專利名稱：：重組人抗狂犬病毒抗體的制作方法重組人抗狂犬病毒抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及重組單克隆抗體，特別是涉及攜帶人抗體重鏈恒定區(qū)Fc段的用于篩選、表達(dá)人抗體scFv-Fc小分子抗體的通用載體在抗體表達(dá)文庫(kù)中的制備方法及其應(yīng)用，涉及在巴斯德酵母中表達(dá)重組人抗狂犬病毒抗體。發(fā)明背景抗體分子的突出特點(diǎn)是其功能和分子結(jié)構(gòu)的雙重性識(shí)別不同抗原需要數(shù)量巨大的結(jié)構(gòu)上的多樣性；與體內(nèi)效應(yīng)系統(tǒng)相互作用需要結(jié)構(gòu)的恒定性。這一特點(diǎn)使抗體分子成為體內(nèi)最復(fù)雜的分子，長(zhǎng)期以來(lái)一直是人們研究的熱點(diǎn)。自19世紀(jì)末，以抗原免疫動(dòng)物獲得抗血清的途徑一直是獲得抗體的經(jīng)典方法。但由于抗血清含有為數(shù)眾多的各種不同的抗體，其中某些抗體會(huì)針對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生交叉反應(yīng)而導(dǎo)致嚴(yán)重后果.因此，長(zhǎng)期以來(lái)抗血清僅用于中和外源性毒素如蛇毒等，而未能應(yīng)用于其他疾病的治療。1975年，KOhler及Milstein建立了制備單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Nature(London),256:495,1975)。通過(guò)細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(McAb，以下有時(shí)也簡(jiǎn)稱"單抗")，這在抗體生產(chǎn)中是一個(gè)具有劃時(shí)代意義的進(jìn)展。特別重要的是，單克隆抗體對(duì)相應(yīng)抗原具有的高度特異性以及抗體分子的均質(zhì)性可大大降低它在體內(nèi)與正常組織的交叉反應(yīng)，為利用抗體治療疾病帶來(lái)了新的希望。近20年來(lái)，單克隆抗體在疾病診斷方面得到廣泛應(yīng)用，在疾病治療方面也取得了突破性進(jìn)展。然而，由于McAb多為鼠源性的，這也大大限制了它作為治療制劑在人體內(nèi)的應(yīng)用。進(jìn)入20世紀(jì)后，隨著整個(gè)基因工程抗體
技術(shù)領(lǐng)域：
的發(fā)展以及抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，DNA重組技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于抗體的改造，出現(xiàn)了各種各樣的基因工程抗體。這些基因工程抗體或消除了天然抗體的一些不利于應(yīng)用的特性，或增加了新的生物學(xué)功能，從而拓展了抗體的應(yīng)用范圍，改善了抗體的應(yīng)用性能。與鼠源性單克隆抗體相比，基因工程抗體具有許多優(yōu)點(diǎn)1)通過(guò)基因工程技術(shù)的改造，可以最大程度地降低抗體的鼠源性，減少甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)；2)基因工程小分子抗體的分子量較小，穿透力強(qiáng)，更易到達(dá)病灶的核心部位；3)可以根據(jù)治療的需要，制備多種用途的新型抗體；4)可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或植物等多種表達(dá)體系大量生產(chǎn)抗體分子，大大降低了生產(chǎn)成本。總之，這些基因工程抗體的產(chǎn)生大大增強(qiáng)了單克隆抗體的臨床效力，引發(fā)了FDA批準(zhǔn)治療性免疫球蛋白和Fab分子上市的浪潮。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前正處于臨床試驗(yàn)中的基因工程抗體約占生物制劑的30%。80世紀(jì)末90年代初噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)的興起，使通過(guò)大規(guī)模富集篩選的方法獲得特異性強(qiáng)、親和力高的基因工程抗體成為可能。但是傳統(tǒng)的噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)由于是基于原核表達(dá)體系的抗體庫(kù)技術(shù)，缺乏對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后修飾功能，從而降低了獲得高親和力基因工程抗體的可能性，因此對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選取時(shí)可能存在表達(dá)產(chǎn)物親和力低、活性不穩(wěn)定甚至難以獲得特異性基因工程抗體的問(wèn)題。所以有必要進(jìn)一步探索和完善基因工程抗體庫(kù)的制備技術(shù)，努力建立一套適用于真核表達(dá)體系的基因工程抗體庫(kù)表達(dá)體系?？袢∈怯煽袢《疽鸬闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染的世界性人獸共患傳染病，人和動(dòng)物一旦發(fā)病其死亡率達(dá)100%。據(jù)06年9月衛(wèi)生部公布數(shù)字顯示，自5月份起，狂犬病已連續(xù)4個(gè)月成為我國(guó)報(bào)告死亡數(shù)最高的傳染病病種。世界衛(wèi)生組織(WHO)建議目前最有效的暴露后預(yù)防措施為聯(lián)合應(yīng)用主動(dòng)及被動(dòng)免疫，即同時(shí)進(jìn)行疫苗接種并注射狂犬病抗血清。但來(lái)源不足、異源蛋白的副作用以及血液制品的潛在致病性都限制了治療性免疫球蛋白在狂犬病的暴露后治療中的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程抗體的研制為人們提供了解決問(wèn)題的新思路。已經(jīng)有人在大腸桿菌中進(jìn)行了人源抗狂犬病毒抗體片段Fab和scFv的表達(dá)，只是這些小分子抗體還無(wú)法完全替代抗血清在體內(nèi)綜合作用，包括抗體依賴的細(xì)胞毒性作用和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解作用等，因此完整的人抗狂犬病免疫球蛋白的生產(chǎn)成為了進(jìn)一步研究的目標(biāo)。我們利用本研究室構(gòu)建的完整人重鏈及輕鏈表達(dá)載體pPICZaCH和pPICZaCK(見(jiàn)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410010991.8)，以來(lái)源于人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗體文庫(kù)的特異性單抗RS3為模板，利用分步整合法轉(zhuǎn)化X33酵母菌對(duì)抗狂犬病毒抗體進(jìn)行克隆及表達(dá)，制備具狂犬病毒抗原結(jié)合活性的完整人源化抗體，以便滿足實(shí)驗(yàn)室研究的需求，并為狂犬病的治療與預(yù)防大量提供這類治療劑。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于畢赤酵母抗體庫(kù)技術(shù)的重組表達(dá)載體，特征在于所說(shuō)的載體同時(shí)攜帶有人重鏈抗體恒定區(qū)的Fc段序列以及供插入scFv抗體片段的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明載體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的用于畢赤酵母抗體庫(kù)技術(shù)的重組表達(dá)載體是重組質(zhì)粒pPICZa/Fc。根據(jù)本發(fā)明載體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,其中所說(shuō)的載體還攜帶有功能性分泌信號(hào)序列。根據(jù)本發(fā)明載體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，人抗狂犬病毒基因工程抗體RS3，包括scFv-Fc小分子抗體及IgG全抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用，其中所說(shuō)的人IgG抗體是通過(guò)分步整合法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得的完整的人單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供被上述重組載體轉(zhuǎn)化的能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下表達(dá)人抗體分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人抗狂犬病毒基因工程抗體RS3,其主要基因特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2及CDR3中特異性核苷酸系列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，如圖6，是所說(shuō)人抗狂犬病毒基因工程抗體RS3的可變區(qū)核苷酸及氨基酸序列，其中重鏈和輕鏈各自相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列。重鏈(VH)三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDR1為YTFTSYYIH;CDR2為T(mén)INPGGGSTSYAEKFQD;CDR3為DLRGYISNWSTLFMDV。輕鏈(Vk)三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDR1為RASQDIRKSLN;CDR2為DASNLEA;CDR3為QQYHHLPPWT。人抗狂犬病毒基因工程抗體RS3scFv-Fc抗體，其特征在于為一種可在原核或真核細(xì)胞中獲得穩(wěn)定有效表達(dá)基因重組的人抗狂犬病毒蛋白基因工程抗scFv-Fc抗體，由重鏈可變區(qū)，輕鏈(Kappa鏈)可變區(qū)及重鏈恒定區(qū)Fc段組成。其重鏈恒定區(qū)Fc基因來(lái)源于載體pPICZalgH，已在專利申請(qǐng)?zhí)枮?00410010991.8的專利申請(qǐng)中陳述。