專利名稱：：BAK缺陷型以及BAK和BAX缺陷型哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mRNA干擾酶誘導(dǎo)的凋亡的抑制的制作方法BAK缺陷型以及BAK和BAX缺陷型哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mRNA干擾酶誘導(dǎo)的凋亡的抑制交叉參考相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求標(biāo)題為"腿/BIKRegulatesBAK-mediatedApoptosisInducedbyInhibitionofProteinSynthesis"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/817,273(2006年7月29日提交的)和標(biāo)題為"InhibitionofmRNAinterferase-inducedapoptosisinBAK-deficientandBAK-andBAX-deficientmammaliancells"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/710，900(2005年8月24日提交的)的優(yōu)先權(quán)的利益，所述臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容在此引用作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及mRNA干擾酶(interferase)誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡的調(diào)控。發(fā)明背景凋亡是從線蟲至脊推動(dòng)物的生物中的遺傳上協(xié)調(diào)和保守的細(xì)胞死亡過(guò)程(Adams,J.M.，GenesDev.17:2481-2495(2003);Danial，N.N.，和Korsmeyer，S.J.Cell116:205-219.(2004))。其對(duì)于胚胎發(fā)育過(guò)程中復(fù)雜的多細(xì)胞組織的成功構(gòu)建和對(duì)于成年生物中的正常纟田胞動(dòng)態(tài)平衡(normalcellularhomeostasis)的維持是必需的，而且也是消除由應(yīng)激或病原體感染損傷的細(xì)胞所必需的(White,E.CellDeathDiffer.13:1-7(2006))。凋亡調(diào)控的臨界點(diǎn)受Bel-2家族成員控制。Bcl-2蛋白家族可基于Bel-2同源性(BH1-4)結(jié)構(gòu)域的保守性分為三個(gè)不同的亞類多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bel-Mc卜l、Bcl-W和Bfl-l/Al)、多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白(BAX和BAK)和BH3-only促凋亡蛋白(BID、BAD、BIM、PUMA、NOXA和NBK/BIK)((Adams，J.M.，GenesDev.17:2481-2495(2003);Danial，N.N.，和Korsmeyer,S.J.Cell116:205—219.(2004);Gelinas，C.，和WhiteE.GenesDev.19:1263—1268(2005);WilHs，S.N.，和Adams,J.M.Curr.Opin.inCellBiol.17:1-9(2005))。值得注意的是，BH3-only蛋白不能殺死缺少BAX和BAK的細(xì)胞，這表明BH3-only蛋白處于BAX和BAK的上游并且依賴于BAX和BAK(Zong，W.Y.，等人，GenesDev.15:1481-1486(2001))。促凋亡BH3-only蛋白是由細(xì)胞因子缺失、激活的癌基因、DM損傷、化學(xué)療法和Y輻射誘導(dǎo)的死亡的最上游的介體(Li，H.，等人，Cell94:491-501(1998);Luo，X.,等人，Cell94:481-490.(1998))。BIM是紫杉烷反應(yīng)的決定子(Boui1let,P.，等人,Science286:1735-1738(1999);.Tan，T.T，等人，CancerCell7:227-238(2005))，PUMA和NOXA是p53誘導(dǎo)的凋亡的中心介體(Jefferes，J.R.，等人，CancerCell4:321-328(2003);.Shibue，T，等人GenesDev.17:2233-2238.(2003);Vi1lunger,等人，Science302:1036-1038(2003))，BAD調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的凋亡(Datta，S.R.，等人，Mol.Cell6:41-51(2000);Datta，S.R.等人Dev.Cell3:631-643.(2002))。相反地，未詳盡地表征特異性觸發(fā)NBK/BIK介導(dǎo)的凋亡途徑的細(xì)胞反應(yīng)。如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一樣，細(xì)菌細(xì)胞也調(diào)控細(xì)胞的死亡。