專利名稱：Bpde致癌相關基因的全基因組篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體的說涉及一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法。
背景技術：
隨著社會經濟的飛速發(fā)展，環(huán)境污染已成為人們所面臨的一個嚴峻問題，生活在工業(yè) 國家或地區(qū)的人們普遍面臨著由化學物質引起誘變、致癌或致畸的危險。腫瘤，尤其是惡 性腫瘤，嚴重危害著人類的健康及生命，很多國家為此投入了巨大的人力和物力，但迄今 腫瘤的危害仍未能被遏制。近幾年來，很多國家惡性腫瘤發(fā)病率節(jié)節(jié)攀升。在我國，惡性 腫瘤死亡率已高居死因第一位。肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，我國肺癌的發(fā)病率和 死亡率一直呈明顯上升趨勢，有報告預計，到2025年，我國每年僅死于肺癌的人數(shù)將接近 100萬。因此開展惡性腫瘤防治研究對于預防惡性腫瘤的發(fā)生，降低發(fā)生率，減少死亡率， 指導臨床和提高腫瘤患者的生存質量等都具有十分重要的現(xiàn)實意義。經過長期的探索和研 究，尤其是近20年來癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，使得人們認識到腫瘤其實是一種基因分子 疾病。腫瘤的發(fā)生是一個多因素作用、多基因參與、經過多個階段才最終形成的極其復雜 的生物學現(xiàn)象。人類腫瘤中，絕大部分是環(huán)境致癌因素與機體基因相互作用的結果?；瘜W 性和生物性致癌因素是腫瘤病因中的重要環(huán)境因素。化學致癌物在酶系統(tǒng)作用后，經代謝 活化產生有致癌活性的終致癌物，其親電子基團能與細胞耙器官——生物大分子如DNA中 的親核基團經共價鍵結合，形成化學性質穩(wěn)定的產物即加合物，導致DNA的突變，造成遺 傳性危害。但目前對環(huán)境化學致癌物靶基因作用位點的了解尚不能闡明環(huán)境化學致癌物的 致癌分子機制。
苯并[oc]芘(benzo[a]pyrene， BccP)是一種廣泛存在于人們生活環(huán)境中的多環(huán)芳烴類環(huán) 境污染物，主要由含碳物質的不完全燃燒產生，存在于煤煙、香煙的煙霧、熏烤食品、汽 車排出的廢氣中，致癌性強，與人類肺癌的發(fā)生有關。BaP是間接致癌物，需在體內代謝 活化才具有強烈的致癌作用。反式二氫二醇環(huán)氧苯并芘[anti-7，8-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo(cc)pyrene， BPDE]是BctP的活性代謝終產物之一，致癌活性最強，具有親電子性，可 與DNA的親核位點共價結合形成BPDE-DNA加合物，引起DNA堿基突變，在化學誘變 和腫瘤發(fā)生中起關鍵作用。但其具體致癌機制仍不十分清楚。
文獻表明，BPDE可能通過引起p53、 k-ras、 c-myc、 bcl-2等多種基因的突變而引發(fā)腫 瘤。目前已知的與BPDE相互作用的基因尚不能闡明BPDE的致癌分子機制，尋找出更多 的BPDE致癌易感基因是個亟需解決的問題，而如何尋找更多的BPDE耙基因作用位點又 成為其中的關鍵。人類基因組研究發(fā)現(xiàn)人類基因數(shù)目約為3.4萬至3.5萬個，如此眾多的基
因，究竟哪個或哪幾個基因是這些致癌物的特異靶作用位點？又如何高通量篩選出致癌物 特異的靶基因作用位點？
目前，對各種生命奧秘和疾病相關基因的分離和鑒定已成為功能基因組學的研究熱點，
已發(fā)展多種技術方法尋找差異表達基因，如差異顯示PCR (DD-PCR)方法、基因芯片技 術、基因表達的系統(tǒng)分析(SAGE)、消減雜交法等，這些方法都能有效分離差異基因，但 又存在其自身的缺點和局限性。如DD-PCR的假陽性率高，獲得的片段較短，提供的基因 信息比較有限，同位素有污染和傷害問題；基因芯片技術的雜交和洗滌條件較難把握，會 導致一定的假陽性或假陰性率，分析圖像和數(shù)據(jù)較耗時；SAGE則克隆過程比較繁瑣；消 減雜交法雖可獲得低豐度的差異基因，但不能同時展示所有的基因及差異基因。
擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)是新近發(fā)展起 來的一項DNA指紋技術，基因組DNA經限制性內切酶酶切后，產生DNA限制性片段， 用雙鏈人工接頭連接到限制性片段的兩端形成的特異性片段作為模板，在接頭序列和內切 酶識別位點的基礎上加上一定數(shù)目(1~3個)的選擇性堿基設計引物，只有那些限制性位 點側翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增，可以在不需要知道 DNA序列信息的前提下，對酶切片段進行傳統(tǒng)的PCR擴增，將酶切限制性片段的可靠性 和PCR技術的快捷方便結合在一起，克服了 RFLP和RAPD技術中的一些不足而兼具兩者 的優(yōu)點。由于AFLP可用多種不同類型的限制性內切酶及不同數(shù)目的選擇性堿基，因此， 理論上AFLP可以產生無限多的標記數(shù)并可覆蓋整個基因組，是指紋圖譜中多態(tài)性最豐富 的一項技術，且具有準確性高，重復性好，結果可靠等特點，是檢測基因組變異較為理想 的一種方法，已廣泛用于遺傳圖譜構建、遺傳多樣性研究、基因定位及品質鑒定等方面。 Majima等應用AFLP技術成功分離克隆出了一條與大鼠腎癌早期發(fā)生有關的候選新基因一 ^Niban基因。也有學者應用AFLP技術檢測了小鼠高、低轉移性肝癌細胞株基因組的遺傳 改變，檢測到4條差異片段，認為AFLP技術適用于腫瘤易感基因的篩選。AFLP篩選是基 因組水平基因分型的一個策略，已廣泛應用植物和細菌方面，但應用于人類的報道還很少 見。Wong等首次應用毛細管電泳AFLP技術進行人腫瘤的分類和鑒別診斷，成功分類了 16個腫瘤樣品，而這些樣品用比較基因組雜交并沒有檢測到基因組的變異，表明毛細管電 泳AFLP技術是進行腫瘤篩選和診斷的有應用前景的方法。Matsunaga等應用AFLP差異顯 示技術對肺癌組織和肺癌病人外周血的基因轉錄產物進行鑒定，發(fā)現(xiàn)了 4個差異轉錄產物， 并用這4個轉錄產物和細胞角蛋白19作為新的指標對肺癌病人分期進行評價，有助于肺癌 病人的早期診斷、分期和隨訪，改善肺癌病人的預后和提高生存率。因此，AFLP結合其他 分子生物學技術可以用于腫瘤易感基因的篩選和鑒定。AFLP采用特定引物擴增，退火溫度 高，使假陽性率降低，特異性和可靠性增高，因而具有準確性高，重復性好，結果可靠等 特點，而且可以在不知道基因組序列特點的情況下對其進行擴增，利用少量的內切酶組合 建立一系列AFLPDNA，可以涵蓋所有的基因組序列，用不同的引物組合來篩選這些AFLP 片段中的感興趣的序列，理論上可以將基因組中的這些感興趣的序列全部富集篩選出來，
被認為是一種十分理想的、有效的、先進的分子標記。
研究表明，BPDE與DNA相互作用形成BPDE-DNA加合物進而引起DNA堿基的突變， 可能與DNA特定的位點有關或者是具有明顯的DNA堿基序列或構象的特異性。利用這個 特點，我們設計了在體外使BPDE抗原與DNA雙酶切片段相互作用，BPDE抗原與DNA 的特異作用序列結合制備形成BPDE抗原-DNA特異作用序列加合物。然后用針對BPDE 抗原的特異性單克隆抗體與納米磁顆粒耦聯(lián)成免疫納米磁顆粒，把與BPDE相互作用并結 合的特異DNA片段從未結合的DNA片段中分離出來，找出可能致癌的與BPDE作用的特 異DNA片段。此過程中，關鍵的問題是如何把特異的DNA片段進行初步富集并分離出來。 以納米磁顆粒和抗原抗體反應為基礎的免疫磁性分離(immunomagnetic separation, IMS) 技術，由于具有巨大的比表面積、高吸附特性，及靈敏度高、特異性強、重復性好、分離 效果好、簡便快速等優(yōu)點，已用于微生物、細胞以及其他目的物質的富集和分離，已成為 一種有效的富集、分離和純化工具。但免疫磁性分離技術應用于核酸片段的分離和富集尚 未見報道。把AFLP技術和IMS技術相結合應用于腫瘤易感基因的篩選亦尚未見報道。我 們利用抗原抗體反應的高特異性和納米磁顆粒的巨大比表面積、高吸附特性、高靈敏性、 重復性好、分離效果好、簡便快速等優(yōu)點，對特異的DNA片段成功進行了初步富集和分離， 解決了實驗中的一個關鍵問題，并為后續(xù)的AFLP-PCR進一步的擴增富集提供了物質基礎。 由于能與BPDE相互作用的特異DNA片段可能很少，且我們并不能事先知道與BPDE 相互作用的特異DNA片段的序列特點和堿基組成，如何使這些片段進一步擴增和富集成為 實驗中的另一個關鍵問題。應用AFLP技術正好可以解決這一問題，從而對初步富集分離 的與BPDE相互作用的特異DNA片段進行大量特異性擴增，為后續(xù)實驗提供條件。進而 通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從而富集、分離、擴增、回收、克隆測序BPDE作用位點 的特異DNA片段的核苷酸序列，經同源相似性分析獲得與其同源的已知基因或未知核苷酸 序列。 '

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選 方法。
本發(fā)明的技術方案概述如下
BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，包括如下步驟 (1)從正常肺組織中提取基因組DNA;
〖2) AFLP DNA片段的制備基因組DNA經雙酶切獲得AFLP DNA片段；
G)與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分離AFLP DNA片段與BPDE
孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒，在磁場作
用下，使與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分離出來；
(4) AFLPPCR擴增AFLP DNA片段與接頭的連接，預擴增和選擇性擴增；
(5) AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色；
(6) 差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析。
優(yōu)選的是所述AFLP DNA片段的制備為
(1) 用TaqI消化準備4-6個反應體系，每個反應體系總體積為20 pl，其中包括DNA300 ng， Taq I 10u， 1 Xbuffer,其中1 Xbuffer的成分終濃度為50 mM Tris-HCl pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50mMNaCl，混勻后，65。C恒溫水浴消化l-3 h;
(2) 向每一反應體系中補加Pst I 10u， 37。C恒溫水浴消化l-3 h后，70 75。C水浴10 20 min 滅活酶的活性，4 8'C保存?zhèn)溆茫?br> (3) 1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的酶切情況。
優(yōu)選的是所述與BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分離的步驟為
(1) 納米磁顆粒免疫分離BPDE-DNA片斷1) 取所述AFLPDNA片段20pl，分成4組放入試管中免疫磁性特異分離組、免疫磁性 非特異吸附組、裸磁顆粒非特異吸附組、正常對照組；
2) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入2 mmol/L的BPDE 0.5~2 pl，其余各組分別 加入0.5-2 ^滅菌超純水，37'C避光孵育3~7 d;
3) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入體積比為10 : 4的乙酸乙酯和乙醚20~22 ^， 輕搖混勻，靜置l 4min，除去含有未結合BPDE的上層液相，重復2-4次，純化、沉淀 DNA-BPDE加合物，力B 20 pl水重懸DNA-BPDE加合物；
4) 向所述免疫磁性特異分離組和免疫磁性非特異吸附組中加入針對BPDE抗原的免疫納 米磁性顆粒0.5~2 |_d，向所述裸磁顆粒非特異吸附組中加入裸磁顆粒0.5 2 W，向所述正 常對照組中加入滅菌超純水0.5 2 pl，室溫、避光、輕搖10 30min;
