專利名稱：：人類異源物質(zhì)代謝酶基因的單核苷酸多態(tài)性在診斷和治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面之應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測2個人類異源物質(zhì)代謝酶基因ABCG2和CYPffil上的4個與系統(tǒng)性紅斑,(systemictapiiserythematosus,SLE)相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，以及應(yīng)用這些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)預(yù)測系統(tǒng)性紅斑lfeli的易患性。本發(fā)明也提供了一種有助于預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼痛的方法，也可應(yīng)用于篩選針對不同類型系統(tǒng)性紅斑狼痛的適當(dāng)療法。背暈技術(shù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種慢性自身免疫性疾病，該癇的一個顯著特征是產(chǎn)生可導(dǎo)致多組織炎癥的自身抗體，SUB可能影響身體的任何部分，但是最常見的是心臟，關(guān)節(jié)，皮膚，肺部，血管，肝臟，腎臟及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。SLE主要影響育齡期的婦女，女性患者和男性患者的比例大約是9比1,過去認(rèn)為SLE是—種罕見的疾病，但是從上世紀(jì)節(jié)年代開始，更多SLE的病例隨著人們對它的認(rèn)識的增加而被發(fā)現(xiàn)。目前，單是美國，就估計有大約27萬至150萬人患有紅斑狼痛，而在世界范圍，保守的估計有超過500萬的患者。雖然SIB的準(zhǔn)確致病機(jī)理現(xiàn)在還不明確，但,來越多證據(jù)顯示多種遺傳和環(huán)境的因素都可能影響發(fā)病，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多種化學(xué)物質(zhì)，包括芳香胺，肼類化合物，硅，硅氧烷，氯乙烯，有機(jī)溶劑和重金屬，與SLE的發(fā)生有關(guān)。與這些化學(xué)物質(zhì)接觸可能誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞和自身抗體，并且刺激前炎性細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還可能引起耙器官的損傷(Sarzi-pu幽iP,AtzeniF,Iaccari加L,andD(HiaP,2005.Environment加dsystemiclupuserythematosus:Anoverview.Autoimmunity,November;38(7》465472)。此外，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示吸煙者更加容易患上SLE近期的研究還發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)反應(yīng)性氧(reactiveoxy辟nspeciesROS)對SLE的發(fā)生有重耍作用(Ah咖H,AHAandAIi艮2003.Oxy辟nfteeradicalsandsystemicautoinununity.ClinExpbununol;131:398-404),異源物質(zhì)代謝酶(XMEs)異源物質(zhì)是非人體罔有的天然成人工合成的物質(zhì)，包括藥物，.T:業(yè)產(chǎn)物，殺蟲擁，污染性物質(zhì)，生物堿,及由細(xì)菌,真菌，植物和動物產(chǎn)生的毒素，許多異源物質(zhì)本身或其經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的形式具有毒性或致癌性。異源物質(zhì)代謝酶(XMEs)能導(dǎo)致各種致癌物，致癌物前體，毒素和藥物的活性化，它們也能參與宿主對異源物質(zhì)的防御反應(yīng)，由于治療性藥物對人體而言也是異源物質(zhì)，因此某些異源物質(zhì)代謝酶也被稱為藥物代謝酶(DMEs)。參與異源物質(zhì)的氧化反應(yīng)和連接反應(yīng)的酶分別被稱為I相和n相異源物質(zhì)代謝酶，I相異源物質(zhì)代謝酶，例如細(xì)胞色素P450s(CYPs)基因家族，催化多種內(nèi)源性和外源性的異源物質(zhì)(從類固醇到污染物)的氧化反應(yīng)，在這些氧化過程中可ll^生親電的和可致突變的中間產(chǎn)物，n相異源物質(zhì)代謝酶通常以氧作為進(jìn)一步代謝反應(yīng)的位點(diǎn)，比如接上協(xié)同因，物質(zhì)變得更親水進(jìn)而有利于該物質(zhì)的排出，除了i相和n相異源物質(zhì)代謝酶，ATP-結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)子，利用ATP水解的能量完成多種化合物的跨膜運(yùn)輸,亦促使異源物質(zhì)的代謝，在腸壁，血腦屏障和胎盤里存在著大量的異源物質(zhì)代謝酶和ABC,暗示這些酶能限制異源物質(zhì)進(jìn)入主要系統(tǒng)并在宿主的防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用(toikerJW,BuitelaarM,Wa辟naarE,etal.,20(^.Iliebrraskcancerresistancepotebiprotectsa扭加tamajorchl咖沐yll-derived也etaiyphototoxinandpxrtqiotirtiyria.ProcNaflAciSciUSA.狄15649-54)ABCG2(ABCP,MXR1,BCRP)基因是最新發(fā)現(xiàn)的ABC藥物排出轉(zhuǎn)運(yùn)子，它是由幾間不同實(shí)驗室分別發(fā)現(xiàn)的，通過分析那些對米托葸醒(mitmantorie)有抗性，但沒有超量表達(dá)ABCB1或ABCC1基因的細(xì)胞系找到了ABCG2基因，如果將ABCG2基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，可以使這些細(xì)胞獲得對化療藥物的抗性。ABCG2蛋白是一個半轉(zhuǎn)運(yùn)子，它與對痛癥化療中常使用的結(jié)構(gòu)與機(jī)理并不相關(guān)的各種藥物的交叉抗性有關(guān)(GottesmanMM,FojoTaodBatesSE>,^XH.MuMdragresistancein咖cenrateofATP~depOKlent咖qxates.NatRevC皿cra2,48-58),對哺乳動物各種組織中ABCG2的分布在RNA和蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行分析，顯示ABCG2廣泛的分布在許多正常組織中，包括小腸和結(jié)腸的腸絨毛上皮細(xì)胞腔面以及許多組織的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(DoyteIA,膽dRossDD,2003>Ma旭dmgieslsttDcendiatedby也etaeastc旭cerresistanceputdnBCRP(ABCG2).Oncogene22:7340"S8),ABCG2分布在小腸和結(jié)腸上皮的頂端，這種現(xiàn)象暗示著ABCG2對防止異源物質(zhì)侵入起到一定的作用(MaH^>aarfMSehefferGLF膽eyteIF,etaL,2001.Subcellularlocalization旭ddis她oti加ofthetae腿tcanceriesistai%protdntranspcnterinncmalhurantissues.Can咖Res.61:3458-64),人類的ABCG2基因定位在4號染色體的q22區(qū)上,全長66,882bp,含有16個大小從60bp到532bp(20到74密碼子)的外顯子(欲加)，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游312bp的序列具有基本的啟動子活性，該基因的翻譯起始位點(diǎn)位于外顯子2。