在大腸桿菌中，通過(guò)稱為"成癮模塊(addictionmodules)"或"毒素-抗毒素模塊(toxin-antitoxinmodules)"的獨(dú)特遺傳系統(tǒng)介導(dǎo)生長(zhǎng)抑制和隨后的細(xì)胞死亡，所述遺傳系統(tǒng)由成對(duì)的編碼兩個(gè)組分的基因組成，一個(gè)編碼穩(wěn)定的毒素，另一個(gè)編碼不穩(wěn)定的抗毒素(Engelberg-Kulka等人，TrendsMicrobiol.12:66-71(2004);GerdesK.等人Nat.Rev.Microbiol.3:371-382(2005))?？苟舅睾投舅赝ǔＴ谙嗤牟倏v子中表達(dá)(稱為"成癮模塊"或"抗毒素-毒素系統(tǒng)")，抗毒素與毒素的復(fù)合物或單獨(dú)的抗毒素自身負(fù)調(diào)節(jié)它們的表達(dá)和功用。當(dāng)抗毒素和毒素的共表達(dá)被抑制，抗毒素很快地被特定的蛋白酶降解，從而使得毒素能夠?qū)ζ浒挟a(chǎn)生作用。已報(bào)導(dǎo)用于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的這樣的遺傳系統(tǒng)存在于許多大腸桿菌染色體外因子中(Gerdes，K.等人Nat.Rev.Microbiol.3:371-382(2005))。大腸桿菌染色體上的一個(gè)成癮模塊邁az^F系統(tǒng)由兩個(gè)位于re/A基因下游的相鄰基因邁a^"和邁a^P組成(Aizenman，E.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:6059-6063(1996))。MazF是在ACA序列上特異性切割單鏈RNA(ssRNA)的序列特異性核糖核酸內(nèi)切酶。"核糖核酸內(nèi)切酶"是在核酸鏈內(nèi)的位置上特異性切割核酸的大類酶中的一類酶。核糖核酸內(nèi)切酶或核糖核酸酶對(duì)于RNA是特異性的。MazF稱為mRM干擾酶，因?yàn)槠渲饕陌惺求w內(nèi)信使RNA(mRNA)。MazF是穩(wěn)定的毒素，而MazE是被ChpPA(ATP依賴性絲氨酸蛋白酶)快速地降解的不穩(wěn)定的抗毒素(Aize纖n，E.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:6059-6063(1996))。最近已證明MazF是序列特異性核糖核酸內(nèi)切酶，該酶在ACA三聯(lián)體序列(tripletsequence)上特異性切割大腸桿菌mRM以阻止蛋白質(zhì)從頭合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和隨后的細(xì)菌細(xì)胞死亡(Zhang，Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。此外，已顯示MazE負(fù)責(zé)拮抗MazF的核糖核酸內(nèi)切酶活性(Zhang,Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003)。該成癮模塊的目的是為編碼其的細(xì)菌提供竟?fàn)幧L(zhǎng)性有利方面。如在細(xì)菌中一樣，由核糖核酸酶介導(dǎo)的RNA切割、使用抗生素的翻譯沉默(translationsilencing)或病原體感染誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成的抑制導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡。響應(yīng)病毒感染，干擾素激活切割18S和28S核糖體RNA的RNA酶L，這抑制了蛋白質(zhì)的合成，最終誘導(dǎo)由細(xì)胞色素c釋放和caspase-3激活介導(dǎo)的凋亡，從而消除病毒感染的細(xì)胞(Silverman,R.H.，Biochemistry42:1805-1812(2003);Xiang，Y，等人,CancerRes.63:6795-6801(2003)。病毒產(chǎn)生的雙鏈RM(dsRNA)激活RNA激活的蛋白激酶(PKR)，該激酶磷酸化真核超始因子2(elF-2)，從而抑制mRM翻譯，導(dǎo)致凋亡(Gi1和Esteban，M..Apoptosis5:107—114(2000))。反過(guò)來(lái)，病毒已進(jìn)化出通過(guò)使得能夠進(jìn)行病毒而不是宿主的蛋白質(zhì)合成(Barzilai，A.,等人，J.Virol.80:505-513(2005))和通過(guò)抑制凋亡(White,E.，CellDeathDiffer.13:1-7(2006);Roulston，A.，等人，A匪.Rev.Microbiol.53:577-628.(1999))來(lái)逃避這些和其他宿主的防御的機(jī)制。例如腺病毒編碼阻斷干擾素介導(dǎo)的基因表達(dá)、抑制PKR激活和阻止凋亡的因子(Roulston,A，，等人，Annu.Rev.Microbiol.53:577-628.(1999);Cuconati，A.，和White,E.GenesDev.16:2465-2478.(2002))。這允許病毒而非細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成而不導(dǎo)致細(xì)胞死亡。最后，抗生素例如亞胺環(huán)己酮(CHX)、噤呤霉素和依米丁是用(anti-bacterialarsenal)的部分(Meijerman，I.，等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.156:46-55.(1999))。