基的組分易得、配 制方便。利用所獲微球菌直接降解河道底泥中的硝基苯，可縮短傳統(tǒng)治理工藝流 程、縮減成本，提高效聿，為開發(fā)硝基苯污染河道底泥的原位微生物修復新技術 提供了可能。
具體實施例方式實施例1:1、 配制富集分離培養(yǎng)基準備5個300ml三角瓶，分別標記為A瓶、B瓶、 C瓶、D瓶和E瓶，按組分含量(質(zhì)量百分比，下同)為0.5%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04-7H20、 0.01%維生素B、 97.69%水，pH = 7.0配制 的lOOg富集分離培養(yǎng)基置于A瓶；將組分含量為0.4%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8% K2S04、 0.5%MgSO4'7H2O、 0.01%維生素B、 97.79%水、pH-7.0配制的lOOg 富集分離培養(yǎng)基置于B瓶；將組分含量為0.3%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04'7H20、 0.01%維生素B、 97.89%水、pH = 7.0配制的lOOg富集分 離培養(yǎng)基置于C瓶；將組分含量為0.2%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%維生素B、 97.99%水、pH = 7.0配制的lOOg富集分離培 養(yǎng)基置于D瓶；將組分含量為0.1%硝基苯、0.5% NaCl， 0.8% K2S04、 0.5% MgS04'7H20、 0.01%維生素B、 98.09%水、pH = 7.0配制的lOOg富集分離培 養(yǎng)基置于E瓶。然后將富集分離培養(yǎng)基于lirC下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用o2、 富集分離培養(yǎng)取5g河道底泥，接種于A瓶中，置28'C空氣浴震蕩培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h后，在A瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到B瓶中，置28'C空氣浴震
蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30h后，在B瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到C瓶中，置28'C空氣 浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在C瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到D瓶中，置28" 空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在D瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到E瓶中，置 28'C空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，獲得最終富集培養(yǎng)液。3、 配制純化培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.1%牛肉膏，0.5%葡 萄糖，0.5%NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04.7H20， 0.01%維生素B， 0.1%硝 基苯，1.5%瓊脂，pH = 7.0， 95.99%水，置于lirC下濕熱滅菌30min，在無 菌條件下分別傾倒入8個培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫后，每個培養(yǎng)皿底部均形成均勻 薄凝固層。4、 純化培養(yǎng)a、用移液管量取lml最終富集培養(yǎng)液，接種到一個形成純化 培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中，置28'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基 均勻薄凝固層表面形成若干乳黃色菌苔。b、用接種^"'挑取該培養(yǎng)皿中的數(shù)量居 多的乳黃色菌苔，在另、一個形成純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中劃線，置 28'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層表面形成形態(tài)基本相同 的菌苔。c、按上述b步驟重復操作6次，即可獲得純化的微球菌株，于4。C下 保存。5、 配制擴大繁殖培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.2%牛肉膏，0.5% 葡萄糖，0.4% NaCl， 0.6% K2S04， 0.3% MgS04'7H20， 0.01%維生素B， pH = 7.0， 97.99%水，置于三角瓶中，于1lrC下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用。6、 擴大增殖培養(yǎng)a、在無菌條件下，取擴大繁殖培養(yǎng)基200ml置于三角瓶 中。b、用接種環(huán)取兩環(huán)微球菌苔，接種于上述盛有200ml擴大繁殖培養(yǎng)基的三 角瓶中，置28'C空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h后，靜置10min，待培養(yǎng)液中的渾 濁物全部沉淀于三角瓶底部，倒出50ml上層清液。c、在無菌條件下，向該三角 瓶中補充50ml擴大繁殖培養(yǎng)基，置28'C空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，即獲 得擴大增殖的微球菌菌液。實施例2:1、配制富集分離培養(yǎng)基準備5個300ml三角瓶，分別標記為A瓶、B瓶、 C瓶、D瓶和E瓶，按組分含量(質(zhì)量百分比，下同)為0.5%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04'7H20、 0.01%維生素B、 97.69%水，pH = 7.0配制 的lOOg富集分離培養(yǎng)基置于A瓶；將組分含量為0.4%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8% K2S04、 0.5%MgSO4'7H2O、 0.01%維生素B、 97.79%水、pH-7.0配制的lOOg
