專利名稱：一種測(cè)定丙酮酸脫氫酶系活性的分光光度法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙酮酸脫氫酶系活性測(cè)定的方法。具體是基于用吩嗪二甲酯硫酸鹽作電子傳遞體，噻唑藍(lán)作為電子受體，噻唑藍(lán)被丙酮酸脫氫酶(E1)的催化產(chǎn)物所還原，測(cè)定噻唑藍(lán)的還原量，確定丙酮酸脫氫酶系活性的分光光度法。
背景技術(shù)：
丙酮酸脫氫酶活性的測(cè)定在丙酮酸脫氫酶系的性質(zhì)、基因克隆、分離、純化、鑒定及相關(guān)研究中都是必不可少的。對(duì)于研究與丙酮酸的代謝異常有關(guān)的疾病，以酮酸脫氫酶系為靶標(biāo)的除草劑和殺菌劑也具有重要的意義。本發(fā)明對(duì)丙酮酸脫氫酶系的測(cè)活方法進(jìn)行研究，并建立了一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)有效的測(cè)活方法。
丙酮酸脫氫酶系或丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)在催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA的能量代謝過程中起著關(guān)鍵的作用。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)是多酶體系，其中包括丙酮酸脫氫酶(E1；EC 1.2.4.1)，二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶(E2；EC 2.3.1.12)和二氫硫辛酸脫氫酶(E3；EC 1.8.1.4)]三種主酶。丙酮酸脫氫酶是一種限速酶，催化丙酮酸脫羧生成羥乙基-TPP(羥乙基-焦磷酸硫胺素)，接下來將在E2的作用下，羥乙基氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴；瑫r(shí)轉(zhuǎn)移到E2的輔基硫辛酰胺上。
目前已有報(bào)道的丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定方法幾乎都是二十世紀(jì)六十年代就發(fā)展起來的。根據(jù)采用的手段主要可分為兩大類分光光度法和放射性同位素法。測(cè)定還原型輔酶I(NADH)形成速率的標(biāo)準(zhǔn)分光光度法常被用純化的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，這種方法由于易受到丙酮酸脫氫酶復(fù)合體反應(yīng)產(chǎn)物的副反饋抑制而受到限制，且試劑價(jià)格昂貴；常用測(cè)定丙酮酸脫氫酶活性的分光光度法有鐵氰化鉀法；2，6-二氯吲哚酚(2，6-DCPIP)法。同位素標(biāo)記法主要用于粗酶液，是基于14C丙酮酸經(jīng)過E1的催化作用轉(zhuǎn)化為的CO2，可以通過測(cè)定14C標(biāo)記的CO2生成量來決定E1酶的活性。因?yàn)橥凰貥?biāo)記法是采用動(dòng)態(tài)的測(cè)量，所以沒有分光光度的方法便利，同時(shí)它還用到一種相對(duì)不穩(wěn)定的放射性物質(zhì)，易造成環(huán)境污染。1981年(Hinman L M.& J P.Blass，J.Biol.Chem.，Vol.256，No.13)等人報(bào)道了一種在粗的均質(zhì)液中測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體活性的分光光度計(jì)法方法，此方法一直被用于測(cè)定粗的勻質(zhì)液和線粒體的制備后酶活的測(cè)定。
通過本發(fā)明人的系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)鐵氰化鉀法的靈敏度極低，在反應(yīng)起始后30分鐘內(nèi)基本沒有觀察到吸光度的變化；2，6-二氯吲哚酚法又易受到疏基保護(hù)劑(β-疏基乙醇和二硫蘇糖醇等，為了使提取的酶保持原有的活性，一般在提取酶的過程中都要加入疏基保護(hù)劑)的影響，當(dāng)巰基保護(hù)劑β-疏基乙醇濃度很低(50微摩爾/升)時(shí)，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體就能與β-疏基乙醇發(fā)生激烈的反應(yīng)；而在同樣的條件下用噻唑藍(lán)與β-疏基乙醇不發(fā)生反應(yīng)。1981年Hinman.