盡管通過(guò)各種方法對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制是獲得選擇性有利方面的共同武器，和已知該抑制激活哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡反應(yīng)，但用于激活凋亡的途徑是未知的。已證明細(xì)菌毒素MazF正如在細(xì)菌中一樣在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞mRNA的顯著降解和蛋白質(zhì)合成的抑制。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MazF的表達(dá)引起caspase-3的激活和多(ADP-核糖)聚合酶("PARP")的斷裂，這是凋亡細(xì)胞死亡的標(biāo)志，這一切都被抗毒素MazE阻斷。有趣地，bax和/或bak缺陷型或BH3-only促凋亡基因(puma、bim、noxa和nbk/bik)缺陷型永生化幼鼠腎("iBMK")細(xì)胞中MazF的表達(dá)顯示NBK/BIK和BAK是MazF誘導(dǎo)的凋亡所必需的。此外，BAX和BAK、BAK或NBK/BIK缺陷賦予對(duì)由環(huán)已酰亞胺導(dǎo)致的蛋白質(zhì)合成抑制或由病毒感染誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的中斷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成的中斷通常是細(xì)胞對(duì)病原體的反應(yīng)，因此這意味著NBK/BIK和BAK特異性凋亡途徑可控制該過(guò)程。附圖概述圖l顯示MazF的表達(dá)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞mRNA的降解。(A)人GAPDH和p肌動(dòng)蛋白的Northern印跡分析。用32P標(biāo)記的人GAPDH和P肌動(dòng)蛋白cDM探測(cè)來(lái)自指定的時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞的總RNA。通過(guò)瓊脂糖-甲醛凝膠電泳然后進(jìn)行溴化乙錠染色來(lái)顯示28S和18S核糖體RNA。(B)mRNA水平的量。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR定量人GAPDH和P肌動(dòng)蛋白mRNA水平。根據(jù)第24、48和72小時(shí)的樣品中的熒光信號(hào)與對(duì)應(yīng)的第0小時(shí)的樣品的比較來(lái)計(jì)算mRNA的相對(duì)量。圖2顯示MazF抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的合成。(A)T-Rex-293細(xì)胞中"S-甲硫氨酸的整合。將來(lái)自指定時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的T-Rex-293細(xì)胞的"S-曱硫氨酸標(biāo)記的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和放射自顯影法(左)和用考馬斯藍(lán)染色(右)。(B)35S-甲硫氨酸標(biāo)記的蛋白的定量。使用PhosphoimagerSTORM860(Moleculardynamics)掃描(A)中凝膠上的蛋白條帶，然后計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度。圖3顯示MazF誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡細(xì)月包死亡。(A)四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞的相差照片(放大率IOOX)。(B)(A)中的T-Rex-293細(xì)胞的存活率分析。將指定的時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞進(jìn)行錐藍(lán)排除法(trypanblueexclusion)。存活率表示為時(shí)間為0時(shí)的總細(xì)胞的百分比。(C)說(shuō)明在四環(huán)素處理的T-Rex-293細(xì)胞中通過(guò)FACS測(cè)量的多典化丙錠標(biāo)記的代表性例子。(D)來(lái)自T-Rex-293細(xì)胞的裂解物的Western印跡分析。使用抗活性caspase-3抗體(上)、抗PARP抗體(中)和抗肌動(dòng)蛋白抗體(下)免疫印跡來(lái)自指定時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的或星形孢菌素(staurosporine)處理的T-Rex-293細(xì)胞的完全細(xì)胞裂解物。圖4顯示BCL-2家族蛋白的水平在MazF的誘導(dǎo)期間保持恒定。使用特異性識(shí)別圖中指示的抗凋亡和促凋亡蛋白的抗體免疫印跡來(lái)自四環(huán)素處理的T-Rex-293細(xì)胞的完全細(xì)胞裂解物。圖5顯示BAK的功能是MazF誘導(dǎo)的凋亡所需要的。(A)瞬時(shí)表達(dá)MazF的iBMK細(xì)胞的存活率。將瞬時(shí)共LacZ和MazF的W2、D3、X2和Kl細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第48小時(shí)進(jìn)行P半乳糖苷酶測(cè)定法。將P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞計(jì)算為其總細(xì)胞的百分比。