外顯子3上有一個WalterA特征區(qū)域，ABC特征區(qū)域(核苷酸結(jié)合區(qū)域)和WalkerB則位于外顯子6,外顯子10，13，14,15和16據(jù)推斷含有6個穿膜區(qū)(Bailey-DellKJ,HasselB,DoyteLA,andRossDD.,鄉(xiāng)l.FroiiKMercharactrai幼ti加andg節(jié)omicorganizati加ctfiiiehumanbreastc旭cer咖istancepdein(ATP-bindlngcassettetransportsG2)gene.BiochimBi(^tysA咖1520:2沐241)。CYPffil酶主要負(fù)責(zé)活化和代謝多種低分子量化^，例如芳香型部分齒化的碳水化^fe,N-亞硝胺，苯胺，氯乙烯和氨基甲酸乙脂，這些化合物中有一些對機(jī)體有毒害作用，CYP2E1酶是由酒精誘導(dǎo)產(chǎn)生，是引致酒精氧化的主要細(xì)胞色素酶，可產(chǎn)生活化了的氧物質(zhì)并造成氧化應(yīng)激反應(yīng)。在引發(fā)對乙酰氨基酚(acetoto叩hen)肝中毒的一連串過程中，CYP2E1是啟動及限速酶，缺少此酶時中毒現(xiàn)象僅在高濃度毒素情況下發(fā)生。CYPffil還被發(fā)現(xiàn)與酒精肝及非酒精倒旨肪肝的肝臟病理變化有關(guān)聯(lián)(Gonzal枕EJ.2005.RoteofcyttwhromBSP4S0inchemicaltoxic塒旭doxidativesttess:studiesw他CY^￡1.MatatRes.5砂10W0),CYPZE1在對DNA產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的過程中是必不可少的，閑此，CYP2E1在酒精相關(guān)的肝痛形成中可能起到關(guān)鍵的作用(BradfoKlBU,KonoH,IsayamaF,etal.,2005.CytochromeM鄰CYP2E1,butnotBicotinam^adraiine幽w;teotidephosphateoxiitese,isrequiredfcvetha加Mnducedoxidati怖DNA(tama辟inrodentHver.Hep^ology.41:336-344),實(shí)^ffi實(shí)CYraEl的遺傳多態(tài)性是造成異源物質(zhì)對人##性作用有個體差異的原因之一(HanidaN,Tkiaka-KagawaT,Miy血Yetal.,2003.FunctionalcharacterizationofltoeehiumacytoctaKoep450旭wi肌tswilfaaminoacidsubstitutions.X節(jié)obiotica.33:575-586)。在有鐵作催化劑的情況下，CYP2E1可以產(chǎn)生諸如hyiroxylradical的強(qiáng)氧化劑(KessovaI>CedeiteimALSX)3.CY^Sl:biochoDistry,toxicology,ieguMonandfiincti加ine也膽ol-induced!i鄉(xiāng)injuiy.QnrMbl編.3:5股518),三氯乙烯是一種工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑，在相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)査中發(fā)現(xiàn)它可以誘發(fā)SLE和其他的自身免疫性疾病，如硬皮病(sclerodemia)COtaniKftWarahawBH.1992.Prevalenceofsys咖lupusoythematos腿(SLE)and邁u咖sce加旭tinoclearantibodiesassociatedwittchnmicexposurestotrichl(Hoe也yl幼eandoiiercbeioiadtowellwater.EnvitmRes.54:1-9),在機(jī)體內(nèi),三氯乙烯主要是通過CYP2Elfil^謝為毒性中間產(chǎn)物再由n相異源物質(zhì)代謝IWi化進(jìn)行連接反應(yīng)成為毒性較低的代謝物。Griffii1等人的研究還證明了抑制的CYP2E1活性可以逆轉(zhuǎn)三氯乙烯所激發(fā)的免疫敞虔。這說明三氯乙烯需要在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過CYP2B1催化的活化作用才能誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)(GriffinJM>GilbertKM>PumfradNR.2000.MiibMonerfCYP2E1revrasesCD4+T~cellateaii咖intrichltnoediylene-tteatedMRL*/+mice.ToxicolSd.54:383-389),CYPZE1基因位于10號染色體的q24.3區(qū)至末端，基因全長11，413bp,有9個外顯子。單核苷酸多態(tài)性(SNP)人類基因組中DNA序列的差異導(dǎo)致了個體的不同特征，包括每個人接觸了異源物質(zhì)(污染物，毒素和藥物)后不同的反應(yīng)-基因組中的單個核苷酸(A,G,C或T)發(fā)生變化就產(chǎn)生了單核苷酸多態(tài)性(SNP),在傳代的過程中單核苷酸多態(tài)性逐漸趨于穩(wěn)定,大家越來越認(rèn)識到大量已定位SNP的收集將為人類遺傳學(xué)的研究提供有力的工具，此外，SNP還能作為遺傳標(biāo)記用于家系的連鎖分析，特定人群的連鎖不平衡分析以及疾病關(guān)聯(lián)性分析來尋找與疾病有關(guān)的基H,像系統(tǒng)性紅斑狼痛這樣的多基因病，與疾病有顯著關(guān)聯(lián)的SNP就可以作為診斷工具來辨別對疾病有較高易感性的個體，而對患系統(tǒng)性紅斑狼痛的病人進(jìn)行基因檢測則有可能揭示一些未知的遺傳病因并且優(yōu)化疾病的管理和治療，當(dāng)系統(tǒng)性紅斑狼痛病人和皿對瓶組的SNP被發(fā)現(xiàn)和檢測后，霜，析有關(guān)數(shù)據(jù)來確定某個SNP與系統(tǒng)性紅斑狼痛之間是否存在顯著的聯(lián)系。這是基于即使某個SNP"X"能直接影響系統(tǒng)性紅斑狼痛的易感性，擁有這個SNP"X"也不是得系統(tǒng)性紅斑狼痛的充分必要條件，但是這個SNP"X"在病人中的出現(xiàn)頻率一定離于正常人，同樣地，與此SNP"X"呈連鎖不平衡(Mcagedisequilibrium,IJ))的其它SNP也會出現(xiàn)這種情況。因此，對SNP與疾病的關(guān)聯(lián)性的研究可以在兩個方向上進(jìn)行直接檢測一個有功能影響的SNP或者用這個SNP作為連鎖不平衡(LD)的標(biāo)記物進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供位于2個異源物質(zhì)代謝酶基因ABCG2和CYPmi上的4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼痛易感性有關(guān)聯(lián)，它們可運(yùn)用于開發(fā)一些新的方法在早期臨床階段對系統(tǒng)性紅斑lllitt行輔助診斷，本發(fā)明給出了一條獨(dú)立的多核苷酸片斷，它的序列與SEQIDNO:l的序列相同。該多核苷酸片斷為人類ABCG2基因的一部分，包括外顯子10和2個多態(tài)性位點(diǎn)51523TM5和ra2231148。本發(fā)明還給出了"^PCR引物可用于擴(kuò)增出如同SEQIDNO:l的多核苷酸片斷，該套引物中的第一條弓l物的序列與SEQIDNO:2所示相同，或與SEQIDNO:2互補(bǔ)第二條弓陶的序列與SEQIDNO:3所示相同，或與之互補(bǔ)。本發(fā)明給出了一條獨(dú)立的多核苷酸片斷，它的序列與SEQIDNO:4的序列相同。該多核苷酸片斷為人類CYP2E1基因的包括內(nèi)顯子2的部分序列和1個多態(tài)性位點(diǎn):ra8192T72,本發(fā)明還給出了一套PCR引物可用于擴(kuò)增出如同S1Q邁NO:4的多核苷酸片斷，該套引物中的第一條弓l物的序列與SEQIDNO:5所示相同，或與之互補(bǔ)第二條引物的序列與SlQIDNO:6所示相同，或與之互補(bǔ)。