專利名稱：：用于傳染病和癌癥檢測的分子信標(biāo)成像的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體涉及^r測疾病標(biāo)記物的分子信標(biāo)，更特別是檢測疾病標(biāo)記物的傳染和/或表達(dá)或突變的分子信標(biāo)以及使用它們對生命體進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的方法。
背景技術(shù)：
：在美國癌癥是第二大死亡原因。在美國近一半男人和稍多于三分之一的女人在他們一生中可能患有癌癥。今天，上百萬人正在帶癌生活或已經(jīng)患有癌癥。增加患者存活率的一個重要因素是盡早診斷癌癥。越早發(fā)現(xiàn)癌癥并開始治療，存活多年的機(jī)會越大?，F(xiàn)在并沒有有效診斷癌癥的血清腫瘤標(biāo)記物。例如在乳腺癌中，雖然用乳房X光攝影檢查術(shù)早期檢查降低了疾病的死亡率，仍有近20%乳腺癌病人被乳房X光攝影檢查術(shù)遺漏。此外，乳房X光#_影片異常的病人中，僅有10-20%活組織切片檢查確證患有乳腺癌。因此，開發(fā)癌癥早期診斷的新方法對成功治療和增加病人存活率是十分重要的。開發(fā)癌細(xì)胞早期檢測的新方法和確定癌細(xì)胞對治療藥物的反應(yīng)對增加癌癥病人存活率有很大希望。正如癌癥對人類是威脅一樣，傳染病也是一大死亡原因，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致四分之一至三分之一的死亡。在未來20年中，新出現(xiàn)和再度出現(xiàn)的傳染病將形成上升的全球健康威脅和使全球安全復(fù)雜化。2003年中期開始于東南亞的高致病性禽流感的當(dāng)前爆發(fā)是記栽中最大和最嚴(yán)重的一次。在這次疾病前，歷史上從未有過如此多的國家同時感染，而導(dǎo)致如此多的鳥死亡。病原體H5N1病毒已證明極為頑固。WHO及其它地方的專家相信世界現(xiàn)在比自1968年上世紀(jì)三次流行病大流行中的最后一次發(fā)生起任何時候都更接近另一次流行性感冒的廣泛流行。CDC推行強(qiáng)有力的措施來檢測(國內(nèi)監(jiān)測)、診斷和實驗室檢測H5N1以預(yù)防禽流感A(H5N1)病毒的傳播。由于H5N1禽流感在鳥中的廣泛流行和禽流感H5N1病毒可能的鳥至人傳染，迫切需要一種早期和敏感的診斷方法來檢測禽流感和人流感病毒。缺乏有效的早期藥物基因組學(xué)檢測常常導(dǎo)致難以治療許多有生命威脅的疾病。一種在疾病過程的早期階段快速、準(zhǔn)確、特效和可負(fù)擔(dān)的診斷和/或藥物基因組學(xué)篩選可提供對改善病人結(jié)果和醫(yī)生給病人最佳治療的決策無法衡量的益處。分子信標(biāo)(MB)是可用于在雜交檢測中不需要從過量探針中分離探針-靶標(biāo)的雜交體即可檢測互補(bǔ)核苷酸靶點存在的雜交探針[15，16]。由于這種性質(zhì)，MB已用于在活細(xì)胞內(nèi)檢測RNAs[lO,13],在密封反應(yīng)器中監(jiān)測特異性核苷酸的合成[6,16],和構(gòu)建自我報告寡核苷酸陣列[14]。MB可用于進(jìn)行同種一管檢測來鑒定DNA中的單核苷酸變異[3，7-9]和才企測病原體[12,17〗。雖然以前研究表明用MB探針檢測互補(bǔ)核苷酸靶的存在是可行的方法，在其它事情中，如何將此新技術(shù)開發(fā)為可廣泛用于基礎(chǔ)研究和臨床實驗室的簡單方法成為問題。因此，在本領(lǐng)域需要解決前述未解決的問題以克服上述缺陷和不足。發(fā)明概述在其它事情中，本發(fā)明尋找解決使用分子信標(biāo)作為診斷試劑檢測疾病細(xì)胞特別是檢測傳染病細(xì)胞和/或癌細(xì)胞的當(dāng)前可用方法中存在的上述缺陷。一方面，本發(fā)明涉及檢測用于在生命體中診斷和藥物基因組研究的疾病標(biāo)記物的傳染和/或表達(dá)或突變的方法。在一個實施方案中，本方法包含步驟a)獲得來自生命體的樣品，其中所述樣品含有一個或多個細(xì)胞；b)有機(jī)溶劑固定樣品；c)添加分子信標(biāo)至所述樣品中；和d)觀察加入分子信標(biāo)的結(jié)果以檢測疾病標(biāo)記物的傳染和/或表達(dá)或突變，其中所述的分子信標(biāo)與一個或多個細(xì)胞中的疾病標(biāo)記物中疾病相關(guān)的rna或dna雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。此方法還包含觀察步驟前用染料染色一個或多個細(xì)胞中的至少一個細(xì)胞核的步驟。進(jìn)行添加分子信標(biāo)和觀察結(jié)果的步驟不超過2小時。染色結(jié)果可用包括顯微鏡、FACS掃描器、ELISA平板讀出器、閃爍計數(shù)器以及任何它們的組合中的一種工具來;f全測。分子信標(biāo)可檢測傳染病細(xì)胞，其中所述的傳染病包含流行性感冒病毒引發(fā)的疾病。流行性感冒病毒包括流行性感冒病毒A,其中流行性感冒病毒A包括16H和9N抹中的一種，和任何它們的組合。流行性感冒病毒還可以選自包括流行性感冒病毒A、流行性感冒病毒AH5、流行性感冒病毒AN1、流行性感冒病毒B以及任何它們的組合組成的組。分子信標(biāo)還可檢測癌細(xì)胞，其中所述的癌癥選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結(jié)腸癌、咽喉癌和動物中發(fā)生的任何癌組成的組。突變是疾病標(biāo)記物的點突變和/或缺失，其中疾病標(biāo)記物是靶向治療的生物學(xué)靶點。生物學(xué)靶點是EGFR基因和/或它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品，其中EGFR基因在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中含有缺失突變。在一個實施方案中，分子信標(biāo)包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核香酸探針，其含有選自包括SEQIDNOs:1-11和任何它們的組合的組的核苷酸序列。在另一個實施方案中，分子信標(biāo)能與EGFR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品雜交。在另一個實施方案中，分子信標(biāo)能檢測耐藥癌癥和/或耐藥病原體。另一方面，本發(fā)明涉及從生命體中檢測癌細(xì)胞的方法。在一個實施方案中，此方法包含步驟a)從生命體中獲得含有一個或多個細(xì)胞的樣品；b)用有機(jī)溶劑固定樣品；c)添加分子信標(biāo)至樣品中；和d)觀察添加了分子信標(biāo)的結(jié)果以在樣品中檢測癌細(xì)胞，其中分子信標(biāo)能與樣品中的一個或多個細(xì)胞內(nèi)的癌細(xì)胞標(biāo)記物相關(guān)RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。此方法還包含在觀察步驟前用染料染色樣品中的一個或多個細(xì)胞中細(xì)胞核的步驟。有機(jī)溶劑是丙酮、乙醇、曱醇、曱眵、多聚曱醛、丁醇和它們的任何組合，其中固定樣品的有機(jī)溶劑在添加分子信標(biāo)前用Triton處理。分子信標(biāo)包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其含有選自SEQIDNOs:1-7以及任何它們的組合的組的核香酸序列。癌細(xì)胞選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結(jié)腸癌、咽喉癌和動物中發(fā)生的任何癌癥的組，其中癌細(xì)胞顯示了癌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物中至少一個點突變和/或缺失。樣品是組織切片、活組織4全查的抽吸液(aspirate)、血液和體液中的脫落細(xì)胞中的一種。另一方面，本發(fā)明涉及從生命體中檢測流行性感冒病毒感染的細(xì)胞的方法。在一個實施方案中，此方法包含步驟從生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細(xì)胞；用有機(jī)溶劑固定樣品；添加分子信標(biāo)至樣品中；觀察結(jié)果以檢測樣品中流行性感冒病毒感染的細(xì)胞，其中分子信標(biāo)能與至少一個細(xì)胞中的流行性感冒病毒標(biāo)記物相關(guān)的RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。此方法還包含在觀察步驟前用染料染色一個或多個細(xì)胞中至少一個細(xì)胞核的步驟。在一個實施方案中，有機(jī)溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種，其中固定樣品的有機(jī)溶劑在添加分子信標(biāo)前用Triton處理。在一個實施方案中，分子信標(biāo)包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其含有選自包括SEQIDNOs:8-11及任何它們的組合的組的核芬酸序列。在一個實施方案中，流行性感冒病毒包含禽流感病毒，其中流感病毒是流感病毒A和流感病毒B。流感病毒A包括16H和9N株中的一種，以及任何它們的組合。在一個實施方案中，用同時加至樣品的一個或多于一個的探針實施本方法。另一方面，本發(fā)明涉及檢測疾病標(biāo)記物的傳染和/或表達(dá)或突變以在生命體中進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的方法。在一個實施方案中，此方法包含步驟從生命體中獲得樣品，其中樣品含有一個或多個細(xì)胞；用有機(jī)溶劑固定樣品；添加分子信標(biāo)至樣品中；觀察添加了分子信標(biāo)的結(jié)果以檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變，其中分子信標(biāo)與細(xì)胞中的疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號，并且其中添加分子信標(biāo)和觀察結(jié)果的時間不超過2小時。在一個實施方案中，此方法還包含在觀察步驟前用染料染色樣品的一個或多個細(xì)胞中細(xì)胞核的步驟。