等人所報(bào)到測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體活性的方法，原理是測(cè)定碘硝基四唑紫與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體共同作用后的產(chǎn)物還原型輔酶I發(fā)生反應(yīng)引起的光吸收的變化。經(jīng)過人們的研究發(fā)現(xiàn)碘硝基四唑紫不僅能與NADH反應(yīng)，它同時(shí)也能與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中第一個(gè)酶丙酮酸脫氫酶的產(chǎn)物直接發(fā)生作用，所以這種方法測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的可靠性值得進(jìn)一步考慮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定方法，這種方法具有經(jīng)濟(jì)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、受到的干擾小的特點(diǎn)。
本發(fā)明提供的丙酮酸脫氫酶活性的測(cè)定方法具體描述如下利用分光光度計(jì)，存在底物丙酮酸鈉和輔助因子氯化鎂、焦磷酸硫胺素的情況下，用吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)作電子傳遞體，噻唑藍(lán)(MTT)作為電子受體，噻唑藍(lán)被丙酮酸脫氫酶(E1)的催化產(chǎn)物羥乙基-焦磷酸硫胺素所還原，測(cè)定丙酮酸脫氫酶E1的催化產(chǎn)物對(duì)噻唑藍(lán)的還原量，確定酶的活性。噻唑藍(lán)被丙酮酸脫氫酶(E1)的催化產(chǎn)物還原后，噻唑藍(lán)最大吸收峰從波長(zhǎng)400-430納米變?yōu)?40-640納米，通過測(cè)定波長(zhǎng)540-640納米光吸收的增加量，用噻唑藍(lán)濃度與吸光度之間的關(guān)系曲線--標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定噻唑藍(lán)的還原量，定義酶的活性。當(dāng)石英比色池為1厘米時(shí)，還原的噻唑藍(lán)的濃度與吸光度之間的關(guān)系見標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
反應(yīng)混合物中包含磷酸鉀鹽緩沖液，氯化鎂(MgCl2)，焦磷酸硫胺素(TPP)，噻唑藍(lán)，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)和作為反應(yīng)底物的丙酮酸鈉。酶活性單位用實(shí)驗(yàn)決定的還原的噻唑藍(lán)的量來計(jì)算。酶的活性單位定義為每毫克蛋白每分鐘還原1納摩爾噻唑藍(lán)為1單位。
上述測(cè)定噻唑藍(lán)在波長(zhǎng)540-640納米吸光度的增加量的溫度為室溫10～30℃。
本發(fā)明首次利用噻唑藍(lán)作為丙酮酸脫氫酶系中丙酮酸脫氫酶(E1)電子受體。與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)方法相比存在以下優(yōu)點(diǎn)經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性高、靈敏度高，受到的干擾少。與傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定NADH(還原型輔酶I)方法相比，所用試劑價(jià)格便宜。其它試劑價(jià)格相當(dāng)，但標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定NADH方法中，100毫克CoA要1950元，而100毫克MTT只需要27元。如前背景技術(shù)所述2，6-二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法盡管試劑價(jià)格也不高，但是鐵氰化鉀法靈敏度極差，2，6-二氯吲哚酚法又易受到巰基保護(hù)劑的影響。而本發(fā)明的方法實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好，經(jīng)過多次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)之間的標(biāo)準(zhǔn)誤差很小。靈敏度比2，6-二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法高。


圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線還原噻唑藍(lán)的濃度與吸光度之間的關(guān)系曲線圖2為MTT法(噻唑藍(lán)法)和DCPIP法(2，6-二氯吲哚酚法)測(cè)定豬心丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)中丙酮酸脫氫的酶的活性的比較曲線圖3為MTT法和DCPIP法測(cè)定乳酸菌丙酮酸脫氫酶的活性的比較曲線圖4MTT法測(cè)定農(nóng)藥對(duì)乳酸菌丙酮酸脫氫酶是否抑制的反應(yīng)時(shí)間與吸光度的關(guān)系曲線具體實(shí)施方式
實(shí)驗(yàn)原理見下式
實(shí)施例1MTT法和DCPIP法測(cè)定乳酸菌丙酮酸脫氫的酶和豬心丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)中丙酮酸脫氫的酶的活性的比較第一步酶的預(yù)處理----乳酸菌丙酮酸脫氫酶(PDH)配制，PDH粉末用含20％甘油的50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液溶解并稀釋到1毫克蛋白/毫升。豬心丙酮酸脫氫酶復(fù)合體用含20％甘油的50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液稀釋到1毫克蛋白/毫升。分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 第二步MTT法反應(yīng)混合物的配制反應(yīng)混合物中包含50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液，1毫摩爾/升MgCl2，0.2毫摩爾/升焦磷酸硫胺素，0.5毫摩爾/升MTT，6.5毫摩爾/升吩嗪二甲酯硫酸鹽和2.0毫摩爾/升丙酮酸鈉作反應(yīng)的底物。DCPIP法參照Nemeria等(2001，J.Biol.Chem.，Vol.276，No.49)所用反應(yīng)體系有所修改(為了使兩種方法具有可比性，輔助因子和底物濃度均相同)。
第三步室溫條件下，加入酶液反應(yīng)起始，進(jìn)行時(shí)間掃描10分鐘。DCPIP法測(cè)定波長(zhǎng)600納米，MTT法測(cè)定波長(zhǎng)540-640納米的吸光度。樣品為完全的反應(yīng)體系，對(duì)照為完全的反應(yīng)體系不加焦磷酸硫胺素。吸光度用HITACHI U-1800紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、3。從兩種方法測(cè)定豬心丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)中丙酮酸脫氫的酶(圖2)可以看出，DCPIP法測(cè)定時(shí)間依賴性光吸收變化線性較差，MTT法線性較好，可以看到在反應(yīng)的起始后2-3分鐘DCPIP法光吸收變化較大，考慮到豬心酶液中的巰基保護(hù)劑β-疏基乙醇(終濃度是20微摩爾/升)可能對(duì)兩種方法造成影響，通過用20微摩爾/升的β-疏基乙醇與MTT和DCPIP分別作用，發(fā)現(xiàn)DCPIP能與β-疏基乙醇發(fā)生激烈的反應(yīng)，而同樣的條件下，即使存在吩嗪二甲酯硫酸鹽，MTT也不與β-疏基乙醇發(fā)生反應(yīng)，只有當(dāng)β-疏基乙醇足夠高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出提酶過程中所使用的濃度時(shí)，MTT才與β-疏基乙醇有比較明顯的反應(yīng)。同時(shí)從吸光度的變化看，MTT法在測(cè)定該酶時(shí)比DCPIP法靈敏度高66.28％。
從兩種方法測(cè)定乳酸菌丙酮酸脫氫酶的結(jié)果(圖3)看，兩種方法測(cè)定乳酸菌丙酮酸脫氫酶時(shí)間依賴性光吸收變化線性都比較好，但是在同樣的條件下，從吸光度的變化看，MTT法在測(cè)定該酶時(shí)比DCPIP法靈敏度高29.71％。從曲線上顯示的標(biāo)準(zhǔn)誤差看兩種方法在測(cè)定不含巰基保護(hù)劑的酶時(shí)重復(fù)性都比較好，即穩(wěn)定性高。