(B)iBMK細(xì)胞中的被激活的caspase-3的免疫熒光。用抗Xpress和抗活性caspase-3抗體共染色瞬時(shí)共表達(dá)LacZ和MazF和/或MazE的W2、D3、X2或Kl細(xì)胞。FITC(綠色)和羅丹明(紅色)染色分別表示細(xì)胞表達(dá)LacZ和激活的caspase-3。數(shù)字表示激活的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。白色箭頭標(biāo)示來(lái)自匹配FITC染色的細(xì)胞的對(duì)應(yīng)的激活的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。(C)瞬時(shí)共表達(dá)MazF和MazE的iBMK細(xì)胞的存活率。將瞬時(shí)共表達(dá)LacZ和MazF和/或MazE的W2、D3、X2和Kl細(xì)胞進(jìn)行P半乳糖苷酶測(cè)定法。如上所述計(jì)算P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞。圖6顯示NBK/BIK介導(dǎo)MazF或CHX誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。(A)瞬時(shí)表達(dá)MazF的iBMK細(xì)胞的存活率。將共表達(dá)LacZ和MazF的/76ir/62T/_、6//zTA、或p咖a—iBMK細(xì)胞進(jìn)行P半乳糖苷酶測(cè)定法。將P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞計(jì)算為其總細(xì)胞的百分比。(B)和(C)，CHX處理的iBMK細(xì)胞的存活率。將用CHX處理的W2、D3、X2和K1細(xì)胞(B)和/26ir/6/irv"B、6/'/zv—、"on—或/7咖a—A細(xì)胞(C)進(jìn)行MTT測(cè)定法。(D)和(E)，TNF-cc/CHX和紫杉醇處理的iBMK細(xì)胞的存活率。將用TNF-oc/CHX(0.05jug/ml)(D)和紫杉醇(E)處理的W2、D3和三個(gè)獨(dú)立的〃細(xì)胞系(A、B和C)進(jìn)行MTT測(cè)定法。圖7顯示NBK/BIK介導(dǎo)腺病毒誘導(dǎo)的凋亡。(A)腺病毒感染的iBMK細(xì)胞的相差照片(放大率IOOX)。(B)來(lái)自病毒感染的iBMK細(xì)胞的裂解物的Western印跡分析。用抗活性caspase-3抗體(上)、抗E1A抗體(中)和抗肌動(dòng)蛋白抗體(下)免疫印跡來(lái)自模擬物、Ad5d/309或Ad5cT/337感染的W2、D3和"Wr/Wi+B細(xì)胞的完全細(xì)胞裂解物。(C)蛋白質(zhì)合成中斷誘導(dǎo)的凋亡途徑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了選擇性調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡的方法，所述方法包括步驟(a)制備包含分離的編碼mRNA干擾酶多肽、mRM干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的核酸序列的第一表達(dá)載體；(b)制備包含分離的編碼mRNA干擾酶拮抗劑多肽、mRNA干擾酶拮抗劑多肽的衍生物或mRNA干擾酶拮抗劑多肽的片段的核酸序列的笫二表達(dá)栽體；(c)將第一表達(dá)栽體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；(d)任意地將第二表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；(e)選擇性地誘導(dǎo)編碼mRM干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的第一表達(dá)載體表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，和(f)任意地選擇性地誘導(dǎo)編碼mRNA干擾酶拮抗劑多肽、mRNA干擾酶拮抗劑多肽的4汙生物或mRNA干擾酶拮抗劑多肽的片段的第二表達(dá)載體表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體各自進(jìn)一步包含至少一個(gè)調(diào)控序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)調(diào)控序列是至少一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一表達(dá)載體中的至少一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效連接至編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二表達(dá)栽體中的至少一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效連接至編碼mRNA干擾酶拮抗劑多肽、mRNA干擾酶拮抗劑多肽的4汙生物或mRNA干擾酶拮抗劑多肽的片段的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)raRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段識(shí)別細(xì)胞信使RNA中的至少一個(gè)第一mRNA干擾酶識(shí)別序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)第一mRNA干擾酶識(shí)別序列是腺噪呤-胞嗜啶-腺嘌呤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，mRM干擾酶多肽是原核細(xì)胞多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，mRNA干擾酶多肽是真核細(xì)胞多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中mRNA干擾酶多肽是尬z尸。