專利名稱：不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別涉及一種不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
目前，厭氧微生物的培養(yǎng)一般需要使用厭氧培養(yǎng)箱。這種厭氧培養(yǎng)箱需要耗費(fèi)大量的純氮?dú)饣蚨趸紒眚?qū)除箱內(nèi)存在的空氣，且氧分壓仍達(dá)不到許多絕對(duì)厭氧微生物的環(huán)境要求，實(shí)驗(yàn)操作需帶上長臂手套在箱內(nèi)進(jìn)行，極不方便。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Joblin等在《Current Microbiology》(《現(xiàn)代微生物學(xué)》，2002年45卷46-53頁)上發(fā)表了題為“Degradation of FreshRyegrass by Methanogenic Co-Cultures of Ruminal Fungi Grown in thePresence or Absence of Fibrobacter succinogenes(“在琥珀酸擬桿菌存在或缺乏時(shí)瘤胃真菌產(chǎn)甲烷共培養(yǎng)對(duì)鮮黑麥草的降解”)的論文，提出一種通過厭氧培養(yǎng)箱輔助制作厭氧培養(yǎng)瓶來培養(yǎng)厭氧微生物的Hungate滾管方法，該方法利用刃天青作為氧化還原狀態(tài)指示劑，利用半胱氨酸和硫化鈉除去瓶內(nèi)氧氣，該方法的不足在于(1)刃天青在高溫滅菌時(shí)會(huì)遭到破壞，顏色會(huì)由藍(lán)色變?yōu)闇\粉紅色，色差弱，當(dāng)培養(yǎng)基溶液本身有顏色時(shí)，不能有效顯示色差變化，因而不能指示瓶內(nèi)是否存在微量氧氣；(2)在室溫狀態(tài)下(如20℃)，硫化鈉與氧氣的反應(yīng)速度很快，往往培養(yǎng)基分裝和加瓶蓋作業(yè)未完成，添加的硫化鈉就已經(jīng)耗盡，隨后進(jìn)入瓶內(nèi)的氧氣不能除去；(3)硫化鈉是一種強(qiáng)堿，具有強(qiáng)腐蝕性，與水中溶解氧反應(yīng)會(huì)生成硫化氫，對(duì)許多厭氧微生物具有毒害作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，使其通過利用高溫穩(wěn)定的指示劑及安全無毒、在室溫下反應(yīng)速度較慢、在高溫下反應(yīng)速度較快的除氧劑，有效除去培養(yǎng)基中的溶解氧，同時(shí)滿足分裝和加瓶蓋的時(shí)間要求，并克服了硫化鈉的氧化產(chǎn)物對(duì)微生物的腐蝕毒害作用。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明具體包括如下步驟(1)配制好培養(yǎng)基溶液后，加入亞甲基蘭作為氧化還原狀態(tài)指示劑，溶液中有溶解氧時(shí)顯藍(lán)色，溶液中沒有溶解氧時(shí)顯無色；(2)在室溫狀態(tài)下，向上述培養(yǎng)基溶液中加入除氧劑，搖勻溶解后，立即將該培養(yǎng)基溶液開始分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，加蓋膠塞和瓶蓋，分裝和加瓶蓋作業(yè)時(shí)間控制在30分鐘內(nèi)；(3)通過注射器針頭穿過膠塞，向經(jīng)步驟(2)處理后的培養(yǎng)瓶中通入氮?dú)?-2分鐘，同時(shí)排氣，交換培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液上方的空氣；(4)將經(jīng)步驟(3)處理后的培養(yǎng)瓶于121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘，冷卻后備用。
步驟(1)中所述的培養(yǎng)基溶液是指各種微生物培養(yǎng)溶液，包括液體培養(yǎng)基溶液和固體培養(yǎng)基溶液；所述的亞甲基蘭，其加入的量為培養(yǎng)基溶液的0.0001％-0.0005％(w/v)。
步驟(2)中所述的室溫狀態(tài)是指室內(nèi)溫度不超過37℃；所述的除氧劑由食品中能允許使用的除氧劑組成，包括維生素C及其鈉鹽，異維生素C及其鈉鹽，半胱氨酸及其鹽酸鹽，以及它們按照不同比例組成的復(fù)合物，該除氧劑安全無毒，室溫下反應(yīng)速度較慢，高溫下反應(yīng)速度較快；所述的除氧劑，其加入的量為培養(yǎng)基溶液的0.02-0.1％(w/v)。