本發(fā)明給出了一條獨(dú)立的多核苷酸片斷，它的序列與SEQIDNO:7的序列相同，該多核苷酸片斷為人類CYP2E1基因的一部分包括外顯子9的部分序列和1個多態(tài)性位點(diǎn):ra24KJ2鄰。本發(fā)明還給出了一套PCR引物可用于擴(kuò)增出如同SEQIDNO:7的多核苷酸片斷。該套引物中的第一條弓l物的序列與SBQIDNO:8歸相同，或與之互補(bǔ)第二條弓l物的序列與SEQIDNO:9所示相同，或與之互補(bǔ)。此發(fā)明的另一部分給出了一種可以預(yù)測一個個體是否更容易或者更不容易得系統(tǒng)性紅斑ms的,，此方法包括(a).檢測該個體的核酸序列；(b).選擇并確定以下4個SNP位點(diǎn)ABCG2基因新發(fā)現(xiàn)的515231>G位點(diǎn)，及在dbSNP數(shù)據(jù)庫01鄰://1^恥11<^.111111>幽砂￥/81，/)中已經(jīng)報吿的ABCG2基因的ra2231148位點(diǎn),CYP2E1基因的ra8192T72和ra2480256位點(diǎn)中的一個或多個位點(diǎn)的核苷酸序列或檢測與上述4個SNP中一個或多個位點(diǎn)處于相同的單倍型或連鎖不平衡(LD)的其它遺傳標(biāo)記。此發(fā)明還給出了一種檢測系統(tǒng)性紅斑狼,人基因型的方法，該方法可以為病人的藥物治療提供在藥學(xué)基因組學(xué)方面的指導(dǎo)，包括:(a).檢測病人的核酸樣本的序列;(b)逸擇并確定以下4個SNP位點(diǎn):ABCG2基因的51523bG和is2231148位點(diǎn)，CYP2E1基因的ra8192772和ra2480256位點(diǎn)中的一個或多個位點(diǎn)的核苷酸序列，或檢測與上述4個SNP中一個或多個位點(diǎn)處于相同的單倍型或連鎖不平衡(m)的其它遺傳標(biāo)記。此發(fā)明也給出了一種篩選藥物的方法,可應(yīng)用于鑒定治療或預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼痛的藥物,此方法包括(a).轉(zhuǎn)染一個載體到真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),該載體至少含有AH異源物質(zhì)代謝酶基因ABCG2,CYPffil中的部份片段，而該片段包含以下4個SNP位點(diǎn)中的一個或幾個ABCG2基因的515231M5位點(diǎn)，在dbSNP數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報導(dǎo)的ABCG2基因的ra2231148,CYPffil基因的rs8192772和ra24802鄰位點(diǎn),或者包含與上述4個SNP中一個或多個位點(diǎn)處于相同的單倍型或連鎖不平衡(LD)的其它遺傳標(biāo)記(b)在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該載體；(c).在這個細(xì)胞系統(tǒng)中加入被篩選的藥物(d).分析異源物質(zhì)代謝酶基因的表達(dá)來研究被篩選的藥物在該細(xì)胞系統(tǒng)中對基因表達(dá)的影響(e).確定那些能夠改變異源物質(zhì)代謝酶基因表達(dá)的藥物。附圉說明以下這些面表將令該項發(fā)明的特點(diǎn)在后面的詳細(xì)敘述中MJB淺顯易懂，圖1是部分基因組ABCG2基因的示意鬮，顯示了糊苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs^31148，551523TMJ的位置和與其鄰坻的外顯子的相對位置。圉2是部分基因組CYPffil基因的示意圖，顯示了,苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs8192772和ra2480256的位置和與其鄰近的外顯子的相對位置，具體實(shí)濾方式術(shù)語的定義-在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中使用了以下各種術(shù)語，它們的定義如下lf^:術(shù)語"等位基因"(allete)指一段核苷酸序列的不同變化形式，術(shù)語"互補(bǔ)的"(comptoentary)與"互補(bǔ)"(coniptement)指一段核苷酸序列可以通過堿基配對的原則與另一條多核苷酸序列在可以配對的區(qū)域IM,術(shù)語"基因型"(genotype)指生物體的遺傳物質(zhì)組成。更確切地說，它是指個體中所含有的等位基因的類型，如某個體的兩條姐妹染色單體上的特定位置核苷酸序列均為A,則該個體在此特定位點(diǎn)的基因型為A/A:如某個體的兩條姐妹染色單體上的特定位置核苷,列分別為A和C,則該個體在此特定位點(diǎn)的基因型為A/C。對一個個體或一份DNA樣本進(jìn)行基因型檢測"(Gencrtyptag)"是指在核苷酸的JC平上來確定一個個體在特定多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因序列。術(shù)語"多態(tài)性"(poljmoritoni)指某個基因或基因的某個部分在人群中存在多于一種的形式。"多態(tài)的，多態(tài)性的"(polymorpWc)指在某一人群中可找到有兩種以上的基因序列變異。"多態(tài)性位點(diǎn)"(polymoipliicsite)指核苷酸序列發(fā)生變異的基因座，術(shù)語"寡核苷酸"(o!igimudeotide)和"多核苷酸"(^Qlynucteotide)在這里指的是在長度上多過一個核苷酸的RNA、DNA或者RNA/DNA雜交的序列。這些序列可以單鏈自鏈的形式存在。通常將小于50個核苷酸殘基組成的核酸稱為寡核苷酸，大于50個核菅酸殘基稱為多核苷酸。術(shù)語"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"(PGR)是一種擴(kuò)增DNA序列的方法，它通過熱穩(wěn)定的聚合酶和一對引物，其中一條引物與正鏈的一端互補(bǔ)結(jié)合,另一條與負(fù)鏈的另一端互補(bǔ)結(jié)合,來進(jìn)行DNA擴(kuò)增,,成的DNA片斷可以作為樓板，與同樣的引物結(jié)合，經(jīng)過退火，延伸和解鏈三個歩驟的循環(huán)迅速而特異地擴(kuò)增出目的序列。術(shù)語"引物"指的是短的單鏈寡核苷酸。它可與DNA樣本中的互補(bǔ)序列配對結(jié)合，引物是依賴模板的DNA合成的起始點(diǎn)，DNA聚合酶可在一條引物的末端位置添加脫氧核糖核酸。"一對引物"(primerpair)或"一套引物"ftirimerset)指的是兩條引物中包含有可雜交于被擴(kuò)增序列5'端位置的某,的一條引物，和可雜交于被擴(kuò)增片斷3'端位置的另一條鏈的引物，術(shù)語"外顯子"(exon)指的是基因中編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，術(shù)語"內(nèi)含子"(taten)指的是那些打斷基因中編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的序列，內(nèi)含子序列可以被轉(zhuǎn)錄為RNA,但是在RNA翻譯為蛋白質(zhì)之前會被切除，本發(fā)明特別關(guān)系到與系統(tǒng)性紅斑狼痛有聯(lián)系的單核苷酸多態(tài)性(SNPs),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果個體ABCCK和CYP2E1基因或與其互補(bǔ)的序列呈現(xiàn)特定的多態(tài)性,則該個體可能具有相對離的系統(tǒng)性紅斑狼痛易感性，一方面本發(fā)明給出了一些與系統(tǒng)性紅斑狼絲聯(lián)系的特定的SNP位點(diǎn)ABCG2基因的rs2231148位點(diǎn),CYPmi基因的!s81效772和ra2480256位點(diǎn)，以上這些SNP位點(diǎn)雖然之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，但瓶未將它們與系統(tǒng)性紅斑狼痛相聯(lián)系，另一方面，本發(fā)明還給出了一個與系統(tǒng)性紅斑,有聯(lián)系的之前從未被發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)ABCG2基因的515231MJ位點(diǎn)，此發(fā)明現(xiàn)給出有關(guān)上述4個SNP位點(diǎn)的詳細(xì)描述,SEQIDN0:1的序列為人類基因組ABCG2基因序列的一部分，包括了此基因的外顯子10及其側(cè)翼序列。