在另一個(gè)實(shí)施方案中mRNA干擾酶拮抗劑多肽是原核細(xì)胞多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中mRNA干擾酶拮抗劑多肽是^z凡在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是Bak缺陷型。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是Bak和Bax缺陷型。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞被病原體感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中病原體是細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或朊病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是已分化的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中已分化的細(xì)胞是肌細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、曱狀腺細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或感覺(jué)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是免疫細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是遺傳損傷的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是毒素?fù)p傷的細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中保持編碼fiiRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的方法，所述方法包括步驟(a)制備包含編碼mRM干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的表達(dá)載體；和(b)將該表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡途徑被阻斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在步驟(b)后進(jìn)一步包括誘導(dǎo)mRNA干擾酶多肽、niRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段表達(dá)的步驟(c)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體還包含至少一個(gè)調(diào)控序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)調(diào)控序列是至少一個(gè)有效連接至編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的核酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，mRM干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，識(shí)別細(xì)胞信使RNA中的至少一個(gè)inRNA干擾酶識(shí)別序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)mRM干擾酶識(shí)別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，mRM干擾酶多肽是原核細(xì)胞多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中mRNA千擾酶多肽是MazF。在另一個(gè)實(shí)施方案中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是BAK缺陷型、NBK/BIK缺陷型、或BAK缺陷型和NBK/BIK缺陷型。