5) 把各試管放入磁分離架上，在磁場作用2 5min，磁顆粒貼附在管壁一側，小心吸棄上 清液，用滅菌超純水30 40nl洗2 4次，每次2 5min;
6) 加5 jal滅菌超純水溶解，即得到與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒 復合物溶液；
(2) AFLP-DNA片段與磁顆粒的解離
把步驟(1)中得到的放置有與BPDE相互作用的AFLPDNA片段免疫納米磁顆粒復 合物溶液的試管放入沸水浴中10 15 min，然后8000 11 000 r/min離心5 10 min， 收集上清液，使AFLP-DNA片段與抗原抗體磁顆粒復合物解離，即獲得含有與BPDE相 互作用的AFLPDNA片段，-2CTC凍存?zhèn)溆谩?br> 所述針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒的制備步驟為
(1) 取裸納米磁顆粒330ial，加入一干凈滅菌的1.5ml離心管中；
(2) 在磁場作用2 5min，吸棄上清；
(3) 取O.l mol/LpH7.8,磷酸緩沖液330 pl重懸裸納米磁顆粒，再加入BPDE單克隆抗體 500
(4) 20 25'C孵育10 20min，然后加入牛血清白蛋白至終濃度為lmg/ml;
(5) 在避光條件下，4 8'C孵育10-16 h，不時輕輕顛倒；
(6) 把離心管放入磁分離架作用2~5 min，吸棄上清；
(7) 向管中加330 plpH7.4磷酸鹽緩沖液，用移液器槍頭輕輕吹打混勻，20-25'C孵育5~10 min，輕輕顛倒；
(8) 重復步驟(6)、 (7)各2次；
(9) 把離心管放入磁分離架作用2~5 min，吸棄上清；
(10) 從分離架上取出離心管，加入330)alpH7.4磷酸鹽緩沖液重懸納米磁顆粒一抗體耦 合物，即成針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒；
所述AFLP PCR擴增的歩驟為
(1) AFLP-DNA片段與接頭的連接
連接反應體系總體積為20 W，其中包括AFLP-DNA片段5 jal， Taq I接頭5 pmol， Pstl接頭2pmo1， T4DNAligase400u， IXbuffer,其中1 Xbuffer的成分終濃度為50mM Tris-HCl， 10mMMgCl2， 10mMDTT， lmMATP， 25嗎/mlBSA， pH7.5;連接反應條件為 16~25°C l~4h， 70°C 5~15min， 4 8。C保存；所述
Taql接頭為5'隱GACGATGAGTCCTGA G -3' 3' - TACTCAGGACTCGC-5' Pstl接頭為5' -GACGTGACGGCCGTCATGCA-3' 3' -GCACTGCCGGCAG T -5'
(2) AFLP預擴增PCR:
AFLP預擴增PCR反應體系總體積為20 pl，其中包括從所述步驟(1)獲得的連接 產物1 pl， Taq I預擴增引物5 pmol， Pst I預擴增引物5 pmol， 1 XTaq PCR MasterMix， 其中IX Taq PCR MasterMix的成分終濃度為10 mmol/L Tris-HCl pH8.3， 50mmol/LKCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件進行 PCR擴增反應:94°C 0.5~lmin， 56°C 0.5~2min， 72°C 0.5~2min， 20~40個循環(huán)后，72 °C 5~15 min， AFLP預擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實有彌散條帶出現(xiàn)后，稀 釋20 50倍，4 8'C保存?zhèn)溆?；所?br> Taql預擴增引物為5' -GATGAGTCCTGAG CGAA-3' Pstl預擴增引物為 5' -GACGGCCGTCATGCAGA-3'
(3) AFLP選擇性擴增PCR
AFLP選擇性擴增PCR反應體系總體積為20 pl，其中包括AFLP預擴增PCR產物 稀釋液lpl， Taql選擇性擴增引物5 pmol, Pst I選擇性擴增引物5 pmol， IXTaq PCR MasterMix,其中1 X Taq PCR MasterMix的成分終濃度為10 mmol/L Tris-HCl pH8.3 ， 50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混勻后，按 下述條件進行PCR擴增反應 94°C 0.5 lmin， 65°C 0.5~lmin， 72°C 0.5~2min，其 中退火溫度從65t:開始每循環(huán)降低0.7X:，共12個循環(huán)，12個循環(huán)后反應條件變?yōu)?4 °C 0.5~lmin， 56°C 0.5~lmin， 72°C 0.5~2min ， 20 30個循環(huán)后，72°C 5~15min， AFLP 選擇性擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實有條帶后，4~8"保存，然后進行變性聚
丙烯酰胺凝膠電泳；所述AFLP選擇性擴增PCR所用Taq I選擇性擴增引物為4條，Pst I選擇性擴增引物為4-5條，組合成4-20對引物組合。 所述4條Taq I選擇性擴增引物分別為
Taql選擇性擴增引物1 5' -GATGAGTCCTGAGCGAACG-3' Taql選擇性擴增引物2 5' -GATGAGTCCTGAGCGAATG-3' Taql選擇性擴增引物3 5' -GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3' Taq I選擇性擴增引物4 5' -GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3' 所述4-5條Pst I選擇性擴增引物分別為
Pstl選擇性擴增引物15' -GACGGCCGTCATGCAGAGC-3'
5' -GACGGCCGTCATGCAGATG-3' 5' -GACGGCCGTCATGCAGACT-3' 5' -GACGGCCGTCATGCAGAAC-3' 5' -GACGGCCGTCATGCAGATT-3'
Pstl選擇性擴增引物2 Pstl選擇性擴增引物3 Pstl選擇性擴增引物4 Pstl選擇性擴增引物5 所述20對引物組合分為
1 23 4
56789 10 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P3T1 P3T2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
P3T3 P3T4 P4T1 P4T2P4T3 P4T4 P5T1 P5T2 P5T3 P5T4
所述AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色的步驟為
(1) 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
向AFLP選擇性擴增PCR產物中加入上樣緩沖溶液，所述AFLP選擇性擴增PCR產物與 上樣緩沖溶液的體積比為8 : 3制成上樣混合物;經60W恒功率預電泳20 50min后，取3 6pl上樣混合物加樣到6%變性聚丙烯酰胺凝膠上以60W恒功率電泳120 150min，亦即至 二甲苯青FF指示帶距凝膠底部2~5cm時終止電泳；
(2) 變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染色
1) 電泳結束后，取下膠板，放入2L體積百分濃度為10%的冰乙酸水溶液即固定液中固定， 充分振蕩10 30 min或至指示劑完全消失；
2) 用超純水振蕩洗膠2 4次，每次2 5min;
3) 把凝膠移至2L染色溶液中，染色溶液的成分為含有1 g/L硝酸銀、1.5ml/L37。/。甲醛的 水溶液，充分振蕩20 40 min;
4) 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5 10 s，立刻將凝膠轉移至l L預 冷的顯色液中，顯色液的成分為含有30 g/L碳酸鈉、2mg/L硫代硫酸鈉、1.5ml/L37。/o甲 醛的水溶液，充分振蕩，直至模板條帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶，倒掉顯色液，把 新鮮的1L預冷的顯色液倒入盤中，使凝膠繼續(xù)顯色2 3 min，或直至所有條帶出現(xiàn)；
5) 待凝膠完全顯色后，加入l L固定溶液，振蕩2 3 min，終止顯色反應，固定凝膠；
6) 在超純水中浸洗凝膠2次，每次2 5 min;
7)將凝膠置于室溫自然干燥，觀察并拍片、保存實驗結果；
所述差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析步驟為
(1) 差異片段DNA的回收 用刀片從聚丙烯酰胺凝膠上切下差異條帶，放入一干凈無菌的離心管中，加入超純水
30~40 pl，置沸水浴中10~20 min，然后3 000~8 000 r/min離心5~10 min，收集上清液備用；
(2) 回收差異片段DNA的PCR再擴增
PCR再擴增的反應體系總體積為50 其中包括差異片段DNA的回收上清液7 jliI， Taq I選擇性擴增引物lOpmol， Pst I選擇性擴增引物lOpmol， 1 XTaq PCR MasterMix，其 中1 X Taq PCR MasterMix的成分終濃度為10 mmol/L Tris-HCl pH8.3， 50 mmol/L KC1， 1.5 mmol/LMgCl2, 250 |imoI/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件進行PCR 擴增反應94。C 0.5~2min，56~65°C 0.5~lmin， 72°C 0.5 2min，25~40個循環(huán)后，72。C 5~15 min，經1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳證實有PCR產物，4 8。C保存；
(3) 克隆
回收差異片段DNAPCR再擴增產物經純化后，與pMD18-T載體質粒進行連接，將連 接有回收差異片段DNA PCR再擴增產物的T載體質粒轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞， 使T載體質粒重組子擴增、提取、酶切鑒定，T載體質粒重組子的酶切鑒定反應體系總體 積為20pl，其中包括T載體質粒重組子.6nl， SalI10u， Xba IlOu, lXbuffer,混勻后，37 °C l~3h， 70°C 5~15min;
T載體質粒重組子用Xba I和Sal I內切酶進行酶切，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，可 見2 681 bp和ll+差異片段長度bp的兩個片段時為陽性質粒重組子，將獲得的差異片段 DNA-T載體質粒陽性重組子進行測序分析差異片段DNA的核苷酸序列；
(4) 同源相似性檢索分析
將測序分析得到的DNA核苷酸序列在美國國家生物技術信息中心基因組核酸數(shù)據(jù)庫 中進行同源相似性檢索分析。 本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，為一高效、特異的方法，在 全基因組水平篩選出更多的BPDE致癌易感基因，為闡明BPDE的致癌分子機制打下基礎。


圖1為本發(fā)明一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法的流程圖。 圖2為免疫磁性分離程序。
圖3為小鼠肺組織基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為小鼠肺組織基因組DNA雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖5為AFLP預擴增PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖6為AFLP選擇性擴增PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖7為不同引物組合選擇性擴增PCR產物聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶圖譜。
圖8為免疫磁性分離AFLP選擇性擴增產物(P3T3) PAGE條帶圖譜。
圖9為免疫磁性分離AFLP選擇性擴增產物(P5T3、 P4T3) PAGE條帶圖譜。