對于SNP515231M3，它的參考等位基因是如SEQIDNO:l所示，核苷酸變化是發(fā)生在第103堿基上，由鳥嘌呤(G)代替參考鵬胸腺嘧啶(T),對于SNPis2231148,它的參考等位基因是如SEQIDNO:l所示，核苷酸變化是發(fā)生在第l砂堿基上，由胸腺嘧啶(T)代替了參考堿基臁嘌呤(A),SEQIDNO:4序列是人類基因組CYP2El基因的部分DNA序列，它包含有內(nèi)含子2的部分序列，對于SNP:rs8192772,它的參考難基因序列如SEQIDNO:4所示，在變化的等位基因序列中，核哲酸的變化發(fā)生鄉(xiāng)170個堿基上，由胞嘧徒(C)代替參考堿基胸腺嘧啶(T),SEQIDNO:7序列是人類基因組CYP2El基因的部分DNA序列，它包含有外顯子9的部分序列。對于SNP-ra2480256,它的參考等位基因序列如SEQIDNO:7所示，在變化的等位基因序列中，核苷酸的變化發(fā)生在第231個自上，由鳥嘌呤(Gm替了參考堿基腺嘌呤(A)。以下部分將給出確認(rèn)這些與系統(tǒng)性紅斑》1相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法1>本發(fā)明所分析的所有健康人和系統(tǒng)性紅斑狼痛病人均為中國漢族人，系統(tǒng)性紅斑狼痛病人均經(jīng)由組織病理學(xué)檢査確認(rèn)，自對照組在性別與年齡上與病人組相匹配，每一個經(jīng)挑選的參與者貢獻(xiàn)5ml外周血，我們使用國際通用的CTXTM血液基因組DNA純化試劑盒(AmershamBiosciraces,NJ,USA)提取樣本血液基因組DNA,用常規(guī)DNA測序的辦法檢測堿基突變。我們ft^應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AKriiedBiosptera,CA,USA)的熱啟動AmpliT叫頃GoMDNA擴(kuò)增試劑盒和EppraKtorf公司的MkstracydeKS梯度擴(kuò)增儀擴(kuò)增基因組DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)并純化后，使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosyste咖,CA,USA)的BigDyeTetmi腿tOTv3.1測序試劑盒在AM3100遺傳分析儀(Applied說osystems,CA,USA)上測序，我們使用標(biāo)準(zhǔn)的卡方分析査找系統(tǒng)性紅斑狼痛與多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性，計算優(yōu)勢比(oddsratios,OR)與95免置信區(qū)間(95%CI)時我們艦了對年齡參數(shù)作校正的邏輯回歸分析。所有統(tǒng)計學(xué)分析均鄉(xiāng)SPSS12.0統(tǒng)計軟件包(SPSSInc.,Chicago,IL),表1顯示了上述SNP與系統(tǒng)性紅斑狼痛相關(guān)性的分析及系統(tǒng)性紅斑狼瘠患者在等位基因和基因型頻率上的關(guān)系，在表l中"SLE"表示系統(tǒng)性紅斑麟病人，"CON"表示正常人，統(tǒng)計學(xué)分析顯示"ABCG2基因上的SNP51523IM3fiH).046)'is223U48ft>=0.021》，CYPZE1基因上的SNPra2480256(psa002)在人群中在等位基因水平上與系統(tǒng)性紅斑狼瘠顯著相關(guān)同時，ABCG2基因上的SNP51523TM3(^0.044)和ra2231148(p=0.003),CYP2E1基因上的SNPra8192772(p=0.009)和ra248025fi^=0.00005)在人群中在基因型水平上與系統(tǒng)性紅斑自顯著相關(guān)，表l:異源物質(zhì)代謝酶基因的SNP與系統(tǒng)性紅斑llli相關(guān)性(P<=0.05)的統(tǒng)計分析，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>相應(yīng)地，本發(fā)明也給出了檢測以下SNP的方法來對系統(tǒng)性紅斑狼港的易感性作出診斷，這些SNP為-ABCG2基因的51523IXJ和is2231148:CYP2E1基因的ra8192772和ra2480256。同時也給出了對系統(tǒng)性紅斑狼痛病人進(jìn)行基因型檢測的方法，以及將ABCG2和CYP2E1基因作為有用的潛在目標(biāo)來制造防治系統(tǒng)性紅斑狼港的藥物，圖1展示了人類ABCG2基因的基因組核酸序列上外顯子的排布情況，圖2為人類CYP2E1基因的基因組核酸序列上外顯子的排布情況。在本發(fā)明中，那些可用于判斷個體系統(tǒng)性紅斑,易感性的SNP的位置也同時在以上附圖中標(biāo)明了，為了檢測SNP51523TMJ和ra2231148,要使用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物來擴(kuò)增一段與SBQIDNO:l相同的基因組DNA片段。然后用SEQ1DNO:2或卿IDNO:3所示引物對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。為了檢測SNPra8192772,要使用SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物來擴(kuò)增一段與SEQIDNO:4相同的基因組DNA片段，然后用SBQIDNO:5或SEQ1DNO:6所示引物對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。為了檢測SNPra2480256,要使用SBQIDNO:8和S1QIDNO:9所示的引物來擴(kuò)增一段與SEQIDNO:7相同的DNA片段。然后用SEQIDNO:8或SEQ邁NO:9所示引物對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，上述圖表和基因型檢測方法對與系統(tǒng)性紅斑狼痛相關(guān)的SNP位點(diǎn)都作了描述，另一方面，此發(fā)明也給出了一種測定和診斷系統(tǒng)性紅斑^S病人的基因型的方法，這種方法通過分析ABCG2和CYP2E1等基因的部分序列來確定ABCG2基因的515231M5,rs2231148;CYP2E1基因的ra8192772和ra2480256;或這些SNP位點(diǎn)中的一個或幾個位點(diǎn)的等位基因和(或)基因型。應(yīng)用該方法首先要取得足夠的，DNA來進(jìn)行序列和(或譯因型的分析才能夠確定以上SNP位點(diǎn)中的某—個或幾個的序列，此方法包括一些目前普遍鄉(xiāng)的技術(shù)，如PCR,就象后面的范例中所描述的，用與范例相同的引物在相同的條件下檢測與系統(tǒng)性紅斑狼痛相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性,也可以對這4個SNP位點(diǎn)使用不同于本發(fā)明中所述的引物進(jìn)行檢測，這些引物可以由具有相關(guān)經(jīng)驗的人勿須經(jīng)過太多實(shí)驗而設(shè)計，其它對單核昔酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測分析有幫助的方法都可以用于檢測上述4個SNP位點(diǎn)和與這4個SNP位點(diǎn)處于連鎖不平衡的其它位點(diǎn)，本發(fā)明的范例還提供了篩選和(或)診斷系統(tǒng)性紅斑狼痛的方法，概括地說，此發(fā)明顯示，在人群中，ABCG2基因515231Mi位點(diǎn)的"G"等位基因可能增加個體患系統(tǒng)性紅斑狼痛風(fēng)險的作用，優(yōu)勢比(OR)為2J斜，(95免置信區(qū)間0.990-5.739),p=0.046,對于SNPis2231148，基因型"a/a"的攜帶者患系統(tǒng)性紅斑狼痛的風(fēng)險大約是"說"或"f/a"攜帶者的1.453倍，(95免置信區(qū)間1.135-1.862),p=0.003。