專利名稱：一種利用重組釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程和基因工程領(lǐng)域，尤其是使用重組釀酒酵母將秸稈等纖維質(zhì)原料經(jīng) 同步酶水解一發(fā)酵轉(zhuǎn)化為纖維素乙醇的的方法，所述的重組釀酒酵母可分泌三種纖維素酶。
二背景技術(shù)：
2006年6月，我國出臺《可再生能源發(fā)展專項資金管理暫行辦法》，明確重點扶持發(fā)展 以秸桿等非糧食資源制取的生物乙醇燃料。開發(fā)替代糧食資源生產(chǎn)纖維乙醇，是解決燃料乙 醇原料成本高的根本出路。
纖維素酶成本是制約纖維乙醇商業(yè)化進程的關(guān)鍵因素。而秸桿等纖維質(zhì)原料中的纖維 素、半纖維素不但被木質(zhì)素包裹，而且半纖維素部分共價和木質(zhì)素結(jié)合。因此，需要纖維素 酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶三種酶系的協(xié)同作用，解除半纖維素和木質(zhì)素包裹后，才能徹底 分解纖維素，將其最大限度的降解為可發(fā)酵糖。生產(chǎn)纖維乙醇，通常要進行預(yù)處理以除去半 纖維素和木質(zhì)素，以提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。因此，降低纖維乙醇成本，有以下措施(l)尋 求有效的方法低成本、大批量生產(chǎn)纖維素酶，降低酶成本；(2)提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。
目前，以秸稈等纖維質(zhì)原料生物法生產(chǎn)燃料乙醇的工藝中，應(yīng)用較多的是先糖化后發(fā)酵 (SHF)工藝和同步糖化發(fā)酵(SSF)工藝。但無論SHF還是SSF工藝，都需要先生產(chǎn)纖維素酶并進 行酶的分離純化，這勢必增加乙醇的生產(chǎn)成本，從而限制了SHF和SSF工藝在纖維乙醇工業(yè)化 生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。此外，還有固定化細胞發(fā)酵工藝，研究最多的是酵母和運動發(fā)酵單胞 菌的固定化，雖然此工藝具有細胞可連續(xù)使用、最終發(fā)酵液乙醇濃度高等優(yōu)點，但也不能解 決纖維素酶成本高的問題。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改造微生物，得到 新的高比活力的重組型纖維素酶，為大量生產(chǎn)纖維素酶提供了可能。纖維素酶基因在大腸桿 菌中可以有效表達，然而，細菌分泌的纖維素酶只在胞質(zhì)中不釋放到胞外，使提取、純化困 難。另外，許多真菌和細菌的纖維素酶是糖基化的，使在大腸桿菌中表達更趨復(fù)雜。于是， 人們把注意力轉(zhuǎn)移到了酵母。酵母為真核表達系統(tǒng)，且不產(chǎn)生毒素，用其表達纖維素酶基因, 其產(chǎn)物高度糖基化,表達水平高,而且產(chǎn)物直接分泌至胞外。
釀酒酵母是工業(yè)生產(chǎn)乙醇的理想菌株，對乙醇的耐受性強，可以同時表達多基因，而且 酵母是真核細胞，能夠?qū)Ρ磉_的外源蛋白進行糖基化。目前，以釀酒酵母作為表達宿主，構(gòu) 建重組型纖維素酶方面，已經(jīng)成功的實現(xiàn)了兩種纖維素酶基因在同一釀酒酵母中的表達。如 日本學(xué)者Akihiko Kondo成功的將葡聚糖內(nèi)切酶基因和P-葡萄糖苷酶基因同時轉(zhuǎn)入釀酒酵
母，構(gòu)建了一種能夠同時表達兩種纖維素酶的酵母工程菌。該工程菌可降解e-葡聚糖生產(chǎn)
乙醇，培養(yǎng)基中e-葡聚糖的含量為45g/L時，發(fā)酵48h后乙醇的產(chǎn)量為16.5g/L。其缺點是由
3于僅表達了2種纖維素酶，該工程菌只能以葡聚糖為底物而不能直接利用纖維素。國內(nèi)有關(guān) 將纖維素酶基因在釀酒酵母菌中表達的報道較少。只有山東大學(xué)的汪天虹教授在這一方面進 行了開創(chuàng)性的工作，將已構(gòu)建的攜帶egl的質(zhì)粒pRS415ME轉(zhuǎn)化釀酒酵母H158，獲得表達胞外 內(nèi)切葡聚糖酶的重組酵母菌株Hlm;隨后將攜帶cbhl的質(zhì)粒pAJ401-cbhl轉(zhuǎn)入Hlm中,構(gòu)建了 同時分泌表達egl和cbhl的重組酵母菌株HMEPC， HMEPC對纖維素底物濾紙和麥芽汁的降 解利用程度均比Hlm有所提高。但是通過共轉(zhuǎn)化的方式構(gòu)建多基因纖維素酶重組釀酒酵母的 過程比較煩瑣，工作量大，時間長。
上述在釀酒酵母中表達纖維素酶的研究，為"只用一種微生物(而無需添加纖維素酶) 直接轉(zhuǎn)化纖維素生產(chǎn)乙醇工藝"展示了良好的前景。但目前的研究局還只是限于將2種纖維
素酶基因葡聚糖內(nèi)切酶基因和e-葡萄糖苷酶基因進行了表達，由此獲得的重組釀酒酵母
還不能直接以纖維素為原料生產(chǎn)葡萄糖，并原位生產(chǎn)乙醇。主要原因是纖維素酶是一種多組 分的復(fù)合酶，包括葡聚糖內(nèi)切酶(EG)，葡聚糖外切酶(或稱纖維二糖水解酶)(CHB)和 e-葡聚糖苷酶(BG)等3種主要組分。在天然纖維素水解成葡萄糖的過程中，必須依靠3種 酶的協(xié)同作用才能完成。