圖10為回收差異條帶PCR再擴增產物瓊脂糖電泳。
圖11為回收差異條帶PCR再擴增產物瓊脂糖電泳。
圖12為T-A克隆的Xba'I和Sal I雙酶切鑒定。
具體實施例方式
研究方法本研究首次應用擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)與免疫纟內米磁性分離(immunomagnetic separation, IMS)技術相結合的 方法，以小鼠為例，對小鼠全基因組DNA與BPDE相互作用的基因位點進行篩選，對差 異片段進行了回收、再擴增、克隆測序及BLAST同源相似性檢索分析，獲得與差異片段核 苷酸序列同源的已知基因或未知核苷酸序列。
本發(fā)明的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法的流程見圖1。
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例1
一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，包括如下步驟
(1) 從正常肺組織中提取基因組DNA;
(2) AFLP DNA片段的制備基因組DNA經雙酶切獲得AFLP DNA片段；
(3 )與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分離AFLP DNA片段與BPDE 孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒，在磁場作 用下，使與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分離出來；
(4) AFLPPCR擴增AFLP DNA片段與接頭的連接，預擴增和選擇性擴增；
(5) AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色；
(6) 差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析。 實施例2
小鼠肺組織基因組DNA的提取
1、 主要儀器
臺式高速冷凍離心機(UNIVERSAL 32R,德國Hettich公司)、Beckman Du530分光光度計 (德國Beckman公司)、紫外分析儀(上海康華儀器制造廠)、高純水裝置SCD-II (軍事 醫(yī)學科學院衛(wèi)生裝備研究所)
2、 主要材料和試劑
BALB/c小鼠(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)、DNA提取試劑盒(北京天為時代)、蛋白 酶K (大連寶生物工程有限公司)、無水乙醇(AR，天津市審泰化學試劑有限公司)、瓊脂 糖(大連寶生物工程有限公司)、DNAMarker (大連寶生物工程有限公司)
3、 主要試劑的配制
(1) PBSpH7.4的配制NaC18.0g， KCl 0.2 g， KH2P04 0.2 g， Na2HP04 12H20 2.9 g，超 純水900 ml，調pH值為7.4，加水至1000 ml，高壓后備用。
(2) 10 mol/L NaOH的配制400 g NaOH溶于450 ml H20中，補H20至1 L。
(3) 0.5 mol/L EDTA的配制186.1 g Na2EDTA 2H20溶于700 ml H20中，加熱、磁力攪 拌使溶解加快，用10 mol/LNaOH調至pH8.0(約40 ml)，補加H20至1 L。
(4) 5XTBE的配制54gTris， 27.5g硼酸，20 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，加水至1 L。 4、方法歩驟 -
按DNA提取試劑盒說明書進行以下步驟
(1) 取小鼠肺組織少許，PBS沖洗血液，放入勻漿器后加少許PBS制成細胞懸液，10 000 r/min離心1 min，棄上清。加200 pi緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。加入200 pi蛋白酶K(20 mg/ml)，混勻，置55'C水浴中至組織溶解，約需3 h。
(2) 加220 pi緩沖液GB，混勻，70°C水浴10min，溶液變清亮。
(3) 加220 nl無水乙醇，混勻，有絮狀沉淀出現(xiàn)。
(4) 將溶液及沉淀轉移至一個吸附柱CB中，將吸附柱CB放入廢液收集管，12 000 r/min 30 s，棄濾液。
(5) 加入500 pi去蛋白液GD， 12 000 r/min離心30 s，棄濾液。
(6) 加700 (til漂洗液GW， 12 000 r/min離心30 s，棄濾液。
(7) 加500 pi漂洗液GW， 12 000 r/min離心30 s，棄濾液。
(8) 再離心，12 000 r/min 2 min，盡量除去漂洗液。
(9) 將CB轉入一個干凈的離心管中，向CB中加入100 ^洗脫緩沖液TE(70'C水浴預熱)， 混勻，室溫放置2 5min， 12 000 r/min 30 s。
(10) 離心得到的溶液再次加入吸附柱CB中，室溫放置2 min， 12 000 r/min 2 min,得到 DNA溶液。
(11) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度、完整性及產量。
(12) Beckman分光光度計檢測DNA純度及含量，分裝成小份，-20°〇保存?zhèn)溆?。見圖3。圖 中，M: DNA Marker DL2000; 1~3:小鼠肺組織基因組DNA
實施例3
雙酶切制備AFLP DNA片段
1、 主要儀器
電熱恒溫水浴箱(天津市華北實驗儀器廠)
2、 主要試劑
小鼠肺組織DNA、Taq I核酸內切酶(美國Invitrogen公司)、Pst I核酸內切酶(美國Invitrogen 公司)
3、 方法步驟
(1)首先用TaqI內切酶消化。其中設不加核酸內切酶的管作為對照。 反應體系如下
Taq I 1 pi
10Xbuffer 2 jal
0.1%BSA 2jJ DNA 1 pi
ddH20 14)jJ - Total 20 pi
反應條件放入恒溫水浴箱，65'C恒溫水浴消化2h; (2)然后進行下述操作，向每一反應體系中補加5 ^含Pst I的反應液
Pstr 1H
10X buffer
ddH20 2 ^
Total 5 nl
反應體系總體積為25
反應條件放入恒溫水浴箱，于37'C水浴消化2h后，70'C水浴10min滅活核酸內切酶的 活性，4。C保存?zhèn)溆?。見圖4，圖中M: DNA Marker DL2000; 1~2: DNA對照；3 4: DNA
雙酶切后。 實施例4
AFLPDNA片段的制備為
(1) 用TaqI消化準備4個反應體系，每個反應體系總體積為20 pl，其中包括DNA300 ng， Taql 10u， 1Xbuffer，其中IXbuffer的成分終濃度為50 mM Tris-HC1 pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50mMNaCl，混勻后，65'C恒溫水浴消化1 h;
(2) 向每一反應體系中補加PstI 10u， 37。C恒溫水浴消化l h后，72'C水浴20min滅活酶 的活性，6'C保存?zhèn)溆茫?br> (3) 1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的酶切情況。 實施例5
AFLP DNA片段的制備為
(1) 用TaqI消化準備6個反應體系，每個反應體系總體積為20 pl，其中包括DNA300 ng， Taql 10u， IXbuffer,其中l(wèi) Xbuffer的成分終濃度為50 mM Tris-HCl pH 8.0，OmM MgCl2， 50mMNaCl，混勻后，65。C恒溫水浴消化3 h;
(2) 向每一反應體系中補加PstI 10u， 37'C恒溫水浴消化3h后，75t水浴10 min滅活酶 的活性，8'C保存?zhèn)溆茫?br> (3) 1.5W瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的酶切情況。 實施例6
與BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分離的步驟為 (一)、免疫納米磁性顆粒的制備 1、主要材料和試劑
納米磁顆粒(本實驗室自制)、磁分離架(本實驗室研制)、BPDE單克隆抗體(monoclonal antibody to benzo(a)pyrene diol epoxide, clone 8E11 )(荷蘭Hycult公司)、BSA (美國Sigma
公司)
2、 主要試劑的配制
(1) 0.1 mol/LpH7.8磷酸緩沖液(PB)的配制A液(0.2 mol/LNa2HP04): Na2HP04 '12H20 7.164 g加水溶解后定容至100 ml; B液(0.2 mol/LNaH2P04): NaH2P04 2H20 3.121 g加 水溶解后定容至100 ml; A液91.5 ml和B液8.5 ml混合，調pH值為7.8，即成0.2 mol/L PB， 稀釋一倍，得到0.1 mol/LpH7.8磷酸緩沖液(PB)。
(2) PBS pH7.4的配制NaCl 8.0 g， KC1 0.2 g， KH2P04 0.2 g, Na2HP04 12H20 2.9 g，超 純水900 ml，調pH值為7.4，加水定容至1 000 ml，高壓后備用。
3、 方法
(1) 取裸磁顆粒330ial加入一干凈滅菌的1.5ml離心管中。
(2) 放入磁分離架中在磁場作用1 min,吸棄上清，把離心管移出磁分離架。
(3) 重懸裸磁顆粒取0.1 mol/L pH7.8磷酸緩沖液(PB)330 pi重懸裸磁顆粒，再加入BPDE 單克隆抗體500 W。
(4) 室溫孵育15min，然后加入BSA至終濃度為0.1% (W/V)。
(5) 在避光條件下，4'C孵育過夜，不時輕輕顛倒。
(6) 把離心管放入磁分離架作用1 min,吸棄上清。
(7) 向管中加330plpH7.4PBS，用移液器槍頭輕輕吹打混勻，室溫孵育5 min，輕輕顛倒。
(8) 重復步驟(6)、 (7)各2次。
(9) 把離心管放入磁分離架作用lmin，吸棄上清。
(10) 從分離架上取出離心管，加入330 plpH7.4PBS，重懸磁顆粒一抗體耦合物，即成針 對BPDE的免疫納米磁性顆粒。
(二)、 AFLPDNA片段的免疫納米磁性富集、分離
1、 主要試劑
BPDE[ Benzo(a)pyrene-r-7，t-8-dihydrodiol-t-9，10-epoxide(±) (anti)](美國國家癌癥研究所化 學致癌物標準品貯藏室)、四氫呋喃(Tetrahydroftiran， THF)(美國Sigma公司)、AFLP DNA 片段、針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒
2、 主要試劑的配制
BPDE溶液的配制稱BPDE 5.2 mg ，加入8.6 ml THF溶解，即可配制成2 mmol/L的BPDE 四氫呋喃溶液，-20^保存?zhèn)溆谩?.
3、 方法
(1)納米磁顆粒免疫分離BPDE-DNA片斷
1) 取AFLPDNA片段20 ^U，共4管，分成4組免疫磁性特異分離組、免疫磁性非特異 吸附組、裸磁顆粒非特異吸附組、正常對照組。
2) 為了獲得BPDE-DNA片段，參照文獻并略做改動，向免疫磁性特異分離組的試管中加 入2 mmol/L的BPDE 0.5 pl，其余各組分別加入0.5 |al滅菌超純水，37'C避光孵育1周。
3) 參照文獻并略做改動萃取免疫磁性特異分離組中未結合的BPDE，即向免疫磁性特異分 離組的管中加入乙酸乙酯和乙醚(10:4， V:V) 20)il，輕搖混勻，靜置3min，除去上
層液相，重復2次，然后根據(jù)《分子克隆實驗指南》中的方法，純化、沉淀DNA-BPDE， 最后加20 pl水重懸DNA-BPDE。
4) 向免疫磁性特異分離組和免疫磁性非特異吸附組中加入針對BPDE抗原的免疫納米磁性 顆粒lpl，向裸磁顆粒非特異吸附組中加入裸磁顆粒1 pl，向正常對照組中加入滅菌超純水 1 Hl，室溫、避光、輕搖20min。
5) 把各試管放入磁分離架上，在磁場作用5 min，磁顆粒貼附在管壁一側，小心吸棄上清 液，用滅菌超純水30pl洗2次，每次3min。
6) 加5 ^滅菌超純水溶解，即得到與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒 復合物溶液。
(2) AFLP-DNA片段與磁顆粒的解離