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含分離的編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中至少一個(gè)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡途徑被阻斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRM干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體還包含至少一個(gè)調(diào)控序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)調(diào)控序列是至少一個(gè)有效連接至編碼mRM干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的4汙生物或mRNA干擾酶多肽的片段的核酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的4汙生物或mRNA干擾酶多肽的片段識(shí)別細(xì)胞信使RNA中的至少一個(gè)mRNA干擾酶識(shí)別序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)mRNA干擾酶識(shí)別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺噤呤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，mRNA干擾酶多肽是原核細(xì)胞多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中mRNA干擾酶多肽是MazF。在另一個(gè)實(shí)施方案中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是BAK缺陷型、NBK/BIK缺陷型、或BAK缺陷型和NBK/BIK缺陷型。發(fā)明詳述下列定義列出了本發(fā)明的參數(shù)?？s寫"ACA"是指序列腺噪呤-胞嘧啶-腺噪呤。此處使用的術(shù)語(yǔ)"凋亡"是指包括程序化的系列事件的正常細(xì)胞過(guò)程，通過(guò)所述過(guò)程，單個(gè)細(xì)胞以有序的、高度受控的方式死亡而不釋放有害的物質(zhì)至周圍區(qū)域。其與壞死(細(xì)胞死亡的另一種方式)不同，所述壞死是不可逆損傷后進(jìn)行的退化現(xiàn)象。凋亡細(xì)胞的特征可以在于由稱為caspase的半胱氨酸蛋白酶家族協(xié)調(diào)的特定形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變。在形態(tài)學(xué)上，凋亡包括核染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的凝縮、細(xì)胞核的片段化和整個(gè)細(xì)胞的出芽，從而產(chǎn)生其中細(xì)胞器完整如初的膜結(jié)合的小體。這些小體被相鄰的細(xì)胞消除而不發(fā)生炎癥。在生物化學(xué)上，在凋亡中，與在壞死中觀察到的隨機(jī)DNA降解不同，存在DNA的特征性核小體間斷裂。在分子水平上，凋亡受到高度調(diào)控。存在導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡的兩條主要途徑，即死亡受體途徑(也稱為外途徑)和線粒體(內(nèi))途徑。據(jù)認(rèn)為死亡受體途徑包括死亡受體的相互作用，即至少5個(gè)屬于TNF(腫瘤壞死因子)/NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)-受體超家族(由Timmer等人，J.Pathol.196(2):125-34(2002)綜述的)的跨膜受體中的一個(gè)例如腫瘤壞死因子(TNF)受體-1或膜結(jié)合細(xì)胞表面Fas受體與其配體的相互作用。一般認(rèn)為Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡成員調(diào)控第二途徑或線粒體途徑(所述途徑依賴于線粒體的參與)。線粒體膜的透化和細(xì)胞色素c的釋放介導(dǎo)線粒體途徑。細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)促凋亡Bcl-2家族成員從細(xì)胞溶膠轉(zhuǎn)移至線粒體，在線粒體中它們誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，而抗凋亡Bc卜2蛋白阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放，從而使細(xì)胞保持存活。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞色素c催化凋亡蛋白酶激活因子-l寡聚化，從而促進(jìn)procaspase-9的激活，然后激活的procaspase-9激活procaspase-3。BAX和/或BAK是線粒體膜透性和內(nèi)凋亡途徑的功能所必需的。除了它們的線粒體相關(guān)性功能外，BAX和BAK也在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中局域化并且起始caspase(caspase12)激活和凋亡的平行途徑。(Zong等人，JCellBiol.162(1):59-69(2003))?？蛇x擇地，死亡受體如腫瘤壞死因子受體-和Fas受體的連接引起procaspase-8的激活。成熟的caspase可直接激活procaspase-3或切割促凋亡BH3-only蛋白BID，這隨后誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放。大多數(shù)細(xì)胞使用BID介導(dǎo)的BAX和BAK激活以增強(qiáng)外途徑。任一途徑的最終結(jié)果是caspase的激活和特定細(xì)胞底物的切割，從而導(dǎo)致與凋亡表型相關(guān)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變。