在一個實施方案中，有機(jī)溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種。另一方面，本發(fā)明涉及包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針的分子信標(biāo)，該探針含有與疾病細(xì)胞中疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。在一個實施方案中，寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苷酸序列。在另一個實施方案中，寡核苷酸探針具有能與癌細(xì)胞中編碼EGFR基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的RNA和/或DNA雜交的核普酸序列。在一個實施方案中，寡核苷S臾探針包含在5'端的熒光團(tuán)和在3'端的猝滅劑，或在3，端的熒光團(tuán)和在5'端的猝滅劑。在一個實施方案中，疾病細(xì)胞是癌細(xì)胞或傳染病細(xì)胞之一。在一個實施方案中，疾病細(xì)胞被流感病毒感染，其中流感病毒是流感病毒A或流感病毒B。在一個實施方案中，流感病毒A包括16H和9N林以及任何它們的組合中的一種。另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測生命體中疾病標(biāo)記物的傳染和/或表達(dá)或突變以進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的診斷試劑盒，包含包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針的分子信標(biāo)，該探針含有能與疾病細(xì)胞中疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)RNA和/或DNA雜交的核香酸序列，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號；和說明書。在一個實施方案中，寡核苷酸探針含有能與癌細(xì)胞中編碼EGFR基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。在一個實施方案中，寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苦酸序列。在一個實施方案中，試劑盒包含超過一個含有選自包括SEQIDNOs:1-7的組的核苷酸序列的寡核苷酸探針。在一個實施方案中，試劑盒包含超過一個含有選自包括SEQIDNOs:8-11的組的核香酸序列的寡核苦酸探針。診斷試劑盒允許進(jìn)行從添加分子信標(biāo)至樣品中至從中觀察到結(jié)果的診斷不超過兩小時。本發(fā)明提供的此方法具有以高敏感性的快速一步法診斷傳染病細(xì)胞和/或癌細(xì)胞，和/或能夠從生物樣品中同時檢測特異性治療靶點或標(biāo)記物的突變以及表達(dá)的優(yōu)點。這些和其它方面將在以下描述的優(yōu)選實施方案和以下附圖中明確，雖然可能在不脫離本說明書的新概念的精神和范圍下對其有改變和修飾。了本發(fā)明的一個或多個實施方案，并且和文字說明書一起解釋了本發(fā)明的原理。在任何可能的地方，附圖中使用的相同的參考文獻(xiàn)編號涉及實施方案中的相同或類似元素。附圖簡述本專利或申請文件含有至少一個有色附圖。帶有彩圖的本專利或?qū)＠暾埞_書的副本由專利和商標(biāo)局根據(jù)需要和支付必須費用提供。圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案設(shè)計用來檢測癌癥標(biāo)記物和癌藥物基因組研究靶點的分子的熒光。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用ALV-1011檢測肺癌細(xì)胞系I和II中治療靶點的點突變的圖^^。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用ALV-1022檢測肺癌細(xì)胞系I和II中治療靶點的第二個點突變的圖像。圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用ALV-1033檢測肺癌細(xì)胞系I和II中一個"通用"癌癥標(biāo)記物的表達(dá)。圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用ALV-1044和ALV-1055檢測胰腺癌病人的活組織檢查中癌癥標(biāo)記物的點突變的圖像。圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案ALV-FluA、ALV-FluAH5、ALV-FluANl和ALV-FluB分子與它們各自的靶點的特異性結(jié)合。圖7顯示了才艮據(jù)本發(fā)明的一個實施方案在禽流感病毒感染中檢測的流感病毒A、流感病毒AH5和流感病毒AN1。圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案在人流感病毒感染中4企測的流感病毒A和流感病毒B。圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案在10-20分鐘內(nèi)快速檢測的人流感病毒A和流感病毒B感染。圖IO顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用ALV-FluA和ALV-FluB分子檢測人流感病毒A和流感病毒B感染的FACS分析。圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用ALV-FluA和ALV-FluB分子檢測人流感病毒A和流感病毒B感染的熒光顯微鏡分析。圖12顯示了ALV-FluA、ALV-FluB、ALV-FluAH5和ALV-FluANl分子的靶向結(jié)合。圖13顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案人流感病毒A感染的ALV-FluA檢測。圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案人流感病毒B感染的ALV-FluB檢測。圖15顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案人流感病毒H5感染的ALV-FluH5檢測。圖16顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案禽流感病毒AN1感染的ALV-FluANl檢效'J。圖17顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案禽流感病毒A感染的ALV-FluA檢測。圖18顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案ALV-FluA檢測后流感病毒感染的FACS分析。圖19顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用熒光平板讀出器的人流感病毒感染的RFU分析。圖20顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中的流感病毒感染。圖21顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測病人中的流感病毒感染。圖22顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測雞胚胎細(xì)胞中的禽流感流感病毒A(H5N3)感染。圖23顯示了4艮據(jù)本發(fā)明的一個實施方案^r測雞胚胎細(xì)胞中的禽流感流感病毒A(H6N1)感染。圖24顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測肺癌細(xì)胞系I中治療靶點的點突變。圖25顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測肺癌細(xì)胞系III中治療靶點的缺失。圖26顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測SMCLC病人的突變。圖27顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案特異于流感病毒的流感病毒A和流感病毒B型，以及流感病毒AH5和流感病毒AN1抹的核苦酸序列，它顯示了EGFR點突變和缺失的位置，其中ALVEGFRMBs檢測此位置進(jìn)行癌癥藥物基因組研究。圖28顯示了生物信息學(xué)備定的特異于流感病毒的流感病毒A和流感病毒B型，以及流感病毒AH5和流感病毒AN1林的序列。優(yōu)選實施方案詳述在下面的實施例中更具體的描述本發(fā)明，其中這些實施例僅用于說明，因為對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說大量修飾和改變是很明顯的。本發(fā)明的多個實施方案會詳細(xì)描述。在本說明書和以下權(quán)利要求中所用的"一個"、"一個"和"這個"的含義包括復(fù)數(shù)指代除非上下文中明確指明。另外，在本說明書和以下權(quán)利要求中所用的"中"的含義包括"中"和"上"除非上下文中明確指明。此外，標(biāo)題和副標(biāo)題也可用在說明書中以方便讀者，而對本發(fā)明的范圍沒有影響。定義在本發(fā)明的上下文中和每個術(shù)語使用的具體上下文中，本說明書中使用的術(shù)語一般具有其本領(lǐng)域內(nèi)的普通含義。用于描述本發(fā)明的特定術(shù)語在下面或說明書的別處討論以給從業(yè)者提供描述本發(fā)明的組合物和方法以及如何制造和使用它們的額外指導(dǎo)。為了方便，特定術(shù)語被突出顯示，例如使用斜體和/或引號。突出顯示的使用對術(shù)語的范圍和含義沒有影響；無論突出顯示與否，術(shù)語的范圍和含義在相同上下文中是一樣的。應(yīng)當(dāng)理解相同事物可以用超過一種方式講述。因此，可選文字和同義詞可用于本文討論的任何一個或多個術(shù)語，而沒有任何特殊含義，無論術(shù)語是否在本文中被詳細(xì)地說明或討論。提供了特定術(shù)語的同義詞。一個或多個同義詞的說明不排除其它同義詞的使用。