結(jié)論MTT法與DCPIP法相比受到巰基保護(hù)劑的干擾少，且靈敏度比DCPIP法高。重復(fù)性好實(shí)施例2抑制劑對(duì)丙酮酸脫氫酶活性抑制率的測(cè)定第一步酶的預(yù)處理----乳酸菌丙酮酸脫氫酶(PDH)配制，PDH粉末用含20％甘油的50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液溶解并稀釋到濃度1毫克蛋白/毫升。
第二步同實(shí)施例1第二步第三步將酶與濃度是100ppm的抑制劑IIM-1(IIM-1是1-(2，4-二取代苯氧乙酰氧基烴基膦酸單鈉鹽類化合物)一起30℃溫浴30-60分鐘第四步室溫條件下，向反應(yīng)混合物中加入酶或者酶和抑制劑起始反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)混合液吸光度與時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果見圖4。
圖4中純酶為完全的反應(yīng)體系加入酶液反應(yīng)起始；對(duì)照為完全的反應(yīng)體系中不加酶液；酶加抑制劑為完全的反應(yīng)體系加入酶和抑制劑。
計(jì)算結(jié)果5分鐘內(nèi)沒有加抑制劑只加酶的樣品管吸光度變化為0.113；加入酶的同時(shí)又加入抑制劑的樣品管吸光度變化為0.84，所以抑制劑對(duì)酶活性的抑制率是(0.113-0.84)/0.113＝25.6637％。
本發(fā)明實(shí)施可隨著具體測(cè)活性質(zhì)不同，進(jìn)行具體反應(yīng)體系調(diào)整，如測(cè)定動(dòng)物源的丙酮酸脫氫酶活性，可以選擇pH值在7附近；但如果測(cè)定植物源的丙酮酸脫氫酶活性，最好選擇pH值在8附近。假如是篩選以丙酮酸脫氫酶為靶標(biāo)的抑制劑，測(cè)定抑制劑對(duì)丙酮酸脫氫酶的抑制性和抑制率，就需要調(diào)整反應(yīng)體系中的底物濃度。
權(quán)利要求
1.一種丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定方法，其特征是用吩嗪二甲酯硫酸鹽作中間電子傳遞體，噻唑藍(lán)作為電子受體，測(cè)定丙酮酸脫氫酶E1的催化產(chǎn)物羥乙基-焦磷酸硫胺素對(duì)噻唑藍(lán)的還原量，根據(jù)噻唑藍(lán)的還原量確定酶的活性，酶的活性單位定義為每毫克蛋白每分鐘還原1納摩爾噻唑藍(lán)為1單位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定方法，其特征是利用分光光度計(jì)，在存在底物丙酮酸鈉和輔助因子氯化鎂、焦磷酸硫胺素的情況下，通過測(cè)定噻唑藍(lán)在波長(zhǎng)540-640納米吸光度的增加量，用噻唑藍(lán)濃度與吸光度之間的關(guān)系曲線--標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定噻唑藍(lán)的還原量，定義酶的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定方法，其特征是測(cè)定噻唑藍(lán)在波長(zhǎng)540-640納米吸光度的增加量的溫度為室溫。
全文摘要
一種測(cè)定丙酮酸脫氫酶活性的分光光度法。該法利用分光光度計(jì)，在存在底物丙酮酸鈉和輔助因子氯化鎂、焦磷酸硫胺素的情況下，用吩嗪二甲酯硫酸鹽作電子傳遞體，噻唑藍(lán)作電子受體，噻唑藍(lán)被丙酮酸脫氫酶(E1)的產(chǎn)物羥乙基－焦磷酸硫胺素所還原，噻唑藍(lán)最大吸收峰從波長(zhǎng)400－430納米變?yōu)?40－640納米，通過測(cè)定波長(zhǎng)540－640納米光吸收的增加量，確定噻唑藍(lán)的還原量，定義酶的活性。本法用的試劑比較經(jīng)濟(jì)，穩(wěn)定性，靈敏度比2，6－二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法高，同時(shí)也克服了2，6－二氯吲哚酚法易受疏基保護(hù)劑影響不利于測(cè)定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中E1活性的缺點(diǎn)，本法既適用于純化丙酮酸脫氫活性測(cè)定，也適用于來自線粒體提取后的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK101017134SQ20071005127
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者袁均林, 何亞輝, 賀紅武, 彭浩, 楊旭, 丁書茂 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)