在scFv基因和Fc基因之間含有Apal酶切位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供如上限定的重組表達(dá)載體在畢赤酵母人源抗體庫(kù)中篩選人抗狂犬病毒scFv-Fe小分子抗體中的應(yīng)用，以及以分步整合法分泌表達(dá)完整的人抗狂犬病毒單克隆抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用甲基營(yíng)養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人抗狂犬病毒抗體的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，其中所說(shuō)的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的(l)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(2)編碼人抗狂犬病毒抗體的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標(biāo)志，從而在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母中產(chǎn)生人抗狂犬病毒抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說(shuō)的甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來(lái)自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于表達(dá)重組人抗狂犬病毒抗體的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長(zhǎng)，并且是被包括甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼人抗狂犬病毒抗體的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來(lái)自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)重組人抗狂犬病毒抗體的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼人抗狂犬病毒抗體的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說(shuō)的甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來(lái)自巴斯德畢赤酵母A0X1基因。圖1顯示小分子抗體scFv-Fc表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖2顯示重組質(zhì)粒pPICZo/Fc的ApaI+XbaI雙酶消化鑒定圖譜泳道13為重組質(zhì)粒pPICZo/Fc的不同克隆ApaI+XbaI雙酶消化結(jié)果；泳道4是DNA分子量標(biāo)志物。圖3顯示重組混合質(zhì)粒pPICZo/scFv-Fc不同克隆的酶切消化鑒定圖譜泳道15、7、8為重組混合質(zhì)粒pPICZo/scFv-Fc的不同克隆XhoI+ApaI雙酶消化結(jié)果；泳道6是DNA分子量標(biāo)志物；泳道912為重組混合質(zhì)粒pPICZo/scFv-Fc的不同克隆XhoI+XbaI雙酶消化結(jié)果。圖4顯示重組的scFv-Fc小分子抗體在畢赤酵母菌中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，不同克隆RS3及RS9第3天培養(yǎng)物上清的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western-blot)分析結(jié)果其中泳道1為蛋白分子量標(biāo)志物；泳道2為RS3轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)物上清的SDS-PAGE結(jié)果.;泳道3為RS9轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)物上清的SDS-PAGE結(jié)果；泳道4為RS3轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)物上清的Western-blot結(jié)果；泳道5為RS9轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)物上清的Western-blot結(jié)果。圖5顯示scFv-Fc小分子抗體RS3的序列分析結(jié)果其中I為小分子抗體RS3重鏈可變區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列;II為小分子抗體RS3輕鏈(Kappa鏈)可變區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列。圖6顯示完整重鏈及輕鏈抗體重組表達(dá)質(zhì)粒分步整合法轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，提取的酵母工程菌基因組DNAPCR分析結(jié)果泳道14，6為擴(kuò)增重鏈Fd結(jié)果；泳道7,8，10,12,13為擴(kuò)增全長(zhǎng)輕鏈結(jié)果；泳道9，13為空載體轉(zhuǎn)化酵母菌PCR結(jié)果；泳道5為DNA分子量標(biāo)志。圖7顯示分步整合法轉(zhuǎn)化畢赤酵母，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，不同克隆培養(yǎng)物上清的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析泳道13為不同克隆培養(yǎng)物上清的SDS-PAGE結(jié)果；泳道4為蛋白分子量標(biāo)志物。圖8顯示抗狂犬病毒全抗體陽(yáng)性菌株1L搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，培養(yǎng)物上清初步濃縮、純化后進(jìn)行免疫印跡(Western-blot)和ELISA分析結(jié)果其中A為非還原條件下，培養(yǎng)物上清Western-blot分析結(jié)果；B為還原條件下，培養(yǎng)物上清Westem-blot分析結(jié)果；C中泳道12為以狂犬病毒抗原電泳后，培養(yǎng)物上清作為一抗，酶標(biāo)記羊抗人IgG為二抗的Western-blot分析結(jié)果，泳道3誘導(dǎo)前培養(yǎng)物上清Western-blot分析結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及scFv-Fc小分子抗體真核表達(dá)抗體文庫(kù)體系的建立，特別是具有狂犬病毒抗原結(jié)合活性的人抗狂犬病毒抗體可變區(qū)序列的獲得及利用所述體系經(jīng)過(guò)篩選獲得較高親和力特異性抗狂犬病毒的scFv-Fv小分子抗體。本發(fā)明涉及單克隆抗體，特別是具有狂犬病毒抗原結(jié)合活性的完整人抗狂犬病毒抗體序列的獲得及其在所述體系中的重組制備?；诖竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)的噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的抗體庫(kù)技術(shù)，但受其自身加工能力的限制，缺乏對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后修飾功能，從而降低了獲得高親和力基因工程抗體的可能性，因此對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選取時(shí)可能存在表達(dá)產(chǎn)物親和力低、活性不穩(wěn)定甚至難以獲得特異性基因工程抗體的問(wèn)題。因此，我們特別選擇應(yīng)用酵母表達(dá)體系來(lái)建立scFv-Fc小分子抗體庫(kù)，其既具備易于操作，遺傳背景清楚，生產(chǎn)成本低等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物的折疊、分泌機(jī)制，可以完成真核生物特異的蛋白酶解、折疊、糖基化等翻譯后修飾過(guò)程，且生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)成分簡(jiǎn)單，能適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。尤其畢赤酵母，它的乙醇氧化酶基因(AOXI)是一個(gè)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控基因，啟動(dòng)活性高，滲漏低，在加入甲醇后可以迅速啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，更適合高密度培養(yǎng)，這對(duì)于提高重組蛋白的產(chǎn)量是至關(guān)重要的。而且，畢赤酵母的N—糖基化方式也更接近高等真核生物，因此有可能將其作為建立人scFv-Fc小分子抗體庫(kù)并且篩選獲得高親和力特異性單抗的另一個(gè)重要的異源表達(dá)體系。本發(fā)明建立的scFv-Fc小分子抗體表達(dá)體系的篩選功能不僅限于傳統(tǒng)的PCR、RT-PCR及分子雜交等基因水平上的操作，而且可利用其強(qiáng)大的分泌功能構(gòu)建抗體表達(dá)文庫(kù)，利用抗體的抗原特異結(jié)合活性來(lái)篩選各種己知或未知的抗體，因此具有較大的靈活性。雖然其克隆能力遠(yuǎn)低于目前廣泛使用于抗體篩選的噬菌體文庫(kù)，而且?guī)烊菹鄬?duì)較小，但是相較于傳統(tǒng)的基于原核表達(dá)體系的噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，其具備真核生物的折疊、分泌機(jī)制，可以完成真核生物特異的蛋白酶解、折疊、糖基化等翻譯后修飾過(guò)程，故有利于篩選得到特異性強(qiáng)的高親和力抗體，而這是噬菌體文庫(kù)所不能比擬的。我們利用基因重組技術(shù)對(duì)畢赤-巴斯德酵母質(zhì)粒進(jìn)行重組，并在此基礎(chǔ)上提供一套適于克隆和表達(dá)各種scFv-Fc小分子抗體的通用工具質(zhì)粒，建立了可克隆、篩選并表達(dá)制備人源scFv-Fc小分子抗體的表達(dá)體系?；诒景l(fā)明的這一抗體庫(kù)表達(dá)系統(tǒng)，我們成功地克隆并篩選獲得分泌表達(dá)的具較高親和力的人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗體。各種基因工程抗體的出現(xiàn)在很大程度上改善了抗體性能，增強(qiáng)了單克隆抗體的臨床效力，使其更適于臨床應(yīng)用。然而，所有這些改造都是在已有單抗基因基礎(chǔ)上針對(duì)抗體的某一附屬特性的改良，即改變或增加其生物學(xué)效應(yīng)、降低其異源性、改變其藥學(xué)動(dòng)力學(xué)效應(yīng)等。已有的人源化鼠單抗(包括對(duì)鼠單抗恒定區(qū)進(jìn)行人源化改造得到的人-鼠嵌和抗體和只保留了抗原決定區(qū)(CDR區(qū))鼠源性的改型抗體等)均未能完全消除鼠單抗的異源性，而仍可產(chǎn)生不同程度的HAMA,使抗體的效應(yīng)減弱，且其親和力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親本鼠單抗。另外，這些小分子抗體由于缺乏Fc段介導(dǎo)，不但在體內(nèi)的半衰期縮短，而且難以通過(guò)耙細(xì)胞殺傷、細(xì)胞吞噬及生物活性物質(zhì)釋放等效應(yīng)功能來(lái)滅活或清除外來(lái)抗原以保護(hù)機(jī)體。因此，各種基因工程抗體都不能完全替代天然抗體發(fā)揮作用。所以，我們利用本研究室構(gòu)建的完整人重鏈及輕鏈表達(dá)載體pPICZaCH和pPICZaCK(見(jiàn)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410010991.8)，以來(lái)源于人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗體文庫(kù)的特異性單抗RS3為模板，利用分步整合法轉(zhuǎn)化X33酵母菌對(duì)抗狂犬病毒抗體進(jìn)行克隆及表達(dá)，成功的制備出具狂犬病毒抗原結(jié)合活性的完整人源化抗體，從而完成了本發(fā)明。