本說明書中任何地方的實例的使用，包括本文討論的任何術(shù)語的實例，僅用作說明而決非限制本發(fā)明或任何例證的術(shù)語的范圍和含義。同樣地，本發(fā)明不限制此說明書中所給的多個實施方案。如本文所用的"大約"或"近似"一般表示在所給值或范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選10%以內(nèi)，更優(yōu)選5%以內(nèi)。如非特別說明可推斷本文所給的數(shù)字量是近似的，意為術(shù)語"大約"或"近似"。如本文所用的"雜交"和"互補(bǔ)"涉及兩個核苷酸間精確配對的能力。例如，如果一個寡核苷酸上特定位置的一個核苷酸能夠與一個DNA或RNA分子上相同位置的一個核苦酸氬鍵結(jié)合，那么這個寡核苷酸和這個DNA或RNA被認(rèn)為在那個位置是互補(bǔ)的或相互間可雜交的。當(dāng)每個分子內(nèi)的足夠量的的相應(yīng)位置被能彼此以氫鍵結(jié)合的核苷酸占據(jù)時，則該寡核苷酸與該DNA或RNA雜交。在本領(lǐng)域內(nèi)可理解反義寡核苷酸的序列不需100%互補(bǔ)于與其雜交的靶核苷酸的序列。寡核苷酸是特異雜交的是指在進(jìn)行檢測的條件下，該寡核苷酸化合物與靶DNA或RNA分子結(jié)合，并且具有足夠互補(bǔ)度來避免反義寡核苷酸與非靶序列在預(yù)計特異性結(jié)合的條件下非特異性結(jié)合，例如在體內(nèi)檢測或治療的生理條件下，或在進(jìn)行體外^r測的條件下。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"寡核苷酸"涉及核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或多聚物。此術(shù)語包括但是不限于自然產(chǎn)生和/或合成的核酸堿基、糖和共價內(nèi)核酸堿基(骨架)連接臂組成的寡核苷酸。由于令人想要的性質(zhì)例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、增強(qiáng)的與核苷酸靶的親合力、和/或增強(qiáng)的在核酸酶存在下的穩(wěn)定性，這些修飾或取代寡核苷酸常常比天然形式優(yōu)選。如本文所用的術(shù)語"分子信標(biāo)"或其首字母縮略詞"MBs"是形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸雜交探針。它的環(huán)含有與靶序列互補(bǔ)的探針序列，而莖由位于探針序列任一側(cè)的互補(bǔ)臂序列退火形成。一個熒光基團(tuán)共價連接于一臂末端而一個猝滅物共價連接于另一臂末端。當(dāng)分子信標(biāo)在溶液中游離時，它不發(fā)出熒光。但是，當(dāng)它與含有靶序列的核苷酸鏈雜交時，它的構(gòu)象發(fā)生變化從而能夠明顯發(fā)出熒光。靶不存在時探針是暗的，因為莖使熒光基團(tuán)與非熒光猝滅物非常接近以致它們短暫地分享電子而失去了熒光基團(tuán)發(fā)出熒光的能力。當(dāng)探針遭遇靶分子時，它形成比莖雜交物更長和更穩(wěn)定的探針-靶雜交物。探針-靶雜交物的穩(wěn)定性和長度杜絕了莖雜交物的同時存在。因此，分子信標(biāo)進(jìn)行了自發(fā)的使莖雜交物分解和熒光基團(tuán)和猝滅物互相分開、發(fā)出熒光的構(gòu)象重組。當(dāng)MB遭遇靶mRNA分子時，環(huán)和部分莖與靶mRNA雜交，引起了自發(fā)的使莖分開的構(gòu)象變化。猝滅物離開熒光基團(tuán)，導(dǎo)致熒光的恢復(fù)。莖環(huán)探針的一個主要優(yōu)點是它們能夠比線性寡核苦酸探針以更高的特異性識別靶。適當(dāng)設(shè)計的MBs可鑒別差別微小如僅有單個核苷酸不同的靶。MBs已有多種應(yīng)用包括DNA突變檢測、蛋白質(zhì)-DNA相互作用、PCR實時監(jiān)測、活細(xì)胞中的基因分型和mRNA檢測。如本文所用的"轉(zhuǎn)染"涉及插入核苷酸至宿主的過程。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知許多種技術(shù)來促進(jìn)核苦酸轉(zhuǎn)染至原核或真核生物中。這些方法包括許多種技術(shù)，例如用高濃度鹽例如但是不僅是鈣或鎂鹽處理細(xì)胞、電場、去污劑或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，從而使宿主細(xì)胞成為能夠攝取核苷酸分子的感受態(tài)細(xì)胞。如本文所用的術(shù)語"基因"或"基因們'，涉及編碼遺傳信息以合成全長RNA、全長蛋白質(zhì)或任意部分這些全長RNA或全長蛋白質(zhì)的核苷酸序列(包括RNA和DNA兩者)。如本文所用的術(shù)語"表達(dá)的"或"表達(dá)"涉及從基因轉(zhuǎn)錄獲得至少與該基因的兩條核苷酸鏈中的一條的部分區(qū)域互補(bǔ)的RNA核苷酸分子。如本文所用的術(shù)語"表達(dá)的"或"表達(dá)"還可涉及從所述RNA核苷酸分子翻譯獲得蛋白質(zhì)或多肽或它們的一部分。如本文所用的術(shù)語"藥物基因組研究"涉及檢查表明藥物反應(yīng)的基因的遺傳變異和探索這些變異可用來預(yù)測病人對一個藥物是lde反應(yīng)、不lA應(yīng)還是完全沒反應(yīng)的方法的-恃。USMD，即"超敏感分子檢測"的縮寫，是本發(fā)明的平臺技術(shù)的商品名。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及使用MB通過直接添加MB至樣品和獲得不需信號放大即可抬，測的信號來檢測疾病標(biāo)記物的感染和表達(dá)或突變以診斷和藥物基因組研究。市場上沒有產(chǎn)品可以以本發(fā)明達(dá)到的敏感性和特異性程度如此快速的工作。在本領(lǐng)域中，分子信標(biāo)已與信號放大一起使用。本發(fā)明提供的分子信標(biāo)和方法可不需信號放大而檢測信號。此外，本發(fā)明進(jìn)行診斷所費時間不超過2小時，而WHO推薦的流感當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)分子檢測花費6小時。此外，本發(fā)明的用于癌癥和流感的MBs序列還未使用，特別是流感序列。本發(fā)明提供了在樣品細(xì)胞中檢測癌癥和傳染病的方法。特別是本文提供了檢測、鑒別或定量在細(xì)胞樣品中的癌癥標(biāo)記物序列或病毒標(biāo)記物序列的存在或改變的方法。本發(fā)明的一方面涉及檢測直接來自組織樣品而不需擴(kuò)增的疾病特異性標(biāo)記物的表達(dá)改變和/或突變。此平臺技術(shù)具有敏感、特異和同時檢測多種疾病相關(guān)標(biāo)記物的優(yōu)點。將含有本發(fā)明的試劑的MB輸送到與疾病相關(guān)的細(xì)胞中會導(dǎo)致信號的改變。當(dāng)檢測試劑檢測到疾病的分子標(biāo)記物的變化時，例如表達(dá)異?；蛲蛔?、疾病細(xì)胞(亮色)可區(qū)別于正常細(xì)胞(暗色)。因此，將這種突破性技術(shù)與近年來發(fā)展的功能基因組學(xué)知識結(jié)合起來后，最初的目標(biāo)是開發(fā)產(chǎn)品用于l)急性和慢性疾病兩者的早期檢測；2)對病人進(jìn)行藥物基因組學(xué)篩選以提高治療效率；3)病人的預(yù)后和治療后過程。此平臺技術(shù)具有快速、敏感、特異和成本低且有效檢測疾病相關(guān)標(biāo)記物的優(yōu)點。本發(fā)明的一方面涉及檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變的方法以對生命體進(jìn)行診斷和藥物基因組研究，其中此方法包括(a)從生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細(xì)胞；(b)用有機(jī)溶劑固定所述樣品；(d)將分子信標(biāo)加入到樣品中；和(c)觀察結(jié)果以檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變。含有目標(biāo)細(xì)胞的樣品可以是組織切片、活組織檢查的抽吸液(aspirate)、血液、或體液中的脫落細(xì)胞。樣品在加入MB前用有機(jī)溶劑固定。用來固定樣品的有機(jī)溶劑包括丙酮、乙醇、曱醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合之一。在一個實施方案中，有機(jī)溶劑固定的樣品在加入分子信標(biāo)前用Triton處理。任選地，觀察添加了分子信標(biāo)的結(jié)果前，此方法還可包括用染料對樣品中的一個或多個細(xì)胞的至少一個細(xì)胞核染色的步驟。樣品中細(xì)胞的細(xì)胞核染色使得確定細(xì)胞在載玻片上的位置非常容易。添加了分子信標(biāo)的結(jié)果可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適當(dāng)?shù)膬x器包括顯微鏡、FACS掃描器、ELISA平板讀出器、閃爍計數(shù)器和任意它們的組合之一來檢測。此外，進(jìn)行從添加分子信標(biāo)至觀察結(jié)果的步驟花費不超過2小時。本發(fā)明的另一方面涉及檢測具有傳染病的細(xì)胞例如檢測流感病毒感染的細(xì)胞的方法。流感病毒包括禽流感病毒，例如流感病毒A和流感病毒B。流感病毒A可以是16H和9N林以及任意它們的組合之一。例如，本發(fā)明的方法檢測的細(xì)胞可以被流感病毒A、流感病毒AH5、流感病毒AN1以及任意它們的組合之一的流感病毒感染。本發(fā)明的另一個實施方案是在含有一個或多個細(xì)胞的樣品中檢測癌細(xì)胞的方法。癌細(xì)胞可以是肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌或結(jié)腸癌。本發(fā)明的另一個實施方案是檢測癌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物中至少一個點突變和/或缺失的方法。本發(fā)明的另一個實施方案是檢測疾病標(biāo)記物的突變，既可以是點突變也可以是和/或缺失的方法。疾病標(biāo)記物包括靶向治療的生物靶。生物靶包括EGFR基因。本發(fā)明的一個實施方案是在樣品中檢測癌細(xì)胞標(biāo)記物的方法，其中癌細(xì)胞標(biāo)記物含有在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有缺失突變。