富集分離培養(yǎng)基置于B瓶；將組分含量為0.3%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8% K2S04、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%維生素B、 97.89%水、pH = 7.0配制的100g富集分 離培養(yǎng)基置于C瓶；將組分含量為0.2%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%維生素B、 97.99%水、pH = 7.0配制的100g富集分離培 養(yǎng)基置于D瓶；將組分含量為0.1%硝基苯、0.5% NaCl， 0.8% K2S04、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%維生素B、 98.09%水、pH = 7.0配制的100g富集分離培 養(yǎng)基置于E瓶。然后將富集分離培養(yǎng)基于lirC下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用o2、 富集分離培養(yǎng)取5g河道底泥，接種于A瓶中，置3(TC空氣浴震蕩培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，在A瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到B瓶中，置30'C空氣浴震 蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，在B瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到C瓶中，置28'C空氣 浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，在C瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到D瓶中，置28'C 空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在D瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到E瓶中，置 28'C空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，獲得最終富集培養(yǎng)液。3、 配制純化培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.1%牛肉膏，0.5%葡 萄糖，0.5%NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04'7H20， 0.01%維生素B， 0.1%硝 基苯，2.0%瓊脂，pH = 7.2， 95.49%水，置于lirC下濕熱滅菌30min，在無 菌條件下分別傾倒入8個培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫后，每個培養(yǎng)皿底部均形成均勻 薄凝固層。4、 純化培養(yǎng)a、用移液管量取lml最終富集培養(yǎng)液，接種到一個形成純化 培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中，置3(TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基 均勻薄凝固層表面形成若干乳黃色菌苔。b、用接種針挑取該培養(yǎng)皿中的數(shù)量居 多的乳黃色菌苔，在另一個形成純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中劃線，置 3(TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層表面形成形態(tài)基本相同 的菌苔。c、按上述b步驟重復操作6次，即可獲得純化的微球菌株，于4。C下 保存。5、 配制擴大繁殖培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.3%牛肉膏，1.0% 葡萄糖，0.6% NaCl， 0.8% K2S04, 0.6% MgS04'7H20， 0.03%維生素B， pH = 7.2， 96.67%水，置于三角瓶中，于1lrc下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用。6、 擴大增殖培養(yǎng)a、在無菌條件下，取擴大繁殖培養(yǎng)基200ml置于三角瓶 中。b、用接種環(huán)取兩環(huán)微球菌苔，接種于上述盛有200ml擴大繁殖培養(yǎng)基的三
角瓶中，置30'C空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，靜置10min，待培養(yǎng)液中的渾 濁物全部沉淀于三角瓶底部，倒出100ml上層清液。c、在無菌條件下，向該三 角瓶中補充100ml擴大繁殖培養(yǎng)基，置3(TC空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后， 即獲得擴大增殖的微球菌菌液。
權利要求
