專利名稱：埃洛石在酶固定載體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域，尤其涉及埃洛石作為一種酶固定載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酶作為一種天然的高分子催化劑，具有極高的選擇性，催化反應(yīng)條件溫和， 無污染，但是游離狀態(tài)的酶對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性 較差，易失活，并且反應(yīng)后混入催化產(chǎn)物等物質(zhì)，純化困難，不能重復(fù)使用。而 酶經(jīng)過固定化后可克服以上缺點(diǎn)，同時(shí)易于保存，對(duì)熱、pH等的穩(wěn)定性也有較 大提高，對(duì)抑制劑的敏感性降低，有的酶還具備了抗蛋白酶分解的特性。經(jīng)過固 定的酶，在反應(yīng)完成后經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾或離心，酶就可以回收，可以循環(huán)使用， 而且酶活力降低較少，這樣就降低了生產(chǎn)成本。因此，游離酶的固定化技術(shù)一直 是近來研究的熱點(diǎn)。固定酶是應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需求而產(chǎn)生的，在工業(yè)生產(chǎn)、生化制 藥中得到了廣泛應(yīng)用，并且近來在研究最活躍的生物傳感器，廢水處理和環(huán)境監(jiān) 測(cè)方面也得到了應(yīng)用，為此，研究制備高固定率、高酶活、高穩(wěn)定性的固定化酶 具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
常用的固定化酶載體材料有高分子載體、無機(jī)載體和復(fù)合載體材料，而無機(jī) 載體材料具有穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、不易被微生物所分解、耐酸堿、成本低、 壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)研究人員在固定化技術(shù)方面進(jìn)行了廣泛的研究，也發(fā)展了一 些獨(dú)特的固定化技術(shù)，載體材料尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的合成。Paul Takhistov用陽(yáng)極 氧化法制備了具有納米孔的氧化鋁，用其吸附青霉素酶制得酶催化生物傳感器， 納米級(jí)孔結(jié)構(gòu)的存在增強(qiáng)了氧化鋁對(duì)酶的固定作用；Humphrey H.P.等利用了三 種分子篩MCM-41、MCM-48和SBA-15對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行了固定化研究;Antonella Petri等用3-甘油丙基三甲氧基硅垸制得環(huán)氧化硅膠，用于固定氯化物、過氧化 氫酶；Li Zeng等人通過在磁性Fe304表面的共聚合成反應(yīng)制備了樹枝狀復(fù)合磁 性粒子(MS型載體)，用簡(jiǎn)單吸附和戊二醛共價(jià)交聯(lián)的方法固定化豬胰脂肪酶。 以上方法所得的固定化酶穩(wěn)定性均高于游離酶，但是所需的載體都需經(jīng)人工合成 制備，工藝相對(duì)復(fù)雜，成本很高，因此，研究適于酶固定化的新型載體及相應(yīng)的 酶固定化技術(shù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種廉價(jià)易得、易于工業(yè)化且能制備出高固定率，高酶 活，高穩(wěn)定性固定化酶的新型酶固定載體，將其應(yīng)用于酶固定，并且對(duì)不同分子 量的酶均可以固定化。
本發(fā)明技術(shù)方案如下選用天然礦物——納米埃洛石為固定化酶載體材料, 將其應(yīng)用于酶固定。
由于埃洛石具有形態(tài)完整的中空管狀結(jié)構(gòu)，尺寸分布均勻穩(wěn)定，管長(zhǎng) 0.5 3Mra,管外徑約30~80nni，管內(nèi)徑約6 40nm，具有高負(fù)電荷表面和能與酶發(fā) 生反應(yīng)的羥基官能團(tuán)，具有高的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，可以大大提高載體和酶之 間的結(jié)合能力，使載體易和酶相交聯(lián)從而提高固化率和固定化酶的操作性和穩(wěn)定 性。為此，本發(fā)明選用埃洛石作為固定化酶載體材料。
具體應(yīng)用步驟首先將埃洛石進(jìn)行細(xì)化處理，用大于200目的篩進(jìn)行篩分得 到埃洛石粉體；將埃洛石粉體與由pH-5 8的緩沖溶液配制而成的酶液混合，攪 拌均勻，于0 35'C溫度下，進(jìn)行固定化反應(yīng)，然后將混合體系離心沉降、洗滌、 干燥，得到固定化酶；或者為更好地提高酶固定效果，可先將埃洛石進(jìn)行交聯(lián)改 性，即將埃洛石粉體加入到0.5%~7%百分濃度的交聯(lián)劑溶液中浸泡，而后充分 水洗，再加入由pH值^5 8的緩沖溶液配制而成的酶液進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混 合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定化酶。