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(如參見(jiàn)分子克隆試驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，第二版，1999年出版)進(jìn)行基因的分離或合成、核苷酸片段的消化與連接、克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增、核苷酸序列的分析與鑒定、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)，以及表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化等操作。作為構(gòu)建本發(fā)明的通用工具載體的起始質(zhì)粒，可使用任何一種能在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定保留并復(fù)制，并在酵母菌中表達(dá)的質(zhì)粒載體。這樣的起始質(zhì)粒包括但不只限于pPIC3.5，pPIC9，pHIL等。但本發(fā)明中優(yōu)選的是高效表達(dá)質(zhì)粒pPICZa。我們利用基因重組技術(shù)，將人抗體重鏈恒定區(qū)Fc基因重組至起始質(zhì)粒相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)，并利用人工合成的寡核苷酸接頭，在載體a信號(hào)肽下游分別引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，構(gòu)建成scFv-Fc小分子抗體庫(kù)通用表達(dá)載體pPICZa/Fc(參見(jiàn)實(shí)施例l)。本發(fā)明的工具載體pPICZa/Fc攜帶有人抗體重鏈恒定區(qū)FccDNA，又包括有可供其它基因插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，因此能夠適合各種scFv-Fc小分子抗體庫(kù)的克隆和重組表達(dá)(圖l)。這里所說(shuō)的各種抗體包括完全人源抗體、人源化鼠單抗和抗體融合蛋白等。本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用本發(fā)明的這一抗體庫(kù)表達(dá)系統(tǒng)克隆、篩選和表達(dá)有用的功能性scFv-Fc小分子抗體分子例如抗狂犬病毒特異性scFv-Fc小分子抗體(參見(jiàn)實(shí)施例23)。為了使用我們的人scFv-Fc小分子抗體庫(kù)表達(dá)系統(tǒng)獲得特異性抗狂犬病毒抗原的人scFv-Fc小分子抗體，首先使用全套擴(kuò)增人VH和VK、Vx基因引物由高滴度的抗狂犬病毒抗體陽(yáng)性血B淋巴細(xì)胞基因組中擴(kuò)增得到全套的人VH和VK、Vx基因，與人工設(shè)計(jì)合成的Linker基因利用重疊延伸PCR方法組裝得到混合scFv小分子抗體cDNA。將此混合scFv小分子抗體cDNA重組到本發(fā)明的人scFv-Fc小分子抗體庫(kù)表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)、篩選后，獲得了具有狂犬病毒抗原結(jié)合活性的小分子抗體。本發(fā)明制得的抗狂犬病毒抗體具有完全人源的可變區(qū)序列。與已發(fā)表的抗體序列的同源性比較分析顯示，其重鏈可變區(qū)和輕鏈(Kappa鏈)可變區(qū)各自相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)基因序列均為本抗體特有的全新基因，因此，可以認(rèn)為該抗體序列是具有狂犬病毒結(jié)合活性的新的人源抗體序列(實(shí)施例4)。在酵母表達(dá)體系中，外源DNA是經(jīng)過(guò)同源重組整合至酵母基因組DNA上進(jìn)行表達(dá)的，表達(dá)載體通過(guò)同源重組將外源基因整合入酵母菌基因組而隨同酵母菌的染色體一起復(fù)制，同源重組時(shí)，畢赤酵母表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)體內(nèi)和體外兩種方式多拷貝的整合于畢赤酵母菌的基因組中，多拷貝的整合在大多數(shù)情況下，可顯著增加外源蛋白的表達(dá)水平。我們利用本研究室構(gòu)建的完整人重鏈及輕鏈表達(dá)載體pPICZaCH和pPICZaCK(見(jiàn)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410010991.8)構(gòu)建人狂犬病毒重鏈、輕鏈重組質(zhì)粒，利用分步整合的方法，依次轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞X33，隨機(jī)挑取7個(gè)2倍Zeocin抗性克隆并提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果5個(gè)克隆均擴(kuò)增得到了全長(zhǎng)輕鏈和重鏈Fd抗體cDNA，從而證明了分步整合方法的高整合效率，從而使全長(zhǎng)重鏈及輕鏈在酵母菌中正確配對(duì)成完整、穩(wěn)定的人抗狂犬病毒完整抗體(參見(jiàn)實(shí)施例5)。將篩選獲得的人抗狂犬病毒抗體重鏈可變區(qū)cDNA和輕鏈可變區(qū)cDNA，分別重組到本研究室構(gòu)建的完整人重鏈及輕鏈表達(dá)載體pPICZaCH和pPICZaCK(見(jiàn)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410010991.8)構(gòu)建人狂犬病毒重鏈、輕鏈重組質(zhì)粒，分步整合的方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，通過(guò)聚丙烯酖胺凝膠電泳、免疫印跡技術(shù)鑒定重組抗體分子的完整性，并以酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的狂犬病毒抗原結(jié)合活性。結(jié)果表明，如上得到的表達(dá)產(chǎn)物具有狂犬病毒抗原特異結(jié)合活性(參見(jiàn)實(shí)施例6)。另外，按本發(fā)明上述方法制得的抗狂犬病毒抗原抗體是一種完全的人源全分子抗體，它不同于現(xiàn)有的Fab，ScFv等抗狂犬病毒小分子抗體。本發(fā)明的抗體既能夠特異識(shí)別并結(jié)合狂犬病毒抗原，又能夠通過(guò)其Fc段發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能，中和并清除外界侵入的抗原物質(zhì)，而且不會(huì)產(chǎn)生人源化抗體常常引發(fā)的HAMA。因此，本發(fā)明制備的人源抗體可望用于臨床預(yù)防和治療由狂犬病毒引起的狂犬病。本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)生產(chǎn)和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)人抗狂犬病毒抗體的方法。巴斯德畢赤酵母(P.Pastoris)是20世紀(jì)80-90年代發(fā)展起來(lái)的極具潛力的酵母表達(dá)系統(tǒng)，由于其在蛋白質(zhì)表達(dá)方面具有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)而得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母具有許多其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點(diǎn)①屬于單細(xì)胞生物，故保留了易于操作和生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)(可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重可達(dá)130g/L以上)；②營(yíng)養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，特別適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；③通過(guò)同源重組，可將表達(dá)載體穩(wěn)定地整合到宿主染色體中，連續(xù)傳代中不易丟失；.④具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因(AOX)啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)；⑤表達(dá)量高，許多蛋白的產(chǎn)率可達(dá)到每升克以上水平；◎表達(dá)的蛋白質(zhì)既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞夕卜，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質(zhì)的分泌量很低，十分有利于目的產(chǎn)物純化；⑦作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的正確加工和修飾；⑧糖基化程度低。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)由一個(gè)外源基因表達(dá)框和AOX1啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)(MCS)和一個(gè)從A0X1基因上拷貝下來(lái)的終止序列(TT)組成。同時(shí)，大多數(shù)載體都包含作為篩選標(biāo)記的HIS4基因和為拷貝增殖而存在的序列(如ColEI復(fù)制起始點(diǎn)和抗氨芐青霉素基因)。另外，還含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色體的A0X1部位的A0X13'非編碼區(qū)序列。本發(fā)明所使用的載體是由啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記、報(bào)告基因、復(fù)制起點(diǎn)等元件構(gòu)成。另外分泌型載體還需要有信號(hào)肽序列。最常用的啟動(dòng)子是A0X1啟動(dòng)子，它的甲醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)，因而它控制下的外源基因能得到較高的表達(dá)。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力是由A0X1提供的。當(dāng)在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，A0X1轉(zhuǎn)錄受到抑制；而在以甲醇為唯一生長(zhǎng)碳源時(shí)，則可誘導(dǎo)A0X1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)。選擇標(biāo)記(HIS4)—般是對(duì)應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白質(zhì)很少，所以分泌表達(dá)是一種理想的表達(dá)方式。同時(shí)，胞外表達(dá)更有利于蛋白質(zhì)的提取和純化。本發(fā)明優(yōu)選的信號(hào)肽是ct因子(aMF)。ct因子信號(hào)序列由87個(gè)氨基酸組成，來(lái)自于啤酒酵母(S.cerevsia)的a性成熟因子前導(dǎo)序列，并且己將這段序列編碼的信號(hào)肽插人到巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體中。本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可以是胞內(nèi)表達(dá)的，也可以是分泌表達(dá)的。這些載體都包括一個(gè)由0.9kb的5'A0X1序列片段和約0.3kb的轉(zhuǎn)錄終止基因的3'序列組成的表達(dá)盒。