本發(fā)明的另一個實施方案是一種方法，^法中將一個或多個探針加入細(xì)胞樣品中。本發(fā)明的另一方面提供了單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針的分子信標(biāo)，該探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11以及任何它們的組合的組的核苷酸序列。分子信標(biāo)能與來自生命體的樣品的至少一個細(xì)胞中的疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)的RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。本發(fā)明的一個實施方案是含有能與編碼通用癌癥標(biāo)記物的RNA和/或DNA雜交的核苦酸序列的MB。在本發(fā)明的一個實施方案中，分子標(biāo)記能與EGFR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。本發(fā)明的另一個實施方案是含有能與編碼癌細(xì)胞中的EGFR基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列的MB。這種MB包含5'端的熒光基團(tuán)和3'端的猝滅物，或3'端的熒光基團(tuán)和5，端的猝滅物。本發(fā)明的另一個實施方案是能檢測耐藥癌癥和/或耐藥病原體的分子信標(biāo)。本發(fā)明的另一方面是4企測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變以對生命體進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的診斷試劑盒，其中診斷試劑盒含有本發(fā)明的分子信標(biāo)和說明書。在一個實施方案中，診斷試劑盒包括含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苦酸序列的MB。此MB和診斷試劑盒內(nèi)的說明書描述的此檢測方法使得從添加分子信標(biāo)至樣品至觀察其結(jié)果的診斷過程花費不超過2小時。了本發(fā)明的一個或多個實施方案，并且和文字說明書一起解釋了本發(fā)明的原理。無論哪里，貫穿在附圖里使用的相同參考編號是指實施方案的相同或類似成分。實施例根據(jù)本發(fā)明的實施方案的范例儀器、裝置、方法和它們的相關(guān)結(jié)果在下面給出而不限制本發(fā)明的范圍。注意標(biāo)題或副標(biāo)題可為了方便讀者而用在實施例中，但不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。此外，本文提出和公開了某些理論；但是無論對錯，不用考慮任何作用的特殊理論或方案，這些理論不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍只要本發(fā)明是根據(jù)本發(fā)明實踐的。實施例1分子信標(biāo)-靶DNA熒光檢測用來測量分子信標(biāo)和DNA模板的結(jié)合(測量MB特異性)的方法如下描述材料包括Opti-MEM轉(zhuǎn)染溶液(Invitrogen)、Costar96孔黑板(eBioscience目錄號44-2504-21)、1.7mLEppendorf管(Denville目錄號C-2170)、標(biāo)準(zhǔn)PCR管、分子信標(biāo)(MWG-BiotechAG)和把DNA(MWG-BiotechAG)。方法力n下(1)稀釋分子信標(biāo)和靶DNA:基于MWG寡聚合成報告，根據(jù)指定的"至100pmol4tl的體積"轉(zhuǎn)染溶液量稀釋分子信標(biāo)和靶DNA。渦旋和旋轉(zhuǎn)。分出相同量的寡聚溶液且避光置于-20。C冰箱中。(2)熒光檢測的準(zhǔn)備以l:10稀釋每種分子信標(biāo)(lpl分子信標(biāo)溶液加9ixl轉(zhuǎn)染溶液)。使用lnlDNA、2pl分子信標(biāo)l:10稀釋液和97pl轉(zhuǎn)染溶液，對每種分子信標(biāo)制備兩份熒光混合物把DNA混合物和對照混合物。避光37。C孵育一小時。(3)進(jìn)行檢測和獲得結(jié)果。每份混合物取95^1至％孔黑板的孔中。在SpectraMAXGeminiXS(來自MolecularDevices)熒光儀和SoftMAXPro4.3.1LS軟件使用以下設(shè)置檢測平板點擊"setup"。設(shè)置設(shè)為"Endpoint"和讀取類型是"Fluorescence(RFU，s)"。改變'Numberofwavelengths"為3，然后按照下表:表1:熒光和MB-靶DNA熒光檢測的波長<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>進(jìn)入"Sensitivity"JU乾動讀數(shù)至8。進(jìn)入"WellstoRead"且選4奪你想讀耳又的孔。點擊"Read"。進(jìn)入"File"和"Import/Export"。在軟盤驅(qū)動器上以文本文件輸出結(jié)果。結(jié)果用MICROSOFTExcel從軟盤驅(qū)動器上讀取。實施例2如表2所示，用來檢測FluA、FluB、FluAH5和FluANl的分子信標(biāo)(MBs)是基于生物信息學(xué)鑒別的特異性的DNA序列被分別設(shè)計的。發(fā)夾環(huán)的形成設(shè)計為具有5或6(大多時候為5)個堿基對。制備MB的常用方法由Peng等人(18)公開。然后由位于NorthCarolina的承包商MWGBiotech,Inc.合成MBs。5'端(或3'端)熒光基團(tuán)可以是任何熒光蛋白質(zhì)，而3'端(或5'端)猝滅物可以是任何能夠淬滅相應(yīng)熒光基團(tuán)的猝滅物。圖28顯示了生物信息學(xué)鑒別的特異于流感病毒FluA和FluB型以及FluAH5和FluANl抹的保守序列。如表3所示，由生物信息學(xué)鑒別的序列特異于流感病毒FluA和FluB型以及FluAH5和FluANl抹。表2:分子信標(biāo)和SEQIDNOs<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例3傳染病檢測本發(fā)明的流感檢測分子顯示了與靶的特異性結(jié)合。分子例如ALV-FluA、ALV-FluAH5、ALV-FluANl和ALV-FluB設(shè)計為分別特異性地沖企測FluA、FluAH5、FluANI和FIuB。如圖6所示，這些分子以非常低的背景特異的與其各自的靶結(jié)合。實施例4快速檢測細(xì)胞培養(yǎng)中流感病毒感染的方法材料包括細(xì)胞培養(yǎng)玻片25x75xlmm(VWR目錄號48312-400);滑動蓋玻片22x50mmNo11/2(VWR目錄號48383194);Dako筆(目錄號S2002);細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640);Opti-MEM轉(zhuǎn)染溶液(Invitrogen);0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(Invitrogen);Gel/Mount(BiomedaCorp.目錄號M01);Hoechst33342(Cambrex,目錄號PA陽3014);TritonX-100(Merck);和用于FluA、FluB、FluAH5和FluANl的分子信標(biāo)試劑的100uMOpti-MEM儲備液。方法如下(1)在載玻片上固定細(xì)胞由于丙酮會溶解黑色墨水，因此用鉛筆標(biāo)記載玻片。然后用無血清培養(yǎng)基沖洗栽玻片一次，和無菌PBS沖洗一次。然后，將載玻片在冰浴的100%丙酮中浸泡8-10分鐘?？諝饬栏奢d玻片。如果載玻片不馬上使用，置于-80。C中保存(2)Triton處理用水浴的無血清培養(yǎng)基沖洗載玻片一次，和冰浴無菌PBS沖洗一次。然后在0.2%Triton溶液的PBS溶液中37'C浸泡20分鐘，和用冰浴的PBS沖洗兩遍。(3)加入本發(fā)明的MB4企測試劑在載玻片上用Dako筆沿孔畫圏。然后用分子信標(biāo)試劑的100uMOpti-MEM儲備液制備適當(dāng)?shù)臐舛?，例?00nM。然后添加100|al(25-35ul用于8孔載玻片)本發(fā)明的MB試劑至細(xì)胞載玻片上適當(dāng)?shù)娜?nèi)，37。C培養(yǎng)箱中緩和放置20分鐘。(4)染色細(xì)胞的細(xì)胞核孵育20分鐘后，移去載玻片上的溶液。為了用熒光顯微鏡觀察，添加Hoechst33342(10mg/ml的PBS儲備液1/1000稀釋)至每個細(xì)胞圈。在37'C培養(yǎng)箱中放置不超過2-4分鐘。(5)完成從培養(yǎng)箱中移出載玻片。然后用冰浴的無菌PBS沖洗載玻片兩遍。如果用于焚光顯微鏡檢測，添加一滴栽玻片gel/mount至每個細(xì)胞圈。在載玻片上放置一個蓋玻片。(6)在熒光顯微鏡(01ympusDP70)下觀察結(jié)果在顯微鏡左側(cè)，打開熒光電源。在顯微鏡右側(cè)，打開顯微鏡電源。在顯微鏡下放置載玻片且用對Hoechst33342的DAPI濾光片對準(zhǔn)細(xì)胞。一旦對準(zhǔn)一些細(xì)胞，在不同熒光燈間旋轉(zhuǎn)以尋找適當(dāng)?shù)臉?biāo)志焚光。當(dāng)準(zhǔn)備好照相時，到計算機(jī)前并雙擊"DPControlIers"圖標(biāo)。對每個熒光燈使用以下設(shè)置:表4:檢測數(shù)據(jù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>首先，點擊"Snap"來捕捉計算機(jī)上的圖像。然后點擊"Saveas"來保存計算機(jī)上的圖像至適當(dāng)?shù)奈募A。在適當(dāng)?shù)臒晒鉄粢约癉API下給細(xì)胞照相以確保細(xì)胞存在于圖像中。完成后，關(guān)閉熒光電源、熒光顯微鏡和計算機(jī)。實施例5在細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測流感病毒感染的臨床前實驗簡要地，狗腎上皮細(xì)胞MDCK的細(xì)胞培養(yǎng)液，感染流感病毒的A或B亞型兩至三天后，分別用特異于流感病毒A(ALV-FluA)和流感病毒B(ALV-FluB)的分子信標(biāo)染色。