專利名稱：螺旋藻工廠化培植優(yōu)良品系的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬于篩選優(yōu)質螺旋藻的技術。
技術背景螺旋藻(&/ra//"a)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋的原核絲狀微藻，系藍藻門 (Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學研 究，1997, 15(4): 369-374]。因富含優(yōu)質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外的極大關注，并 己在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，成為目前全球研究開發(fā)規(guī)模最大，應用前 景最廣泛的經(jīng)濟微藻。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產(chǎn)實踐表明，螺旋藻不同 品種(系)，對溫度、光質、光照強度，以及培養(yǎng)液的鹽度、pH和營養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要 求與適應性存在顯著差異，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟效益也相差甚遠[水生生物學報，1999, 23(1): 59-64]。因此，與其它農業(yè)與生物技術產(chǎn)業(yè)一樣，選育品性兼優(yōu)的品種(系)是有效提升當 前螺旋藻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益、切實解決生產(chǎn)實際問題，最直接而重要的途徑之一。目前國內外篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)螺旋藻品種(系)的一般常規(guī)方法如下1、對新分離到 的品種(系)進行編號；2、在實驗室條件下作多種環(huán)境因子的交叉組合培養(yǎng)試驗，并根據(jù)所 測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標作初步篩選；3、對實驗室初篩到有生產(chǎn)養(yǎng)殖潛 力的候選品種(系)在不同季節(jié)、氣候及營養(yǎng)條件下進行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗，再 篩選出目標品種(系)。這一方法雖然實用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。 因此，有必要建立簡單、快速、有效的評價與篩選方法，以滿足當前國內外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷 發(fā)展的實際需要。發(fā)明內容本發(fā)明目的是提供一種簡單、快速、有效、低成本的篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質螺旋藻 品系的新方法。藻藍蛋白連接多肽I為藍藻等少數(shù)藻類所特有，在藻膽體的組裝過程中起著至關重要的 作用(Yu"a/., 1982; Mac Coll，1998)'。我們通過設計特定引物，利用PCR等分子生物學技 術克隆并測定了 7株螺旋藻品系Sp-l、 Sp-2、 Sp-3、 Sp-4、 Sp-5、 Sp-6和Sp-7的相應基因序 列，并利用DNAStar v6.13軟件將該基因翻譯成氨基酸后進行多重序列聯(lián)配。依據(jù)相似性程 度，7株品系可以分為兩大類即Sp-l、 Sp-2和Sp-6為一類；Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7為另一類。在這兩大類品系中，同一大類內部品系間序列基本相同，而在不同大類品系間差異 主要表現(xiàn)在1 80位氨基酸序列的第7、 20、 30、 56、 72位點。經(jīng)過長期大量的實驗研究與 生產(chǎn)實踐表明，Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7這4株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而Sp-l、 Sp-2和Sp-6因適應能力差而不用于工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。研究證明，螺旋藻的藻藍蛋白連接多肽 I氨基酸序列特征與生產(chǎn)性狀存在相關性，其第1 80位氨基酸序列可用作優(yōu)質螺旋藻品系篩 選的分子標記。即候選品系的第1 80位氨基酸序列的第7、 20、 30、 56、 72位點若與Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7的相同，則生產(chǎn)性狀優(yōu)良，可應用于大規(guī)模生產(chǎn)；若與Sp-l、 Sp-2和Sp-6 的一致，則生產(chǎn)性狀差，不用于工廠化生產(chǎn)。 本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明所建的篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質螺旋藻品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單、 快速、有效，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。 具體實施方本發(fā)明的詳細技術方案可以通過以下步驟實施1、 選用材料為公知的7株螺旋藻品系，即Sp-l、 Sp-2、 Sp-3、 Sp-4、 Sp-5、 Sp-6和Sp-7(浙江大學原子核農業(yè)科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存)。其中，Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7對環(huán)境適應能力強，在大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應用，而Sp-l、 Sp-2和Sp-6 因適應能力差而不用于工廠化生產(chǎn)。2、 試劑和儀器r呵DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；克隆載體pMD18-T、 dNTP、 DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶、RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回 收試劑盒購于Invitrogen公司；PCR引物由上海英駿公司合成。其它試劑均為分析純。序列 擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀。3、 PCR引物設計與擴增引物根據(jù)GenBank上相應的序列AF164139,利用Primer 5.0引物設計軟件得到上游引物 PF: 5，-TTTAGCAGAAGCAAGTCGCC-3,，下游引物PR: 5'-CGTATTATCGGTAGTCATCGG -3，。 25pL PCR反應體系中含引物PF和PR各O.5pmol/L， 4種dNTP各lpmol/L， 2.5U的 T叫DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2.5^L， lOOng基因組DNA[提取方法參考——浙江 大學學報.2002, 28 (5): 533~536]。 PCR反應程序為94°C 5 min; 94°C 30 s， 65°C 1.5 min， 72°C 3min， 30個循環(huán)；最后72°C延伸8 min。4、 PCR產(chǎn)物的克隆及測序將經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉化感受態(tài) Eco"TGl，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質粒 進行測序。5、序列翻譯與多重聯(lián)配采用DNAStar v1.63軟件將藻藍蛋白連接多肽I基因序列翻譯成氨基酸序列，并利用 ClustalX1.81軟件對所得序列進行多重聯(lián)配。經(jīng)過比對，如果被篩選的螺旋藻品系的第1 80 位氨基酸序列的第7、 20、 30、 56、 72位點與Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7品系相同，則可能生 產(chǎn)性狀優(yōu)良，適合大規(guī)模生產(chǎn)。結果與分析藻藍蛋白連接多肽I前80位氨基酸序列多重聯(lián)配Sp-l、 Sp-2、 Sp-3、 Sp-4、 Sp-5、 Sp-6和Sp-7的基因組DNA分別經(jīng)藻藍蛋白連接多肽I 基因序列的特定引物PCR擴增與克隆，測得相應序列后利用DNAStar v1.63軟件翻譯成氨基 酸序列，ClustalX 1.81軟件的多重序列聯(lián)配結果如SeqNO.l所示。長期的實驗研究與生產(chǎn)實踐表明，Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7這4品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中 表現(xiàn)優(yōu)良，而Sp-l、 Sp-2和Sp-6因適應能力差而不能用作工廠化生產(chǎn)。由此可見，藻藍蛋 白連接多肽I氨基酸序列特征與螺旋藻生產(chǎn)性狀存在相關性，因此，第1 80位氨基酸序列 可以作為優(yōu)質螺旋藻品系篩選的分子標記，即候選品系的第1 80位氨基酸序列的第7、 20、 30、 56、 72位點若與Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7的相同，則可能生產(chǎn)性狀優(yōu)良，適合大規(guī)模 生產(chǎn)；若與Sp-l、 Sp-2和Sp-6的一致，則可能不可工廠化生產(chǎn)。作為實例，如SeqN0.2所示，我們選取了 Sp-8、 Sp-9和Sp-lO這3株品系來驗證本發(fā)明 的實用性。其中，Sp-9和Sp-10是適用于大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖的良種，而Sp-8品系因適應性差而 不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。通過克隆并測定這3株品系的藻藍蛋白連接多肽I基因序列，利用 DNAStar v1.63軟件翻譯成氨基酸序列，ClustalX 1.81軟件的多重序列聯(lián)配結果如SeqNO.2所 示。Sp-9和Sp-10的第1 80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列的第7、 20、 30、 56、 72位 點與Sp-3、 Sp-4、 Sp-5和Sp-7的相同，而Sp-8的第1 80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序 列的第7、 20、 30、 56、 72位點與Sp-l、 Sp-2和Sp-6的完全一致。上述結果進一步說明， 第1 80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列可以作為一種分子標記來篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的 優(yōu)質螺旋藻品系。SeqNO.l 7株螺旋藻品系第1 80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列的多重聯(lián)配結果其中Sp-l、 Sp-2、 Sp-6這3株品系與Sp-3、 Sp-4、 Sp-5、 Sp-7兩兩之間的差異位點被標 下劃線；"*"表示7株品系的第1 80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列的相同位點。1020304050Sp-lMAITTQASRLGTTAFQESSLVELRP麗SR2NAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-2MAITTQASRLGTTAFQESS^VELRPNWSR2NAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-6MAITTQASRLGTTAFQESS^VELRPNWSRQNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-3MAITTQSSRLGTTAFQESS￡VELRPNWSRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-4MAITTQSSRLGTTAFQESS￡VELRPNWSRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-5MAITTQ旦SRLGTTAFQESS￡VELRPNWSRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-7MAITT卿RLGTTAFQESS￡ 承承求承承*承*承VELRP而SRg 承氺承氺)|:*9):*承NAQEVIRAVY 承承承承**承*承承RQLLGNgYLM607080Sp-lSSERLISAESLLCDGSITVRE^VRCVAKSESp-2SSERLISAESLLCDGSITVRE^VRCVAKSESp-6SSERLISAESLLCDGSITVRE^VRCVAKSESp-3SSER14SAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSESp-4SSERUSAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSESp-5SSERI^SAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSESp-7SSERI4SAESIX旦DGSITVRE￡VRCVAKSESeqNO.2 