把步驟(1)中得到的盛有與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒復合 物溶液的試管放入沸水浴中10 min，然后11 000 r/min離心10 min，收集上清液，即含有 與BPDE相互作用的AFLPDNA片段，-2(TC凍存?zhèn)溆谩２襟E見圖2。 實施例7
針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒的制備步驟為
(1) 取裸納米磁顆粒330 pl，加入一干凈滅菌的1.5ml離心管中；
(2) 在磁場作用2min，吸棄上清；
(3) 取0.1 mol/LpH7.8磷酸緩沖液330 pl重懸裸納米磁顆粒，再加入BPDE單克隆抗體500
(4) 20'C孵育20 min，然后加入牛血清白蛋白至終濃度為lmg/ml;
(5) 在避光條件下，8t:孵育10h，不時輕輕顛倒；
(6) 把離心管放入磁分離架作用2 min，吸棄上清；
(7) 向管中加330 plpH7.4磷酸鹽緩沖液，用移液器槍頭輕輕吹打混勻，25'C孵育10min， 輕輕顛倒；
(8) 重復歩驟(6)、 (7)各2次；
(9) 把離心管放入磁分離架作用2 min，吸棄上清；
(10) 從分離架上取出離心管，加入330plpH7.4磷酸鹽緩沖液重懸納米磁顆粒一抗體耦合 物，即成針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒；
實施例8
針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒的制備步驟為
(1) 取裸納米磁顆粒330 加入一干凈滅菌的L5ml離心管中；
(2) 在磁場作用5 min，吸棄上清；
(3) 取0.1 mol/LPH7.8磷酸緩沖液330 pl重懸裸納米磁顆粒，再加入BPDE單克隆抗體500
(4) 25。C孵育10min，然后加入牛血清白蛋白至終濃度為lmg/ml;
(5) 在避光條件下，4。C孵育16h，不時輕輕顛倒；
(6) 把離心管放入磁分離架作用5 min，吸棄上清；
(7) 向管中加330plpH7.4磷酸鹽緩沖液，用移液器槍頭輕輕吹打混勻，20'C孵育5min， 輕輕顛倒；
(8) 重復步驟(6)、 (7)各'2次；
(9) 把離心管放入磁分離架作用5 min，吸棄上清；
(10) 從分離架上取出離心管，加入330 plpH7.4磷酸鹽緩沖液重懸納米磁顆粒一抗體耦合 物，即成針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒；
實施例9
與BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分離的步驟為 (1)納米磁顆粒免疫分離BPDE-DNA片斷
1) 取所述AFLP DNA片段20 pl，分成4組放入試管中免疫磁性特異分離組、免疫磁性 非特異吸附組、裸磁顆粒非特異吸附組、正常對照組；
2) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入2mmol/L的BPDEl W，其余各組分別加入1^1 滅菌超純水，37'C避光孵育5d;
3) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入體積比為10 : 4的乙酸乙酯和乙醚21 pl，輕搖 混勻，靜置1 min，除去含有未結合BPDE的上層液相，重復3次，純化、沉淀DNA-BPDE 加合物，加20jal水重懸DNA-BPDE加合物；
4) 向所述免疫磁性特異分離組和免疫磁性非特異吸附組中加入針對BPDE抗原的免疫納米 磁性顆粒1 ial，向所述裸磁顆粒非特異吸附組中加入裸磁顆粒1 ^，向所述正常對照組中加 入滅菌超純水ljal，室溫、避光、輕搖10min;
5) 把各試管放入磁分離架上，在磁場作用3 min，磁顆粒貼附在管壁一側，小心吸棄上清 液，用滅菌超純水35pl洗3次，每次2min;
6) 加5 pl滅菌超純水溶解，即得到與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒 復合物溶液； ，
(2) AFLP-DNA片段與磁顆粒的解離
把步驟(1)中得到的放置有與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒復 合物溶液的試管放入沸水浴中13 min，然后8000 r/min離心5 min，收集上清液，使 AFLP-DNA片段與抗原抗體磁顆粒復合物解離，即獲得含有與BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?實施例10
與BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分離的歩驟為 (1 )納米磁顆粒免疫分離BPDE-DNA片斷
1) 取所述AFLP DNA片段20 )^，分成4組放入試管中免疫磁性特異分離組、免疫磁性 非特異吸附組、裸磁顆粒非特異吸附組、正常對照組；
2) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入2 mmol/L的BPDE2 pl，其余各組分別加入2 pl 滅菌超純水，37'C避光孵育3d;3) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入體積比為10 : 4的乙酸乙酯和乙醚22 (al，輕搖 混勻，靜置4min，除去含有未結合BPDE的上層液相，重復4次，純化、沉淀DNA-BPDE 加合物，加20 pl水重懸DNA-BPDE加合物；
4) 向所述免疫磁性特異分離組和免疫磁性非特異吸附組中加入針對BPDE抗原的免疫納米 磁性顆粒2 ^，向所述裸磁顆粒非特異吸附組中加入裸磁顆粒2 iul，向所述正常對照組中加 入滅菌超純水2pl，室溫、避光、輕搖30min;
5) 把各試管放入磁分離架上，在磁場作用2 min，磁顆粒貼附在管壁一側，小心吸棄上清 液，用滅菌超純水40jiil洗4次，每次5min;
6) 加5 ^滅菌超純水溶解，即得到與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒 復合物溶液；
(2) AFLP-DNA片段與磁顆粒的解離
把步驟(1)中得到的放置有與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒復 合物溶液的試管放入沸水浴中15 rain，然后10000 r/min離心8 min，收集上清液，使 AFLP-DNA片段與抗原抗體磁顆粒復合物解離，即獲得含有與BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-20。C凍存?zhèn)溆谩?實施例11 AFLP PCR擴增
1、 主要儀器
PCR儀(Mastercycler personal 5332，德國Eppendorf公司)
2、 主要材料和試劑
(1) 與BPDE相互作用的AFLP DNA片段(從步驟(二)獲得〕。
(2) 人工接頭由寶生物工程(大連)有限公司DNA合成中心合成，包括核心序列及限制性 內切酶特定序列兩部分。
核心序列 酶特定序列 Taql接頭5' -GACGATGAGTCCTGA G -3'
3' -TACTCAGGACT CGC-5' Pstl接頭5' -GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3'
3' -GCACTGCCGGCAG T -5'
(3) T4 DNA連接酶 (400 u/pl) (NEB， New England BioLabs)
(4) 根據(jù)接頭序列設計AFLP預擴增引物及選擇性擴增引物，引物包括三部分，即5'端與人 工接頭序列互補的核心序列(core sequence, CORE)、限制性內切酶特定序列(enzyme-specific sequence, ENZ)禾B 3'端有選擇性堿基的粘性末端(selective extention， EXT)，預擴增引物 有一個選擇堿基，選擇性擴增引物有三個選擇堿基。引物由寶生物工程(大連)有限公司DNA 合成中心合成。
AFLP預擴增引物
核心序列 酶特定序列 選擇堿基
Taql預擴增引物 5' Pstl預擴增引物 5' 選擇性擴增引物
-GATGAGTCCTGAG CGA -GACGGCCGTCA TGCAG
A-3' A-3'
核心序列酶特定序列選抒堿基
Taql選擇性擴增引物15'-GATGAGTCCTGAGCGAACG-3'
Taql選擇性擴增引物25'-GATGAGTCCTGAGCGAATG-3'
Taql選擇性擴增引物35'-GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3'
Taql選擇性擴增引物45'-GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3'
Pst I選擇性擴增引物15'-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3'
Pstl選擇性擴增引物25'-GACGGCCGTCATGCAGATG-3'
Pstl選擇性擴增引物35'-GACGGCCGTCATGCAGACT-3'
Pstl選擇性擴增引物45'陽GACGGCCGTCATGCAGAAC-3'
Pstl選擇性擴增引物55'-GACGGCCGTCATGCAGATT-3'
選擇性擴增引物兩兩組合可形成20對引物組合，如下:
I 2 3 4 5 6 7 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P2T1 P2T2
II 12 13 14 15 16
89 10 P2T3 P2T4 P3T1 P3T2 17 18 19 20
P3T3 P3T4 P4T1 P4T2 P4T3 P4T4 P5T1 P5T2 P5T3 P5T4
(5) 2X Taq PCR MasterMix (北京天為時代)
3、 主要試劑的配制
接頭和引物的溶解及稀釋向盛接頭或引物的管內加10倍接頭或引物nmol數(shù)體積的 ddH20溶解接頭或引物，然后取lpl至另管，加19plddH20，結果，每pl液體中含接頭或 引物為5 pmol，即接頭或引物的濃度為5 pmoI/L。
4、 方法
(1) AFLP-DNA片段與接頭的連接 連接反應體系
10xbuffer AFLP-DNA片段 T4 DNA ligase Taq I接頭 Pst I接頭 ddH20 Total
2 |ul 5 ^
1 )Ul
1 pi 0.4 nl 10.6 ^ 20 )nl
連接反應條件
22°C 2h， 70°C 10min， 4。C保存。 (2) AFLP預擴增PCR
AFLP預擴增PCR反應體系
Taql預擴增引物 1 pi
Pstl預擴增引物 1^il 迮接產物 1 )J
2 X Taq PCR MasterMix 12.5 |il
ddH20 9.5 |J
Total 25 pi
AFLP預擴增PCR反應體系終濃度為
10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 50匪ol/L KC1 1.5 mmol/L MgCl2 250 ,ol/L dNTP each lu Taq polymerase/10 (il AFLP預擴增PCR反應條件
1.94°C 3min; 2. 94°C 30 s， 3.56°C 60s，
4. 72°C 60s，
5. go to 2， repeat 23 cycles;
6. 72°C lOmin. 7.4°C hold.
AFLP預擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實有彌散條帶出現(xiàn)后，稀釋20倍，4 r保存?zhèn)溆?。見圖5，圖中，M: DNA Marker DL2000; 1:正常對照組；2:裸磁顆粒非特 異吸附組；3:免疫磁性非特異吸附組；4:免疫磁性特異分離組
(3) AFLP選擇性擴增PCR AFLP選擇性擴增PCR反應體系
預擴增產物稀釋液 1 ^
Taq I選擇性擴增引物 1 pi
Pstl選擇性擴增引物 1^1 2 x Taq PCR MasterMix 12.5 pi
ddH20 9.5 ^
Total 25 pi
AFLP選擇性擴增PCR反應條件 1.94°C 3min; 2. 94'C 30 s,
3.65。C 30 s (-0.7°C/cycle)，
4. 72°C 60s，
5. go to 2， repeat 12 cycles; 6.94°C 30 s，
7. 56'C 60s，
8. 72°C 60s，
9. go to 6， repeat 22 cycles;
10. 72。C lOmin; 11.4。C Hold.
