專利名稱：：一種新的產(chǎn)酸克雷伯氏菌lf-1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及產(chǎn)酸克雷伯氏菌的新菌株及該菌株在制備降解植物毒素藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：瘋草(bMM^/)是豆科黃芪屬和棘豆屬有毒植物的總稱，也是世界范圍內(nèi)危害草原畜牧業(yè)最嚴(yán)重的一類毒草。在我國(guó)，瘋草廣泛分布于西北、華北和西南的廣大草原，危害面積達(dá)1100萬hm2。近年來，國(guó)內(nèi)外在瘋草的危害、有毒成分、毒理機(jī)制、防除和利用等方面的研究取得了重要進(jìn)展，但迄今還沒有控制瘋草蔓延的特效方法，致使瘋草中毒問題日趨嚴(yán)重，成為草原畜牧業(yè)的大患。冰川棘豆(ao^0/^.g/"c/fc)是瘋草的一種，也是青藏高原特有草種之--，主要分布在西藏阿里地區(qū)，遍及措勤，改則，革吉，日土，喀爾，普蘭等縣。它具有很強(qiáng)的抗逆性，在荒漠中生長(zhǎng)旺盛，蔓延速度明顯高于當(dāng)?shù)氐钠渌参?，容易形成?yōu)勢(shì)群落。它可以引起多種動(dòng)物發(fā)生慢性中毒，使其出現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為特征的中毒癥狀(楊小平.動(dòng)物棘豆屬瘋草中毒的臨床癥狀.武漢科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，15(3):25-28;席琳喬，馬麗萍.草地毒草棘豆的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展.草原與草坪，2003，(3):19-22)，嚴(yán)重的發(fā)生死亡。據(jù)1996年調(diào)杳統(tǒng)計(jì)，措勤縣11個(gè)鄉(xiāng)實(shí)際放牧草場(chǎng)面積9.30萬hm2，冰川棘豆危害嚴(yán)重的有5.40萬hm2，19781993年的15年中因中毒導(dǎo)致牲畜死亡達(dá)25萬頭(只)，直接經(jīng)濟(jì)損失約2205萬元，年均死亡約1.7萬頭(只)，每年經(jīng)濟(jì)損失150250萬元；改則縣有166.67萬hm"草地冰川棘豆危害比較嚴(yán)重，19871995年牲畜中毒死亡21.28萬頭(只)，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)2562萬元，9年中，年均中毒死亡牲畜約2.4萬頭(只)，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)350多萬元；革吉縣冰川棘豆蔓延較重的草場(chǎng)48.87萬hm2，每年中毒死亡牲畜7500頭(只)以上，經(jīng)濟(jì)損失120150萬元。到1995年為止，阿里東部三個(gè)牧業(yè)縣因冰川棘豆中毒死亡的牲畜總數(shù)在53萬頭以上，損失超過6172萬元(李勤凡，王建華.冰川棘豆生長(zhǎng)的生態(tài)環(huán)境特點(diǎn).家畜生態(tài)，2004，25(1):42-44;王建華，張志恒，高B星.西藏阿里地區(qū)動(dòng)物"醉馬草"中毒病調(diào)査報(bào)告.動(dòng)物毒物學(xué)，1998，13(1-2):22-27;張志恒，高巨星，沈頌東，關(guān)于對(duì)西藏阿里地區(qū)"醉馬草"調(diào)査情況的報(bào)告.動(dòng)物毒物學(xué)，1998，13(1-2):11-13);此外，采食冰川棘豆中毒未致死的牲畜，其性能和品質(zhì)顯著下降，不能騎乘或馱運(yùn)，皮毛質(zhì)量低劣，體重下降，奶肉減產(chǎn)、繁殖能力減弱，出現(xiàn)畸胎、流產(chǎn)和死胎等，其損失超過雪災(zāi)或疫災(zāi)。而且冰川棘豆耐干旱、抗寒冷，與優(yōu)良牧草競(jìng)爭(zhēng)草地，導(dǎo)致大批優(yōu)良牧草產(chǎn)量降低和草場(chǎng)退化。在牲畜冰川棘豆中毒經(jīng)常發(fā)生的地區(qū)，牧民不敢放牧，致使這些草場(chǎng)得不到充分利用(吳達(dá)，司紅麗，王建華.瘋草研究現(xiàn)狀.草業(yè)科學(xué)，2003，20(2):43-47)。由此可見，冰川棘豆對(duì)西藏南部地區(qū)家畜的危害非常嚴(yán)重，給西藏畜牧業(yè)帶來很大損失。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)冰川棘豆的防除主要采取人工挖除、化學(xué)滅除和生物防除的方法。冰川棘豆雖是毒草，但其屬于豆科植物，營(yíng)養(yǎng)全面，如能合理利用，變廢為寶，將會(huì)取得很好的經(jīng)濟(jì)效益，這方面國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了許多有益的探索，牛:要包括合理輪牧、間歇飼喂和日糧搭配、脫毒利用等方法。其中，在有毒植物的脫毒方面，其方法有物理脫毒、化學(xué)脫毒、免疫預(yù)防及微生物降解等。