對于CYP2E1基因的is8192772來說，基因型數(shù)據(jù)分析顯示基因型"c/c"攜帶者比"tft"和"t/c"攜帶者有較高的患系統(tǒng)性紅斑狼痛的風(fēng)險(€-2.193,95免置信區(qū)間1.1974.108,p=0.009),對于CYP2E1基因的SNPrs2480256而言，不論是基因型數(shù)據(jù)還是等位基因數(shù)據(jù)都顯示"A"等位基因攜帶者有較高的患系統(tǒng)性紅斑狼痛的風(fēng)險(011-1.276,95免置信區(qū)間1.093-L491,paO.002):而"a/a"基因型攜帶者的患系統(tǒng)性紅斑麟的風(fēng)險大約是"Vg"或"g&"攜帶者的1.82倍(95免置信區(qū)間1.36CW.435),M.00005。以上所述的SNP位點(diǎn)可以用于診斷性檢測來鑒別那些接蝕異源物質(zhì)時更容易得系統(tǒng)性紅斑狼痛的個體，某些遺傳多態(tài)性不僅影響系統(tǒng)性紅斑狼痛的發(fā)生也影響系統(tǒng)性紅斑的發(fā)展，為此本發(fā)明提供了系統(tǒng)性紅斑狼痛的診斷病理學(xué)與易感基因遺傳多態(tài)性之間的聯(lián)系，這些診斷檢測可以使用一些己知的技術(shù)，包括基因芯片的方法(比如Alfymettix公司的GenFlexlMrag，Pan^ene,inc.公司的PanjCMp等)，把DNA畫定在基質(zhì)上(比如MWigenBioscience公司的SIGNEnMY^SNPHentificationSystem),ABI公司的SNPaPshoOMMbWptex系統(tǒng)(AppliedBiosyste咖Iac.),分子信標(biāo)技術(shù)GS旭yaiyagi,Public股alfcResearchlisti加te,NewYrak,USA)和Pyrosequradn^TM技術(shù)0^rosequenctagAB)。診斷檢測也可以使用以下方絲完成用靴基因特異性引物，靴基因特異性探針直接對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測序，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和變性梯度膠電泳(DOGE)-綜上im,本發(fā)明給出了一個檢測有患系統(tǒng)性紅斑狼痛趨勢的人的方法，它&a過對ABCG2基因的51523T^G,ra2231148:CYP2E1基因的is8192772和ra2480256;這些SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測來實(shí)現(xiàn)的。作為本發(fā)明的另一部分，人工合成的或重組的DNA分子都可以用于診斷，這些DNA分子序列包含以下4個SNP位點(diǎn)的任意組合:ABCG2基因的51523TM3,ra2231148;CYP2El基因的ra8192772和rs2480256。序列可以是它們的任意一種等位基因形式和其側(cè)翼序列，也可以是和這些SNP位點(diǎn)連鎖不平衡的基因座，這些DNA分子序列可以是這6個異源物質(zhì)代謝酶基因的一條或兩條DNA鏈，此外，本發(fā)明還提供了一種對治療系統(tǒng)性紅斑,所用藥物進(jìn)行評價的方法，該方法是基于上述SNP位點(diǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼痛的相關(guān)性，因為有些位點(diǎn)處于基因的啟動子區(qū)或外顯子和內(nèi)含子的交界區(qū)，它們可以影響這些基因inRNA的調(diào)控，合成和剪接。為了檢測這種影響，可以將這些SNP的不同等位基因形式依不同組合方式組成一條新序列，再將序列克隆到合適的表達(dá)載體上，并在一些合適的哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)。轉(zhuǎn)染的方法可用目前普遍使用的轉(zhuǎn)染試擁盒如CeBPhect轉(zhuǎn)染試劑盒(AmeralwmPhaOTadaBiotech,fiic.,USA)和ftoFfection逸哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Prame辟Coporation),轉(zhuǎn)染效率可用一些已知的試劑如磷酸鈣0JfeTechnologiestoc.)等來提商。如果以上一個或幾個SNP位點(diǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼痛相關(guān)的等位基因形式會改^S因表達(dá)和(或)同族基因的結(jié)構(gòu)特征，則以上提到過的細(xì)胞系也可用來篩選一些能夠使基因表達(dá)恢復(fù)正常的化合物，這樣的化合物在治療和預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼痛方面可作為非常有潛力的候選藥物，本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測與系統(tǒng)性紅斑Sli有關(guān)的SNP位點(diǎn)的檢測試劑盒:也提供了明確無誤的DNA測試方法以應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑,遺傳易感性的檢測，用DNA測序或其它基因型檢測方法檢測感興趣的SNP位點(diǎn),首先需要用PCR擴(kuò)增含有以下一個或者多個SNP位點(diǎn)的DNA片段，這些SNP位點(diǎn)包括ABCG2基面的515231>G,ra2231148:CYP2E1基因的is8192772和rs24,6,所獲得的PCR產(chǎn)物可用于之后的DNA測序或別的基因型檢測方絲檢測多態(tài)性位點(diǎn)的不同等位基因形式，如連接依賴性的多探針擴(kuò)增(mnltiptexligationdependentprobeamplificato),單堿基延伸(singlebase4iaseextension),或基因芯片上的序列特異性探針雜交(micniray-basedsequmice~specificoUgcmucle(tfdepobehybii^tti加),單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestraiklcoaf(mationpolyracpMsm),寡核苷酸芯片上的國相POl(soMphaseICRonoiigonudeotidendcroaxrays),直接在寡核苷酸芯片上的復(fù)合PGR(directmnltiptexPGRonoligonucleotidemicroairays)等。檢測結(jié)果可以用軟件包，比如POLYPHARDIM和CONCEDTM等合適的軟件進(jìn)行分析，一個,用于以上檢測的試劑盒可能包括下列組分中的一個或幾個PCR引物，等位基因特異性探針，DNA聚合酶，PCR反應(yīng)緩沖液，氯化鎂，PCR反應(yīng)或引物延伸所需的4種脫氧核糖核酸，如果需要測序的話，該試劑盒還可能霜要含有獮序引物，DNA聚合酶，4種標(biāo)記的雙脫氧核糖核酸和4種未標(biāo)記的脫氧核糖核酸。當(dāng)基因型檢測方法中不需要對DNA進(jìn)行擴(kuò)增時，被檢測的DNA可直接用于檢測上述4個SNP或檢測與任何一個SNP相關(guān)的單倍型，此方法給出了一個篩選藥物的辦法，其步驟包括(a辦一載體轉(zhuǎn)入一個真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該載體必須含有人類ABCG2和CTP2E1基因的一部分或全部，可以是單獨(dú)的某一基因也可以是兩個基因在一起。(b).在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該載體(c).在這個細(xì)胞系統(tǒng)中加入被篩選的藥物幼.分析基因的表達(dá)情況，此基因可以是ABCG2或者CYPffil基因的SNP位點(diǎn)上的所有等位基因的可能組合方式。同時也分析該細(xì)胞系統(tǒng)中相同家族的異源物質(zhì)代謝酶基因的表達(dá)與活性。(e).確定那些被篩選的化合物在該細(xì)胞體系中對同族的異源物質(zhì)代謝酶基因表達(dá)和活性的影響。依照以上方法，得到的化合物或制備的細(xì)胞表達(dá)體系可作為治療和預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼痛的潛在的候選藥物。