AFLP選擇性擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實有條帶見圖6，然后進行變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳。圖中，M: DNA Marker DL2000; 1:正常對照組；2:裸磁顆粒非特異 吸附組；3:免疫磁性非特異吸附組；4:免疫磁性特異分離組 實施例12 AFLP PCR擴增
(1) AFLP-DNA片段與接頭的連接
連接反應體系總體積為20 )nl，其中包括AFLP-DNA片段5 pl， Taq I接頭5 pmol， Pst I接頭2 pmol， T4 DNA ligase 400u， 1 X buffer,其中1 X buffer的成分終濃度為50mM Tris-HCl， 10mMMgCl2， lOmMDTT， lmMATP， 25pg/mlBSA， pH7.5;連接反應條j牛為 16~25°C l~4h， 70°C 5~15 min， 4 8。C保存；所述
Taql接頭為 5' -GACGATGAGTCCTGAG -3' 3' - TACTCAGGACTCGC-5' Pstl接頭為 5' -GACGTGACGGCCGTCATGCA-3' 3' -GCACTGCCGGCAG T -5'
(2) AFLP預擴增PCR:
AFLP預擴增PCR反應體系總體積為20 |al，其中包括從所述步驟(1)獲得的連接 產物lfil, Taq I預擴增引物5pmol， Pst I預擴增引物5 pmol， 1 XTaqPCRMasterMix，其 中1XTaqPCRMasterMix的成分終濃度為10 mmol/L Tris-HCl pH8J， 50mmol/LKCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 |imol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件進行 PCR擴增反應 94°C 0.5~lmin, 56°C 0.5~2min， 72°C 0.5~2min， 20~40個循環(huán)后， 72°C 5~15 min， AFLP預擴增PCR產物經1.5°/。瓊脂糖凝膠電泳證實有彌散條帶出現(xiàn)后， 稀釋20 50倍，4-8'C保存?zhèn)溆茫凰?br> Taql預擴增引物為 5' -GATGAGTCCTGAG CGA A-3'
Pstl預擴增引物為 5' -GACGGCCGTCATGCAGA-3'
(3) AFLP選擇性擴增PCR
AFLP選擇性擴增PCR反應體系總體積為20 pl，其中包括AFLP預擴增PCR產物稀 釋液1^1， Taql選擇性擴增引物5 pmol， Pst I選擇性擴增引物5 pmol， IXTaq PCR MasterMix，其中1 XTaq PCR MasterMix的成分終濃度為10 mmol/L Tris-HCl pH8.3， 50
mmol/L KC1， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase，混勻后，按下 述條件進行PCR擴增反應 94°C 0.5~lmin， 65°C 0.5"min， 72°C 0.5 2min，其中退 火溫度從65'C開始每循環(huán)降低0.7°C，共12個循環(huán)，12個循環(huán)后反應條件變?yōu)?4°C 0.5 lmin， 56°C 0.5 ltriin， 72°C 0.5~2min ， 20 30個循環(huán)后，72°C 5 15 min， AFLP選 擇性擴增PCR產物經1.5M瓊脂糖凝膠電泳證實有條帶后，4-8'C保存，然后進行變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳；所述AFLP選擇性擴增PCR所用Taq I選擇性擴增引物為4條，Pst I選 擇性擴增引物為4-5條，組合成4-20對引物組合，(可以選下面的4-20中的任何對的引物 組合完成本發(fā)明成為新的實施例) 所述4條Taq I選擇性擴增引物分別為-
Taql選擇性擴增引物1 5'
Taql選擇性擴增引物2 5'
Taql選擇性擴增引物3 5'
Taql選擇性擴增引物4 5' 所述4-5條Pst I選擇性擴增引物分別為-
-GATGAGTCCTGAGCGAACG-3' -GATGAGTCCTGAGCGAATG-3' -GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3' 隱GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3'
Pstl選擇性擴增引物15'-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3'
Pstl選擇性擴增引物25'陽GACGGCCGTCATGCAGATG-3'
Pstl選擇性擴增引物35'-CBACGGCCGTCATGCAGACT-3'
Pstl選擇性擴增引物45'-GACGGCCGTCATGCAGAAC-3'
Pstl選擇性擴增引物55'-GACGGCCGTCATGCAGATT-3'
所述20對引物組合分為:
123456了8910
P1T1P1T2P1T3P1T4P2T1P2T2P2T3P2T4P3T1P3T2
11121314151617181920
P3T3P3T4P4T1P4T2P4T3P4T4P5T1P5T2P5T3P5T4
不同弓I物組合選擇性擴增PCR產物聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶見圖7，圖中， 1: P1T2; 2: P1T1; 3: P1T4; 4: P1T3; 5: P2T1; 6: P3T3; 7: P2T2; M: pBR322 DNA/MspI Marker; 8: P3T4; 9: P4T1; 10: P2T3; 11: P4T2; 12: P4T3; 13: P2T4; 14: P4T4;
15: P5T1; 16: P5T2; 17: P5T3; 18: P5T4; 19: P3T1; 20: P3T2
免疫磁性分離AFLP選擇性擴增聚丙烯酰胺凝膠電泳見圖8，圖中，M: pBR322 DNA/MspI Marker; 1:正常對照組；2:裸納米磁顆粒非特異吸附組；3:免疫納米磁顆粒 非特異吸附組；4~7:免疫納米磁顆粒特異分離組；注箭頭所示為差異片段條帶位置。 免疫磁性分離AFLP選擇性擴增產物(P5T3、 P4T3) PAGE條帶見圖9，圖中， M: pBR322 DNA/MspI Marker; 84、 77:正常對照組；83、 76:裸納米磁顆粒非特異 吸附組；82、 75:免疫納米磁顆粒非特異吸附組；71~74、 78 81:免疫納米磁顆粒特異分 離組；圖中清楚可見有差異片段條帶出現(xiàn)。 實施例13 AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色的歩驟為 (一)、AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(變性PAGE)
1、 主要儀器
電腦三恒多用電泳儀DYY-12型(北京六一 電泳儀廠)、DNA序列分析電泳槽DXCZ-20B (北京六一電泳儀廠)
2、 主要試劑
親禾口硅烷(PlusOne Bind-Silane) ( Amersham Bioscience ， Sweden )、 疏zK鞋烷(PlusOne Repel-Silane ES) (Amersham Bioscience, Sweden)、冰乙酸(glacial acetic acid) (GR，天津 市永大化學試劑開發(fā)中心)、95。/。乙醇(AR,天津市申泰化學試劑有限公司)、無水乙醇(AR， 天津市申泰化學試劑有限公司)、Tris堿(Tris base) (AR，美國Genview公司，北京鼎國 分裝)、硼酸(boric acid) (AR，天津市化學試劑六廠)、Na2EDTA 2H20 (美國Amresco 公司)、丙烯酰胺(acrylamide) (Ultra Pure >99.9°/。， BBI原裝，Canada)、雙丙烯酰胺
(bis-acrylamide) (Ultra Pure >99.0%， BBI原裝，Canada)、尿素(urea) (Ultra Pure > 99.5%,美國Amresco公司)、過硫酸銨(ammonium persulfate; APS) (AR，長沙歐麥公 司)、TEMED (tetramethykthylenedia mine;四甲基乙二胺)(AR，上海生工)、甲酰胺
(formamide) (HPLC級，上海生工)、溴酚藍(bromophenol blue ) (AR， Sanland-chem International Inc.)、 二甲苯蘭FF (AR， xylene cyanol FF, 美國Sigma公司)
3、 溶液配制 10XTBE:
Tris堿
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) ddH20 to 30%丙烯酰胺儲存液
丙烯酰胺 雙丙烯酰胺 ddH20 to G3砂芯漏斗過濾，
6%凝膠儲存液:
10%過硫酸銨
Urea 10XTBE
30°/。丙烯酰胺儲存液 ddH20 to store at4。C.
過硫酸銨 ddH20 to
108 g 55 g 40 ml 1 000 ml
28.5 g 1.5 g 100 ml store at 4 °C
63 g 15 ml 30 ml 150 ml
lg 10 ml
store at4。C. 95%乙醇-0.5°/。冰乙酸
95%乙醇 99.5 ml
-冰乙酸 0.5 ml 甲酰胺上樣緩沖液(98%): 7
甲酰胺 98 ml
0.5 mol/L EDTA 2 ml
溴酚藍 0.25 g
二.甲苯蘭FF 0.25 g
4、方法步驟
(1) 玻璃板準備
每次鋪膠前均需分別嚴格處理平玻璃板和凹玻璃板，硅化玻璃板操作過程中應戴手套且在 通風櫥中進行。
1) 平玻璃板準備按下述程序進行
a. 加2 pi親和硅烷到1 ml 95%乙醇-0.5°/0冰乙酸中。
b. 把親和硅烷溶液滴到平玻璃板上，用擦鏡紙輕拭擦勻整塊平玻璃板面。
c. 4 5min后，加2 ml 95%乙醇到平玻璃板上，用擦鏡紙向一個方向輕輕擦拭，然后，垂直 方向略用力擦拭。重復2次，每次均須換用干凈的紙，以除去多余的粘合溶液。
2) 凹玻璃板準備
a. —定要更換手套，防止交叉污染親和硅烷溶液，否則會導致凝膠撕裂。
b. 滴加lml疏水硅垸溶液于凹玻璃板上，擦鏡紙輕輕擦勻。
c. 5 10min后，加2 m95%乙醇于玻璃板上，先單方向擦拭玻璃板，然后再按與原來垂直 的方向擦拭。重復1次。
(2) 凝膠準備
1) 制做膠室把平玻璃板水平放置，沿其長緣把0.4 mm厚壓片放好，然后，將凹玻璃板 壓于其上，用夾子固定于兩側。調整夾子，使鯊魚齒梳子能方便地插入。水平儀調節(jié)水平。
2) 制備6%凝膠液取50 ml 6%凝膠儲液至干凈燒杯中，加熱至室溫，加入250 10% 過硫酸銨和25 pi TEMED，立即輕輕攪動混勻并避免產生氣泡。
3) 灌制膠板立刻用50 ml注射器抽取6%凝膠液，使注射器頭始終位于液面下，將凝膠 沿著壓片邊緣緩慢地注射到兩玻璃板之間的空隙中，溶液靠毛細作用向膠室底端移動，保 持溶液流連續(xù)，避免形成氣泡， 一旦形成氣泡，用手或注射器柄輕敲玻璃板使氣泡移出， 否則會影響電泳結果。將剩下的凝膠溶液于4'C保存，減緩聚合速度。
4) 制作加樣槽膠室灌滿后，立即插入鯊魚齒梳子的平緣至膠內5mm左右，小心勿使梳 子下形成氣泡，用2個夾子夾住膠室頂端，使玻璃板與壓片和梳子貼緊，以防加樣時漏樣。 插入鯊魚齒梳子時動作要快，若凝膠開始聚合，則鯊魚齒梳子將很難插入。檢査是否有凝 膠泄漏，若需要可用剩下的凝膠溶液將膠室灌滿。
5)凝膠聚合靜止放置使凝膠聚合，若凝膠有明顯回縮，可再添加些凝膠溶液。使用甜， 凝膠至少聚合2h，梳子下出現(xiàn)Schlieren線時，標志聚合反應己經完成。若聚合過夜，用 浸透1 X TBE的濾紙覆蓋梳子和玻璃板的底端，以防凝膠變干。 (3)加樣及電泳
1) 除去固定玻璃板的夾子，清除梳子周圍的聚丙烯酰胺凝膠，用ddH20沖洗板的頂端，洗 凈未聚合的丙烯酰胺和濾出的尿素，^小心輕輕地取出鯊魚齒梳子，不要拉扯凝膠頂部，用 ddH20沖洗加樣槽。用水清洗梳子，以供下面使用。
2) 將膠板固定在電泳槽中，稀釋IOXTBE至1XTBE，約1100ml，加入上下兩個電泳槽 中，用吸管吸取1XTBE沖洗加樣槽，以去除可能存在的未聚合丙烯酰胺，并避免加樣槽 內形成氣泡。
3) 預電泳接上電源，用60 W恒功率預電泳30min，預電泳時，在加樣槽上方用注射器 吸取電泳緩沖液把析出的尿素向兩側吹趕。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使 凝膠板達到所需的溫度，可防止GC豐富區(qū)形成發(fā)夾結構。
4) 30min后，切斷電源。用1XTBE沖洗加樣槽，進一步除去尿素。把鯊魚齒梳子有齒的 一頭插入加樣槽至膠內約1 mm，形成加樣孔。
5) 樣品制備預電泳時，即可進行樣品的制備。PCR擴增產物甲酰胺上樣緩沖液按8: 3(V:V)混合，95。C變性8min，然后立即簟冰浴中冷卻。
6) 加樣立即用移液槍吸取3 5)iU樣品，加入樣品孔中。加樣槍頭應在緩沖液槽中沖洗幾 次后，再吸另一樣品。加樣時速度要快，但不要產生氣泡，以防吹出樣品。加樣完畢后， 立即電泳。
7) 電泳60W恒功率電泳，觀察指示劑的遷移情況，以確定電泳時間，約150min。跑膠 10min后可移去梳子。
8) 電泳結束后，排盡緩沖液，卸下膠板，小心分開兩塊玻璃板，凝膠應牢固地附著在平玻 璃板上，放入銀染固定液中固定。
(二)、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的銀染
1、 主要儀器和材料
塑料方盤4 6個，約50cmX35cmX8cm大小、脫色搖床(哈爾濱東聯(lián)電子)
2、 主要試劑
冰乙酸(glacial acetic acid) (GR,天津市永大化學試劑開發(fā)中心)、硝酸銀(silver nitrate) (ACS>99.0%， BBI原裝，Canada) 、 37°/0甲醛(formaldehyde) (ACS 36%~38%， BBI 原裝，Canada)、無7jC碳酸鈉(sodium carbonate, anhydrous) (ACS〉99.5%，美國Amresco 公司)、硫代硫酸鈉(sodiumthiosulfate) (AR，天津市蘇莊化學試劑廠)
3、 溶液配制
銀染固定液(10%冰乙酸)
冰乙酸 200 ml
ddH20 1 800 ml
銀染染色液(lg/L硝酸銀，0.056%甲醛)
硝酸銀 2 g
37%甲醛 3 ml
ddH20 to 2L 銀染顯色液(30g/L碳酸鈉，0.056%甲醛，2mg/L硫代硫酸鈉)
無水碳酸鈉 60 g