近年來，應(yīng)用微生物降解有毒物質(zhì)一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但在微生物降解植物毒素方面的研究較少，不過也取得了一定的成果，周斌從菜籽餅中分離到能夠降解芥子甙的多種微生物70多株，經(jīng)鑒定這些菌是白色球l以酵母(7bnJo/w^ca"cfe/(3)、華豐艮霉(^/7/zopi^c/2/"g"57'S)、總4犬毛霉(Mwcorrace膨雄)、米曲霉"s戸g/〃wso，ae)，通過發(fā)酵試驗(yàn)確定其脫毒率為80%(周斌，分離篩選脫菜籽餅中芥子甙毒素菌株的研究，云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，18(2):122-125)。譚蓓英等從廣西潿洲島的黃牛瘤胃中，分離出4株厭氧細(xì)菌，經(jīng)鑒定為乳桿菌屬(Z^ctote"7/w)(2株)、牛鏈球菌(5V，tococcwsZ)謂's)禾口生孢梭菌(C7as^7'(i/謂，ragew&s)，上述菌株對(duì)含羞草素和二羥基吡啶類毒素具有降解活性，這些脫毒菌生活在瘤胃中，可以保護(hù)宿主動(dòng)物免受毒害(譚蓓英，王旭明，汪儆，降解有毒的含羞草素和二羥基吡啶化合物的瘤胃細(xì)菌.微生物學(xué)報(bào)，1994，34(5):379-384)，其研究方法可用于冰川棘豆研究，以求徹底解決冰川棘豆的毒害問題，使動(dòng)物利用冰川棘豆的豐富營(yíng)養(yǎng)而不中毒。2，2，6，6-四甲基哌啶酮(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidone，TMPD)是從冰川棘豆地上部分提取、分離出來的一種主要毒性生物堿(譚遠(yuǎn)友，王建華，李勤凡等，西藏阿里地區(qū)冰川棘豆毒性生物堿的鑒定，畜牧與獸醫(yī)，2002，34(5):12-13)。目前，尚無有效方法使冰川棘豆中的TMPD毒性降低。如能應(yīng)用微生物降解TMPD，將對(duì)徹底解決冰川棘豆的毒害，為草原毒草的生物學(xué)控制和草原生態(tài)學(xué)研究起到積極作用。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種新的產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1，該菌株能夠有效的降解，2，6，6-四甲基哌啶酮(簡(jiǎn)稱TMPD)的毒性，徹底解決冰川棘豆的毒害，為草原毒草的生物學(xué)控制和草原生態(tài)學(xué)研究起到積極作用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種新的產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1(^7e^ie"aox/"csLF-1)，其保藏號(hào)為CCTCCNO:M206126。產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1已于2006年11月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCCNO:M206126，保藏單位地址；中國(guó)武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明還有一目的是產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1菌株在降解植物毒素中的應(yīng)用。本發(fā)明還有一目的是產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-l菌株在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的應(yīng)用。本發(fā)明還有一目的是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(^Ww'e77ao;r7toca)LF-1在制備降解植物毒素藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還有一目的是產(chǎn)酸克雷伯氏菌a_/e&ieLao玎toca)LF-1在制備降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的應(yīng)用。該產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1來自于西藏、內(nèi)蒙、青海等地瘋草生長(zhǎng)的環(huán)境土壤中，經(jīng)人工分離、篩選而得，具體的分離、篩選見后邊的具體實(shí)施例。以下是本發(fā)明產(chǎn)酸克雷伯氏菌(A7Ws/e77aoz/"ca)LF-1的特征描述。1、形態(tài)學(xué)特征LF-1菌株的菌體呈桿狀，0.50.9umX1.02.0um，其在透射電鏡下的形態(tài)見圖l，其在掃描電鏡下的形態(tài)見圖2;革蘭氏染色陰性，有莢膜，無芽孢，無運(yùn)動(dòng)性；菌落呈圓形，表面光滑，濕潤(rùn)，隆起，邊緣整齊，灰白色，半透明；葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，兼性厭氧，產(chǎn)生吲哚，M.R試驗(yàn)陽性，V—P試驗(yàn)不穩(wěn)定，還原硝酸鹽，能利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不產(chǎn)生H2S，不液化明膠，接觸酶陽性，氧化酶陰性，脲酶陽性。