分泌型表達(dá)載體可以是pPIC9,pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6等；胞內(nèi)表達(dá)的載體可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K，pPICZ，pHWO10E121，pGAPZ、pGAPZa等。本發(fā)明優(yōu)選的是pPICZa。一般用于外源基因表達(dá)的巴斯德畢赤酵母菌株包括Y-11430、M-6100-3、GS115、KM71、SMD1168等，本發(fā)明優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母X-33菌株。得到攜帶目的基因的重組表達(dá)載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)球法和電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞。其中，本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是電穿孑L法(參見(jiàn)Sambrook，ed.MolecularCloning:ALaboratoryManule(2nd.ed.)，Vols.l-3，ColdSpringHarborLabomtory(1998))。導(dǎo)入酵母體內(nèi)的重組表達(dá)載體只有與酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在并得以表達(dá)。本發(fā)明中，為了穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，可以在His或5'AOXl的單酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒載體線性化，使之通過(guò)單交換整合到酵母細(xì)胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲醇利用能力的轉(zhuǎn)化子。用于本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母含有典型高等真核生物的許多翻譯后修飾功能。這些功能包括信號(hào)肽的加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵的形成、O-及N-型糖基化和?；?。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白質(zhì)的糖基化鏈參與細(xì)胞識(shí)別、激素受體結(jié)合、蛋白質(zhì)定位及宿主一微生物間相互作用。糖基化過(guò)程是經(jīng)一系列剪接并產(chǎn)生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)組成的寡核糖的反應(yīng)。巴斯德畢赤酵母能夠?qū)⑻妓衔镞B接到分泌表達(dá)的外源蛋白質(zhì)上。巴斯德畢赤酵母修飾糖鏈的平均長(zhǎng)度為814甘露糖，而且外鏈不含a-l，3甘露糖，所以其表達(dá)的糖蛋白特別適于治療應(yīng)用。絕大多數(shù)情況下，巴斯德畢赤酵母(P.Pastoris)中整合多拷貝外源基因會(huì)提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)量，所以本發(fā)明優(yōu)先選擇分泌型、高拷貝標(biāo)記和易操作的穿梭載體，特別是pPICZa作為人抗狂犬病毒抗體的表達(dá)載體。另外，由于在His位點(diǎn)整合時(shí)，染色體突變的His位點(diǎn)可與表達(dá)盒的HIS4基因位點(diǎn)之間發(fā)生基因交換會(huì)導(dǎo)致表達(dá)盒的丟失，故一般優(yōu)先選擇AOXl位點(diǎn)。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基可以是BMGY/BMMY，BMG/BMM,MGY/MM等培養(yǎng)基，但優(yōu)選的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培養(yǎng)基。作為唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般為培養(yǎng)體積的0.5-1.0%(V/V)。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，可使用已知的方法檢測(cè)由被轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離物所產(chǎn)生的人抗狂犬病毒抗體含量，并從中選擇有高產(chǎn)率的細(xì)胞分離物，用于放大生產(chǎn)。可使用飽和硫酸銨鹽析、離子交換層析、親合層析等方法分離并純化所需的人抗狂犬病毒抗體。本發(fā)明首次在酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達(dá)了人抗狂犬病毒抗體，建立了穩(wěn)定的人抗狂犬病毒抗體畢赤酵母高效表達(dá)體系。與在大腸桿菌中的表達(dá)相比，本發(fā)明的方法具有如下特點(diǎn)①表達(dá)體系穩(wěn)定，含目的基因的表達(dá)盒通過(guò)同源重組整合進(jìn)入酵母的染色體中，菌種穩(wěn)定，不存在質(zhì)粒丟失的問(wèn)題；②有效的分泌表達(dá)，目的蛋白質(zhì)的表達(dá)受醇氧化酶啟動(dòng)子的嚴(yán)格控制，可在甲醇誘導(dǎo)下啟動(dòng)表達(dá)并將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，而且畢赤酵母本身的蛋白很少分泌到培養(yǎng)基中，使目的蛋白更易于純化；③表達(dá)產(chǎn)量高；④不存在內(nèi)毒素污染問(wèn)題；⑤大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)成本低。具體實(shí)施方式以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1:pPICZo/Fc表達(dá)載體的構(gòu)建1.1PCR擴(kuò)增人抗體Fc片段取質(zhì)粒pPICZa-H(含有人抗體重鏈全長(zhǎng)序列)lOOng，擴(kuò)增Fc上游引物5，一TAAGGGCCCCTGAGCCCAAATCTTGTG—3'(SEQID跳1)擴(kuò)增Fc下游引物5，一CCGTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGG—3，(SEQIDNO:2)利用這兩條擴(kuò)增Fc引物在0.2mlEP管中建立以下反應(yīng)體系上述cDNA反應(yīng)液20^1MgCl26^110xLAPCR緩沖液8^1TaKaRaLATaqlpl擴(kuò)增Fc上游引物ljil擴(kuò)增Fc下游引物lul滅菌蒸餾水終體積lOOul在PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)棰?4°C2min②94°C30s，58°C30s,72°C1.5min，28個(gè)循環(huán)③72°ClOmin擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小，確定是否獲得可重組到表達(dá)載體pPICZa的目的基因(產(chǎn)物上、下游分別帶有ApaI和XbaI酶切位點(diǎn))。1.2PCR產(chǎn)物的回收將PCR擴(kuò)增的Fc片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用手術(shù)刀片切下相應(yīng)分子大小的條帶，稱重后移入EP管中。根據(jù)DNA片段純化/回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收。1)按凝膠重量加入3倍體積的溶液B(6MNaC104，0.03MNaAcpH5.2,少量酚紅)，65"C水浴溶化凝膠。2)將溶液移至含樹(shù)脂的離心柱中，靜置2min，8000g離心60s。3)加入0.5ml溶液C(100mMNaClpH7.5，10mMEDTApH7.5，50mMTris陽(yáng)HClpH7.5)8OOOg離心60s。4)重復(fù)上述步驟，15000g再離心甩干柱內(nèi)殘余液體。5)將離心柱置于新的EP管中，加入5(TC預(yù)熱的溶液D(TE),靜置2min,15000g離心60s，管底即為所需DNA。1.3在pPICZa表達(dá)載體中插入人工合成的寡核苷酸1)將人工合成的互補(bǔ)的寡核苷酸FhTCGAGAAGAGACATCTGTTGTAGACTCACGGGCCCG(SEQIDNO:3)及F2:AATTCGGGCCCGTGAGTCTAC:AACAGATGTCTCTTC(SEQIDNO:4)各取l嗎加入TE至40nl體積，IOO'C煮沸15min，緩慢冷卻至室溫?；パa(bǔ)鏈退火后分別形成帶有Xhol和EcoRI粘性末端的接頭，且在EcoRI位點(diǎn)前引入了Apal位點(diǎn)。XhoI和EcoRI消化pPICZa表達(dá)載體，按上述方法回收后，與人工合成寡核苷酸16'C連接過(guò)夜。連接反應(yīng)體系如下人工合成寡核苷酸0.10.3pmd載體pPICZa0.03pmo110x連接緩沖液"1T4DNA連接酶1^1滅菌蒸餾水終體積iow2)感受態(tài)細(xì)胞的制備①?gòu)?7'C培養(yǎng)16h的XL廣Blue陰性培養(yǎng)板上挑取單個(gè)菌落(直徑23mm)，接種于含有100mlLB培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中，250r/min，37"C震蕩培養(yǎng)3h。②每隔2030min測(cè)定OD600,待其達(dá)到0.35時(shí)，取出含有菌液的培養(yǎng)瓶，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至(TC。③4。C，4000r/min離心10min收集細(xì)胞。④倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。⑤用60ml預(yù)冷過(guò)的O.lmol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重懸細(xì)胞沉淀。4°C,4OOOr/min離心10min，回收細(xì)胞。⑦倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。⑧用4ml預(yù)冷過(guò)的O.lmol/LCaCl2重懸細(xì)胞沉淀。(D加入DMSO，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置15min。⑩再加入14(^1DMSO，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置15min。無(wú)菌分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化①取一份凍存的感受態(tài)細(xì)胞冰上融化，加入上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻。②冰浴30min。③將反應(yīng)管放入預(yù)熱至42'C的循環(huán)水浴中，恰恰放置90s，不要搖動(dòng)。④快速取出反應(yīng)管并移置冰上12min。⑤加入800WSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37。