步驟(3)中所述的膠塞是指能自動(dòng)閉合針頭穿入孔的膠塞，包括丁基膠塞，橡膠塞等；所述的氮?dú)?，是純度?9.999％的高純氮?dú)狻?br> 本發(fā)明對(duì)Hungate滾管法進(jìn)行了改進(jìn)，利用高溫滅菌后仍然穩(wěn)定的亞甲基蘭作為指示劑，并利用室溫下反應(yīng)速度較慢、高溫下反應(yīng)速度較快、安全無毒的除氧劑替代硫化鈉，不需要厭氧培養(yǎng)箱輔助進(jìn)行培養(yǎng)基分裝和加瓶蓋作業(yè)，在分裝、加蓋、換氣后，在高溫滅菌過程中，使除氧劑與氧氣快速反應(yīng)除去培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)不需要使用厭氧培養(yǎng)箱，操作簡便，成本低；(2)加入亞甲基蘭經(jīng)121℃滅菌20分鐘后仍然穩(wěn)定，完全可以指示瓶內(nèi)溶液的氧化還原狀態(tài)，克服了刃天青在高溫滅菌時(shí)，顏色會(huì)由藍(lán)色變?yōu)闇\粉紅色，當(dāng)培養(yǎng)基溶液本身有顏色時(shí)，不能有效顯示色差等缺點(diǎn)；(3)加入的除氧劑安全無毒，在室溫下反應(yīng)速度較慢，在高溫下反應(yīng)速度較快，既能達(dá)到有效除氧目的，又能滿足分裝和加瓶蓋的時(shí)間要求，克服了硫化鈉與氧氣的反應(yīng)速度太快，往往來不及進(jìn)行培養(yǎng)基分裝和加瓶蓋作業(yè)，氧化產(chǎn)物對(duì)微生物有害等缺點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1用天然牛胃液培養(yǎng)土壤中的厭氧微生物稱取1.0克土壤，加入2ml蒸餾水，渦旋混勻2分鐘后，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清液作為待培養(yǎng)的微生物菌懸液備用；取一干凈燒杯，加入100ml澄清牛胃液，加入亞甲基蘭0.0005克，加入除氧劑0.02克，搖勻溶解后，立即開始分裝，將培養(yǎng)基溶液分裝于規(guī)格為4ml西林瓶內(nèi)，每瓶2ml，利用西林瓶壓蓋機(jī)蓋上丁基膠塞和固定鋁蓋，分裝和加塞固定時(shí)間控制在30分鐘內(nèi)，然后通過注射器針頭穿過膠塞，通入高純氮?dú)?99.999％)1分鐘，同時(shí)排氣，交換培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液上方的空氣，用常規(guī)滅菌鍋在121℃下蒸汽滅菌20分鐘，滅菌冷卻后，通過注射器針頭穿過膠塞，將20ul待培養(yǎng)的微生物菌懸液接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后，培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液由澄清變?yōu)闇啙?，表明待培養(yǎng)的微生物已經(jīng)培養(yǎng)放大，可用于后續(xù)的單純菌株篩選或分子鑒定。
實(shí)施例2用天然牛胃液分離土壤中的厭氧微生物單純菌株稱取1.0克土壤，加入2ml蒸餾水，渦旋混勻2分鐘后，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清液作為待培養(yǎng)的微生物菌懸液備用；取一干凈燒杯，加入100ml澄清牛胃液，加入瓊脂2.0克，煮沸溶解瓊脂后冷卻至60℃左右，加入亞甲基蘭0.0001克，加入除氧劑0.1克，搖勻溶解后，立即開始分裝，將培養(yǎng)基溶液分裝于規(guī)格為4ml西林瓶內(nèi)，每瓶2ml，利用西林瓶壓蓋機(jī)蓋上丁基膠塞和固定鋁蓋，分裝和加塞固定時(shí)間控制在30分鐘內(nèi)，然后通過注射器針頭穿過膠塞，通入高純氮?dú)?99.999％)1分鐘，同時(shí)排氣，交換培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液上方的空氣，用常規(guī)滅菌鍋在121℃下蒸汽滅菌20分鐘，滅菌后冷卻至55℃，通過注射器針頭穿過膠塞，將20ul待培養(yǎng)的微生物菌懸液接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，搖勻后立即放入盛有冰水的器皿中勻速滾動(dòng)，待培養(yǎng)基固化后，放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后，在培養(yǎng)基內(nèi)將出現(xiàn)許多形態(tài)各異的單菌落，這些單菌落即為單純菌株，可用毛細(xì)管挑取，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。
實(shí)施例3產(chǎn)氫厭氧微生物的篩選稱取1.0克污泥土壤，加入2ml蒸餾水，在100℃水浴鍋中處理45分鐘，渦旋混勻2分鐘后，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清液作為待培養(yǎng)的微生物菌懸液備用；取一干凈燒杯，加入l00ml篩選產(chǎn)氫厭氧微生物的培養(yǎng)基溶液(培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)林明等，“產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌培養(yǎng)基的選擇和改進(jìn)”，《哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》，2003年第35卷第4期398-402頁)，加入瓊脂2.0克，煮沸溶解瓊脂后冷卻至60℃左右，加入亞甲基蘭0.0003克，加入除氧劑0.06克，搖勻溶解后，立即開始分裝，將培養(yǎng)基溶液分裝于規(guī)格為4ml西林瓶內(nèi)，每瓶2ml，利用西林瓶壓蓋機(jī)蓋上丁基膠塞和固定鋁蓋，分裝和加塞固定時(shí)間控制在30分鐘內(nèi)，然