2、生理生化特征具體生理生化特征見表l。表1.LF1菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"+"表示生長(zhǎng)或反應(yīng)陽性；"一"表示不生長(zhǎng)或反應(yīng)陰性；"V"表示反應(yīng)不穩(wěn)定。3、16SrDNA序列溯定與同源性分析取LF—1菌株單菌落接種于lOmlLB液體培養(yǎng)基中，37'C過夜振蕩培養(yǎng)后取1.5ml菌液離心去上清，按照U-Gene公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中所示的提取方法制備PCR模板DNA,—2(TC保存?zhèn)溆谩Ｓ糜?6SrDNA的PCR反應(yīng)的引物為一對(duì)通用引物。正向引物BSF8/20:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGAT(XAGCCGCA-3'。PCR反應(yīng)體系為Taqmix25^L，引物BSF8/20(10Mmo1/L)2叱，引物BSR1541/20(10Wnol/L)2叱，模板DNAWL，重蒸水20叱。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min;94。Clmin，56。Clmin，72t:2min，循環(huán)29次;72。C10min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下顯示的圖像如圖3所示，其中Ml為D12000，LF-1為PCR產(chǎn)物，M2為200bpLadder。PCR產(chǎn)物用U-Gene公司的凝膠回收試劑盒回收純化。測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，測(cè)序用引物為引物BSF8/20。LF-1菌株的16SrDNA的GenBank登錄號(hào)為EF127829,16SrDNA序列如序列表中序列所示。將LF1菌株的16SrDNA序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，利用DNAStar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4。從圖4得出，LF-1菌株的遺傳進(jìn)化距離與克雷伯氏桿菌屬最近，它與產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(A7Ws^Wa0j/^ca)同處于一個(gè)最小的分支，與已知菌株ar/tocaisolateDR.Y14(DQ226215)的同源性達(dá)到99.52%，說明該菌在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)匕屬T產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌。經(jīng)16SrDNA序列同源性分析，依據(jù)同源性在系統(tǒng)發(fā)育中的分類原則并結(jié)合形態(tài)、生理生化特征，參考《伯杰細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(第八版)》，最終確定LF-1菌株為產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(A7e&^l/aoy/toca)。本發(fā)明的產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF--1可降解冰川棘豆的主要毒素TMPD，為徹底解決冰川棘豆的毒害奠定基礎(chǔ)。圖1是LF—1菌株的透射電鏡照片；圖2是LF—1菌株的掃描電鏡照片；圖3是LF—1菌株的1%瓊脂糖凝膠電泳圖4是利用DNAStar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖5是不同培養(yǎng)時(shí)間TMPD降解率曲線；具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和發(fā)明人給出產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1的分離篩選辦法及其產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1在降解TMPD試驗(yàn)來進(jìn)--步說明本發(fā)明的有益效果。實(shí)施例1:產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1的分離篩選1、土樣采自西藏、內(nèi)蒙、青海等地瘋草生長(zhǎng)的環(huán)境土壤；2、菌株的分離篩選分別取20g30g瘋草生長(zhǎng)環(huán)境中的4個(gè)來源的土壤接種于種，37'C培養(yǎng)24h，挑出單個(gè)菌落接種于含50mg/LTMPD的普通肉湯中，37。C培養(yǎng)48h，保存菌種；將上一步保存下來的菌種接種于含100mg/LTMPD的普通肉湯中，置37。C培養(yǎng)48h;重復(fù)以上過程，每次培養(yǎng)均增加TMPD含量，降低培養(yǎng)液中有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分的含量，保存菌種。