20分鐘染色完成后，載玻片上的細(xì)胞用熒光顯微鏡分析。如圖20所示，流感病毒A感染的細(xì)胞用流感病毒A檢測產(chǎn)品ALV-FluA特異性檢測(A圖中紅色)，而流感病毒B感染的細(xì)胞用流感病毒B感染的產(chǎn)品ALV-FluB檢測(C圖中綠色)。實施例6病人中檢測流感病毒感染的臨床研究在2005-2006的冬季流感季節(jié)里，根據(jù)IRB指南和亞洲主要大學(xué)醫(yī)院的合作下，設(shè)計了一項臨床研究來評價使用本發(fā)明的分子信標(biāo)快速檢測流感病毒感染的可行性。作為標(biāo)準(zhǔn)程序，涂抹病人的咽喉拭子作為顯微鏡載玻片上收集的樣品。單獨的拭子樣品也收集用于RT-PCR分析的病毒培養(yǎng)和RNA提取。載玻片用含有分別特異于流感病毒A和B的ALV-FluA和ALV-FluB的混合物，或用于紅色和綠色熒光的相應(yīng)對照試劑ALV-RanRed和ALV-RanGreen的分子信標(biāo)流感病毒產(chǎn)品檢測。從盲軸(blindpivotal)臨床研究得到的結(jié)果是非常成功的，分子信標(biāo)產(chǎn)品檢測的結(jié)果與RT-PCR獲得結(jié)果超過90%都是一致的。如圖21所示的代表結(jié)果中，RT-PCR確認(rèn)的感染流感病毒A的病人用含有分別特異于流感病毒A和流感病毒B的ALV-FluA和ALV-FluB混合試劑的產(chǎn)品檢測。如圖21所示，病人檢測為流感病毒A感染陽性(圖A中紅色)而流感病毒B感染不是陽性(圖B中綠色)。另一個沒有被流感病毒感染的病人用ALV-FluA(圖D中紅色)和ALV-FluB(圖E中綠色)檢測陰性。圖C和F中的藍(lán)色熒光是相應(yīng)細(xì)胞的染色細(xì)胞核。實施例7開發(fā)了檢測禽流感病毒感染的試劑。開發(fā)了使用所設(shè)計的特異于FluA、FluAH5、FluANl和FluB的流感病毒檢測分子的檢測方法來快速和敏感地檢測FluA(H5N1和HH6N1)感染。一旦感染，用本發(fā)明的檢測試劑快速檢測被感染的宿主。如圖7所示，禽流感病毒A(H6N1)感染的宿主用本發(fā)明的分子信標(biāo)ALV-FIuA(用于FluA，紅色)和ALV-FluANl(用于Nl，綠色)分別鑒別。同樣，感染禽流感病毒A(H5N3)的宿主用本發(fā)明的分子信標(biāo)ALV-FluA(用于FluA,紅色)和ALV-FluAH5(用于FluAH5)分別鑒別。實施例8開發(fā)可用于檢測人和禽流感病毒感染的檢測試劑。檢測分子ALV-FluA和ALV-FluB是分別特異于流感病毒A和B的。它們能夠檢測流感病毒A和B抹引起的人類感染。如圖8所示，結(jié)果說明ALV-FluA和ALV-FluB分別特異檢測FluA和FuB病毒感染。實施例9禽流感病毒H5和N1感染的檢測除了檢測用于禽流感病毒A感染的產(chǎn)品ALV-FluA，ALV-FluAH5和ALV-FluANl產(chǎn)品分別特異于流感病毒A(H5)和流感病毒A(N1)抹。在ALV-FluA，ALV-FluAH5和ALV-FluANl試劑的組合下，使用這些產(chǎn)品的檢測方法應(yīng)當(dāng)是特異檢測流感病毒A(H5N1)的感染。但是，由于流感病毒A(H5N1)感染的人或動物樣品的獲得受到限制和存在潛在的嚴(yán)重危害，使用ALV-FluAH5和ALV-FluANl來檢測流感病毒A(H5)和流感病毒A(N1)感染的可行性評價用流感病毒A(H5N3)和流感病毒A(H6N1)感染的雞胚胎細(xì)胞來進(jìn)行。流感病毒A(H5N3)感染的細(xì)胞作為流感病毒A(H5)檢測的模型和流感病毒A(H6N1)感染的細(xì)胞作為流感病毒A(N1)檢測的模型。雞胚胎細(xì)胞在模型系統(tǒng)下感染禽流感病毒A(H5N3)或禽流感病毒A(H6N1)，感染的宿主細(xì)胞用本發(fā)明的分子信標(biāo)產(chǎn)品檢測。如圖22所示，感染禽流感病毒A(H5N3)的宿主細(xì)胞分別用ALV-FluA(用于流感病毒A,圖A中紅色)和ALV-FluAH5(用于流感病毒A(H5),圖B中紅色)來鑒別。同樣，如圖23顯示，感染禽流感病毒A(H6N1)的宿主細(xì)胞分別用本發(fā)明的分子信標(biāo)，ALV-FluA(用于流感病毒A，圖D中紅色)和ALV-FluANl(用于流感病毒A(N1)，圖F中綠色)來鑒別。藍(lán)色熒光是每個相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的染色細(xì)胞核。超敏感分子檢測(USDM)平臺技術(shù)的主要特征包括(l)一種檢測目的基因的表達(dá)和突變的快速和有效技術(shù)的創(chuàng)新；(2)適合于疾病過程和藥物基因組研究的早期檢測；(3)10-20分鐘最終信號讀出的一步檢測法。本發(fā)明的分子信標(biāo)產(chǎn)品對于檢測禽流感病毒感染是敏感的。本發(fā)明提供了特異于FluA、FluB、FluAH5和FluANl的檢測分子。檢測禽流感感染的分子包括ALV-FluA-紅色、ALV-FluB-綠色、ALV-FluAH5-紅色和ALV-FluANl-綠色。細(xì)胞的Hoechst33342-DNA染色顯示為藍(lán)色。本發(fā)明的這些分子信標(biāo)產(chǎn)品設(shè)計為從多種樣品中檢測流感病毒感染。可檢測出禽流感病毒的動物包括鳥、雞、鴨、鵝、鴿、豬、人等等。實施例10本發(fā)明的檢測方法已證實為高保真度的快速一步檢測法。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的基于MB的流感病毒感染檢測是簡單的一步檢測法。全部過程僅花費10-20分鐘。如圖9所示，此檢測法在檢測人FluA或FluB病毒感染時在10或20分鐘間的背景很低或沒有。實施例11使用本發(fā)明的分子信標(biāo)的檢測結(jié)果可容易地處理。例如，本發(fā)明用于流感病毒感染的檢測法得到的結(jié)果可用臨床中常用的儀器測量。除了前示結(jié)果中應(yīng)用的焚光顯微鏡，此檢測法還可用焚光活化細(xì)胞分揀器(FACS),這是一種常規(guī)使用的儀器來測量HIV感染病人的白細(xì)胞計數(shù)。圖10是顯示ALV-FluA和ALV-FluB檢測人FluA和FluB病毒感染的常用的定量柱狀圖。FACS結(jié)果與如圖11所示的使用熒光顯微鏡獲得的結(jié)果非常一致。讀出檢測結(jié)果的其它常用方法還在評價過程中。本發(fā)明的檢測分子顯示了對耐藥性菌抹爆發(fā)的快速反應(yīng)。如在癌癥藥物基因組研究中，本發(fā)明的流感病毒檢測分子能夠檢測包括點突變和缺失的突變。如果發(fā)生藥物例如Tamilflu耐受的禽流感病毒菌抹的爆發(fā)，一旦鑒別了突變序列，本發(fā)明的檢測分子的分子設(shè)計和產(chǎn)品需要的周期時間范圍是2-3周。這與基于抗體開發(fā)的檢測法是不能比較的。本發(fā)明的檢測分子可擴(kuò)大至覆蓋廣譜禽流感菌林包括16H和9N抹；和快速識別對出現(xiàn)耐藥菌林爆發(fā)的響應(yīng)。圖13-19顯示了本發(fā)明的檢測分子ALV-FluA檢測人FluA病毒感染(圖13)、ALV-FluB檢測人FluB病毒感染(圖14)、ALV-FluH5檢測人FluH5病毒感染(圖15)、ALV-FluANl檢測禽FluANl病毒感染(圖16)、ALV-FluA檢測禽FluA病毒感染(圖n)、ALV-FluA檢測后FACS分析流感病毒感染(圖18)、用熒光平板讀出器RFU分析人流感病毒感染(圖19)。表5:使用臨床實驗室常用的儀器讀出本發(fā)明的MBs信號的簡便性<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>總之，本發(fā)明的4全測分子是檢測流感病毒感染包括禽流感感染的高敏感試劑。例如，ALV-FluA和ALV-FluB對區(qū)別人流感病毒A和B亞型敏感，ALV-FluAH5和ALV-FluANl對檢測流感病毒A(H5)和流感病毒A(N1)禽流感病毒林敏感。此外，與ALV-FluAH5組合，ALV-FluANl和ALV-FluA具有快速檢測流感病毒A(H5N1)林的潛能。此外，本發(fā)明的檢測分子是快速一步檢測法，檢測過程僅花費10、20或30分鐘或更少。檢測信號的分析可靈活和簡單讀出。本發(fā)明的這些檢測分子具有擴(kuò)展至檢測廣傳流感病毒抹包括16H和9N家族中可能致死抹的可能性。實施例12癌癥標(biāo)記物檢測表6顯示了檢測EGFR點突變和缺失的分子信標(biāo)和檢測陽性對照存活和隨機(jī)的陰性對照的MB。5'(或3')端的熒光基團(tuán)和3'(或5')端的猝滅物可以是任何其它熒光基團(tuán)或猝滅物，只要它們可被淬滅。對于ALV-EGFR101-105,它們在EGFR基因上的相應(yīng)位置在圖27中顯示。表6:核香酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例13使用分子信標(biāo)試劑進(jìn)行肺癌細(xì)胞檢測以下是用于檢測EGFR點突變和/或缺失以進(jìn)行癌癥藥物基因組學(xué)研究的方法。EGFR是表皮生長因子受體的縮寫，它是在細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的與表皮生長因子(EGF)結(jié)合的一種蛋白質(zhì)。材料包括細(xì)胞培養(yǎng)載玻片25x75xlmm(VWR目錄號48312-400)、Dako筆(目錄號S2002)、細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)、Opti-MEM轉(zhuǎn)染溶液(Invitrogen)、0.25%胰蛋白酶EDTA溶液、Gel/Mount(BiomedaCorp.目錄號M01)和Hoechst33342。方法力口下沖洗和包被載玻片(僅在細(xì)胞不貼孔時進(jìn)行)在70%乙醇中室溫下浸泡載玻片30分鐘。(熒光抗體位點微載玻片，一端覆蓋，2個刻蝕環(huán)，大小3xl，，厚度0.93-1.05mm，~0.5Gross，金封閉，目錄號#3032)。從乙醇中移出載玻片且風(fēng)干。用無菌(高壓滅菌)1%凝膠(在H20中)在室溫中1小時包被載玻片的一側(cè)。除去凝膠溶液且風(fēng)干載玻片。在載玻片上固定細(xì)胞林在載玻片上畫兩個大圏(用DAKO筆)以區(qū)別細(xì)胞林放置的位置。