10株螺旋藻品系第1 80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列的多重聯(lián)配結果1020304050Sp-9MAITTQ厶SRLGTTAFQESSLVELRP證SRQNAQE厶IRAIYRQLLGNDYLMSp-10MAITTQASRLGTTAFQESSLVELRP麗SR2NAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-lMAITTQASRLGTTAFQESSLVELRP麗SR2NAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-2MAITTQ4SRLGTTAFQESS)LVELRP麗SRQNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-6MAITTQASRLGTTAFQESSLVELRPNWSR2NAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-3MAITT吸SRLGTTAFQESS￡VELRP麗SRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-4MAITTQ旦SRLGTTAFQESSfVELRP麗SRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-5MAITTQ^SRLGTTAFQESS￡VELRP麗SRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-7MAITTQ旦SRLGTTAFQESSEVELRPNWSRgNAQEVIRAVYRQLLGNDYLMSp-8MAITTQ,LGTTAFQESS￡VELRP酵SRgNAQEVIRAVY 承)！氺承承承3lei)e承承RQLLGNDYLM60 70 80Sp-9SSERLISAESLLCDGSITVREFVRCVAKSESp-10SSERLISAESLLCDGSITVREFVRCVAKSESp-lSSERLISAESLLCDGSITVREFVRCVAKSESp-2SSERLISAESLLCDGSITVREFVRCVAKSESp-6SSERLISAESLLCDGSITVREFVRCVAKSESp-3SSERLISAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSESp-4SSERUSAESIXCDGSI旦VRE￡VRCVAKSESp-5SSERX!SAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSESp-7SSERLISAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSESp-8SSERI^SAESLLCDGSITVRE￡VRCVAKSE
權利要求
1. 一種篩選用于螺旋藻工廠化培植的優(yōu)良品系的方法，其特征是將7株螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-4、Sp-5、Sp-6、Sp-7分成兩類，一類是Sp-1、Sp-2和Sp-6，另一類是Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7；與候選螺旋藻品系的第1～80位藻藍蛋白連接多肽I氨基酸序列，按SeqNO.1的第7、20、30、56、72位點進行多重比對，比對結果，如與前一類相同，其性狀為劣質；如與后一類相同則其性狀為優(yōu)質。
2、 按權利要求l所述篩選優(yōu)質螺旋藻品系的方法，具體采用下列操作步驟(1) 選用材料為7株螺旋藻品系，即Sp-l、 Sp-2、 Sp-3、 Sp-4、 Sp-5、 Sp-6和Sp-7;(2) 試劑和儀器r叫DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；克隆載體pMD18-T、 dNTP、 DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶、RNase A均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回 收試劑盒購于Invitrogen公司；PCR引物由上海英駿公司合成，其它試劑均為分析純，序列 擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀；(3) PCR引物設計與擴增引物根據(jù)GenBank上相應的序列AF164139,利用Primer 5.0引物設計軟件得到上游引物 PF: 5，-TTTAGCAGAAGCAAGTCGCC-3，，下游引物PR: 5，-CGTATTATCGGTAGTCATCGG -3，， 25pLPCR反應體系中含引物PF和PR各0.5nmol/L， 4禾中dNTP各lnmol/L， 2.5U的 7^ DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2.5nL， lOOng基因組DNA， PCR反應程序為94°C 5 min; 94。C30s， 65。C1.5min， 72°C 3 min， 30個循環(huán);最后72°C延伸8 min;(4) PCR產(chǎn)物的克隆及測序將經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉化感受態(tài) co//TGl，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質粒進行測序；(5)序列翻譯與多重聯(lián)配 采用DNAStar vl.63軟件將藻藍蛋白連接多肽I基因序列翻譯成氨基酸序列，并利用 ClustalX 1.81軟件對所得序列進行多重聯(lián)配。
全文摘要
一種篩選螺旋藻工廠化培植優(yōu)良品系的方法。通過設計特定引物，利用PCR等分子生物學方法克隆并測定了7株螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-4、Sp-5、Sp-6和Sp-7的相應基因序列，并利用DNAStar v6.13軟件將該基因翻譯成氨基酸后進行多重序列聯(lián)配發(fā)現(xiàn)，根據(jù)1～80位氨基酸序列的第7、20、30、56、72位點，7株品系可以分為兩大類其中Sp-1、Sp-2和Sp-6為一類；Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7為另一類；將候選品系的第1～80位氨基酸序列進行比對，若與Sp-3、Sp-4、Sp-5和Sp-7品系相同，則可能生產(chǎn)性狀優(yōu)良，適合大規(guī)模生產(chǎn)；若與Sp-1、Sp-2和Sp-6品系一致，則可能不可用于工廠化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/12GK101240242SQ20071006996
公開日2008年8月13日 申請日期2007年7月9日 優(yōu)先權日2007年7月9日
發(fā)明者曹學成, 楊靈勇, 汪志平, 暉 黃 申請人:浙江大學