ddH20 to 2L 冷卻至4 10°C。在臨用前立即向碳酸鈉溶液中加入3 ml 37%甲醛和400 pi 10 mg/ml硫代 硫酸鈉溶液，既成顯色液。 4、染色程序
染色過程要求凝膠浸在塑料盤內的溶液中，因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類 似。在盤中加入新鮮溶液之前必須用高質量的水洗滌盤子。
(1) 電泳結束后卸下膠板，用手術刀片小心地分開兩塊玻璃板，去掉壓片，凝膠應該牢固地 附著在平玻璃板上。
(2) 固定凝膠將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定溶液2L浸沒，充分振蕩20min或至 樣品中指示劑完全消失。膠亦可在固定溶液中保存過夜(不要振蕩)。保留固定溶液，以備用 于終止顯色反應。
(3) 洗膠用超純水振蕩洗膠3次，每次3min。從水中取出，在進行下一步洗滌之前，拿 著膠板邊緣靜止10 20s，使水流盡，再進行下一步操作。
(4) 凝膠染色往染色盤中倒入2L染色液，把凝膠移至染色溶液中，充分振蕩40min。
(5) 凝膠顯色-
1) 顯色液的配制在上一步即將結束時，向預冷至4 10°。的碳酸鈉溶液中加入37%甲醛3 ml和10mg/ml的硫代硫酸鈉溶液400 pl，既成顯色液。往顯色盤中倒入預冷的顯色液1 L， 放在一邊，其余顯色液仍放在冰浴中。把凝膠從染色液中取出，放在一邊，染色液回收到 燒杯中，盤清洗后加入超純水。
2) 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5 10 s。注意，把凝膠從超純水中 轉移到顯色溶液中時動作要快，總時間不能長于5 10s。浸泡時間過長則導致信號微弱或 喪失信號。若浸泡時間過長，可重復用染色液浸泡染色。
3) 立刻將凝膠轉移至1L(總量的一半)預冷的顯色液中，充分振蕩，直至模板條帶開始顯現(xiàn) 或開始出現(xiàn)第一批條帶，倒掉顯色液，把新鮮的1L顯色液倒入盤中，使凝膠繼續(xù)顯色2 3min，或直至所有條帶出現(xiàn)。
(6) 終止顯色反應棄掉顯色液，加入1L固定溶液，置搖床上反應2 3 min，終止顯色反 應，固定凝膠。
(7) 洗膠在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2min。注意在本操作中應戴手套拿著膠板邊 緣，避免在膠上印上指紋。
(8) 干膠將凝膠置于室溫干燥，觀察并照相、掃描保留實驗結果。
實施例14
AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色的歩驟為
(1)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1)向AFLP選擇性擴增PCR產物中加入上樣緩沖溶液，所述AFLP選擇性擴增PCR產物與上 樣緩沖溶液的體積比為8 : 3制成上樣混合物；經60W恒功率預電泳20min后，取3pl上 樣混合物加樣到6%變性聚丙烯酰胺凝膠上以60W恒功率電泳150min，亦即至二甲苯青FF 指示帶距凝膠底部2cm時終止電泳； (2)變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染色
1) 電泳結束后，取下膠板，放入2L體積百分濃度為10%的冰乙酸水溶液即固定液中固定， 充分振蕩10 min或至指示劑完全消失；
2) 用超純水振蕩洗膠4次，每次2 min;
3) 把凝膠移至2L染色溶液中，染色溶液為含有1 g/L硝酸銀、1.5ml/L37。/。甲醛的水溶液， 充分振蕩20 min;
4) 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5 s，立刻將凝膠轉移至l L預冷的 顯色液中，顯色液為含有30g/L碳酸鈉、2mg/L硫代硫酸鈉、1.5 ml/L 37%甲醛的水溶液， 充分振蕩，直至模板條帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶，倒掉顯色液，把新鮮的1 L預 冷的顯色液倒入盤中，使凝膠繼續(xù)顯色3min，或直至所有條帶出現(xiàn)；
5) 待凝膠完全顯色后，加入l L固定溶液，振蕩3 min，終止顯色反應，固定凝膠；
6) 在超純水中浸洗凝膠2次，每次5 min;
7) 將凝膠置于室溫自然干燥，觀察并拍片、保存實驗結果； 實施例15
AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色的步驟為 (1)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
1)向AFLP選擇性擴增PCR產物中加入上樣緩沖溶液，所述AFLP選擇性擴增PCR產物與上 樣緩沖溶液的體積比為8 : 3制成上樣混合物；經60W恒功率預電泳50min后，取6pl上 樣混合物加樣到6%變性聚丙烯酰胺凝膠上以60W恒功率電泳120min,亦即至二甲苯青FF 指示帶距凝膠底部5cm時終止電泳； (2)變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染色
1) 電泳結束后，取下膠板，放入2L體積百分濃度為10%的冰乙酸的水溶液為固定液，充 分振蕩30 min或至指示劑完全消失；
2) 用超純水振蕩洗膠2次，每次5min;
3) 把凝膠移至2L染色溶液中，染色溶液為含有1 g/L硝酸銀、1.5 ml/L37。/。甲醛的水溶液， 充分振蕩40 min;
4) 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗10 s，立刻將凝膠轉移至1 L預冷的 顯色液中，顯色液為含有30g/L碳酸鈉、2mg/L硫代硫酸鈉、1.5 ml/L 37°/。甲醛的水溶液， 充分振蕩，直至模板條帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶，倒掉顯色液，把新鮮的l L預
冷的顯色液倒入盤中，使凝膠繼續(xù)顯色2min，或直至所有條帶出現(xiàn)
5) 待凝膠完全顯色后，加入l L固定溶液，振蕩2 min,終止顯色反應，固定凝膠；
6) 在超純水中浸洗凝膠2次，每次2min;
7) 將凝膠置于室溫自然干燥，觀察并拍片、保存實驗結果； 實施例16
差異片段的回收、擴增、克隆、.測序及同源相似性檢索分析步驟為
(1) 差異片段DNA的回收
用刀片從聚丙烯酰胺凝膠上切下差異條帶，放入一干凈無菌的離心管中，加入超純水 35^11，置沸水浴中15 min，然后5000 r/min離心7 min，收集上清液備用；
(2) 回收差異片段DNA的PCR再擴增
PCR再擴增的反應體系總體積為50 nl，其中包括差異片段DNA的回收上清液7 pl， Taq I選擇性擴增引物lOpmol， Pst I選擇性擴增引物lOpmol， 1 XTaq PCR MasterMix，其 中l(wèi)XTaq PCRMasterMix的成分終濃度為10 mmol/LTris-HCl pH8.3， 50mmol/LKCI， 1.5 mmol/LMgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件進行PCR 擴增反應94°C 0.5min， 56°C lmin， 72°C 0.5min， 25個循環(huán)后，72°C 15 min，經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳證實有PCR產物，8'C保存；
(3) 克隆
回收差異片段DNAPCR再擴增產物經純化后，與pMD18-T載體質粒進行連接，將連 接有回收差異片段DNAPCR再擴增產物的T載體質粒轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞， 使T載體質粒重組子擴增、提取、酶切鑒定，T載體質粒重組子的酶切鑒定反應體系總體 積為20(il，其中包括T載體質粒重組子6pl， SalI10u， Xba I 10u， 1Xbuffer，混勻后，37 。C 3h， 70°C 5min;
T載體質粒重組子用Xba I和Sal I內切酶進行酶切，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，可見 2 681 bp和11+差異片段長度bp的兩個片段時為陽性質粒重組子，將獲得的差異片段 DNA-T載體質粒陽性重組子進行測序分析差異片段DNA的核苷酸序列；
(4) 同源相似性檢索分析
將測序分析得到的DNA核苷酸序列在美國國家生物技術信息中心基因組核酸數(shù)據(jù)庫 中進行同源相似性檢索分析。 實施例17
片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析步驟為
(1) 差異片段DNA的回收
用刀片從聚丙烯酰胺凝膠上切下差異條帶，放入一干凈無菌的離心管中，加入超純水 40 |il，置沸水浴中20 min，然后8 000 r/min離心10 min，收集上清液備用；
(2) 回收差異片段DNA的PCR再擴增 PCR再擴增的反應體系總體積為50pl，其中包括差昇片段DNA的回收上清液7m1，
Taq I選擇性擴增引物lOpmol， Pst I選擇性擴增引物lOpmol， 1 XTaq PCRMasterMix ，其
中1XTaqPCRMasterMix的成分終濃度為:10 mmol/LTris-HCl pH8.3， 50mmol/LKCI， 1.5 mmol/LMgCl2， 250 |jmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件進行PCR 擴增反應94°C 2min， 65°C 0.5min， 72。C2min， 40個循環(huán)后，72°C 5 min，經1.5%瓊 脂糖凝膠電泳證實有PGR產物，4'C保存；
(3) 克隆
回收差異片段DNAPCR再擴增產物經純化后，與pMD18-T載體質粒進行連接，將連 接有回收差異片段DNAPCR再擴增產物的T載體質粒轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞， 使T載體質粒重組子擴增、提取、酶切鑒定，T載體質粒重組子的酶切鑒定反應體系總體 積為20^i，其中包括T載體質粒重組子6jul， SalI10u， Xba I 10u， 1Xbuffer，混勻后，37 °C lh， 70°C 15min;
T載體質粒重組子用Xba I和Sal I內切酶進行酶切，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，可見2 681 bp和11+差異片段長度bp的兩個片段時為陽性質粒重組子，將獲得的差異片段DNA-T載 體質粒陽性重組子進行測序分析差異片段DNA的核苷酸序列；
(4) 同源相似性檢索分析
將測序分析得到的DNA核苷酸序列在美國國家生物技術信息中心基因組核酸數(shù)據(jù)庫 中進行同源相似性檢索分析。 實施例18
差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析步驟為 (一)、差異片段的回收和擴增
1、 主要儀器和材料 PCR儀(同前) 電泳儀(同前)
2、 主要試劑
Taq PCR MasterMix (同前) PCR擴增引物(同前)
3、 方法
(1) 差異片段DNA的回收
1) 仔細觀察銀染后的聚丙烯酰胺凝膠上免疫磁性特異分離組、免疫磁性非特異吸附組、裸 磁顆粒非特異吸附組、空白對照組各泳道上的條帶分布，找出免疫磁性特異分離組與免疫 磁性非特異吸附組和裸磁顆粒非特異吸附組之間的差異條帶。
2) 用鋒利的手術刀片直接從聚丙烯酰胺凝膠上切下差異條帶，放入一干凈無菌的離心管 中。
3) 向管中加入超純水30pl，置沸水浴中10min。 .
4) 3 000 r/min離心5 min,收集上清液備用。
(2) 回收差異片段DNA的PCR再擴增
由于PAGE的樣品上樣量較少，從片段中回收的差異片段DNA的量亦較少，故需對回收產
物進行PCR再擴增，所用引物與該產物AFLP-PCR選擇性擴增的引物相同, PCR再擴增的反應體系
回收產物上清液 Taql選擇性擴增引物 Pstl選擇性擴增引物 Taq PCR MasterMix H20
Total
7^1 2^1 2 nl 25 pi 14 pi 50 pi
PCR再擴增的反應條件:
1)94 °C2 min
2)94 °C30 s
3)60 °C30 s
4)72 。C]min
5)Go to 2)，repeat 39 cycles
6)72 °C10 min
7)4°Chold
PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有回收產物。見圖10和圖11，圖10中，M: DNA Marker DL2000;其余泳道為不同差異條帶的回收再擴增產物。 圖11中，中間為DNA Marker DL2000;其余泳道為不同差異條帶的回收再擴增產物。 (二)、差異片段的克隆和測序
1、 主要儀器 紫外分析儀(同前)
電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司) 臺式高速冷凍離心機(同前)
2、 主要試劑
回收DNA片段PCR再擴增產物
TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (大連寶生物公司) T載體質粒pMD18-T vector (大連寶生物公司)
X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- P -D-Galactoside)(大連寶生物公司) IPTG(Isopropyl- P -D-thiogalactopyranoside)(大連寶生物公司) ￡ co// competent cell DH5 a (大連寶生物公司) 質粒提取試劑盒(美國Promega公司)
3、 主要試劑的配制
(1) LB培養(yǎng)基(pH-7.2):胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， NaCl 10 g，加超純水至1 000 ml， 加碳酸鈉調pH至7.2，高壓消毒后備用。
(2) 5XX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚—e-半乳糖苷):溶解25 mg的X-gal于1 ml的二甲基
甲酰胺(DMF)，用鋁箔包裹裝液管，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?br> (3)氨芐青霉素(ampicillin)(100mg/ml):溶解lg氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定 容至10 ml。分裝后于-20'C貯存。以25 50^g/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。 4、方法 .