經(jīng)5次培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基中TMPD含量增加到300mg/L時(shí)，4。C保存菌種備用；將上述保存的菌種接種于普通肉湯中，37。C培養(yǎng)48h進(jìn)行活化和擴(kuò)菌，7500r/min離心15min，棄去上清液，沉淀的菌體用滅菌磷酸鹽緩沖液沖洗3次，最后用滅菌磷酸鹽緩沖液制成20mL的菌懸液，分別接種于含150mg/LTMPD培養(yǎng)基和無營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)犯h后，挑出頂PD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株，再劃線分別接種于TMPD培養(yǎng)基和無營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，重復(fù)培養(yǎng)，挑純，得到一株降解菌，命名為L(zhǎng)F-l菌株。所述的普通肉湯培養(yǎng)基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，肌PO,lg,蒸餾水1L,pH為7.47.6，12rC高壓滅菌20min。所述的普通瓊脂培養(yǎng)基的組分及配比為-牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，K,1.0g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.47.6，121。C高壓滅菌20min。所述的無營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組分及配比為NaCl1.0g，K2HP041.Og，NH.，Cl1.Og，MgSO,7H200.4g，F(xiàn)eCl:(0.Olg，瓊脂20g，溶于1000mL雙蒸水中，pH為7.27.4，121。C滅菌30min。根所述的TMPD培養(yǎng)基據(jù)不同需要，向無營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入TMPD，調(diào)節(jié)pH7.27.4，121匸滅菌30min。試驗(yàn)例1:產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1降解頂PD效果試驗(yàn)采用紫外一可見分光光度計(jì)法測(cè)定該菌對(duì)TMPD的降解率。將該降解菌分別接種于普通肉湯中，37t:培養(yǎng)48h進(jìn)行活化和擴(kuò)菌，7500r/min離心15min，棄去上清液，沉淀的菌體用滅菌磷酸鹽緩沖液沖洗3次，最后用滅菌磷酸鹽緩沖液制成20mL的菌懸液，分別接種于含150mg/LTMPD培養(yǎng)液中，每隔3天測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度，測(cè)定結(jié)果帶入回歸曲線，計(jì)算其濃度。具體TMPD的降解率見表2。從表2可以看出，經(jīng)30天培養(yǎng)，LF-1菌株的TMPD降解率為82.54%。不同培養(yǎng)時(shí)間TMPD降解率曲線見圖5，從圖5可以看出該菌在接種后15d內(nèi)降解速度最快，培養(yǎng)18d后，降解速度降低，說明該降解菌接種TMPD培養(yǎng)液培養(yǎng)15天后，TMPD能被很好的降解。表2.不同培養(yǎng)時(shí)間TMPD的降解率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表<H0〉西北農(nóng)林科技大學(xué)<120>—種新的產(chǎn)酸克雷伯氏菌LF-1及其應(yīng)用<磨<210><211><212>111477隠<213>產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)<400>1gcaagtggcggLcgagtggcggg咖cggtattg('OilCftggacgalccctactccuicggtgccgcgtgttaaggttaatccagcagccgcacgcaggcgcg股記ct;ggc.gcgtag卿tcaggtgcgaagatgtcgactaccgcctgggagcggtggagccagagaactgctgtcgtcatcctttgttggaaggtggggUgtcc卿ttcagaatgccagtgggttgctcatgtictgggcagctacacgacgggtgaggctaataccg3tgtgCCC3gagctggtctggaggcagcagatgaagaaggaaccttgtcgcggtaatacggt.ctgtcaagaggctgg鄰tctggagg朋tagcgtggggatgg鄉(xiāng)ttgtgagtacggcccatgtggtt.t.tagcagagatgctcgtgttg(jcttgcgatt(j3tg3CgtC朋l鵬gt('tgcacggtgaataggtgatigtcgatgcagtcgataatgtctggcataacgtcg3tggg3tt3g聊gg;atgeictggggia由tccttcgggttattgacgttagagggtgcaatcggatgtga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