專利名稱：獲得有形太歲菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得有形太歲菌種的方法，特別涉及一種呈圓形或近 圓形太歲菌種的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景"太歲"是一種多發(fā)現(xiàn)于土壤中的軟體、肉質(zhì)的不明物體，《山海經(jīng)》 稱之為"視肉、聚肉、肉芝"，在我國的古代記載中，其形態(tài)有"牛肝" 狀的，有"人手"狀的，有"團(tuán)塊"狀的。在中國民間，"太歲"向來被 看作是一種神秘莫測的東西，具有在冥冥之中支配和影響人們命運(yùn)的力 量，有"誰敢在太歲頭上動(dòng)土"的咀咒。近十幾年，我國發(fā)現(xiàn)"太歲"的報(bào)道有數(shù)次，因其質(zhì)地肉質(zhì)又被俗稱為"怪肉"，震驚全國傳媒的就是1992年8月陜西周至縣發(fā)現(xiàn)的渭河"怪 肉"。對(duì)"太歲"的認(rèn)識(shí)以往僅憑肉眼直觀或借助顯微鏡觀察鑒定，鑒定 的結(jié)論有的說是粘菌復(fù)合體，有的說是無生命體。"太歲"具有不同的形 態(tài)，有軟體無定形的和有形的兩種，雖都為肉質(zhì)，但前者肉質(zhì)較蓬松而富 彈性，后者致密極具韌性，憑直觀感覺不都是粘菌復(fù)合體；"太歲"個(gè)體 能夠被觀察到生長而不腐爛，懷疑不可能不是無生命體。僅憑肉眼直觀或 仍借助顯微鏡觀察難以再提升對(duì)太歲的認(rèn)識(shí)水平，其不足之處是不能進(jìn)行 有形太歲的繁殖，就不能完成對(duì)有形太歲的正確認(rèn)知。該發(fā)明解決了對(duì)有 形太歲進(jìn)行認(rèn)知和繁殖的菌種問題。應(yīng)用該發(fā)明，分別對(duì)軟體無定形太歲和有形太歲的離體組織進(jìn)行培 養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所提供的培養(yǎng)基上，軟體無定形太歲不能獲得菌類生物體， 有形太歲能夠獲得菌類生物體，此結(jié)果一方面再次支持了太歲分為有形和 無定形兩類的觀點(diǎn)，另一方面創(chuàng)新形成了一種獲得有形太歲菌種的方法， 同時(shí)表明該方法與同時(shí)代的其它研究法比較，是解開千年太歲之謎的首創(chuàng)之舉。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種獲得有形太歲菌種的方法。為了解決上述技術(shù)的問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的獲 得有形太歲菌種的方法，是將有形太歲的無菌組織，接種在菌物培養(yǎng)基上 進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以上所述的有形太歲的無 菌組織，是在太歲表皮下割取，經(jīng)干燥、消毒、削去被消毒組織的表層后 切成小塊而成。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以上所述的菌物培養(yǎng)基由黃 豆小麥水煮過濾后的濾液加葡萄糖、瓊脂和水組成。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以上所述的菌種是具有一致 性菌落形態(tài)的培養(yǎng)產(chǎn)物。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以上所述的每一小塊無菌組 織定位接種在1個(gè)試管斜面培養(yǎng)基的中間部位。本發(fā)明還可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以上所述的培養(yǎng)適宜溫度在 攝氏16至22度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是通過獲得有形太歲菌種的 方法，能方便實(shí)現(xiàn)有形太歲的繁殖。為有形太歲的研究、開發(fā)和生產(chǎn)提供 了有力的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述 制取有形太歲的無菌組織。