(1)回收DNA片段PCR再擴增產物的回收和純化 1 )用1 XTBE緩沖液配制1.5%的瓊騁糖凝膠，然后對目的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳， 約35 min。
2) 在紫外分析儀中觀察凝膠中DNA條帶的位置，與預計大小相符時，用鋒利刀片切下含 有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的電泳緩沖液，并盡量切除多余的凝 膠，減小凝膠體積，提高DNA的回收率。
3) 稱量凝膠塊的重量，根據(jù)lmg^W計算凝膠塊的體積。
4) 切碎膠塊，可縮短回收時間，提高DNA回收率。
5) 向膠塊中加入膠塊溶合融化液DR-I buffer,加入DR-I buffer的量是凝膠塊體積的4 倍。
6) 混合均勻后，置75"C水浴中加熱融化膠塊，約10 min，此間應間斷振蕩混合，使膠塊 充分融化。否則，會嚴重影響DNA的回收率。
7) 向上述膠塊融化液中加入DR-I buffer 1/2體積量的DR-I1 buffer,混合均勻。當回 收片段小于400 bp時，應在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。
8) 將Spin Column柱裝入Collection管中。
9) 將步驟7)中的溶液轉移到Spin Column柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液。如將 濾液再加入到Spin Column柱中離心一次，可提高DNA的回收率。
10) 將500(^1的Rinase A加入到Spin Column柱中，12 000 r/min離心30 s，棄濾液。
11) 將700 |al的RinaseB加入到Spin Column柱中，12 000 r/min離心30 s，棄濾液。
12) 重復步驟11)。
13) 將Spin Column柱安裝到新的1.5 ml離心管中，向Spin Column柱膜的中央處滴加預熱 到60'C的滅菌超純水25 |al，室溫靜置1 min。
14) 12 000 r/min離心1 min洗脫DNA，收集洗脫液(含有差異片段DNA)分裝凍存?zhèn)溆谩?(2)差異片段的克隆和測序
1) T載體簡介
pMD18-T Vector是一種高效克隆PCR產物(TA cloning)的專用載體，由pUC18載體 改建而成，在pUC18、 pUC19載體的多克隆位點處導入了 EcoRV識別位點，使用EcoRV 進行酶切反應后，再在兩側的3'端添加"T"而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR 反應時都有在PCR產物的3'末端添加一個"A"的特性，所以使用這種載體可以進行PCR 產物的連接和克隆。
2) T-A連接與克隆 ①T-A連接
連接反應體系在冰水浴中向200 pi PCR管中加入以下成份并混勻，以H20代替純 化的PCR產物進行連接反應為陰性對照。
pMD18-T Vector(50 ng/^il) 1 ^il
差異片段DNA回收洗脫液 1 nl
連接液Solution I 5 |il
H20 3 pi
Total 1(M 連接反應條件16°C 30min， .2(TC保存?zhèn)溆谩?br> ② 用T-A連接產物轉化大腸桿菌DH5 ct感受態(tài)細菌
a. 用冷卻的無菌吸頭取200 pi感受態(tài)細胞懸液，轉移到無菌1.5ml離心管中，再加 入T-A連接產物或陰性對照組的連接產物10 jal，輕輕旋轉混勻，在冰水浴中放置 30 min。
b. 將離心管放到42'C水浴中，熱沖擊lmin，不要搖動離心管。
c. 快速將離心管轉移到冰水浴中，使細胞冷卻2 min。
d. 每管加800 ^1LB培養(yǎng)基，37'C輕搖(轉速不超過225 r/min) 1 h;以使細胞復蘇 并增加感受效率。
e. 取lOOpl轉化液涂抹含有X-Gal、 IPTG和Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基，置于37 'C至液體被吸收后倒置平板，于37'C培養(yǎng)，12-16 h后可出現(xiàn)菌落。pMD18-T Vector 和差異DNA片段結合成陽性重組子，其菌落為白色，pMD18-T Vector自身環(huán)化成 陰性重組子，其菌落為藍色。
③ T-A克隆的擴增與提取
a. 從平板上挑一個白色或藍色單菌落，加入含Amp的LB培養(yǎng)基中，37。C振搖培養(yǎng)過 夜，直至菌液明顯混濁。
b. 吸取菌液5ml于EP管中，室溫，10 000Xg離心1 min。
c. 棄上清，將細菌沉淀以250 ^ Solution I(含RNAase)重懸，吹打并劇烈振蕩以混勻 細菌。
d. 溫和加入Solution II 250^1，輕柔顛倒混合數(shù)次，室溫放置5 min,可見菌液完全清 亮。
e. 溫和加入Solution III 350 pl，輕柔顛倒混合至見白色絮狀沉淀；室溫12 000Xg離 心10 min。
f. 將上清小心轉移至吸附柱中(勿吸白色沉淀)，然后將吸附柱置入試劑盒所配的2 ml EP管中，室溫10 000Xg離心1 min。
g. 棄濾液，在吸附柱中加入500 pi Buffer HB，室溫10000Xg離心1 min。
h. 棄濾液，向吸附柱中加750 nl wash buffer,室溫10 000Xg離心1 min，使溶液過 柱。重復此步驟一次。
i. 室溫10 000Xg離心2min，徹底除去washbuffer。 j.把吸附柱放入無菌的1.5mlEP管中，加無菌水30pl于吸附柱中。 k.室溫10 000Xg離心1 min，此時濾液中含有T-A連接所形成的質粒。 ④T-A克隆的酶切鑒定
pMD18-T Vector的T克隆位點位于Xba I和Sal I兩個酶切位點之間，二者之間 為11 bp，用這兩種酶進行雙酶切時，產生2 681 bp和11 bp兩個片段，在1.5%的瓊 脂糖凝膠電泳時，由于11 bp的片段太小，只能看到2 681 bp的條帶，如將DNA片 段成功插入T克隆位點后再進行雙酶切，電泳時則可見2 681 bp和11+差異片段長度 bp的兩個片段。
見圖12，圖中M: 100 bp DNA Ladder Marker; 1:陽性重組質粒；2:陰性重組質粒 酶切反應體系
10 x buffer 2 pi
重組質粒 6 )J
Sal I 1
Xba I 1 ^
ddH20 10 pi
Total 20 )il
酶切反應條件37°C 2h。. 然后經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。將獲得的差異片段DNA-T載體陽性重組子送交北 京Imdtrogen公司進行測序分析差異片段DNA的核苷酸序列。
共獲得125條差異片段DNA的核苷酸序列，將測序分析得到的DNA核苷酸序列在美 國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)中的全基 因組核酸數(shù)據(jù)庫中進行BLAST(basic local alignment search tool,基本局部相似性査詢工具) 相似性檢索分析，與數(shù)據(jù)庫中所有已知序列相比，尋找與待查序列有足夠相似性的序列， 以提供功能相似的估計，或者確定該序列在基因組中是一個新的序列。把新的未知核苷酸 序列向GenBank申請?zhí)峤蛔浴?現(xiàn)舉例說明. 如25-1序列
tcctatatag ctactgcctg tctctcacct cctcaatgct aatcatgctc aggtcttcca 60 ggccattagt gctgaaatag ggctgccaag ggttaatgag tcctggctcc ctctgttctc 120 atctctttag agggacaagc tggccctagg ctctatctag cctgtgggac aggtaaccaa 180 ggagcacggg tgagagttgc agaacccaag tcaaagacta cagggatggg tcctctcatc 240 tttactcaga gggaacctgt agtatagatg ctgtctgttc aggagcaccg ttcgctcagg 300 actcatca 308
經BLAST相似性檢索分析后，其對應的基因是已知基因Ngfb (nerve growth factor, beta [Mus musculus ], GeneID: 18049沐1 Tspan2 (tetraspanin 2 [ Mus musculus ]， GeneID: 70747)。 如25-3序列
ccagcactgg gtgctctgtg aatacttaaa agattccagc ccgtcttttc ctgcttctct 60 ctgggtgatt cttattttta tctcctccac aacttcctac ttaattttaa ctttccgttc 120 cctcctggct ggtttatatt ccaggaggct ctatgctatt cagttcctta tgactccttc 180 taacagcgtt cgctcaggac. tcatca 206
經BLAST相似性檢索分析后，其對應的基因是未知功能的已知基因2410003LllRikRIKEN cDNA2410003L11 gene [ Mus musculus ]， .GenelD: 69729。 如38-3序列
gacggccgtc atgcagactc aatgcaatcc ccattaaaat tccaactcaa ttattcaacg 60 aattagaagg agcaatttgc aaattcatct ggaataacaa aaaaccgagg atagcaaaaa 120 ctcttctcaa gggtaaaaga acctctggtg gaatcaccat gccagaccta aagctttatt 180 acagagcaat tgtgataaaa actgcatggt actggtatag agacagacaa gtggaccaat 240 ggaatagaat tgaagaccca ggaatgaacc cacacaccta tggtcgcttg atcttcgctc 300 aggactcatc 310
經BLAST相似性檢索分析后，該序列為與已知基因沒有同源相似性的核苷酸序列， 已向GenBank提交注冊為新序列，該序列在GenBank的基因登錄號為EF473141 。 實施例19
研究結果
1、 以擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)和免疫磁性分離(IMS)相結合，成功建立了基于小鼠 全基因組的高效、特異篩選BPDE致癌相關基因的方法。
2、 成功獲得了清晰的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶圖譜和與BPDE作用的差異DNA 片段條帶圖譜，并成功對差異片段進行了回收、擴增、克隆測序，共獲得125條差異片段 DNA的核苷酸序列。
3、 經BLAST分析發(fā)現(xiàn)有193條已知基因與差異片段核苷酸序列有同源性，主要為 信號轉導及通路、生長發(fā)育、血管生成、免疫及炎性反應、轉錄調控、細胞分化等方面的 基因和一些未知功能的基因。有6條未知核苷酸序列，向GenBank提交注冊，已被GenBank 接受為新序列并給予相應的基因登錄號分別為EF176681、 EF473140、 EF473141 、 EF473142、 EF473143、 EF473144。這些基因和序列有可能是與BPDE致癌相關的基因序列。
研究結論
1、 擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)和免疫磁性分離(IMS)技術相結合的方法，適用于在小 鼠全基因組篩選BPDE致癌相關基因。
2、 AFLP與IMS技術相結合，共獲得125條差異片段DNA的核苷酸序列。經BLAST 分析發(fā)現(xiàn)有193條己知基因與差異片段核苷酸序列有同源性，有6條未知核苷酸序列， 這些基因和序列有可能是與BPDE致癌相關的基因和序列。
權利要求
1.BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，包括如下步驟(1)從正常肺組織中提取基因組DNA；(2)AFLP DNA片段的制備基因組DNA經雙酶切獲得AFLP DNA片段；(3)與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分離AFLP DNA片段與BPDE孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒，在磁場作用下，使與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分離出來；(4)AFLP PCR擴增AFLP DNA片段與接頭的連接，預擴增和選擇性擴增；(5)AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色；(6)差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述AFLP DNA片段的制備為(1) 用T叫I消化準備4-6個反應體系，每個反應體系總體積為20 pl，其中包括DNA 300 ng， T叫I 10u， 1Xbuffer，其中l(wèi)Xbuffer的成分終濃度為50 mM Tris-HCl pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50 mM NaCl，混勻后，65'C恒溫水浴消化1 3 h;(2) 向每一反應體系中補加Pst I 10u， 3廣C恒溫水浴消化l 3h后，70 75。C水浴10 20 min滅活酶的活性，4 8。C保存?zhèn)溆茫?3) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的酶切情況。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述與 BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分離的步驟為(1)納米磁顆粒免疫分離BPDE-DNA片斷1) 取所述AFLP DNA片段20 pl，分成4組放入試管中免疫磁性特異分離組、免疫磁性 非特異吸附組、裸磁顆粒非特異吸附組、正常對照組；2) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入2 mmol/L的BPDE 0. 