(DakoPen，目錄號然2002)。旋轉(zhuǎn)從癌癥病人收集的肺液樣品中的細(xì)胞。在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞至密度為-106細(xì)胞/ml。將2到3滴的細(xì)胞培養(yǎng)基滴到適當(dāng)?shù)妮d玻片上。將載玻片置于支架上以方便操作。將支架置于培養(yǎng)室放入37。C和2。/。C02的培養(yǎng)箱中2-4小時或直至大部分細(xì)胞貼上。用無血清培養(yǎng)基沖洗載玻片1次，無菌PBS沖洗1次。在冰浴的100%丙酮中浸泡平板8-10分鐘。用鉛筆標(biāo)記載玻片因為丙酮會溶解黑色墨水。風(fēng)干載玻片。如果載玻片不馬上使用，在-80。C保存載玻片。加入MB試劑用無血清培養(yǎng)基沖洗載玻片1次，無菌PBS沖洗1次。從MB試劑的100uM儲備液中按需要制備適當(dāng)濃度的無血清培養(yǎng)基溶液，如200nM和50nM。在細(xì)胞載玻片的適當(dāng)?shù)膰屑尤?00^1的MB試劑溶液。37'C培養(yǎng)箱中放置大約1小時。細(xì)胞染色培養(yǎng)1小時后，用無菌PBS沖洗栽玻片2次。加入Hoechst33342(10mg/ml的PBS儲備液的1/1000稀釋液)至每個細(xì)胞圈。37。C培養(yǎng)箱中放置不超過2-3分鐘。完成從培養(yǎng)箱中移出栽玻片。用無菌PBS沖洗載玻片2次。加入一滴載玻片gel/mount至每個細(xì)胞圏。每個圈上放置一個蓋玻片。(VWR微蓋玻片22x55mm,編號11/2,VWR目錄號#48393194)。熒光顯微鏡(ZeissAxioplan2)下熒光檢測向顯微鏡右邊，打開焚光電源。在顯微鏡右側(cè)，打開顯微鏡電源。連接黑電線至顯微鏡頂部的藍(lán)色AxioCamHRc的背面。在熒光顯微鏡下放置載玻片并且用白光濾光片定位細(xì)胞。一旦定位一些細(xì)胞，就可以切換不同熒光來尋找適當(dāng)?shù)臉?biāo)志熒光。當(dāng)準(zhǔn)備好拍照時，至計算機(jī)上雙擊"AxioVision4"圖標(biāo)。在側(cè)邊工具欄上，打開AxioCamHRControl。對每個熒光使用以下設(shè)置照射百分比應(yīng)設(shè)為80%。表7:檢測數(shù)據(jù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>打開顯微鏡右側(cè)的相機(jī)窗口。點擊"Live"在計算機(jī)上觀看載玻片的現(xiàn)場圖片。點擊"Snap"在計算機(jī)上捕捉圖片。點擊"Export"在計算機(jī)上保存圖片。確保在適當(dāng)?shù)臒晒夂桶坠庀陆o細(xì)胞照相以確保細(xì)胞在圖片中出現(xiàn)。一旦完成，確保關(guān)閉熒光顯樣吏鏡。實施例14在肺癌中檢測EGFR突變大約40。/。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的病人發(fā)現(xiàn)具有表皮生長因子受體(EGFR)基因的特異性突變。EGFR的突變和/或缺失認(rèn)為與酪氨酸激酶抑制劑例如gefitinib(Irressa)和erlotinib(Tarceva)的臨床反應(yīng)性有關(guān)。這些突變導(dǎo)致了生長因子信號的增加和對抑制劑治療的敏感性。篩選肺癌中的這些突變可以鑒別出對靶向治療會具有更好應(yīng)答率的病人。癌癥病人的早期篩選的新方法的開發(fā)對成功治療和增加病人存活率是極為重要的。癌癥的最初焦點是開發(fā)和商品化基于MB技術(shù)的診斷和藥物基因組研究產(chǎn)品以提高輩巴向EGFR的藥物的治療效果-影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的EGFR突變對靶向EGFR治療的癌癥病人的反應(yīng)和存活具有直接影響。本發(fā)明的產(chǎn)品覆蓋超過80%的通常發(fā)現(xiàn)影響EGFR靶向藥物反應(yīng)的EGFR突變。實施例15人肺癌細(xì)胞系的EGFR突變檢測設(shè)計的癌癥藥物基因組研究的第一個產(chǎn)品是來檢測肺癌中的EGFR點突變和/或缺失。靶向標(biāo)記物的特異性突變已知與進(jìn)行EGFR靶向治療的病人的臨床反應(yīng)相關(guān)。如圖4所示，與沒有突變的野生型細(xì)胞系I比較，臨床前試驗得到的結(jié)果，顯示了本發(fā)明的產(chǎn)品檢測肺癌細(xì)胞系I中的點突變(圖A),。本發(fā)明的產(chǎn)品還檢測了EGFR標(biāo)記物基因的特異性缺失。如圖5所示，與目標(biāo)靶區(qū)域沒有缺失的野生型細(xì)胞系III比較，產(chǎn)品檢測了肺癌細(xì)胞系III中的缺失(圖A)。實施例16肺癌病人的EGFR突變4全測使用本發(fā)明的產(chǎn)品檢測收集自NSCLC病人的胸膜液中存在的癌細(xì)胞的EGFR突變的可行性研究可用來評價臨床應(yīng)用中產(chǎn)品的癌癥檢測進(jìn)行EGFR耙向治療藥物基因組研究的可能性。圖6中的代表數(shù)據(jù)顯示癌癥產(chǎn)品檢測了在收集自NSCLC病人的胸膜液癌細(xì)胞中的EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的缺失(紅色，圖A)。圖B中顯示了EGFR點突變陰性的病人。藍(lán)色熒光是染色的胸膜液細(xì)胞細(xì)胞核?？傊景l(fā)明用于癌癥藥物基因組研究的檢測分子是(l)能夠同時檢測特異性突變和表達(dá)；(2)來自生物樣品的治療靶或標(biāo)記物；(3)設(shè)計用于用特異性標(biāo)記物表達(dá)的癌癥基因組研究和早期癌癥檢測；和(4)屬于使用癌細(xì)胞系的臨床前試驗的概念證據(jù)式說明。可使用的樣品包括SMCLC肺癌病人的胸膜液。實施例17癌癥檢測本發(fā)明的一方面涉及開發(fā)特異于檢測癌癥標(biāo)記物和藥物基因組研究靶的分子。一系列癌癥檢測分子設(shè)計用于檢測癌癥標(biāo)記物表達(dá)和癌癥藥物基因組研究的靶。如圖1所示，ALV-1011和ALV-1022設(shè)計用于肺癌藥物基因組研究。ALV-1033特異于一個通用癌癥標(biāo)記物的表達(dá)。ALV-1066和ALV-1077設(shè)計用來檢測胰腺癌的特異性標(biāo)記物的點突變。ALV-1011和ALV-1022設(shè)計用來檢測靶向肺癌的標(biāo)記物的單突變和/或缺失。此革巴向標(biāo)記物的特異性突變已知與進(jìn)行治療的病人的臨床反應(yīng)相關(guān)。臨床前試驗得到的結(jié)果，如圖2和3所示，顯示了肺癌細(xì)胞系I中的點突變可以分別用ALV-1011和ALV-2022完整檢測(圖A)，與沒有突變的細(xì)胞系III比較。ALV-1033設(shè)計用來檢測肺瘤生成早期的"通用"癌癥標(biāo)記物的表達(dá)。這個"通用"癌癥標(biāo)記物的表達(dá)在超過80%的幾乎所有種類腫瘤中發(fā)現(xiàn)并且其表達(dá)水平與病人疾病過程的預(yù)后有關(guān)。這個"通用"癌癥標(biāo)記物的表達(dá)在正常組織中通常無法檢測。如圖4所示，ALV-1033檢測肺癌細(xì)胞系I(高)和II(低)中的特異性標(biāo)記物的表達(dá)。ALV-1033在診斷乳腺癌和肺癌中特別有用。ALV-1033的應(yīng)用可用于診斷其它癌癥標(biāo)記，包括結(jié)腸和前列腺癌。ALV-1044和ALV-1055設(shè)計用于胰腺癌的早期檢測。標(biāo)記物的突變在胰腺癌剛剛發(fā)展的早期。這個標(biāo)記物的點突變發(fā)現(xiàn)于>90%的胰腺癌中。這些突變的大多數(shù)集中于特異性部位。圖5中的結(jié)果顯示了ALV-1044和ALV-1055在三個胰腺癌病人個體的活組織檢查的特異性癌癥標(biāo)記物中檢測了它們的特異性靶向突變。多種腫瘤標(biāo)記物基因的表達(dá)的檢測同時提供了一種鑒別和分類臨床樣品例如組織切片、細(xì)針活組織4企查的aspirates、血液和體液中剝脫細(xì)胞中的癌細(xì)胞的特異和敏感的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用本發(fā)明的產(chǎn)品和方法來鑒定了其表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的一組基因。在其它方面中，本發(fā)明公開了使用分子信標(biāo)成像檢測和/或鑒別生命體的細(xì)胞和組織中的多種癌癥和病毒標(biāo)記物的基因表達(dá)的點突變和/或改變存在的方法，以及它的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，分子信標(biāo)設(shè)計為當(dāng)分子信標(biāo)之一在一個或多個細(xì)胞中靶向疾病特異性標(biāo)記物序列時，分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)發(fā)出熒光從而產(chǎn)生相應(yīng)熒光信號。熒光信號不需信號放大即可檢測。根據(jù)本發(fā)明，使用MBs檢測疾病標(biāo)記物的感染和表達(dá)或突變來診斷和藥物基因組研究通過直接加入MBs(試劑)至樣品(細(xì)胞樣品)來進(jìn)行，不需要進(jìn)行信號放大。已顯示基于USMD技術(shù)的檢測法是對特異性分子靶的一種快速、特異、敏感、易使用和花費低的檢測法。比較本發(fā)明與當(dāng)前市場上可商業(yè)獲得的診斷產(chǎn)品，例如RT-PCR和基于免疫的檢測法，如圖8中描述，顯示了本發(fā)明的優(yōu)越性。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在其它方面中，本發(fā)明具有臨床和經(jīng)濟(jì)利益，總結(jié)如下*敏感、特異、易使用和花費低的快速一步檢測法流感病毒感染和癌癥的基于USMD的檢測是一種快速和簡單的一步檢測法。與花費超過6小時用于流感檢測和數(shù)天用于肺癌中EGFR檢測的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR檢測法比較，全過程可僅花費30分鐘或更少來完成。檢測結(jié)果的簡單處理不需昂貴儀器，基于USMD的檢測法得到的結(jié)果用臨床和研究實驗室中常用儀器檢測。