無菌的意義是除卻有形太歲組織中所含的 菌，不再混入來自組織外的雜菌，這樣獲得的菌培養(yǎng)物才確保是純粹的有 形太歲菌種；否則，若不能保證用于離體培養(yǎng)的組織是無菌組織，所分離 的菌種即使經(jīng)過各種純化手段，也不能確切保證所得到的菌種來自該太歲組織。無菌組織是從未和有菌外界接觸的組織，原則上可通過以下途徑獲 得撕裂開有形太歲直接無菌切取內(nèi)部組織，或經(jīng)局部表面過度消毒后再 穿刺鉤挑取內(nèi)部組織，或?qū)⒉糠蛛x體組織塊經(jīng)過度消毒后再割取內(nèi)層組 織。但是由于太歲的持有者常以寶物自居，不允許做大的破壞就不便用撕 開法取組織；不允許整個(gè)太歲接受長時(shí)間消毒處理和置無菌環(huán)境下，就不 便用穿刺法挑取內(nèi)部組織；只能是通過索取部分組織塊、再對(duì)其進(jìn)行技術(shù) 處理后得到無菌組織。1、有形太歲無菌離體組織塊的制備(1) 取樣在有形太歲表皮組織下1厘米深處割取長3厘米，寬2 厘米，厚2厘米的組織塊。(2) 樣品風(fēng)干將割取的有形太歲組織塊放在潔凈的培養(yǎng)皿中，敞 口放置在室內(nèi)通風(fēng)處風(fēng)干，當(dāng)組織干燥至用力擠壓或刀切情況下不滲水， 巳硬結(jié)時(shí)為止。(3) 表面消毒在無菌空間內(nèi)進(jìn)行，將風(fēng)干組織塊放入滅菌容器中，選用對(duì)組織滲透力強(qiáng)、毒性小的表面消毒劑如75%酒精對(duì)組織塊進(jìn)行表面 消毒。消毒時(shí)要淹沒整塊組織，進(jìn)行表面消毒12分鐘。消毒時(shí)間長，意義在于寧可殺死部分表層組織，也不殘留1個(gè)表層組織雜菌，避免雜菌帶 來的干擾。(4) 無菌水反復(fù)洗脫組織塊上的殘留消毒劑在無菌空間內(nèi)進(jìn)行。消毒結(jié)束后倒去消毒劑，倒入無菌水淹沒組織塊，震蕩洗脫殘留消毒劑，再倒出洗脫液倒入無菌水震蕩洗脫，如此洗脫6次。意義在于避免殘留消毒劑再殺死內(nèi)部組織。(5) 吸干組織塊表面水分在無菌箱內(nèi)進(jìn)行。將組織塊倒在放有多層無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌鑷子夾住無菌濾紙反復(fù)吸干組織塊表面水 分。意義在于避免可能有的雜菌再隨水?dāng)U散。(6) 削去被消毒組織的表層在無菌箱內(nèi)進(jìn)行。在墊有干燥滅菌濾 紙的培養(yǎng)皿上用無菌手術(shù)刀削去被消毒組織的表層，每削一刀換一個(gè)手術(shù) 刀。意義在于一方面去除被消毒劑殺死的組織，另一方面再次去除掉表層 可能帶有的雜菌。(7)切片切塊在無菌箱內(nèi)進(jìn)行。在一新墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上用無菌手術(shù)刀將組織塊切成2毫米厚薄片后切成2毫米細(xì)絲，再改刀切成 2毫米見方小塊，每切一刀都換一個(gè)重新消毒的手術(shù)刀，這樣的小塊就是 能夠用于接種的無菌組織。意義在于組織越小，暴露的表面積就會(huì)越大， 接觸培養(yǎng)基的面積就越大，被培養(yǎng)活化的可能性就越大;小塊的數(shù)量越多， 接種重復(fù)就越多，同時(shí)仍堅(jiān)持優(yōu)良的無菌操作。2、配制無菌組織長成菌種和易于觀察的培養(yǎng)基培養(yǎng)基是人工配制的適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的 營養(yǎng)基質(zhì)，基本組成是碳源、氮源、礦質(zhì)元素和水。培養(yǎng)基的種類很多，按照對(duì)于培養(yǎng)基的組成物質(zhì)的化學(xué)成份是否了 解，可以把培養(yǎng)基分為合成培養(yǎng)基與天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用化學(xué)成 份完全了解的物質(zhì)配制成的，適于研究已知菌類的營養(yǎng)代謝、分類鑒定， 適合生長的菌類范圍易受配方組成、含量多少的限制。