后通過注射器針頭穿過膠塞，通入高純氮?dú)?99.999％)1分鐘，同時(shí)排氣，交換培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液上方的空氣，用常規(guī)滅菌鍋在121℃下蒸汽滅菌20分鐘，滅菌后冷卻至60℃，通過注射器針頭穿過膠塞，將20ul待培養(yǎng)的微生物菌懸液接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，搖勻后立即放入盛有冰水的器皿中勻速滾動(dòng)，待培養(yǎng)基固化后，放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后，在培養(yǎng)基內(nèi)將出現(xiàn)許多形態(tài)各異的單菌落，這些單菌落即為單純菌株，可用毛細(xì)管挑取，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征在于，具體包括如下步驟(1)配制好培養(yǎng)基溶液后，加入亞甲基蘭作為氧化還原狀態(tài)指示劑；(2)在室溫狀態(tài)下，向培養(yǎng)基溶液中加入除氧劑，搖勻溶解后，立即將該培養(yǎng)基溶液開始分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，加蓋膠塞和瓶蓋，分裝和加瓶蓋作業(yè)時(shí)間控制在30分鐘內(nèi)；(3)通過注射器針頭穿過膠塞，向經(jīng)步驟(2)處理后的培養(yǎng)瓶中通入氮?dú)?，同時(shí)排氣，交換培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液上方的空氣；(4)將經(jīng)步驟(3)處理后的培養(yǎng)瓶高溫蒸汽滅菌，冷卻后備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，步驟(1)中所述的培養(yǎng)基溶液為液體培養(yǎng)基溶液或固體培養(yǎng)基溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，步驟(1)中所述的亞甲基蘭，其在培養(yǎng)基溶液中的重量體積百分比含量為0.0001％-0.0005％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，步驟(2)中所述的室溫狀態(tài)是指室內(nèi)溫度小于或等于37℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，步驟(2)中所述的除氧劑為維生素C及其鈉鹽、異維生素C及其鈉鹽、半胱氨酸及其鹽酸鹽，或這些物質(zhì)組成的復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，步驟(2)中所述的除氧劑，其在培養(yǎng)基溶液中的重量體積百分比含量為0.02-0.1％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，所述的氮?dú)猓羌兌葹?9.999％的高純氮?dú)狻?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，所述的通入氮?dú)?，時(shí)間為1-2分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不需厭氧培養(yǎng)箱輔助的厭氧微生物培養(yǎng)方法，其特征是，所述的高溫蒸汽滅菌，溫度為121℃，時(shí)間為20分鐘。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的厭氧微生物培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)配制好培養(yǎng)基溶液后，加入亞甲基蘭作為氧化還原狀態(tài)指示劑；(2)在室溫狀態(tài)下，向上述培養(yǎng)基溶液中加入除氧劑，搖勻溶解后，立即將該培養(yǎng)基溶液開始分裝培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶內(nèi)，加蓋膠塞和瓶蓋，分裝和加瓶蓋作業(yè)時(shí)間控制在30分鐘內(nèi)；(3)通過注射器針頭穿過膠塞，向經(jīng)步驟(2)處理后的培養(yǎng)瓶中通入氮?dú)?，同時(shí)排氣，交換培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液上方的空氣；(4)將經(jīng)步驟(3)處理后的培養(yǎng)瓶高溫蒸汽滅菌，冷卻后備用。本發(fā)明無需使用厭氧培養(yǎng)箱，操作簡便，成本低，所用的指示劑經(jīng)高溫滅菌后仍然穩(wěn)定，所用的除氧劑安全無毒，并能達(dá)到有效除氧目的，又能滿足分裝和加瓶蓋的時(shí)間要求。
文檔編號(hào)C12N1/00GK101050422SQ200710038080
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月15日
發(fā)明者董德賢, 李榮秀, 陳德兆 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)