新發(fā)現(xiàn)的人類ABCG2基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)51523T^不僅它本身可以單獨(dú)或同時用于診斷,開發(fā)藥物或疾病預(yù)防，而且，與它處于連鎖不平衡或同一單倍型的其它遺傳標(biāo)志也可有同樣的用途。更進(jìn)一步，不僅如范例1中所述的PGR與DNA測序方法可以用于檢測被測DNA樣本的如下單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)ABCG2基因的51523T^G,ra2231148:CYP2El基因的is8192772和rs2480256,還有其它—些類似的測序方法也可用于這一用途。比如多重連接依賴的探針擴(kuò)增(muMptexligationdependentprobeanq)腿cati加,MLPA),pyrosequencing測序^yrosequencingAB),單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singtestrandconformati加pdymot0iis邁，SSCP),或者變性梯度膠電泳(denaturingpwliraitgelelectoq*esis,DGGE),另有一些方法可達(dá)到此目的,這些方魏括:使用DNA芯片的方銜比如AlfymBtrix公司的GenHexTMHag,Pamg節(jié)e,toe.公司的PamCMp等)；把DNA固定在基質(zhì)上的方法(比如MWlgenBioscience,fiic.公司的SIGNETTMY~SNPI(teQtificati加System);ABI公司的Msmi)SNIWuMTMMuMplSystemBiospte咖lhc.):或者是分子信標(biāo)技術(shù)(S皿yaiyagi,PublicHraWiReseareJiInstitute,美國紐約)。以下將舉例說明本發(fā)明，但正如一些熟知此
技術(shù)領(lǐng)域：
的Aff顯而易見的那樣，這并不意味著將本發(fā)明局限于以下的示例，實(shí)施例1:檢測本發(fā)明中新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)51523TM5本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)了位于ABCG2基因內(nèi)含子9上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)515231M3,檢測此位點(diǎn)的方法介紹如下可用軟件Prtnia30i鄰:〃ftodo.wLndteda/cgi-biii4ffteiiH3^HiniH3)設(shè)計一些特異性弓l物用于査找相關(guān)區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)，用BLASTIM程序(NatiwralCentraforBiotechnology11631!00-1101>:/細(xì)1傲1^.11110111.§^/81^81)檢測所設(shè)計的引物相對于人類基因組序列的特異性。不論是正向還是反向引物，只有當(dāng)它們在BLAST程序的特定條件下所找到的相似性序列少于5條時才會被認(rèn)為是特異性的并被采納，用Amp]i!^⑧Gold聚合ll^劑盒(A卯]MBiosy8teim,C^美國)和MastercydeiGradient熱循環(huán)儀促ppend0rf,Hambmg,德國)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)'聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積為20微升，包括1.5mM鎂離子,200幽四種堿基，每條引物各0.3,m^基因組DNAWng,和0.5U的聚合酶。首先用呈梯度溫度變化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來為每一對引物尋找最合適的退火溫度，表2列出了一對引物序列的例子及其退火溫度。聚合,式反應(yīng)程序為95度10分鐘(l個循環(huán))，接著進(jìn)行45個循環(huán)的94度30秒，幼度30秒和72度30秒。最后為72度延伸2分鐘，產(chǎn)物用l鄰的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進(jìn)行分析確認(rèn)為所需長度,然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用MoWScreenTMPCR鄰純化試劑盒(MiffiporeCraporation,BedftK^美國)純化除去剩余的反應(yīng)物，表2:檢測單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)515231M5基因型的引物與其最佳退火11。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>我們采用對PCR產(chǎn)物的雙鏈分別測序的方法來査找感興趣區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn).采用的試劑盒為Bi^y癱Trani腿ttffv3.0CycleSequraidngKit(AppliedBiosyste咖，CA,USA),采用的測序儀器為ABIPRBM3100GeneticAnaly淑(AppliedBiosyste咖,CA,USA).每一個樣本至少測序兩次。將測序結(jié)果輸入到Bi(^dit軟件中作序列比對與分析，以此確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，實(shí)施例2:檢測人類ABCG2和CYP2E1基因上與系統(tǒng)性紅斑lftlS相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)此范例描述了一個用于檢測并確定上文所述的一個或幾個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法。人類的ABCG2基因和CYP2E1基因的部分目標(biāo)區(qū)域?qū)⒂米髂０鍋砗铣蒔CR產(chǎn)物，表3列出了贈特異性引物，每對可分別用于擴(kuò)增特定目標(biāo)區(qū)域，表3:用于ABCG2和CYP2E1基因的PCE和DNA測序的弓I物臟多態(tài)性位點(diǎn)名稱正向引物反向引物獮序引物最頓火溫度ra223簡CTACCAOCimX^AAGCA(卿UNO:2)N03)SBQB)m2is8股TOGTTCTraGTTTTCCCAGCTCIl(SBQE>CTGAOTCTKXXK/OtiCmCArAA(SBQIDNO勸卿IDND:SGAAAACGAmCTGTOCTGOAGA(卿GCMAOAAAQOAAICAGTTFQAGaSQDJNO鄰含有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)片段的PCR擴(kuò)增與擴(kuò)增產(chǎn)物的測序以下試劑用于PCR擴(kuò)增感興趣的片段1.5幽鎂離子,200pM四種堿基，每條引物各0.3,,離基因組DNA10ng,和0.5U的聚合酶，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積為20微升，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用MastecyctertiGradient熱循環(huán)儀仿ppendorf,Hairinng,德國)按以下步驟進(jìn)行95度10分鐘(1個循環(huán))，接著進(jìn)行45個循環(huán)的94度30秒，60度30秒和72度30秒，最后為72度延伸2分鐘，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用MiWScreenTMPCR粥純化試劑盒(MilliporeCraporation,Bedford美國)純化后直接用BigPyeTeimi旭torv3.0CycleSequraiciiigKit(^>liedBiiwjB敏ns,CA,USA)試劑盒測序。