天然培養(yǎng)基是采用 化學(xué)成份還不清楚或化學(xué)成份還不恒定的天然有機(jī)物(如動(dòng)植物組織浸汁 或榨汁、土壤浸液、牛奶、血清等)制成的培養(yǎng)基，由于其營養(yǎng)豐富，適 于多種菌類的生長，尤適做未知菌類的分離篩選。培養(yǎng)基按其制成后的物理狀態(tài)又可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和 固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基適于已知純菌種的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，不能方便的 觀察到菌落，出現(xiàn)雜菌也不能方便的觀察到和檢出；液體培養(yǎng)基加一定量 凝固劑便成為固體培養(yǎng)基，常用的凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠等，最合適 的凝固劑是瓊脂，它具有不被微生物液化分解、凝固點(diǎn)高凝固溫度范圍寬、 透明度好粘著力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。固體培養(yǎng)基為微生物的生長提供了一個(gè)營養(yǎng)表 面，在這樣一個(gè)表面上生長的微生物可形成單個(gè)菌落，分界邊緣清晰，便 于微生物的分離鑒定。
據(jù)此，設(shè)計(jì)了一種天然瓊脂固體大表面培養(yǎng)基，用于把有形太歲的離 體無菌組織培養(yǎng)成菌種，其配方和制作方法如下(1) 配方黃豆300克，小麥100克，葡萄糖20克，瓊脂20克， 水1000毫升。用完整黃豆、小麥的水煮浸液提供菌類生長的氮源、多種 碳源、礦物質(zhì)以及維生素等活性物質(zhì)；用葡萄糖提供簡單的碳源；用高添 加量的瓊脂做固化劑，固化程度高，便于觀察菌落的長勢和轉(zhuǎn)移分離挑取。(2) 配制按配方比例稱好各組份；黃豆和小麥最好先用水浸泡5 小時(shí)后開始水煮，開鍋后計(jì)時(shí)，30分鐘后用雙層紗布過濾；取濾液溶化 瓊脂；加葡萄糖；開水定溶至1000毫升；用18X180毫米規(guī)格試管分裝; 每只試管約裝12毫升；121度下滅菌70分鐘；趁鍋內(nèi)溫度高于80度時(shí) 出鍋，以免在擺放前就已凝固定型；擺放時(shí)在管口端墊一直徑1厘米的圓 柱，使管內(nèi)液體的長度約占試管總長的三分之二，冷凝后即成試管固體斜 面，即可供接種使用。經(jīng)檢查該培養(yǎng)基在121度下滅菌50分鐘即能達(dá)到 無菌要求，為徹底排除殘留菌的干擾，采用了延長滅菌時(shí)間至70分鐘的 過度滅菌工藝。3、 嚴(yán)格無菌條件下的定位接種和多重復(fù)接種在封閉良好的無菌空間里，用無菌的接種工具，將分割的無菌組織 小塊轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基大表面的中間位置。無菌接種才能保證在接種環(huán)節(jié)不混入外界雜菌干擾，保證分離到純 粹的太歲菌種。接種組織塊被接種在培養(yǎng)基固體表面的中間部位，以增加菌落徑向 生長的表面積，便于觀察菌落長勢的變化。接種的數(shù)量， 一個(gè)培養(yǎng)基表面接種1個(gè)組織塊；接種的總量要大， 一般高于30個(gè)重復(fù)，便于從生長表現(xiàn)一致性上剔除極個(gè)別雜菌感染，獲 得準(zhǔn)確的菌種。4、 仿自然溫度(20度)下培養(yǎng)依據(jù)太歲發(fā)現(xiàn)于土壤中的事實(shí)，推知培育太歲菌種的適宜溫度。已