除了熒光顯微鏡，結(jié)果還可用熒光活化細(xì)胞分揀器(FACS),一種常規(guī)用于監(jiān)測HIV感染病人的白細(xì)胞計數(shù)的儀器、和萸光平板讀出器，這是一種用于免疫熒光^T測的標(biāo)準(zhǔn)儀器。*開發(fā)用于多種流感病毒抹的感染檢測的多種產(chǎn)品如以上公開，本發(fā)明在檢測流感病毒A和B亞型以及流感病毒A(H5)和A(N1)林中具有許多優(yōu)點。在ALV-FluA、ALV-FluAH5和ALV-FluANl組合下，最近爆發(fā)于東南亞的傳染性禽流感可被檢測。USMD平臺技術(shù)可應(yīng)用于其它亞型和其它株特異性流感病毒。對耐藥突變爆發(fā)的快速反應(yīng)無論對癌癥或流感傳染，本發(fā)明用于檢測突變包括缺失和點突變。如果出現(xiàn)耐藥突變的爆發(fā)，例如禽流感病毒Tamiflu耐藥抹或耐藥癌癥出現(xiàn)，一旦鑒別出突變序列，用來設(shè)計和制造基于USMD的產(chǎn)品的周期時間范圍是2-3周。識別新產(chǎn)品的快速周期時間是基于抗體的檢測法開發(fā)的時間無法比較的。*早期診斷^r測和藥物基因組研究的應(yīng)用本發(fā)明用來不僅;險測與疾病過程例如癌癥和傳染病相關(guān)的標(biāo)記物基因的表達(dá)，還檢測與靶向治療的藥物基因組研究相關(guān)的缺失或點突變。早期診斷和藥物基因組研究兩者均可對及早開始有效治療的病人有益。本發(fā)明的范例實施方案的上述說明僅用于例證和說明目的而不是詳盡的或限制本發(fā)明為公開的精確形式。在以上指導(dǎo)下的許多修飾和改變是可能的。選擇和描述實施方案以解釋本發(fā)明的原理和它們的實際應(yīng)用以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用本發(fā)明和多個實施方案的多種修飾以適用于特殊需要的用途。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說改變的實施方案很明顯屬于本發(fā)明不偏離其精神和范圍。因此，本發(fā)明的范圍是由附加的權(quán)利要求而不是上述說明書和如本文描述的范例實施方案定義的。參考文獻(xiàn)BaselgaJ,NortonLFocusonbreastcancer.CancerCell2002年；l(4):319-322.[2]BelsheRB.TheOriginsofPandemicInfluenza-Lessonsfromthe1918Virus.NEnglJMed2005年；353(21):2209-2211。KostrikisLG,TyagiS,MhlangaMM,HoDD,KramerFR.Spectralgenotypingofhumanalleles.Science1998年；279:1228-1229。KostrikisLGetal.AchemokinereceptorCCR2alleledelaysHIV-IdiseaseprogressionandisassociatedwithaCCR5promotermutation.NatMed1998年；4:350-353。10]Matsuo,T.InsituvisualizationofmessengerRNAforbasicfibroblastgrowthfactorinlivingcells.BiochimBiophysActa1998年；1379:178-184。MinamotoT,MaiM,RonaiZ.K-rasmutation:earlydetectioninmoleculardiagnosisandriskassessmentofcolorectal,pancreas,andlungcancers-areview.CancerDetectPrev2000年；24(1):1-12。PiatekASetal.MolecularbeaconsequenceanalysisfordetectingdrugresistanceinMycobacteriumtuberculosis.NatBiotechnol1998年；16:359-363。SokolDL，ZhangX，LuP,GewirtzAM.RealtimedetectionofDNA隱RNAhybridizationinlivingcells.ProcNatlAcadSciUSA1998年;95:11538-11543。TyagiS，KramerFR.Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization.Nat.Biotechnol196;14:303-308。TyagiS,BratuDP，KramerFR.Multicolormolecularbeaconsforallelediscrimination.Nat.Biotechnol1998年；16:49-53。VetJAMetal.Multiplexdetectionoffourpathogenicretrovirusesusingmolecularbeacons.ProcNatlAcadSciUSA1999年；96:6394-6399。Xiang-HongPeng,Ze-HongCao，Jin-TangXia,GrantW.Carlson,MelindaM.Lewis,W川iamC.Wood,andUlyYang.CabcerRes2005年；65:(5),1909-1917。權(quán)利要求1.檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變以對生命體進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的方法，包含以下步驟:a)從所述生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細(xì)胞；b)用有機(jī)溶劑固定所述樣品；c)將分子信標(biāo)加入到所述樣品中；和d)觀察添加了分子信標(biāo)的結(jié)果以檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變，其中所述的分子信標(biāo)與一個或多個細(xì)胞中的疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測到的信號。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包含在所述觀察步驟前用染料對一個或多個細(xì)胞中的至少一個細(xì)胞核進(jìn)行染色的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中實施所述的添加分子信標(biāo)和觀察結(jié)果的步驟的時間不超過2小時。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中染色的結(jié)果用包括顯微鏡、FACS掃描儀、ELISA平板讀出器、閃爍計數(shù)器和任意它們的組合中的一種的儀器;^測。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分子信標(biāo)檢測傳染病細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的傳染病包括流感病毒疾病。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的流感病毒包括流感病毒A。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的流感病毒A包括16H或9N林中的一種，和它們的任何組合。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的流感病毒選自包括流感病毒A、流感病毒AH5、流感病毒AN1、流感病毒B和任何它們的組合的組。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分子信標(biāo)檢測癌細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所迷的癌癥選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結(jié)腸癌、咽喉癌和任何在動物體內(nèi)產(chǎn)生的癌的組。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的突變是疾病標(biāo)記物的點突變和/或缺失。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的疾病標(biāo)記物是靶向治療的生物靶。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的生物靶是表皮生長因子受體基因和/或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所迷的表皮生長因子受體基因包含表皮生長因子受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的缺失突變。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分子信標(biāo)含有單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苦酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:l-ll和任何它們的組合的組的核苷酸序列。17.檢測生命體中的癌細(xì)胞的方法，包含以下步驟a)從生命體中獲得含有一個或多個細(xì)胞的樣品；b)用有機(jī)溶劑固定所述樣品；c)將分子信標(biāo)添加到所述樣品中；和d)觀察添加了分子信標(biāo)的結(jié)果以檢測所述樣品中的癌細(xì)胞，其中所述分子信標(biāo)與樣品中一個或多個細(xì)胞中的癌細(xì)胞標(biāo)記物相關(guān)的RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，還包括在所述觀察步驟前用染料對樣品中的一個或多個細(xì)胞中的細(xì)胞核進(jìn)行染色的步驟。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是丙酮、乙醇、曱醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種。