C，然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上，225r/min震蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。⑥取200W已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含Zeocin(25ng/ml)的LB平板，37'C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1216h。4)重組載體的鑒定①隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種于25mlLB培養(yǎng)基中，37'C強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。②取0.5ml菌液，置于1.5mlEP管，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，用振蕩器最大速度振蕩lmin，充分混勻。③4。C，12OOOg離心5min，取上清0.45ml左右，移至另一個(gè)EP管中，加入等體積異丙醇混勻，4°C，12OOOg離心5min。棄上清，加0.5ml75%乙醇洗滌。⑤重復(fù)上述步驟，室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇◎lOjxlTER(含Rnase的TE)溶解沉淀，從中取出1^1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)進(jìn)行酶切鑒定。⑦Apal+BglII雙酶消化鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)內(nèi)切酶譜鑒定正確克隆。⑧DNA測(cè)序。1.4pPICZo/Fc表達(dá)載體的構(gòu)建利用合成的短鏈寡核苷酸鏈于pPICZa表達(dá)載體的a信號(hào)肽3'末端引入Apal位點(diǎn)，與載體上的XbaI酶切位點(diǎn)供基因重組到載體pPICZa相應(yīng)的內(nèi)切酶部位。因此用Apal+Xbal消化Fc片段PCR回收產(chǎn)物和載體pPICZa，按上述方法回收后常規(guī)連接，同前轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，提取質(zhì)粒DNA,以ApaI+XbaI雙酶消化鑒定并進(jìn)行DNA測(cè)序。結(jié)果如附圖2所示。實(shí)施例2:抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗體庫(kù)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建獻(xiàn)血志愿者為經(jīng)過(guò)法國(guó)PM株Vero細(xì)胞純化疫苗全程免疫(上臂三角肌注射)，且抗體滴度達(dá)到相應(yīng)保護(hù)水平者。采血20ml(取lmli分離血清后用于抗體檢測(cè))，分別放入無(wú)菌肝素抗凝管中。用淋巴細(xì)胞分離液，分離提取淋巴細(xì)胞，而后用Trizol法，提取總RNA。2.1總RNA的提取2丄1淋巴細(xì)胞的分離1)加入等體積平衡鹽溶液稀釋外周血，緩慢混勻。2)離心管內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液(10ml血加入35ml分離液)，傾斜45。C，距液面lcm處沿管壁緩緩加入稀釋血。3)于室溫條件下2000r/min離心30min，離心管內(nèi)液體分為血漿層、灰白層(淋巴細(xì)胞)、淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞層。4)吸取灰白層，用5倍體積的平衡鹽溶液洗滌2次(依次以2000r/min、1500r/min于室溫離心30min),收集淋巴細(xì)胞立即用于RNA的提取或存于-80。C備用o2.1.2Trizol法提取總RNA1)在上述提取淋巴細(xì)胞中加入5mlTrizo1，充分吹打混勻。2)加入lml氯仿(200nl/mlTrizol)，充分振蕩搖勻，室溫下放置5min。3)于4'C，12000g離心15min。4)將上層水相移至另一干凈離心管中。5)加入等體積異丙醇，振蕩搖勻，室溫沉淀10min。6)4°C,12000g離心15min，棄上清。7)加入75%乙醇lml洗滌沉淀，4°C，12000g離心5min。8)重復(fù)上述步驟，室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇。9)將總RNA沉淀溶于50plDEPC處理的水中，-80°〇保存?zhèn)溆谩?0)取lpl稀釋100倍后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。RNA含量按下面公式計(jì)算-RNA(pg/ml)=4(^0026(^稀釋倍數(shù)OD260/OD280=1.82.0表示純度合格2.2RT-PCR克隆人抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)(VH、Vk及VX)cDNA及鑒定l)RT反應(yīng)取總RNA樣品1嗎，加入1^01igodT，70。C變性10min，冰浴lmin，然后加入下列反應(yīng)液MgCl24nl10xRNAPCR緩沖液2^1RNA酶抑制劑0.5nldNTP2^1AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1^1無(wú)RNA酶滅菌水終體積20^1于PCR儀上42'C反應(yīng)60min,然后99°C5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA-2(TC保存?zhèn)溆谩?)PCR反應(yīng)利用VH、Vk及VX克隆引物，其中VH克隆上游引物為VH1:5，一SAGGTGCAGCTGSWGSAGTCKGG—3'(SEQIDNO:5)VH2:5，~CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG—3，(SEQIDNO:6)VH3:5，~CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG~3，(SEQIDNO:7)VH4:5，~GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC_3，(SEQIDNO:8)VH克隆下游引物為VHbl:5，一TGARGAGACGGTGACCRKKGTSCC—3，(SEQIDNO:9)VHb2:5，一TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC—3'(SEQID跳10)VK克隆上游引物為-Vk1:5，~GAMATYSWGWTGACSCAGTCTCC_3'(SEQIDNO:11)Vk2:5，一GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC—3'(SEQIDNO:12)Vk3:5,~GAAACGACACTCACGCAGTCTCC—3，(SEQIDNO:13)Vk4:5，一GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC—3'(SEQIDNO:14)vk克隆下游引物為VkM:5，一ACGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC—3，(SEQIDNO:15)Vicb2:5，一ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC—3，(SEQIDNO:16)VKb3:5，一ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC—3'(SEQID跳17)VX克隆上游引物為VX1:5，~CAGTCTGYSYTGACKCAGCCKSC—3'(SEQIDNO:18)VX2:5，一TCYTMTGWGCTGACTCAGSMMCC—3，(SEQIDNO:19)TO:5，~CACGTTATACTGACTCAACCGCC—3'(SEQIDNO:20)錫5'—CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC—3，(SEQIDNO:21)VX5:5，一AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA—3，(SEQIDNO:22)VX克隆下游引物為VXB:5,—ACCTARRACGGTSASCTKGGTCCC—3，(SEQIDNO:23)在0.2miEP管中建立以下反應(yīng)體系上述cDNA反應(yīng)液20jxlMgCl26nl10xLAPCR緩沖液8nlTaKaRaLATaqlpl克隆上游引物克隆上游引物滅菌蒸餾水終體積100^1在PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小，確定是否得到正確目的基因。3)回收VH、Vk、VX片段PCR產(chǎn)物，分別常規(guī)連接入pMD-T載體，DNA測(cè)序鑒定PCR所得VH、Vk、VX片段。2.3scFv抗體片段的組裝2.3.1利用VH、linker及Vk組裝scFv分別回收上述RT-PCR克隆所得VH、Vk片段，與相應(yīng)linker(kappa鏈)GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACGTTTGAT(SEQIDNO:24)，通過(guò)重疊延伸PCR方法組裝scFv。用于擴(kuò)增scfv上游引物SI:5，_TTACTCGAGAAGAGASAGGTGCAGCTGSWGSAGTCKGG—3'(SEQIDNO:25)S2:5，一TTACTCGAGAAGAGACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG—3，(SEQIDNO:26)S3:5，一TTACTCGAGAAGAGACAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG—3'(SEQIDNO:27)S4:5，一TTACTCGAGAAGAGAGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC—3'(SEQIDNO:28)用于擴(kuò)增scFv下游引物(kappa鏈)SkM:5，一ATTGGGCCCGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC_3，(SEQIDNO:29)SKb2:5'—ATTGGGCCCGTTTGATATCCACTTTGGTCCC—3'(SEQIDNO:30)SKb3:5，一ATTGGGCCCGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC—3，(SEQIDNO:31)1)純化的VH片段和Vk片段各1ug，250nglinker(kappa鏈)片段，5P110XPCR緩沖液(含Mg2+)，5110mraol/L的dNTP混合液，最后加去離子水至50uL進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4。C5min后，加入0.5y1(2.5U)Taq聚合酶；94。Clmin，60°C4min，72°C2min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。2)于上述反應(yīng)液中加入lPl(2.5U)Taq聚合酶，5pl10XPCR緩沖液(含Mg2+)，2P110mmol/L的dNTP混合液，2y1擴(kuò)增scFv上游引物，2n1擴(kuò)增scFv下游引物(kappa鏈)，最后加去離子水至50ul。