專利名稱：一種從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用生物技術(shù)從無花果樹樹葉
中提取超氧化物歧化酶(SOD)。
背景技術(shù)：
無花果英文名Fig，學(xué)名FicuscaricaL。為?？?Moraceae)榕屬 (FicusL.)多年生亞熱帶落葉果樹，小喬木或灌木。又稱壽果、明日果、 蜜果，原產(chǎn)于地中海沿岸的西亞沙特阿拉伯、也門一帶沙漠綠洲里，是 人類最早栽培的果樹之一。無花果葉含有黃酮、果膠、樹脂、e-谷甾醇、 P-香樹脂醇、蛇麻脂醇、棕櫚酸、纈草酸、愈瘡木酚、廿八烷、蕓香苷、 苯甲醛、呋喃香豆素，補骨脂素，佛手柑內(nèi)酯，其中某些被認為是抗癌 活性成分。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD,EC 1.15.11)是一種金屬 酶，分子量為31000—33000，由兩個亞基組成。SOD廣泛存在于生物細 胞內(nèi)和植物葉綠體基質(zhì)中。
1938年Mann和Keilin首次從牛血紅細胞中分離出一種藍色的含銅蛋 白(Hemocuprein) ; 1969年McCord禾卩Fridovich發(fā)現(xiàn)這種含銅蛋白能催 化超氧陰離子自由基(02— )發(fā)生歧化反應(yīng)，將其命名為超氧化物歧化 酶(Superoxide dismutase， SOD) 。 SOD是生物體內(nèi)超氧自由基的專一 清除劑，能清除人體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(02—■)，消除活性氧 毒性，在生物體內(nèi)自由基產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中起著重要作用，是生
物體內(nèi)一種重要的防御酶。由于具有巨大的藥用價值和廣闊的應(yīng)用前 景，多年來對SOD的研究與應(yīng)用一直受到科學(xué)界和企業(yè)界的極大關(guān)注。
SOD的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究進展十分迅速，并已進行了臨床試驗。其臨 床應(yīng)用主要集中在抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老及皮膚病、心血管病等疾病 的預(yù)防和治療。隨著研究工作的不斷深入，SOD的應(yīng)用也越來越廣泛， 國外已有專利生產(chǎn)SOD消炎藥、含SOD的化妝品、抗輻射SOD膠囊、治 療局部缺血癥SOD藥劑等。美國、日本及西歐一些國家開發(fā)的重組人
soD藥物，已經(jīng)進行入ii期和in期臨床研究。我國也開展了基因重組
SOD的研究。
目前從植物中提取SOD的工藝流程植物組織或器官—組織破碎， 鹽溶液提取—離心收集上清液—硫酸銨分級沉淀—收集沉淀—水或緩 沖液溶解—丙酮沉淀—pH7.8磷酸鉀緩沖液溶解—離心除去不溶雜蛋白 —透析—Biogel P-60柱層析—收集活力組分—硫酸銨沉淀—pH7.8磷酸 鉀緩沖液溶解，透析—DE-32柱層析—收集活力組分—DE-32柱層析— 收集活力組分，濃縮得到SOD成品
相關(guān)資料表明，國內(nèi)外有關(guān)SOD分離提取工藝中均采用乙醇、丙 酮有機溶劑。若大規(guī)摸生產(chǎn)SOD，需回收乙醇、丙酮等有機溶劑，不僅 浪費人力物力，而且有機溶劑易燃易爆，用于工業(yè)生產(chǎn)將有重大的安全 隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶的方法，從 而可解決現(xiàn)有生產(chǎn)方法中采用有機溶劑提取導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，需回收乙 醇、丙酮等有機溶劑，浪費人力物力，及有機溶劑易燃易爆，用于工業(yè)
生產(chǎn)將有重大安全隱患等一系列問題。以無花果樹樹葉為原料，采用無 有機溶劑提取超氧化物歧化酶的方法未見有文獻報到。本發(fā)明采取的技 術(shù)方案是包括下列步驟 一、抽提
選新鮮或低溫保鮮的無花果樹樹葉100克，清洗，加入50(K1000mL 含0.1 0.5mMEDTA/0.1 0.5。/o甘油0.01 0.05% P -巰基乙醇、pH7.8的磷 酸鈉緩沖液，勻漿，抽提1~2小時，除渣過濾，5000~8000rpm離心10min;
二、 鹽析
向上清液中加入固體硫酸銨至40%飽和度，8000 10000rpm離心 10min，向上清中補加硫酸銨至85%飽和度，靜置1~2小時， 8000 10000rpm離心10 20min。沉淀用50 80ml的5~10mM， pH7.8的 磷酸鈉緩沖液溶解，并在4"C下對該緩沖液透析40 60小時，8000 10000rpm離心5 10min，收集上清液；
三、 陰離子交換層析
將上清液加入經(jīng)5~10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用5 10mM， pH7.8的磷酸鈉 緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，采用5 10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液含 0.1 0.2M的氯化鈉洗脫目的蛋白，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測 其酶活性，合并活性峰，凍干濃縮至3 5ml;
四、 Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析