20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑固定的樣品在所述添加所述分子信標(biāo)前用Triton處理。21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述分子信標(biāo)包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核香酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:1-7和任何它們的組合的組的核苦酸序列。22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的癌細(xì)胞選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結(jié)腸癌、咽喉癌和任何在動物體內(nèi)產(chǎn)生的癌的組。23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的癌細(xì)胞顯示了癌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物中至少一個點突變和/或缺失。24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的樣品是組織切片、活組織檢查的抽吸液、血液和體液中的剝脫細(xì)胞中的一種。25.檢測生命體中流感病毒感染的細(xì)胞的方法，包含以下步驟a)從所述生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細(xì)胞；b)用有機(jī)溶劑固定所述樣品；c)將分子信標(biāo)加入到所迷樣品中；d)觀察結(jié)果以;險測所述樣品中的流感病毒感染的細(xì)胞，其中所述的分子信標(biāo)與至少一個細(xì)胞中的流感病毒標(biāo)記物相關(guān)的RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，還包含在所述的觀察步驟前用染料對一個或多個細(xì)胞中的至少一個細(xì)胞核進(jìn)行染色的步驟。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑固定的樣品在添加所述分子信標(biāo)前用Triton處理。29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述分子信標(biāo)含有單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苦酸探針，所迷探針含有選自包括SEQIDNOs:8-l1和任何它們的組合的組的核苷酸序列。30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的流感病毒包含禽流感病毒。31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的流感病毒是流感病毒A或流感病毒B。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的流感病毒A包括16H和9N抹中的一種，和它們的任何組合。33.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中一個或超過一個的探針同時添加到所述樣品中。34.檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變以對生命體進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的方法，包含以下步驟a)從所述生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細(xì)胞；b)用有機(jī)溶劑固定所述樣品；c)將分子信標(biāo)添加至所述樣品中；d)觀察添加了分子信標(biāo)的結(jié)果以;險測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變，其中所述分子信標(biāo)與細(xì)胞中疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)的RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，還包含在所述觀察步驟前用染料對樣品中一個或多個細(xì)胞中的細(xì)胞核進(jìn)行染色的步驟。36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中進(jìn)行添加分子信標(biāo)和觀察所述結(jié)果的時間不超過2小時。37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是丙酮、乙醇、曱醇、曱醛、多聚曱酪、丁醇和任何它們的組合中的一種。38.分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)包含單鏈發(fā)夾形結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，所述探針含有與疾病細(xì)胞中的疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苦酸序列。40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的寡核苷酸探針具有能與癌細(xì)胞中編碼表皮生長因子受體基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的寡核苷酸探針包含5'端的熒光基團(tuán)和3'端的猝滅物，或3'端的熒光基團(tuán)和5'端的猝滅物。42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的疾病細(xì)胞是癌細(xì)胞或傳染病細(xì)胞中的一種。43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的疾病細(xì)胞感染流感病毒。44.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的流感病毒是流感病毒A或流感病毒B。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的分子信標(biāo)，其中所述的流感病毒A包括16H和9N抹中的一種，和任何它們的組合。46.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的疾病細(xì)胞是癌細(xì)胞。47.檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變以對生命體進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的診斷試劑盒，包含a)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)；和b)說明書。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的寡核苷酸探針含有能與癌細(xì)胞中編碼表皮生長因子受體基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核芬酸序列。50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的試劑盒包含超過一個的寡核苦酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:1-7的組的核苦酸序列。51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的試劑盒包含超過一個的寡核苦酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:8-11的組的核苷酸序列。52.根據(jù)權(quán)利要求47所述的診斷試劑盒，其中從將所述分子信標(biāo)添加到樣品中至從中觀察到結(jié)果所進(jìn)行的診斷過程的時間不超過2小時。53.根據(jù)權(quán)利要求38所述的分子信標(biāo)，其中所述的寡核苷酸探針含有能與編碼通用癌癥標(biāo)"^己物的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。54.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分子信標(biāo)能與表皮生長因子受體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。55.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分子信標(biāo)能檢測耐藥癌癥和/或耐藥病原體。全文摘要本發(fā)明公開了用于檢測疾病標(biāo)記物的感染和/或表達(dá)或突變以進(jìn)行診斷和藥物基因組研究的分子信標(biāo)。所述分子信標(biāo)能與從生命體獲得的樣品中的疾病標(biāo)記物的疾病相關(guān)RNA或DNA雜交，從而發(fā)射不需信號放大即可檢測的信號。疾病標(biāo)記物包括特異于病原體包括流感病毒、癌細(xì)胞標(biāo)記物和對耐藥癌癥和傳染病原體的耐藥性相關(guān)的基因突變標(biāo)記物的基因序列。為了檢測疾病細(xì)胞，從生命體獲得含有一個或多個細(xì)胞的樣品，并用有機(jī)溶劑固定。然后將分子信標(biāo)加入到樣品中，隨后對樣品中細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色。信號用顯微鏡、FACS掃描儀、ELISA平板讀出器、閃爍計數(shù)器或任何它們的組合進(jìn)行檢測。文檔編號C12Q1/68GK101384730SQ200680053274公開日2009年3月11日申請日期2006年12月22日優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日發(fā)明者周成春,奧古斯丁·林,楊泮池申請人:阿爾維德醫(yī)藥技術(shù)公司