因此，將三個纖維素酶基因同時轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，構(gòu)建一種能同時分泌三種纖維素酶的 釀酒酵母工程菌，直接將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，并同時將其發(fā)酵為乙醇。對于降低纖維乙醇 生產(chǎn)成本，促進纖維乙醇的工業(yè)化進程具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用重組釀酒酵母同步酶水解一發(fā)酵秸稈等纖維質(zhì)原料生產(chǎn) 纖維素乙醇的方法。所述的重組釀酒酵母可分泌三種纖維素酶葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖水
解酶、e-葡聚糖苷酶。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
(1) 構(gòu)建重組表達載體
將葡聚糖內(nèi)切酶基因egl、纖維二糖水解酶基因cbhl和e -葡聚糖苷酶基因bglc與合適 的載體和啟動子連接，構(gòu)建成三基因重組表達載體；
其中所述的質(zhì)粒載體選自pYEX-BX (7. lkb)、 Y印lacl95 (5.24kb)，進一步的各質(zhì)粒 載體所含的選擇性標記選自(1) Ampr， URA3和leu2三個選擇標記和(2) Kanr和圃 兩個選擇標記。
(2) 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母；
(3) 進行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選 利用重組子本身帶有的抗生素抗性基因或者是氨基酸、尿嘧啶缺陷的選擇性培養(yǎng)基進行
篩選。其次，進行PCR檢測、Southern blot對選擇出的菌株進一步鑒定篩選，最終篩選出 同時含有三個纖維素酶基因的釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子。
(4) 重組釀酒酵母同步酶水解發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇應(yīng)用上述重組釀酒酵母，以秸桿等纖維質(zhì)為原料，采用同步酶水解一發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn) 纖維素乙醇。
本發(fā)明的優(yōu)點在于
(1) 本發(fā)明的重組釀酒酵母，可同時分泌三種纖維素酶到胞外，即葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、 纖維二糖水解酶(CHB)和e-葡聚糖苷酶(BG);
(2) 本發(fā)明的重組釀酒酵母，可將纖維素直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖，同時將葡萄糖原位轉(zhuǎn)化成乙 醇；
(3) 本發(fā)明的一種用重組釀酒酵母直接轉(zhuǎn)化秸稈等纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的方法，可實現(xiàn)只 用一種微生物，無需另外加入纖維素酶就可一步直接將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇；
(4) 本發(fā)明的一種用重組釀酒酵母直接轉(zhuǎn)化秸稈等纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的方法，可以大幅 度降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，推動纖維素乙醇替代石油燃料的進程，具有廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。
具體實施例方式
實施例l纖維素酶重組釀酒酵母l
載體pYEX-BX (7. lkb)(含有Ampr， URA3和leu2三個選擇標記)、3-磷酸甘油醛脫氫 酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、信號肽編碼序列采用T. reesei中的木聚糖酶 基因的信號肽序列(XYNSEC )，構(gòu)建重組表達載體I,其表達序列框為 GAPDHp-XYNSEC-cbhl-GAPDHT-GAPDHP-XYNSEC-egl- GAPDH「GAPDHp - GLUSEC-bglc-GAPDHt，命 名為pYEX-BX-GAPDH-EchBl。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母S. cerevisiae MT8-1中；根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細 胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如 果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上 將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是 否同時含有egl，cbhl和bglc三個纖維素酶基因，最終篩選出同時含有三種纖維素酶基因的 釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子。 實施例2纖維酶重組釀酒酵母2