測序反應(yīng)條件為鄰度l分鐘(l個循環(huán))，接著進(jìn)行25個循環(huán)的96度10秒，50度5秒和幼度4分鐘。測序產(chǎn)物用含有DNA純級別SephaitexTMG-50的A，a^Seq9ffTMPlates平板(AniKshamHiaimaciaBiotech,toe,USA)純化。純化產(chǎn)物經(jīng)加入5nlIl-DiForaiaraide(AppliedBiosyste咖,CA,USA)95攝氏度變性。變性的測序產(chǎn)物用ABI公司提供的方法在ABIPRBM3100GeneticAnalyzer(AppliedBiosyste咖,CA,USA)測序儀上分析。將測序結(jié)果輸入到BidEdtt軟件中作序列比對與分析，表4列出了用此方法的測序統(tǒng)計結(jié)果。表格分別列出了在基因型與等位基因梨的水平上正常人與系統(tǒng)性紅斑狼痛病人在多個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的序列情況，表4:在ABCG2和CY12E1基因中與系統(tǒng)性紅斑自相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的表格<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>雖然以上只介紹了一種檢測與系統(tǒng)性紅斑狼痛有關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點(diǎn)的方法，任何熟知此方面工作的人都知道可以使用其它方法達(dá)到此目的，比方說，設(shè)計等位基因特異性探針，等位基因特異性引物延伸反應(yīng),或者使用單麟延伸反應(yīng)來檢測a實(shí)施例3:檢測ABCG2基因的51523TM3，ra2231148和CYP2E1基因的re8192772和ra2480256的試劑食此范例描述了一個試劑盒，該試劑盒用于檢測并確定上文所述的4或幾個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的序列，從而得到被測個體的基因型，檢測結(jié)果可運(yùn)用于對該個體對系統(tǒng)性紅斑鵬的易感性作出預(yù)測。該試劑盒包含以下引物SEQ3DNO:2，SEQIDNO:3，SH3IDNO:5,SEDIDNO:6，SH3IDNO:8和SEDD3NO:9,該試劑盒還包含以下試劑用于PCR擴(kuò)增ABCG2和CYP2E1基因的片段1.5nM鎂離子,200HM四種堿基，陽性對照人類模板基因組DNA,和聚合酶，運(yùn)用試劑盒時，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積為20微升，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ttffl熱循環(huán)儀按以下步驟進(jìn)行95度10分鐘(l個循環(huán))，接著進(jìn)行45個循環(huán)的斜度30秒，60度30秒和72度30秒，最后為72度延伸5分鐘，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用測序等方法來確定ABCG2基因的51523!>G,is^3114S和CYP2E1基因的ra8192772和ra2480256的序列，核,列的清單<110>廖,，沈南，張浩<120>人類異源物貭代謝酶基因的單核苷酸多態(tài)性在診斷和治療系統(tǒng)性紅斑》|方面之應(yīng)用<160>9<210>1<211>593<212>DNA<213>H(nno幼plrais<220><221>ioisc_Jb^[ae<222>(卿<223>單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)51523TMIn-1或g<2脅<221>miscjeature<223>*核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)ra2231148,闊或t柳培ctgt咖ttttetecca鵬acg紹gccaagcca^pglgt加tettaat120ggaga辟tet辟ttatgtaacc^ta加tectaataaatgg^tataagtilttat180ctetaa卿aactctteccctttttttgcatttttctttttgaaaagatcattgtc^a240gtcgtactgggactggttataggtgccattta^ttgggctaaaaaa培a加tac敏a3Wfttccagaaca^taagtaaattisgatc汰gattttc^a腿tg改gttactttc您a360agc加ttgaaatccattaa脾tt(gaatttaa^caagtatagtgtaaal^ca加t420tttattg鄉(xiāng)gtaggatgagtc^tttatttttgagacagagtcatgctct^ccc紹柳gc敏^gcag^acgcgatctcagctcac瞎caalctecgcctco:驩gttc幼gcaa540ttctcctgccteagcttcccaagte^cctcgactaot,ttfccaccaccacg593<210>2<212>DNA<213>人工序判<2脅<223>用來檢測人類ABCG2基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序列。<400>2cteccactctcccc咖gca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>用來檢測人類ABCG2基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序列,<400>3cgtgg^g^ga^ctgta加<210>4<211>241<212>DNA<213>Ho咖salens<22ft><221>mi8c一featuie<222>(170)<223>單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)ra8192772，n=t或c<400>4gHcnggtttteccagcte堪a瞎ctttgcacagtcact敏魄acctgcaagatttt60a爽助gaaac紹ctg敏agtc^aaagctgcaagt^agg^lilgtggg敏鵬120gagglggg^gtpc頓agtggccata鵬gttt^卿gcatgg銘aagactca測g241<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用來檢測人類CYP2E1基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序列,<400>5gttcttggtttteccagctc121<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用來檢測人類CYP2E1基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序列,<400>6ctgagtcttccccatgctacataa24<2脅7<211>275<212>DNA<213>H咖o幼pi加s<221>misc一featwe<222>(231)<223>單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)is2480256,n=g或a<400>7gaaaacg喊gtgtgctg薩g腿ggcc敏ctegca^gag^ttcttQgt^stg60ccattt^cagcattttaatttgaafcctctc織gaccc鵬,tatcpccteagcc120ctatacatettgggntggc柳teccaccacgttacaaadc^gtcattccccgctl甜catp^t跑tggaggacaccctg^cccccc^tscaaacaagttttcaaatliJttg,^gtca鵬t加tcaa^tga加ctttc啤c275<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><2忍>用來檢測人類0￥2￡1基因t^基因的變化類型的AX合成DNA序列。