1、一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培養(yǎng)方法，其特征是本發(fā)明首先設計一種富集分離培養(yǎng)基，從河道底泥中分離出一種硝基苯優(yōu)勢降解細菌并進行純化培養(yǎng)，其具體步驟如下(1)、配制富集分離培養(yǎng)基富集分離培養(yǎng)基由NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O、維生素B、硝基苯和水組成，pH為7.0-7.2，先準備5個三角瓶，分別標記為A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶，每個瓶都裝等量的富集分離培養(yǎng)基，其中NaCl、K2SO4、MgSO4.7H2O和維生素B的含量是固定的，它們是(質(zhì)量百分比)0.5％NaCl，0.8％K2SO4，0.5％MgSO4·7H2O，0.01％維生素B，在A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶中，硝基苯的含量依次為(質(zhì)量百分比)0.5％、0.4％、0.3％、0.2％和0.1％，水的含量依次為(質(zhì)量百分比)97.69％、97.79％、97.89％、97.99％和98.09％，然后將富集分離培養(yǎng)基于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用；(2)、富集分離培養(yǎng)首先，按照上述富集分離培養(yǎng)基質(zhì)量的5％取河道底泥，接種到A瓶中，置28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h-48h；培養(yǎng)完成后，在A瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到B瓶中，置28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h-36h；培養(yǎng)完成后，在B瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到C瓶中，置28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；培養(yǎng)完成后，在C瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到D瓶中，置28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；培養(yǎng)完成后，在D瓶內(nèi)取5ml培養(yǎng)液，接種到E瓶中，置28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。這樣便獲得最終富集培養(yǎng)液；(3)、配制純化培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.1％牛肉膏，0.5％葡萄糖，0.5％NaCl，0.8％K2SO4，0.5％MgSO4·7H2O，0.01％維生素B，0.1％硝基苯，1.5-2.0％瓊脂，95.49％-95.99％水，pH＝7.0-7.2，于111℃下濕熱滅菌30min，然后將純化培養(yǎng)基分別傾倒入8個培養(yǎng)皿中，冷卻至常溫，使每個培養(yǎng)皿底部均形成均勻的薄層凝固層；(4)、純化培養(yǎng)a、取富集分離培養(yǎng)得到的最終富集培養(yǎng)液1ml接種到一個形成純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中，置28℃-30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基表面形成若干乳黃色菌苔；b、選取形態(tài)相同且數(shù)量居多數(shù)的菌苔，用接種環(huán)挑取微量，在另一個形成純化培養(yǎng)基均勻薄凝固層的培養(yǎng)皿中劃線，置28℃-30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在純化培養(yǎng)基表面形成形態(tài)基本相同的菌苔；c、按上述b步驟重復操作6次，最終獲得純菌株，即對硝基苯具有特異降解能力的微球菌，于4℃保存；(5)、配制擴大繁殖培養(yǎng)基其組分和含量為(質(zhì)量百分比)0.2％-0.3％牛肉膏，0.5％-1.0％葡萄糖，0.4％-0.6％NaCl，0.6％-0.8％K2SO4，0.3％-0.6％MgSO4·7H2O，0.01％-0.03％維生素B，96.67％-97.99％水，pH＝7.0-7.2，置于三角瓶中，于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻至常溫備用；(6)、擴大增殖培養(yǎng)a、在無菌條件下，取擴大繁殖培養(yǎng)基200ml置于三角瓶中；b、用接種環(huán)取兩環(huán)微球菌菌苔，接種于盛有200ml擴大繁殖培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h-48h后，靜置10min，待培養(yǎng)液中的渾濁物全部沉淀于三角瓶底部后，倒出三角瓶中50ml-100ml上層清液；c、在無菌條件下，向該三角瓶中補充與倒出上層清液等體積(50ml-100ml)的擴大繁殖培養(yǎng)基，置28℃-30℃空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，所獲培養(yǎng)液即為擴大增殖的微球菌菌液。
全文摘要
一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培養(yǎng)方法，本發(fā)明首先設計一種富集分離培養(yǎng)基，從河道底泥中分離出一種硝基苯優(yōu)勢降解細菌并進行純化培養(yǎng)，其具體步驟為1.配制富集分離培養(yǎng)基；2.富集分離培養(yǎng)；3.配制純化培養(yǎng)基；4.純化培養(yǎng)；5.配制擴大繁殖培養(yǎng)基；6.擴大增殖培養(yǎng)。本發(fā)明首次從河道底泥中篩選出對硝基苯具有特異降解能力的微球菌。該位球菌的篩選、分離、純化和擴大培養(yǎng)方法簡單、可靠，各培養(yǎng)基的組分易得、配制方便。利用所獲微球菌直接降解河道底泥中的硝基苯，可縮短傳統(tǒng)治理工藝流程、縮減成本，提高效率，為開發(fā)硝基苯污染河道底泥的原位微生物修復新技術提供了可能。
文檔編號C12N1/20GK101210229SQ20071015825
公開日2008年7月2日 申請日期2007年11月13日 優(yōu)先權日2007年11月13日
發(fā)明者孫鐵珩, 李曉東, 李海波, 楊瑞崧 申請人:沈陽大學