有的研究表明，年均氣溫(x)與年均土壤溫度(y)相關(guān)極顯著，回歸方程 為"y =2. 9001+0. 9513x，相關(guān)系數(shù)r 二O. 9889。這樣計(jì)算的年均土壤溫度 (50cm)為13.22士6.02。C。所以，將培養(yǎng)溫度的上限調(diào)整在22度以下，比 土壤的最高溫度低，培養(yǎng)溫度的下限調(diào)整在15度以上，比土壤的最低溫度 高， 一方面體現(xiàn)了地溫比較恒定的狀況，另一方面又將低溫控制在15度以 上，利于組織塊萌發(fā)快和在仿自然氣溫下生長。將接好種的試管移出無菌 箱，置20度下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，18至36小時(shí)就能觀察到自組織塊上萌發(fā)出絲 狀菌絲，繼續(xù)培養(yǎng)，菌絲將在試管斜面上生長蔓延，并出現(xiàn)紅色素沉著。5、 經(jīng)選擇后確認(rèn)菌落形態(tài)表現(xiàn)一致性的活菌培養(yǎng)物為有形太歲的菌種。離體組織的無菌培養(yǎng)操作，無論怎樣嚴(yán)格，也難免出現(xiàn)極個(gè)別雜菌 感染，另一方面，太歲是由單一菌構(gòu)成還是由多種菌構(gòu)成到目前并不清楚， 所以，從培養(yǎng)一開始就應(yīng)及時(shí)觀察組織塊的萌發(fā)生長和菌落種類、形態(tài)變 化情況，各種表現(xiàn)均一致的培養(yǎng)單元的菌培養(yǎng)物就是所分離太歲的準(zhǔn)確菌 種。6、 有形太歲菌種的保藏和繁殖-有形太歲菌種在8度低溫下生長緩慢，可用8度冷藏箱保存。保藏期 間可用上述培養(yǎng)基轉(zhuǎn)管繼代。本發(fā)明的意義在于突破了僅憑肉眼直觀或顯微觀察太歲的局限性，是 解開千年太歲之謎的首創(chuàng)之舉;通過太歲菌種的獲得否定了有形太歲是無 生命體的論點(diǎn)；通過菌體培養(yǎng)物顯現(xiàn)的絲狀真菌菌落特征，獲得了有形太 歲主要是真菌組織體的新發(fā)現(xiàn)；以后通過菌體培養(yǎng)物的純化培養(yǎng)，將助于 人類搞清有形"太歲"是屬于單一生物體還是復(fù)合生物體，并確定其在生 物界的分類地位和形成機(jī)理；利用菌體培養(yǎng)物易繁殖的特性，能方便實(shí)現(xiàn) 其代謝物的研究、開發(fā)和生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1、一種獲得有形太歲菌種的方法，其特征在于將有形太歲的無菌組織，接種在菌物培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
2、 如權(quán)利要求l所述的獲得有形太歲菌種的方法，其特征在于有形 太歲的無菌組織是在太歲表皮下割取，經(jīng)干燥、消毒、削去被消毒組織的 表層后切成小塊而成。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的獲得有形太歲菌種的方法，其特征在于 菌物培養(yǎng)基由黃豆小麥水煮過濾后的濾液加葡萄糖、瓊脂和水組成。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的獲得有形太歲菌種的方法，其特征在于 菌種是具有一致性菌落形態(tài)的培養(yǎng)產(chǎn)物。
5、 如權(quán)利要求1或2所述的獲得有形太歲菌種的方法，其特征在于 每一小塊無菌組織定位接種在1個(gè)試管斜面培養(yǎng)基的中間部位。
6、 如權(quán)利要求1或2所述的獲得有形太歲菌種的方法，其特征在于 培養(yǎng)適宜溫度在攝氏16至22度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得有形太歲菌種的方法。屬于微生物的技術(shù)領(lǐng)域。其用于解決對(duì)有形太歲進(jìn)行認(rèn)知和繁殖的菌種問題。獲得有形太歲菌種的方法是在太歲表皮下割取，經(jīng)干燥、消毒、削去被消毒組織的表層后切成小塊無菌組織，接種在由黃豆小麥水煮過濾后的濾液加葡萄糖、瓊脂和水組成斜面菌物培養(yǎng)基的中間部位，在攝氏16至22度進(jìn)行培養(yǎng)，選擇具有一致性菌落形態(tài)的培養(yǎng)產(chǎn)物為菌種。采用這種獲得有形太歲菌種的方法可廣泛地應(yīng)用于對(duì)有形太歲的認(rèn)知研究、開發(fā)利用和進(jìn)行繁殖。
文檔編號(hào)C12N1/00GK101117620SQ200710062318
公開日2008年2月6日 申請日期2007年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月18日
發(fā)明者王世清, 王朝江 申請人:王朝江;王世清