<400>8gaaaacgagtg^tgc^gaga22<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>^3^用來檢測A^CYP2E1基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序列,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>權(quán)利要求1.用如下四個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)制造診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的試劑盒的用途，所述四個SNP分別是ABCG2基因的位點(diǎn)51523T＞G，即，SEQIDNO1序列第103個堿基處的單核苷酸由T變成G；ABCG2基因的位點(diǎn)rs2231148，即，SEQIDNO1序列第169個堿基由A變成T；CYP2E1基因的位點(diǎn)rs8192772，即，SEQIDNO4序列第170個堿基單核苷酸由T變成C；CYP2E1基因的位點(diǎn)rs2480256，即，SEQIDNO7序列第231個堿基處的單核苷酸由A變成G。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其中，根據(jù)基于包含這四個SNP中任何一種或多種的SEQIDNO:1,SEQIDNO:4或SEQIDNO:7來設(shè)計引物，所述試劑盒包含所述引物。3.—種對系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人進(jìn)行基因型分析以判斷其在臨床和藥學(xué)基因組學(xué)分類地位的方法，其特征在于，該方法為檢測如下4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中的一個或幾個位點(diǎn)的序列，這些位點(diǎn)為ABCG2基因的51523T>G，rs2231148;CYP2E1基因的rs8192772，rs2480256。4.一種用于-篩選治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物的方法，其特征在于，該方法為a)將一載體轉(zhuǎn)入一個真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該載體必須含有人類ABCG2和CYP2E1基因的一部分或全部，可以是單獨(dú)的某一基因也可以是幾個基因在一起，這些基因片段必須包括以下SNP位點(diǎn)中的一個或多個ABCG2基因的51523T>G，rs2231148;CYP2E1基因的rs8192772，rs2480256。b)在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該載體；C)在這個細(xì)胞系統(tǒng)中加入被篩選的藥物；d)分析該細(xì)胞系統(tǒng)中的那些異源物質(zhì)代謝酶的表達(dá)情況與活性；e)確定那些可以改變異源物質(zhì)代謝酶基因表達(dá)和活性的藥物。這些異源物質(zhì)代謝酶基因可能因為以卜一這4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的存在而表現(xiàn)為不同的等位基因形式，也可能因為一些與這4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)呈相同單倍型或處于連鎖不平衡的其它遺傳標(biāo)志的存在而表現(xiàn)為不同的等位基因形式，這4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)指的是屬于ABCG2基因的51523T>G，rs2231148;CYP2E1基因的rs8192772，rs2480256。5.—種可以用來檢測以下4個SNP序列的診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括檢測以下4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)所需的一切合適的試劑，所述4個SNP分別是ABCG2基因的位點(diǎn)51523T>G，艮P，SEQIDNO:l序列第103個堿基處的單核苷酸由T變成G;ABCG2基因的位點(diǎn)rs2231148，即，SEQIDNO:1序列第169個堿基由A變成T;CYP2E1基因的位點(diǎn)rs8192772，即，SEQIDNO:4序列第170個堿基單核苷酸由T變成C;CYP2E1基因的位點(diǎn)rs2480256，即，SEQIDNO:7序列第231個堿基處的單核苷酸由A變成G。6.—種預(yù)測人類對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感性的方法，其特征在于，它應(yīng)用權(quán)利要求5中的檢測4個SNP序列的診斷試劑盒，來診斷一個人的基因型。該方法為檢測此個體的單套或兩套染色體組上的一個或多個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核酸序列，這些位點(diǎn)包括ABCG2基因的51523T>G，rs2231148;CYP2E1基因的rs8192772，rs2480256。該方法檢測位于SEQIDNO:1序列第103個堿基處的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)51523T>G，基因型為t/t者較不易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡，基因型為t/g或g/g者較易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡。該方法檢測位于SEQIDNO:1序列第169個堿基處的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2231148，基因型為aA或t/t者較不易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡，基因型為a/a者較易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡。該方法檢測位于SEQIDNO:4序列第170個堿基處的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs8192772，基因型為t/t或t/c者較不易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡，基因型為c/c者較易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡。該方法檢測位于SEQIDNO:7序列第231個堿基處的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2480256，基因型為g/a或g/g者較不易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡，基因型為a/a者較易患系統(tǒng)性紅斑狼瘡。7.—種用于診斷一個系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人的基因型的方法，其特征在于，它應(yīng)用權(quán)利要求5中的檢測4個SNP序列的診斷試劑盒。全文摘要本發(fā)明涉及檢測在2個人類異源物質(zhì)代謝酶基因ABCG2和CYP2E1上的4個與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，以及應(yīng)用這些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)預(yù)測系統(tǒng)性紅珊狼瘡的易患性及篩選治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物。本發(fā)明所提供的信息有助于預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡及開發(fā)有效的新療法。文檔編號C12Q1/68GK101230386SQ200710008909公開日2008年7月30日申請日期2007年4月28日優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日發(fā)明者吳汪黔生,廖凌虹,浩張,南沈申請人:廖凌虹;沈南;張浩