載體pYEX-BX (7. lkb)(含有A即r， URA3和leu2三個選擇標記)、磷酸甘油酸激酶基 因啟動子(PGKp)和終止子(PGKt)、信號肽編碼序列采用T. reesei中的木聚糖酶基因的信 號肽序列(XYNSEC )，構(gòu)建重組表達載體II，其表達序列框為 PGKp-XYNSEC-cbhl-PGK廠PGK廠XYNSEC-egl-PGK廠PGKp —PGK廠GLUSEC -bglc— PGKT，命名為 pYEX-BX-PGK-EchBl;采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母S. cerevisiae MT8-1中；根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細 胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如 果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是
否同時含有egl，cbhl和bglc三個纖維素酶基因，最終篩選出同時含有三種纖維素酶基因的
釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子。
實施例3纖維素酶重組釀酒酵母3
載體Y印lacl95 (5. 24kb)(含有Kanr和URA3兩個選擇標記)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基 因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt) 、 Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信號肽 (GLUSEC), 構(gòu)建重組表達載體III ,其表達序列框為 GAPDHp-XYNSEC-cbhl-GAPDHt-GAPDHp-XYNSEC-eg1-GAPDH廣GAPDHp - GLUSEC_bglc-GAPDHT，命 名為Y印lac-GAPDH-EchBl。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母S. cerevisiae MT8-1中；根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細 胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如 果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上 將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是 否同時含有egl,cbhl和bglc三個纖維素酶基因，最終篩選出同時含有三種纖維素酶基因的 釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子。
實施例4重組釀酒酵母轉(zhuǎn)化玉米秸桿生產(chǎn)乙醇
(1) 秸桿預(yù)處理
取玉米秸桿200g，粉碎，過20目篩，加入0.5%硫酸1.2L，在15(TC處理20h，再轉(zhuǎn)入 5L反應(yīng)器，蒸汽加熱1. 5rain至壓強達15bar,維持10min，冷卻，至壓力為2 bar。取出秸 桿原料，用50。C水洗滌5次，過濾，得120g處理后的玉米秸桿，備用。
(2) 菌種培養(yǎng)
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件葡萄糖，20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3; pH 5.5 ，溫度30士1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件葡萄糖，50;酵母浸膏，5; (NH4)S04, 7.5; K2HP04, 3.5; MgS04 . 7H20， 0.75;CaCl2 . 2H20， 1M檸檬酸緩沖液，pH5.5±0.1， 35±0.5°C,培養(yǎng)30 h , 轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量按每100ml轉(zhuǎn)化液接種1.0g菌體(以干菌體計)
(3) 秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
發(fā)酵液組成(g/1):酵,浸膏，5; (NH4)2S04, 7.5; K2HP04， 3.5; MgS04 7H2O，0.75; CaCl2.2H20，l;預(yù)處理的秸桿，50, 0.05M檸檬酸緩沖液，置250ml搖瓶中，用2MNaOH調(diào) pH5滅l。
發(fā)酵液滅菌后，加入重組釀酒酵母菌種1.0g (以干菌體計)、0.1 gTween 80(1 g/1)，發(fā)酵 液總體積為100ml，在38。C，通氮氣，厭氧發(fā)酵48-60h，乙醇濃度達10.2g/L。 實施例5重組釀酒酵母轉(zhuǎn)化稻草秸桿生產(chǎn)乙醇
(1)秸桿預(yù)處理取稻草150g,粉碎，過20目篩，加入0.5%硫酸1.2L，在150。C處理20h，再轉(zhuǎn)入5L反 應(yīng)器，蒸汽加熱1. 5min至壓強達15bar，維持10min,冷卻，至壓力為2 bar。取出秸桿原 料，用50。C水洗滌5次，過濾，得105g處理后的稻草秸桿，備用。
(2) 菌種培養(yǎng)