將前經(jīng)凍干濃縮的樣品，加入經(jīng)5 10mM, pH7.8的磷酸鈉緩沖液 平衡的Sephacryl S-100HR層析柱，用5~10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液 洗脫，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰；進
行酶活檢測及相關(guān)鑒定。
本發(fā)明以新鮮無花果樹樹葉為原料，經(jīng)抽提，鹽析，離子交換層析，
分子篩層析，制備出穩(wěn)定的高活性的SOD。本發(fā)明所述無花果樹樹葉中 SOD的提取制備，工藝簡單、成本低、可擴大生產(chǎn)且環(huán)保無污染。本工 藝提取的無花果樹樹葉SOD具有活性高和穩(wěn)定性好等特點，在醫(yī)藥、 保健品及化妝品工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。


圖1無花果葉SOD的SDS-PAGE電泳圖譜，圖中
lanel:箭頭所示為經(jīng)S-100純化的SOD lane2: DEAE離子柱分離的SOD
M:低分子量標準蛋白Marker
圖2無花果葉SOD的PAGE電泳NBT活性染色圖譜，圖中 Laneh NBT染色，Lane2:考馬斯亮藍染色。
具體實施方式
實施例1 一、抽提
選新鮮或低溫保鮮的無花果樹樹葉100克，清洗，加入500mL含 0.1mMEDTA/0.1Q/。甘油0.01Q/。e-巰基乙醇、pH7.8的磷酸鈉緩沖液，勻 漿，抽提1小時，除渣過濾，5000rpm離心lOmin;
二、鹽析
向上清液中加入固體硫酸銨至40%飽和度，8000rpm離心lOmin， 向上清中補加硫酸銨至85%飽和度，靜置1小時，8000rpm離心lOmin。 沉淀用50ml的5mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解，并在4"C下對該緩沖
液透析40小時，8000rpm離心5min，收集上清液；
三、 陰離子交換層析
將上清液加入經(jīng)5mM ， pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用5~10mM， pH7.8的磷酸鈉 緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，采用5mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液含0.1M 的氯化鈉洗脫目的蛋白，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性， 合并活性峰，凍干濃縮至3ml;
四、 Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析
將前經(jīng)凍干濃縮的樣品上用5mM， pH7.S的磷酸鈉緩沖液平衡的 Sephacryl S-100 HR層析柱，用5mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液洗脫，以 紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰。
實施例2 一、抽提
選新鮮或低溫保鮮的無花果樹樹葉100克，清洗，加入750mL含 0.3mMEDTA/0.3。/。甘油0.03%3-巰基乙醇、pH7.8的磷酸鈉緩沖液，勻 漿，抽提1.5小時，除渣過濾，7000rpm離心10min;
二、 鹽析
向上清液中加入固體硫酸銨至40%飽和度，9000rpm離心10min， 向上清中補加硫酸銨至85。/。飽和度，靜置1.5小時，9000rpm離心15min。 沉淀用70ml的8mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解，并在4。C下對該緩沖 液透析50小時，9000rpm離心8min，收集上清液；
三、 陰離子交換層析
將上清液加入經(jīng)8mM ， pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的
DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用7mM， pH7,8的磷酸鈉緩 沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，采用7mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液含0.15M的 氯化鈉洗脫目的蛋白，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性， 合并活性峰，凍干濃縮至3.5ml;
四、Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析
將前經(jīng)凍干濃縮的樣品上用8mM， pH7.S的磷酸鈉緩沖液平衡的 Sephacryl S-100 HR層析柱，用8mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液洗脫，以 紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰。
實施例3 一、抽提
選新鮮或低溫保鮮的無花果樹樹葉100克，清洗，加入1000mL含 0.5mMEDTA/0.5。/。甘油0.05。/。P-巰基乙醇、pH7.8的磷酸鈉緩沖液，勻 漿，抽提2小時，除渣過濾，8000rpm離心10min;
二、 鹽析