5 2 pl，其余各組分 別加入0.5 2 pl滅菌超純水，37'C避光孵育3 7 d;3) 向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入體積比為10 : 4的乙酸乙酯和乙醚20 22 pl， 輕搖混勻，靜置l 4min，除去含有未結合BPDE的上層液相，重復2 4次，純化、沉淀 DNA-BPDE加合物，加20 pl水重懸DNA-BPDE加合物；4) 向所述免疫磁性特異分離組和免疫磁性非特異吸附組中加入針對BPDE抗原的免疫納米 磁性顆粒0.5 2nl，向所述裸磁顆粒非特異吸附組中加入裸磁顆粒0. 5 2 nl，向所述 正常對照組中加入滅菌超純水0. 5 2 pl，室溫、避光、輕搖10 30 niin;5) 把各試管放入磁分離架上，在磁場作用2 5 min，磁顆粒貼附在管壁一側，小心吸棄 上清液，用滅菌超純水30 40 pl洗2 4次，每次2 5 min;6) 加5 pl滅菌超純水溶解，即得到與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒復合物溶液； (2) AFLP-DNA片段與磁顆粒的解離把歩驟(1)中得到的放置有與BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫納米磁顆粒復合 物溶液的試管放入沸水浴中10 15 min，然后8000 11 000 r/min離心5 10 min，收 集上清液，使AFLP-DNA片段與抗原抗體磁顆粒復合物解離，即獲得含有與BPDE相互作用 的AFLP DNA片段，-2CTC凍存?zhèn)溆谩?br> 4. 根據(jù)權利要求3所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述針 對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒的制備步驟為(1) 取裸納米磁顆粒330 pi,加入一干凈滅菌的1.5 ml離心管中；(2) 在磁場作用2 5 min，吸棄上清；(3) 取0. 1 raol/L pH7. 8磷酸緩沖液330 pl重懸裸納米磁顆粒，再加入BPDE單克隆抗體 500(4) 20 25。C孵育10 20 min，然后加入牛血清白蛋白至終濃度為lmg/ml;(5) 在避光條件下，4 8'C孵育10 16 h，不時輕輕顛倒；(6) 把離心管放入磁分離架作用2 5 min，吸棄上清；(7) 向管中加330 pl pH7.4磷酸鹽緩沖液，用移液器槍頭輕輕吹打混勻，20 25匸孵育 5 10 min，輕輕顛倒；(8) 重復步驟(6)、 (7)各2次；(9) 把離心管放入磁分離架作用2 5 min，吸棄上清；(10) 從分離架上取出離心管，加入330 pl pH 7.4磷酸鹽緩沖液重懸納米磁顆粒一抗體 耦合物，即成針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述AFLP PCR擴增的步驟為(1) AFLP-DNA片段與接頭的連接連接反應體系總體積為20 其中包括AFLP-DNA片段5 pl， Taq I接頭5 pmol， Pst I接頭2 pmol， T4 DNA ligase 400u， IXbuffer,其中IXbuffer的成分終濃度為 50mM Tris-HCl， 10mM MgCl2， 10mM DTT， ImM ATP， 25pg/ml BSA， pH 7.5;連接反應條件 為16 25°C 1 4 h， 70°C 5 15 min， 4 8。C保存；所述 Taql接頭為5' -GACGATGAGTCCTGA G -3' 3' -TACTCAGGACT CGC-5' Pstl接頭為5' -GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3' 3' -GCACTGCCGGCAG T —5'(2) AFLP預擴增PCR:AFLP預擴增PCR反應體系總體積為20 pl，其中包括從所述歩驟(1)獲得的連接 產物1 pl， Taq I預擴增引物5 pmol， Pst I預擴增引物5 pmol， IXTaq PCR MasterMix，其中l(wèi)XTaq PCRMasterMix的成分終濃度為10匪ol/L Tris-HCl pH8. 3， 5O國ol/LKC1， 1.5 mmol/L MgCL， 250 )amol/L dNTP each， 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件 進行PCR擴增反應94°C 0. 5 lmin， 56°C 0. 5 2min， 72°C 0. 5 2min， 20 40個 循環(huán)后，72°C 5 15 min， AFLP預擴增PCR產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳證實有彌散條帶 出現(xiàn)后，稀釋20 50倍，4 8'C保存?zhèn)溆?；所述Taq I預擴增引物為 5' -GATGAGTCCTGAG CGA A-3' Pst I預擴增引物為 5' -GACGGCCGTCA TGCAG A-3' (3) AFLP選擇性擴增PCRAFLP選擇性擴增PCR反應體系總體積為20 )til，其中包括AFLP預擴增PCR產物稀 釋液l)nl， Taql選擇性擴增引物5 pmol， Pst I選擇性擴增引物5 pmol， lXTaq PCR MasterMix，其中l(wèi)XTaq PCR MasterMix的成分終濃度為:10 mmol/L Tris-HC1 pH8. 3， 50 mmol/L KC1， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each， 2u Taq polymerase,混勻 后，按下述條件進行PCR擴增反應94°C 0. 5 lmin， 65°C 0. 5 lmin， 72°C 0. 5 2min，其中退火溫度從65'C開始每循環(huán)降低0.7t:，共12個循環(huán)，12個循環(huán)后反應條件 變?yōu)?4。C 0. 5 lmin， 56°C 0. 5 lmin， 72°C 0. 5 2min ， 20 30個循環(huán)后，72°C 5 15 min， AFLP選擇性擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實有條帶后，4 8'C保存， 然后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；所述AFLP選擇性擴增PCR所用Taq I選擇性擴增引 物為4條，Pst I選擇性擴增引物為4-5條，組合成4-20對引物組合。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述4 條Taq I選擇性擴增引物分別為Taql選擇性擴增引物l 5' -GATGAGTCCTGAGCGAACG-3' Taq I選擇性擴增引物2 5' -GATGAGTCCTGAGCGAATG-3' Taql選擇性擴增引物3 5' -GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3' Taql選擇性擴增引物4 5' -GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3' 所述4-5條Pst I選擇性擴增引物分別為Pstl選擇性擴增引物l 5' -GACGGCCGTCATGCAGAGC-3'Pst I選擇性擴增引物2 5' -GACGGCCGTCATGCAGATG-3'Pst I選擇性擴增引物3 5' -GACGGCCGTCATGCAGACT-3' Pstl選擇性擴增引物4 5' -GACGGCCGTCATGCAGAAC-3'Pst I選擇性擴增引物55' -GACGGCCGTCATGCAGATT-3' 所述20對引物組合分為12345678910P1T1P1T2P1T3P1T4P2T1P2T2P2T3P2T4P3T1P3T211121314151617181920P3T3P3T4P4T1P4T2P4T3P4T4P5T1P5T2P5T3P5T4
7.根據(jù)權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色的歩驟為(1) 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳向AFLP選擇性擴增PCR產物中加入上樣緩沖溶液，所述AFLP選擇性擴增PCR產物與 上樣緩沖溶液的體積比為8 : 3制成上樣混合物；經60W恒功率預電泳20 50min后，取3 6^1上樣混合物加樣到6%變性聚丙烯酰胺凝膠上以60W恒功率電泳120 150min，亦即至 二甲苯青FF指示帶距凝膠底部2 5cm時終止電泳；(2) 變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染色1) 電泳結束后，取下膠板，放入2L體積百分濃度為10%的冰乙酸水溶液即固定液中固定， 充分振蕩10 30 min或至指示劑完全消失；2) 用超純水振蕩洗膠2 4次，每次2 5 min;3) 把凝膠移至2L染色溶液中，染色溶液的成分為含有l(wèi) g/L硝酸銀、1.5 ml/L 37%甲醛 的水溶液，充分振蕩20 40 min;4) 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5 10 s，立刻將凝膠轉移至l L預 冷的顯色液中，顯色液的成分為含有30 g/L碳酸鈉、2 mg/L硫代硫酸鈉、1.5 ml/L 37% 甲醛的水溶液，充分振蕩，直至模板條帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶，倒掉顯色液， 把新鮮的l L預冷的顯色液倒入盤中，使凝膠繼續(xù)顯色2 3 min，或直至所有條帶出現(xiàn)；5) 待凝膠完全顯色后，加入1 L固定溶液，振蕩2 3 min，終止顯色反應，固定凝膠；6) 在超純水中浸洗凝膠2次，每次2 5 min;7) 將凝膠置于室溫自然干燥，觀察并拍片、保存實驗結果。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述差 異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析步驟為(1) 差異片段DNA的回收用刀片從聚丙烯酰胺凝膠上切下差異條帶，放入一干凈無菌的離心管中，加入超純水 30 40 ial，置沸水浴中10 20 min，然后3 000 8 000 r/min離心5 10 min，收集上 清液備用；(2) 回收差異片段DNA的PCR再擴增 PCR再擴增的反應體系總體積為50pl，其中包括差異片段DNA的回收上清液7pl，Taq I選擇性擴增引物10 pmol， Pst I選擇性擴增引物10 pmol, lXTaq PCR MasterMix， 其中1 XTaq PCR MasterMix的成分終濃度為10 mmol/L Tris-HC1 pH8. 3， 50 mmol/L KC1， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each， 2u Taq polymerase,混勻后，按下述條件進 行PCR擴增反應94°C 0. 5 2min， 56 65°C 0. 5 lmin， 72°C 0. 5 2min， 25 40個 循環(huán)后，72°C 5 15 min，經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳證實有PCR產物，4 8。C保存；(3) 克隆回收差異片段DNA PCR再擴增產物經純化后，與pMD18-T載體質粒進行連接，將連接 有回收差異片段DNA PCR再擴增產物的T載體質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，使T 載體質粒重組子擴增、提取、酶切鑒定，T載體質粒重組子的酶切鑒定反應體系總體積為 20|_d，其中包括T載體質粒重組子6nl， Sal I 10u， Xba I 10u， lXbuffer，混勻后，37 °C 1 3 h， 70°C 5 15 min:T載體質粒重組子用Xba I和Sal I內切酶進行酶切，經1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，可 見2 681 bp和ll+差異片段長度bp的兩個片段時為陽性質粒重組子，將獲得的差異片段 DNA-T載體質粒陽性重組子進行測序分析差異片段DNA的核苷酸序列； (4)同源相似性檢索分析將測序分析得到的DNA核苷酸序列在美國國家生物技術信息中心基因組核酸數(shù)據(jù)庫中 進行同源相似性檢索分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，包括如下步驟(1)從正常肺組織中提取基因組DNA；(2)AFLP DNA片段的制備；(3)與BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分離；(4)AFLP PCR擴增；(5)AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色；(6)差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析，本發(fā)明的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，為一高效、特異的方法，在全基因組水平篩選出更多的BPDE致癌易感基因，為闡明BPDE的致癌分子機制打下基礎。
文檔編號C12Q1/68GK101113474SQ20071005841
公開日2008年1月30日 申請日期2007年7月27日 優(yōu)先權日2007年7月27日
發(fā)明者李君文, 王新為, 王景峰, 諶志強, 邱志剛, 敏 金, 陳照立 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所