pH值-5 8的緩沖溶液為磷酸緩沖溶液或醋酸鹽或醋酸鈉/醋酸緩沖溶液。 交聯(lián)劑為戊二醛等。
本發(fā)明首次采用天然礦物埃洛石作為酶固定化的載體，技術(shù)關(guān)鍵在于
1、 使用通過200目以上篩分的管狀埃洛石粉體作為酶固定材料。
2、 選擇適合于自由酶的緩沖溶液。
3、 調(diào)節(jié)系統(tǒng)的pH值，pH值對(duì)酶固定化過程起至關(guān)重要的作用，pH值可以 改變酶分子和固定化載體的離子化狀態(tài)，pH值較低時(shí)，固化效果不理想，若pH 過高，對(duì)酶結(jié)構(gòu)有破壞作用，會(huì)導(dǎo)致固定化酶催化活性下降。
4、控制系統(tǒng)的溫度，溫度對(duì)于酶固定化過程也很重要，溫度過低，固定率和 酶活均不理想，溫度過高，會(huì)破壞酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，甚至失活。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于使用天然礦物為載體原料，廉價(jià)易得，穩(wěn)定性好，機(jī)械 強(qiáng)度高，易于與產(chǎn)物分離，可回收和反復(fù)使用，降低了固定化酶的操作成本；而 且載體具有大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)徑6~40mi，納米級(jí)孔結(jié)構(gòu)的存在適
合各種酶的固定化，所得固定化酶固定率高，穩(wěn)定性優(yōu)良。
本發(fā)明利用考馬斯亮藍(lán)染色法計(jì)算酶的固定率，不同的酶采取相應(yīng)的方法測(cè) 定其酶活，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，固定化酶比游離態(tài)的酶具有更寬的溫度適用范圍和pH適用 范圍，而且固定化酶具有良好的重復(fù)使用性和存放穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更好的說明，舉實(shí)施例如下 實(shí)施例l
將埃洛石進(jìn)行破碎、研磨處理，用250目篩進(jìn)行篩分，得到埃洛石粉體。將 0. 25g埃洛石粉體與14mg/mL氨基酰化酶液(由pH=7. 0的磷酸緩沖溶液配置)5mL 混合，攪拌均勻，于4'C條件下，進(jìn)行固定化反應(yīng)12小時(shí)，或者將埃洛石加入 到1%百分濃度的戊二醛溶液中浸泡，而后充分水洗，再加入上述氨基?；敢?， 進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定化酶。蛋白質(zhì) 結(jié)合率達(dá)0. U2 0.252mg (g halloysite廣1 ，酶活達(dá)0. 105 0. 253IU (mg halloysite)-1， pH值適用范圍4 14，溫度適用范圍40~100°C，固定化酶使用15 次后，剩余活性仍達(dá)80~85%，未失去活性。樣品在4'C下存放3個(gè)月后，酶活性 仍可保持原有催化活性的92~95%。 實(shí)施例2
將埃洛石進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠扑?、研磨處理，并利?00目篩進(jìn)行篩分，得到埃洛 石粉體。將0. 25g的埃洛石粉體與12mg/mL脲酶液(由pH=7. 0的磷酸緩沖溶液配 置)5mL混合，攪拌均勻，于4'C條件下，進(jìn)行固定化反應(yīng)12小時(shí)，或者將埃洛 石加入到1%百分濃度的戊二醒溶液中浸泡，而后充分水洗，再加入上述脲酶液， 進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定化脲酶。酶活 力回收率可達(dá)52~85%, pH值適用范圍5-9，溫度適用范圍32~90°C，固定化酶 使用IO次后，剩余活性仍達(dá)87~95%， 4'C下存放2個(gè)月固定化酶的酶活性仍可
保持原有催化活性的80~95%。。 實(shí)施例3
將埃洛石進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠扑?、研磨處理，并利?00目篩進(jìn)行篩分，得到埃洛 石粉體。將0. 25g的埃洛石粉體與16mg/mL辣根過氧化物酶液(由PH=6. 0的醋酸 鈉/醋酸緩沖溶液配置)5mL混合，攪拌均勻，于14'C條件下，進(jìn)行固定化反應(yīng) 12小時(shí)，或者將埃洛石加入到3%百分濃度的戊二醛溶液中浸泡，而后充分水洗， 再加入上述辣根過氧化物酶液，進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混合體系離心沉降、洗滌、 干燥，得到固定辣根過氧化物酶。固定化效率可高達(dá)95%，固定酶活達(dá)1.0U/g， pH值適用范圍5.5 9.5，溫度適用范圍40 85'C，固定化酶使用3次后，剩余活 性仍達(dá)80~85%,未失去活性。樣品在4'C下存放4個(gè)月后，酶活性仍可保持原有 催化活性的75%。 實(shí)施例4