向上清液中加入固體硫酸銨至40%飽和度，10000rpm離心10min， 向上清中補加硫酸銨至85%飽和度，靜置2小時，10000rpm離心20min。 沉淀用50 80ml的10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解，并在4"C下對 該緩沖液透析60小時，10000rpm離心10min，收集上清液；
三、 陰離子交換層析
將上清液加入經(jīng)10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用10mM， pH7.8的磷酸鈉緩 沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，采用10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液含0.2M的 氯化鈉洗脫目的蛋白，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，
合并活性峰，凍干濃縮至5ml;
四、Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析
將前經(jīng)凍干濃縮的樣品上用10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的 Sephacryl S-100HR層析柱，用10mM， pH7.8的磷酸鈉緩沖液洗脫，以 紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰。 實例無花果樹的葉SOD檢測
(1) 酶活檢測
采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的酶活性。酶活性單位定義在 25。C下，與325nm波長處，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時， 所需要的酶量，定義為一個酶活力單位。
因此，每毫升反應(yīng)液中酶活單位按下式計算
自氧化速率-樣液氧化速率,
V-—自氧化速率 x反應(yīng)液總體積xtffl1^ 50% 樣液體積
(2) 純度及分子量鑒定
參照Weber&Osbom方法，采用5%濃縮膠，15%分離膠，進行不連 續(xù)系統(tǒng)的SDS-PAGE，凝膠以考馬斯亮藍R-250染色，以pharmacia標 準蛋白為對照，考察產(chǎn)品的純度及分子量。從電泳圖譜(見附圖1)可 見，本工藝提取的SOD達到電泳純，亞基分子量為17800Da。
(3) NBT活性染色
參照Beauchamp和Fridovich方法，將提取的無花果樹樹葉SOD， 采用5%濃縮膠，10%分離膠，進行不連續(xù)系統(tǒng)的PAGE后，將凝膠進行 NBT染色，可見特異的SOD活性著色帶(見附圖2)。
權(quán)利要求
1、一種從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步驟一、抽提選新鮮或低溫保鮮的無花果樹樹葉100克，清洗，加入500～1000mL含0.1～0.5mM EDTA/0.1～0.5％甘油0.01～0.05％β-巰基乙醇、pH7.8的磷酸鈉緩沖液，勻漿，抽提1～2小時，除渣過濾，5000～8000rpm離心10min；二、鹽析向上清液中加入固體硫酸銨至40％飽和度，8000～10000rpm離心10min，向上清中補加硫酸銨至85％飽和度，靜置1～2小時，8000～10000rpm離心10～20min。沉淀用50～80ml的5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解，并在4℃下對該緩沖液透析40～60小時，8000～10000rpm離心5～10min，收集上清液；三、陰離子交換層析將上清液加入經(jīng)5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，采用5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液含0.1～0.2M的氯化鈉洗脫目的蛋白，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰，凍干濃縮至3～5ml；四、Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析將前經(jīng)凍干濃縮的樣品，加入經(jīng)5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的Sephacryl S-100 HR層析柱，用5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液洗脫，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰；進行酶活檢測及相關(guān)鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，以新鮮無花果樹樹葉為原料，經(jīng)抽提，鹽析，離子交換層析，分子篩層析，制備出穩(wěn)定的高活性的SOD。本發(fā)明所述無花果樹樹葉中SOD的提取制備，工藝簡單、成本低、可擴大生產(chǎn)且環(huán)保無污染。本工藝提取的無花果樹樹葉SOD具有活性高和穩(wěn)定性好等特點，在醫(yī)藥、保健品及化妝品工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N9/08GK101096663SQ200710055710
公開日2008年1月2日 申請日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者今 張, 雷 張, 張同海, 曲和之, 杜珊珊, 王擁軍, 王曉平, 郝東云, 露 黃 申請人:王曉平;王擁軍