此處使用的術(shù)語(yǔ)"異常凋亡"是指過(guò)度凋亡或指凋亡不足。異常凋亡可以是有害的并且可引起或促成各種疾病、病癥、綜合征、病狀或損傷。例如，無(wú)限制的、異常凋亡與癌癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退化性疾病(neurodegenerativedisorder)(包括亨廷頓舞蹈病、阿耳茨海默(氏)病和猝中)相關(guān)。此處使用的術(shù)語(yǔ)"疾病"或"病癥"是指對(duì)健康的損害或異常功能的狀況。術(shù)語(yǔ)"綜合征"，如此處所用的，是指標(biāo)示一些疾病或狀況的癥狀的模式。此處使用的術(shù)語(yǔ)"損傷"是指由外部試劑或力量引起對(duì)身體的結(jié)構(gòu)或功能的損傷或傷害，其可以是物理的或化學(xué)的損傷。此處使用的術(shù)語(yǔ)"狀況"是指許多種疾病狀態(tài)或表示包括由任何背后的^/L制、病癥或損傷引起的病癥或疾病。本發(fā)明提供了用于選擇性(表示優(yōu)先于另一種或其他的選擇、挑選)調(diào)控耙哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡的方法。在一些實(shí)施方案中，此處描述的方法誘導(dǎo)靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。在一些實(shí)施方案中，此處描述的方法用于抑制靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。在一些實(shí)施方案中，靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞可被病原體(是指破壞細(xì)胞的正常生理和引起疾病癥狀的媒介物)例如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲或朊病毒感染。在一些實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是已分化的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中革6哺乳動(dòng)物細(xì)胞是肺瘤細(xì)胞，包括但不限于，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是遺傳上受到損傷的細(xì)胞，即其細(xì)胞損傷的類型導(dǎo)致可沿續(xù)傳遞給其后代的變化的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中靶細(xì)胞是毒素?fù)p傷的細(xì)胞，意指暴露于天然發(fā)生的或合成的物質(zhì)并被其損傷的細(xì)胞，所述物質(zhì)當(dāng)導(dǎo)入活組織時(shí)是有毒性的[意指有毒的、致癌的或?qū)ι苯佑泻Φ腯。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是具有異常凋亡的免疫細(xì)胞，本發(fā)明的方法用于恢復(fù)正常的免疫系統(tǒng)功能。術(shù)語(yǔ)"拮抗劑，，和"抑制劑"在此處可互換使用，是指阻止、減少、阻斷、中和或抵消另一種試劑的效應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"Bcl-2蛋白"("B-細(xì)胞淋巴瘤2蛋白")是指調(diào)節(jié)凋亡途徑的一個(gè)或多個(gè)組分的活性的跨膜蛋白的家族。不受理論的限制，其主要作用機(jī)制據(jù)認(rèn)為是調(diào)節(jié)線粒體的膜透性。該家族的一些成員是促凋亡的，而其他成員是抗凋亡的。此處使用的術(shù)語(yǔ)"促凋亡"是指促進(jìn)細(xì)胞死亡的活性、組分或效應(yīng)。Bcl-2超家族的促凋亡成員據(jù)認(rèn)為增加線粒體的膜透性。此處使用的術(shù)語(yǔ)"抗凋亡"是指至少部分通過(guò)對(duì)抗該線粒體膜透性的增加來(lái)抑制凋亡的活性、組分和效應(yīng)。BCL-2家族分為三個(gè)亞家族，其共有一些稱為BCL-2同源性(或BH)區(qū)域的同源性區(qū)域。始于氨基末端(N)，從左至右朝向C末端("C)移動(dòng)，BH區(qū)域排列如下N-BH4-BH3-BH1-BH2-TM-C，其中TM是指跨膜區(qū)(transmembranespanningregion)。Bcl-2亞家族包括但不限于Bc卜2、Bel-xL、Bcl-w和MCL-l。它們是抗凋亡的，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。此處使用的術(shù)語(yǔ)"Mcl-l"(髓細(xì)胞性白血病序列l(wèi))是指最初分離自人髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞的Bcl-2相關(guān)性抗凋亡蛋白。BH3-only蛋白(1)激活BAX和BAK，和(2)拮抗抗凋亡蛋白如BCL-2以誘導(dǎo)凋亡。Bc卜2蛋白的BAX亞家族包括BAX和BAK。這些蛋白是促凋亡的，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡。它們?cè)贐H1、BH2和BH3區(qū)域但非BH4區(qū)域中顯示與Bcl-2亞家族的序列同源性。由于其與Bc卜2的廣泛同源性，BAX可與Bel-2形成異二聚體。BAX的同二聚體或異二聚體抑制Bcl-2的抗凋亡活性。