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件葡萄糖,20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3; pH 5.5 ，溫度30士1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件葡萄糖,50;酵母浸膏，5; (NH4)S04, 7.5; K2HP04， 3.5; MgS04 . 7H20, 0.75;CaCl2 . 2H20, 1M擰檬酸緩沖液，pH5.5±0.1, 35±0.5°C,培養(yǎng)30 h , 轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量按每100ml轉(zhuǎn)化液接種1.0g菌體(以干菌體計)
(3) 秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
發(fā)酵液組成(g/1):酵母浸膏，5; (NH4)2S04, 7.5; K2HP04, 3.5; MgS04 7H2O,0.75; CaCl2 *2H20， 1;預(yù)處理的稻草秸桿,50， 0.05M檸檬酸緩沖液，置250ml搖瓶中，用2MNaOH 調(diào)pH5.0土0.1。
發(fā)酵液滅菌后，加入重組釀酒酵母菌種1.0g (以干菌體計)、0.1 g Tween 80(1 g/l)，發(fā)酵 液總體積為100ml，在38。C，有氧發(fā)酵24-48h,乙醇濃度達7.82g/L。
權(quán)利要求
1. 一種利用重組釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，其特征在于重組釀酒酵母產(chǎn)生的3種纖 維素酶(葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、纖維二糖水解酶(CHB)和e-葡聚糖苷酶(BG))可 將纖維質(zhì)原料酶解為葡萄糖，并由重組釀酒酵母原位發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇。
2. 權(quán)利要求1所述的重組酵母，其特征在于該酵母含有引入的能編碼葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖水解酶、e-葡聚糖苷酶的基因；
3. 權(quán)利要求1所述的重組酵母，其特征在于該酵母是釀酒酵母屬的；
4. 權(quán)利要求2所述的重組酵母,其特征在于可同時分泌三種纖維素酶:葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、 纖維二糖水解酶(CHB)和e-葡聚糖苷酶(BG)。
5. 權(quán)利要求3所述的重組酵母，其特征在于能有效的將秸稈等纖維質(zhì)原料直接轉(zhuǎn)化成乙醇；
6. 權(quán)利要求4所述的將纖維質(zhì)原料直接轉(zhuǎn)化成乙醇的過程包括重組酵母將秸稈轉(zhuǎn)化成葡 萄糖，并同時將葡萄糖發(fā)酵成乙醇；
7. 獲得能有效的將纖維素直接轉(zhuǎn)化成乙醇的重組釀酒酵母的方法是將葡聚糖內(nèi)切酶基因、纖維二糖水解酶基因、e-葡聚糖苷酶基因與合適的質(zhì)粒載體及啟動子連接，構(gòu)建成3基因重組表達載體，轉(zhuǎn)化釀酒酵母；
8. 權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒載體，其特征在于含有Ampr， URA3和leu2三個選擇性標記；
9. 權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒載體，其特征在于含有Kanr和URA3兩個選擇性標記
10. 權(quán)利要7所述的方法，其中啟動子選自3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)、磷 酸甘油酸激酶基因啟動子(PGKp)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用重組釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的方法。其特征在于將編碼葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、纖維二糖水解酶(CHB)和β-葡聚糖苷酶(BG)的基因與合適的載體和啟動子連接，構(gòu)建成三基因重組表達載體，再轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得可同時表達三種纖維素酶的釀酒酵母工程菌。該釀酒酵母工程菌可將纖維素直接高效轉(zhuǎn)化成葡萄糖，并同時將葡萄糖原位轉(zhuǎn)化成乙醇。本發(fā)明的優(yōu)點在于以纖維素為原料，無需另外加入纖維素酶，利用該釀酒酵母工程菌可實現(xiàn)纖維素原料的同步酶水解-發(fā)酵從而生產(chǎn)乙醇，可大幅度降低纖維乙醇的生產(chǎn)成本，推動纖維乙醇替代石油燃料的進程。
文檔編號C12P7/10GK101311271SQ20071010768
公開日2008年11月26日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者劉均洪, 劉海洲, 吳小飛, 吳汝林, 烽 宿, 張媛媛, 李俊峰, 李鳳梅, 王繁業(yè), 蘇忠亮, 邵宏波 申請人:青島科技大學(xué)