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4°Clmin，55°C2min，72°C2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。2.3.2利用VH、linker及組裝scFv分別回收上述RT-PCR克隆所得VH、片段，與相應(yīng)linker(lambda鏈)GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACCTARRAC(SEQIDNO:32)，通過(guò)重疊延伸PCR方法組裝scFv。用于擴(kuò)增scFv下游引物(lambda鏈).SX1):5，一ATTGGGCCCCTARRACGGTSASCTKGGTCCC—3，(SEQIDNO:33)2.4scFv-Fc小分子抗體表達(dá)質(zhì)粒pP[CZo/scFv-Fc的構(gòu)建PCR擴(kuò)增上述組裝所得scFv片段，常規(guī)方法回收。擴(kuò)增產(chǎn)物用XhoI+Apal消化后與相應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化的pPICZo/Fc表達(dá)載體常規(guī)連接。1)超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞的制備參見(jiàn)《分子克隆》相應(yīng)章節(jié)。2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞XLrblue，將此轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接種于5mlSOC培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)1小時(shí)后，取10020(^l涂含有Zeocin抗性的平皿，剩余菌液轉(zhuǎn)入一三角瓶，加入10mlLB培養(yǎng)基(含Zeocin25pg/ml),37。C振搖1小時(shí)后，加入LB培養(yǎng)基至100ml左右，37C振搖過(guò)夜。隨機(jī)挑取Zeocin平板上菌落1020個(gè)，小提質(zhì)粒后，以XhoI+Apal雙酶消化鑒定，檢測(cè)scFv片段的插入效率。結(jié)果如附圖3所示。實(shí)施例3:scFv-Fc小分子抗體在畢赤酵母中的表達(dá)3.1線性化重組質(zhì)粒的制備scFv-Fc重組質(zhì)粒pPICZo/scFv-Fc轉(zhuǎn)化超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞XLrblue，37。C振搖過(guò)夜培養(yǎng)后所得菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行提取。1)用1.5mlEP管收集35ml菌液，12000g離心30s，吸干上清；2)加入150^1溶液B(50mMTris-Cl,1OmMEDTA),10^1溶液A(RNaseA)，充分振蕩懸浮，室溫放置5min;3)加入300pl溶液C(l%SDS,0.2MNaOH)，溫和反復(fù)顛倒混勻46次，室溫放置5min;4)加入45(^1溶液D(4M鹽酸胍)，反復(fù)顛倒混勻46次；5)12000g離心5min，去沉淀；6)將上清置于離心柱中，靜置2min;7)8000g離心30s,棄下清；8)加入50(HU溶液E，8000g離心30s,棄下清；9)加入500nl溶液F，8000g離心30s，棄下清；10)12OOOg再次離心lmin以甩干殘余液體；11)將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開(kāi)離心管蓋放置510min，加入305(Hd預(yù)熱的溶液G(TE)，保溫5min，12000g離心lmin，管底即為質(zhì)粒DNA;12)取重組質(zhì)粒15嗎，以限制性內(nèi)切酶PmeI消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀；13)線性化的質(zhì)粒用15pl二蒸水溶解，置冰上備用。3.2酵母感受態(tài)的制備1)從畢赤酵母X33的YPD陰性培養(yǎng)板上挑取單個(gè)菌落，接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，225r/min，30'C震蕩培養(yǎng)8h。2)取其中500^1菌液接種于含150mlYPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，225r/min，3(TC震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3)監(jiān)測(cè)OD6(K)，待其達(dá)到1.31.5時(shí)，取出含有菌液的培養(yǎng)瓶置于冰上，放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0'C。4)4°C，1500r/min離心5min收集細(xì)胞。5)倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。6)用2S0ml預(yù)冷過(guò)的二蒸夸重懸細(xì)胞沉淀，4°C，l500r/min，離心5min。7)125ml預(yù)冷過(guò)的二蒸水重懸細(xì)胞沉淀，4'C，1500r/min，離心5min。8)20ml預(yù)冷過(guò)的lMD-山梨醇重懸細(xì)胞沉淀，4°C，1500r/min，離心5min。9)500pl預(yù)冷過(guò)的lMD-山梨醇重懸細(xì)胞沉淀，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，置于冰上，當(dāng)天使用。3.3轉(zhuǎn)化1)分別取80pl上述感受態(tài)菌，與不同質(zhì)量的線性化重組表達(dá)質(zhì)?；旌?分別為100ng、500ng、l嗎、2嗎、5嗎、IO嗎)，移入0.2cm電轉(zhuǎn)化杯，冰浴5min。2)擦干水汽，置電轉(zhuǎn)儀上，選擇酵母參數(shù)fimgi-pulse，電轉(zhuǎn)化。3)立即加入lml冰浴的山梨醇，將混合物轉(zhuǎn)到1.5mlEP管中。4)30。C靜置孵育12h。5)分別取50100nl轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin(100jig/ml)的YPD平板，3(TC培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)23天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)。3.4轉(zhuǎn)化子的表達(dá)1)從scFv-Fe小分子抗體轉(zhuǎn)化菌的YPD培養(yǎng)板上分別挑取10個(gè)Zeocin抗性克隆接種于10mlBMGY培養(yǎng)基中，30。C震蕩培養(yǎng)24h，至00600達(dá)2.06.0收集細(xì)胞。2)10mlBMMY重懸細(xì)胞沉淀，30'C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)過(guò)程中，每2411補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌二蒸水，使發(fā)酵液總體積保持不變。'3)在培養(yǎng)O天，l天，2天，3天，4天，5天等時(shí)間點(diǎn)各取lml發(fā)酵液，離心菌體，上清利用蘭州生物制品研究所抗狂犬病抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行初步蛋白活性篩選分析。4)如此重復(fù)三輪小分子抗體的表達(dá)、篩選。實(shí)施例4:scFv-Fc小分子抗體表達(dá)產(chǎn)物狂犬病毒抗原結(jié)合活性分析4.1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子酵母基因組DNAPCR分析經(jīng)過(guò)三輪篩選，煮凍煮法提取所得陽(yáng)性酵母克隆菌株基因組DNA，利用擴(kuò)增VH、Vk、VX引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所得產(chǎn)物回收后連接入pMD-T載體，進(jìn)行DNA測(cè)序，以確定VH、Vk、VX片段序列及分類。4.2不同陽(yáng)性克隆RS3、RS9的ELISA分析1)scFv-Fc小分子抗體表達(dá)的檢測(cè)用0.1M的NaHC03(pH8.6)溶液包被抗人IgG抗體(1:1000稀釋)，4'C過(guò)夜；4%脫脂奶封閉，37°C1小時(shí)；加入表達(dá)上清，37°C1小時(shí)；加入酶標(biāo)抗人IgG二抗(1:800稀釋)，37。Cl小時(shí)；蘭州所顯色液顯色，2MH2S04終止反應(yīng)，檢測(cè)490nm處的光吸收值。2)scFv-Fc小分子抗體抗原結(jié)合活性的檢測(cè)根據(jù)蘭州生物制品研究所抗狂犬病抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，分別對(duì)RS3和RS9第96h蛋白表達(dá)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。表1不同克隆RS3和RS9scFv-Fc小分子抗體的表達(dá)和抗原結(jié)合活性分析(^土5)陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照空白R(shí)S3RS9<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>從表1所示的結(jié)果可以看出，克隆RS3和RS9具有較好的scFv-Fc小分子抗體表達(dá)及狂犬病毒抗原結(jié)合活性。4.3SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分別取ELISA檢測(cè)陽(yáng)性scFv-Fc小分子抗體，培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠12%,濃縮膠5%)。每孔加樣60pl，40V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到IOOV，恒壓電泳至分離膠底部，考馬斯亮藍(lán)染色分析。結(jié)果如附圖4所示。4.4WesternBlot分析1)常規(guī)SDS-PAGE(分離膠12%,濃縮膠5%)。2)剪1塊與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜(NC膜)和6塊3mm濾紙。3)將剪好的濾紙與纖維素膜在轉(zhuǎn)移緩沖液(48mmoi/LTris，39mmol/L甘氨酸，20%甲醇)中浸泡35min。4)待電泳結(jié)束后，取下凝膠，按以下順序安裝陽(yáng)極側(cè)~^海綿一3張濾紙一NC膜一凝膠一3張濾紙一海綿一陰極側(cè)。在放置每一層時(shí)，均要去除它們之間的氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移效果。5)用塑料支架夾緊上述各層，置于轉(zhuǎn)移電泳儀內(nèi)，以恒流200mA轉(zhuǎn)移2h。6)取下NC膜，用鉛筆在膜的上緣作好標(biāo)記。將膜置于平皿中，加入20mmol/LTris-Cl(pH7.5)室溫漂洗10min。7)加入2。/。BSA(其量以浸過(guò)膜即可)室溫條件下輕輕振蕩2h。8)加入洗滌液(20mmol/LTris-Cl，pH7.5;0.2%Tween20)室溫漂洗2次，510min/次。9)將纖維素膜放入雜交袋內(nèi)，加入1:500稀釋的山羊抗人IgG-HRP，室溫條件下?lián)u動(dòng)孵育23h。10)取出纖維素膜，加入洗滌液室溫漂洗4次，510min/次。