將埃洛石進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠扑?、研磨處理，并利?00目篩進(jìn)行篩分，得到埃洛 石粉體。將0. 25g的埃洛石粉體與14nig/mL漆酶液(由pH=5. 0的磷酸緩沖溶液配 置)5mL混合，攪拌均勻，于24'C條件下，進(jìn)行固定化反應(yīng)12小時(shí)，或者將埃洛 石加入到5%百分濃度的戊二醛溶液中浸泡，而后充分水洗，再加入上述漆酶液， 進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定漆酶。固定化 效率60~86%， pH值適用范圍2. 5~9，溫度適用范圍25 65°C，固定化酶使用15 次后，剩余活性仍達(dá)60~70%, 4。C下存放2個(gè)月固定化酶的酶活性仍可保持原有 催化活性的80~95%。 實(shí)施例5
將埃洛石進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠扑椤⒀心ヌ幚?，并利?50目篩進(jìn)行篩分，得到埃洛 石粉體。將0. 25g的埃洛石粉體與12mg/mL纖維素酶液(由pH=8. 0的磷酸緩沖溶 液配置)5mL混合，攪拌均勻，于2"條件下，進(jìn)行固定化反應(yīng)12小時(shí)，或者將 埃洛石加入到7%百分濃度的戊二醛溶液中浸泡，而后充分水洗，再加入上述纖 維素酶液，進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定纖 維素酶。固定酶活性600~650U/g， pH值適用范圍3.9~5.8，溫度適用范圍40~80 °C，固定化酶使用15次后，剩余活性仍達(dá)70~83%， 4'C下存放2個(gè)月固定化酶 的酶活性仍可保持原有催化活性的80~90%。
實(shí)施例6
將埃洛石進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠扑?、研磨處理，并利?50目篩進(jìn)行篩分，得到埃洛 石粉體。將0. 25g的埃洛石粉體與14mg/mL青霉素?；敢?由pH=7. 0的醋酸鈉 /醋酸緩沖溶液配置)5mL混合，攪拌均勻，于4'C條件下，進(jìn)行固定化反應(yīng)12 小時(shí)，或者將埃洛石加入到0.5%百分濃度的戊二醛溶液中浸泡，而后充分水洗， 再加入上述青霉素?；敢?，進(jìn)行固定化反應(yīng)，隨后混合體系離心沉降、洗滌、 干燥，得到青霉素?；?。固定化效率60~86%，固定化酶活達(dá)1330~1680IU/g， pH值適用范圍6 10，溫度適用范圍20 60°C，固定化酶使用8次后，剩余活性 仍達(dá)72~85%，在6(TC保溫2小時(shí)仍保留活力80%。
權(quán)利要求
1、埃洛石在酶固定載體中的應(yīng)用，其特征在于，將其應(yīng)用于酶固定載體。
2、 如權(quán)利要求1所述的埃洛石在酶固定載體的應(yīng)用，其特征在于，首先將細(xì)化、 分散的埃洛石與由pH值=5-8的緩沖溶液配制而成的酶液混合均勻，于0-35'C條 件下攪拌均勻進(jìn)行物理吸附，而后混合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定化 酶。
3、 如權(quán)利要求l所述的埃洛石在酶固定載體的應(yīng)用，其特征在于，先將細(xì)化、 分散的埃洛石加入到0.5%-7%百分濃度的交聯(lián)劑溶液中浸泡，充分水洗后，加入 由pH值4-8的緩沖溶液配制而成的酶液，于0-35'C條件下進(jìn)行固定化反應(yīng)，而 后混合體系離心沉降、洗滌、干燥，得到固定化酶。
4、 如權(quán)利要求2或3所述的埃洛石在酶固定載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的 緩沖溶液為磷酸緩沖溶液或醋酸鹽或醋酸鈉/醋酸緩沖溶液。
5、 如權(quán)利要求3所述的埃洛石在酶固定載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的交聯(lián) 劑為戊二醛。
全文摘要
本發(fā)明公開了酶生物催化劑載體材料埃洛石在酶固定載體中的應(yīng)用。本發(fā)明選用埃洛石作為酶生物催化劑載體材料，將埃洛石細(xì)化、分散后進(jìn)行化學(xué)處理，然后加入一定量的酶液，于一定溫度下進(jìn)行固定化反應(yīng)，將混合體系經(jīng)離心沉降、洗滌、干燥，得到固定化酶。本發(fā)明制備出的埃洛石固定化酶與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有較高的催化活性和良好的穩(wěn)定性，易與產(chǎn)物分離，可以反復(fù)使用，原料易得，成本低。
文檔編號(hào)C12N11/14GK101096665SQ200710054558
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日
發(fā)明者冰 張, 曹艷霞, 陳榮峰 申請(qǐng)人:河南省科學(xué)院