TMB試劑顯色，成像。結(jié)果如附圖4所示。實(shí)施例5:人抗狂犬病毒全長(zhǎng)重鏈及輕鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以來(lái)源于人抗狂犬病毒scFv庫(kù)的特異性單抗RS3基因?yàn)槟０?，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增VH及Vk基因，按如下比例建立PCR反應(yīng)體系人抗狂犬病毒scFv庫(kù)的特異性單抗RS3基因50ng;含Mg^的10xPCR緩沖液lOpl;dNTPs8^1(各2.5腿ol/L);VH上游引物為5，-CAGGTCGACCTGCTGCAGTCGGGGGC-3，(SEQIDNO:34)VH下游引物為5，-CTAGGGCCCGAAGAGACGGTGAC-3，(SEQIDNO:35)。它們分別含有內(nèi)切酶Sail和Apal(劃線部位)的識(shí)別序列。Vk上游引物為5'-CGAACTAGTGTTGACCCAGTCTCCA-3，(SEQIDNO:36)，vk下游弓I物為5，-AGCCGGTCCGCGTTTGATTTCCACT-3，(SEQIDNO:37)。它們分別含有內(nèi)切酶Spel和Cpol(劃線部位)的識(shí)別序列。反應(yīng)體系中含上述引物均為lpl(20pmol爾l);Taq酶lpl(5U爾1);滅菌超純水至終體積10(^1。PCR反應(yīng)條件是94°C4分鐘；94°C30秒，56°C30秒，72°C1分鐘，共28個(gè)循環(huán)，然后72°C8分鐘。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察片段大小，確定是否得到正確目的基因。(2)人抗狂犬病毒全長(zhǎng)重鏈及輕鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建完整重鏈及輕鏈表達(dá)載體pPICZaCH及pPICZaCK由本實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建，已將人CH及Ck基因重組到表達(dá)載體pPICZaC上，并在載體a信號(hào)肽3'末端分別引入了Spel及Sail識(shí)別序列，供可變區(qū)基因插入(見(jiàn)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410010991.8)。分別進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析回收PCR擴(kuò)增的VH和Vk基因片段。回收后，分別將VH和Vk基因片段用Sail+ApaI(VH)和Spel+CpoI(Vic)消化，完整重鏈及輕鏈表達(dá)載體pPICZaCH及pPICZaCK也分別用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化，分別將獲得的VH和Vic基因片段重組到載體相應(yīng)的內(nèi)切酶部位，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒。連接反應(yīng)體系包括酶切后的目的基因片段(VH和Vk基因片段)0.10.3pmol;相應(yīng)酶切后的完整重鏈及輕鏈表達(dá)載體(pPICZaCH及pPICZaCK)0.03pmol;DNA連接酶200U和10x連接緩沖液1^1;滅菌超純水至終體積IOW，16。C連接30分鐘。按照常規(guī)方法，從37'C培養(yǎng)16小時(shí)的XL,-Bhie陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的LB瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落(直徑23mm)，接種于含有100mlLB培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中，以制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并于-8(TC凍存?zhèn)溆?。取一份凍存的感受態(tài)細(xì)胞融化后，加入上述連接產(chǎn)物，進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化。然后取200^1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含Zeocin(25ng/ml)的低鹽LB瓊脂平板上，37"培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1216小時(shí)。(3)重組載體的鑒定隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種于含Zeocin(25ng/ml)的低鹽LB培養(yǎng)基中，37'C強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后常規(guī)提取質(zhì)粒DNA。取lpl溶解的DNA沉淀物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。內(nèi)切酶鑒定可見(jiàn)Sall+Xbal消化出現(xiàn)1400bp左右片段(VH+CH)，Spel+Cpo1消化出現(xiàn)700bp左右片段(Vk+Ck),挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒，用于DNA序列分析。實(shí)施例6:重組人抗狂犬病毒全長(zhǎng)抗體的表達(dá)(1)人抗狂犬病毒全長(zhǎng)重鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞取測(cè)序正確的培養(yǎng)菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量分析。取2025嗎pPICZo/(VH+CH)重組質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶消化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用10nl超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母X-33的YPD陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落，接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，250rpm,3(TC震蕩培養(yǎng)8小時(shí)，以常規(guī)制備酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。然后取80pl上述感受態(tài)菌，與2025嗎線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；旌?，移入0.2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。取50100nl轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin(100ng/ml)的YPD平板上，3(TC培養(yǎng)箱培養(yǎng)23天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。然后用PCR方法(擴(kuò)增人抗體重鏈Fd基因引物，其它反應(yīng)條件同上)篩選轉(zhuǎn)化酵母菌。離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進(jìn)行PCR鑒定。而后按照實(shí)施例7中的方法進(jìn)行重組重鏈抗體的表達(dá)分析，篩選出高表達(dá)的重鏈抗體菌種。(2)人抗狂犬病毒全長(zhǎng)抗體表達(dá)菌株的獲得取測(cè)序正確的培養(yǎng)菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量分析。取2025嗎pPICZo/(VK+CK)重組質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶消化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用l(Hil超純水溶解后置冰上備用。取上述篩選出的重鏈抗體表達(dá)陽(yáng)性菌株，接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，250rpm,3(TC震蕩培養(yǎng)8小時(shí)，以常規(guī)制備酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。然后取80nl上述感受態(tài)菌，與2025嗎線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；旌?，移入0.2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。取50100pl轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含不同Zeocin濃度(100pg/ml，15(^g/ml，170ng/ml，190ng/ml，200ng/ml)的YPD平板上，30。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)23天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。然后用PCR方法(分別使用擴(kuò)增人抗體重鏈Fd基因引物和擴(kuò)增人抗體輕鏈全長(zhǎng)基因，其它反應(yīng)條件同上)篩選轉(zhuǎn)化酵母菌。離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如附圖6所示。而后按照實(shí)施例7中的方法進(jìn)行重組抗體的表達(dá)分析，從而獲得人抗狂犬病毒全長(zhǎng)抗體表達(dá)菌株。實(shí)施例7:重組人抗狂犬病毒全長(zhǎng)抗體的表達(dá)產(chǎn)物抗原結(jié)合活性分析1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量測(cè)定和初步定量分析。方法如下配制10%分離膠5%濃縮膠。分別取不同時(shí)間點(diǎn)和不同克隆的培養(yǎng)物上清按4:1比例加入5xSDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸35分鐘。取上述樣品，冷卻至室溫后，離心(10000rpm)30秒，取上清每孔加樣20^1。40V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到IOOV，繼續(xù)恒壓電泳分離?？捡R斯亮藍(lán)染色并脫色后，觀察分析結(jié)果。結(jié)果如附圖7所示。2.將狂犬病免疫球蛋白表達(dá)陽(yáng)性酵母菌株接種于1L搖瓶發(fā)酵，0.5%甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)上清經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀濃縮后，進(jìn)行Western-blot及ELISA分析。(1)表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析按照常規(guī)方法將狂犬病毒抗原經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥3060分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0.2。/。BSA的TTBS)，室溫輕輕振蕩23小時(shí)或4"C封閉過(guò)夜。封閉結(jié)束后，將NC膜放入雜交袋中加入表達(dá)的人抗狂犬病全抗體，室溫振蕩14小時(shí)。膜用TTBS漂洗35次后，用抗體稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體至1:2001:1000，加入雜交袋中，與NC膜一起室溫振蕩24小時(shí)。加入lml0.3%(W/V)NiCl或CoCl2及10^130%&02溶液。洗膜后，將膜移入顯色液中，室溫下輕輕搖動(dòng)并觀察顯色反應(yīng)。結(jié)果如附圖8所示。(2)重組人抗狂犬病毒抗體的ELISA分析狂犬病毒抗原進(jìn)行包被，5%脫脂奶粉封閉，依次滴加不同時(shí)段表達(dá)的人抗狂犬病全抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗，蘭州所顯色液顯色，加入lmol/L硫酸終止反應(yīng)后，檢測(cè)490nm處的光吸收值。結(jié)果如圖9所示。表2克隆R5抗狂犬病毒抗體誘導(dǎo)表達(dá)后不同時(shí)段的發(fā)酵上清的ELISA分析結(jié)果(xts)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>從表2所示的結(jié)果可以看出，克隆R5完整抗體表達(dá)上清具有良好的狂犬病毒抗原結(jié)合活性。序歹lj表<110>吉林圣元科技有限公司<120>重組人抗狂犬病毒抗體<140><141><160>6<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>1TAAGGGCCCCTGAGCCCAAATCTTGTG<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>2CCGTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGG<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的互補(bǔ)的寡核苷酸。<400>3TCGAGAAGAGACATCTGTTGTAGACTCACGGGCCCG<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的互補(bǔ)的寡核苷酸。<400>4AATTCGGGCCCGTGAGTCTACAACAGATGTCTCTTC<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4SAGGTGCAGCGSWGSAGTCKGG<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TGARGAGACGGTGACCRKKGTSCC<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4GAMATYSWGWTGACSCAGTCTCC<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4GAAACGACACTCACGCAGTCTCC<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ACGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CAGTCTGYSYTGACKCAGCCKSC<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TCYTMTGWGCTGACTCAGSMMCC<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CACGTTATACTGACTCAACCGCC<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>"C223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ACCTARRACGGTSASCTKGGTCCC<210>24<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>k卿a鏈linker。<400>4GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACGTTTGAT<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGASAGGTGCAGCTGSWGSAGTCKGG<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGACAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG<210>28<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGAGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ATTGGGCCCGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC<210>30<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ATTGGGCCCGTTTGATATCCACTTTGGTCCC<210>31<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv詢PCR擴(kuò)增引物。<400>4ATTGGGCCCGTTTAATCTCCAGTCGTGT(〕CC<210>32<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>lambda鏈linker。<400>4GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACCTARRAC<210>33<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作擴(kuò)增scFv的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ATTGGGCCCCTARRACGGTSASCTKGGTCCC<210>34<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>^23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CAGGTCGACCTGCTGCAGTCGGGGGC<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4CTAGGGCCCGAAGAGACGGTGAC<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCRT增引物。<400>4CGAACTAGTGTTGACCCAGTCTCCA<210>37<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4AGCCGGTCCGCGTTTGATTTCCACT權(quán)利要求1.本發(fā)明涉及一新的重組人抗狂犬病毒抗體及應(yīng)用。2、本發(fā)明所涉及的重組人抗狂犬病毒抗體，其主要特征在于應(yīng)用畢赤酵母人源抗體庫(kù)對(duì)人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗體進(jìn)行分泌型表達(dá)篩選。3、本發(fā)明所涉及的重組人抗狂犬病毒抗體，其主要特征在于應(yīng)用畢赤酵母并以分步整合法對(duì)完整的人抗狂犬病毒抗體進(jìn)行了分泌型表達(dá)。4、本發(fā)明所涉及的重組人抗狂犬病毒抗體，其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定簇互補(bǔ)區(qū)(ComplementDeterminingRegions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，如說(shuō)明書(shū)附圖。5、本發(fā)明所涉及的重組人抗狂犬病毒抗體，其主要特征在于其輕鏈和重鏈各自相應(yīng)的三個(gè)CDR序列為本抗體特有的全新序列。重鏈三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDRl為YTFTSYYIH;CDR2為T(mén)鵬GGSTSYAEKFQD;CDR3為DLRGYISNWSTLFMDV。輕鏈三個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDRl為RASQDIRKSLN;CDR2為DASNLEA;CDR3為QQYHHLPPWL6、重組人抗狂犬病毒抗體RS3scFv-Fc抗體，其特征在于為一種可在原核或真核細(xì)胞中獲得穩(wěn)定有效表達(dá)基因重組的人抗狂犬病毒蛋白基因工程scFv-Fc抗體，由重鏈可變區(qū)，輕鏈(Kappa鏈)可變區(qū)及重鏈恒定區(qū)Fc段組成。其重鏈恒定區(qū)Fc基因來(lái)源于載體pPICZaIgH,已在專利申請(qǐng)?zhí)枮?00410010991.8的專利申請(qǐng)中陳述。在scFv基因和Fc基因之間含有Apal酶切位點(diǎn)。7、本發(fā)明所涉及的重組人抗狂犬病毒抗體，其主要功能特征在于特異性狂犬病毒抗原結(jié)合活性，具有中和狂犬病毒和抗狂犬病毒感染的活性。8、根據(jù)上述7條權(quán)利要求，重組人抗狂犬病毒抗體的用途特征在于利用上述獲得中和性抗體的決定簇互補(bǔ)區(qū)、可變區(qū)、scFv-Fc或全抗體基因，可以在任何其他原核及真核細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)改建后的含有此抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和狂犬病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達(dá)產(chǎn)物可望在臨床上用于預(yù)防和治療由狂犬病毒引起的狂犬病。9、根據(jù)權(quán)利要求4和5中所述的CDR氨基酸序列為本抗體特有的抗體序歹U，任何新的工程抗體可變區(qū)基因或相關(guān)產(chǎn)物基因不應(yīng)含有與上述任何兩種CDR序列完全相同或基本同源的序列。全文摘要本發(fā)明涉及重組人源抗體的生產(chǎn)方法，特別是涉及重組人抗狂犬病毒抗體的生產(chǎn)方法。其主要特征在于該重組抗體是由存在于抗體重鏈和輕鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并可在原核和真核細(xì)胞中獲得表達(dá)的特異性結(jié)合狂犬病毒的中和性抗體。其今后的可能用途在于利用該抗體中CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的任何表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)該抗體，可在臨床上用于預(yù)防和治療狂犬病。文檔編號(hào)C12N15/13GK101235086SQ20071005530公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2007年2月2日優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日發(fā)明者王丁丁,顏煒群申請(qǐng)人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司