BH3-only亞家族包括BAD和BID蛋白，其為促進(jìn)細(xì)胞死亡的促凋亡蛋白。它們只在BH3區(qū)域與Bcl-2亞家族共有序列同源性。BID也缺乏跨膜區(qū)。術(shù)語(yǔ)"Bim"是指Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員，所述成員在通過(guò)BH1-3多結(jié)構(gòu)域蛋白BAX或BAK的激活的線粒體凋亡途徑中起著必需的作用。"NBK/Bik"表示"天然發(fā)生的殺傷蛋白/Bel-2相互作用殺傷蛋白，，，其表示促凋亡Bcl-2相關(guān)蛋白。術(shù)語(yǔ)"PUMA"("p53上調(diào)的凋亡介體)是指在p53的下游和在p53缺陷型細(xì)胞中起作用的p53的促凋亡BH3-only轉(zhuǎn)錄靶。p53是細(xì)胞周期相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制劑，其促進(jìn)誘導(dǎo)響應(yīng)DM損傷或其他細(xì)胞應(yīng)激的細(xì)胞周期停滯或凋亡的基因的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)證據(jù)不支持PUMA對(duì)p53的結(jié)合作為凋亡誘導(dǎo)的機(jī)制。下表(根據(jù)Antonsson,CellTissueRes.，306(3):347-61(2001)和Zhang等人HuMolec.Genet10(21):2329-39(2001)修改的)是已知的bcl-2蛋白家族的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>此處使用的術(shù)語(yǔ)"caspases"是指在恰好C末端至天冬氨酸殘基的位置上選擇性切割蛋白質(zhì)并且在凋亡期間通過(guò)切割許多細(xì)胞蛋白負(fù)責(zé)細(xì)胞分解的半胱氨酸蛋白酶的家族。以無(wú)活性的、隨后通過(guò)蛋白水解切割成活性caspases的procaspase形式合成caspases。促凋亡調(diào)控劑(例如，BAX)促進(jìn)caspase的活一化。術(shù)語(yǔ)"cDNA"是指使用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的單鏈互補(bǔ)DM或拷貝DNA。所述單鏈cDNA通常用作鑒定目的DM片段或基因中的互補(bǔ)序列的探針。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"已分化的細(xì)胞"是指已特化進(jìn)行特定功能能力的細(xì)胞。它們包括但不限于肌細(xì)胞(即，經(jīng)特化產(chǎn)生機(jī)械力的細(xì)胞)、腎小管細(xì)胞、肺(肺泡)細(xì)胞、曱狀腺細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、血細(xì)胞(包括但不限于紅細(xì)胞、白細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)和血小板)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元(即，經(jīng)特化用于通訊聯(lián)絡(luò)的細(xì)胞)和感覺(jué)細(xì)胞(表示檢測(cè)外界刺激的細(xì)胞，例如內(nèi)耳的毛細(xì)胞、眼睛的柱細(xì)胞)。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"編碼"、"編譯"或"編碼的"對(duì)于特定的核酸是指貯存在用于翻譯成特定蛋白的核酸中的信息。編碼蛋白的核酸可以在核酸的翻譯區(qū)內(nèi)包含非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)，或可以缺少該插入的非翻譯序列(例如，如在cDNA中一樣)。通過(guò)使用密碼子明確說(shuō)明借以編碼蛋白的信息。通常，通過(guò)由使用"通用"遺傳密碼的核酸編碼氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在編碼的序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的對(duì)核酸、肽、多肽或序列的單個(gè)置換、缺失或添加是"保守性修飾的變體"，其中改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸對(duì)氨基酸的置換。術(shù)語(yǔ)"保守性修飾的變體"用于氨基酸序列和核酸序列。對(duì)于特定的核酸序列，保守性修飾的變體是指編碼相同的氨基酸序列或氨基酸序列的保守性修飾的變體的核酸。因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能等同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG都編碼氨基酸亮氨酸。因此，在每一個(gè)由密碼子確定為亮氨酸的位點(diǎn)上，可將密碼子改變?yōu)樗鰧?duì)應(yīng)密碼子的任一密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異是"沉默變異"，其代表了一類保守性修飾的變異。此處編碼多肽的每一個(gè)核酸序列，參照遺傳密碼，也描述了每一種可能的核酸的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可改變核酸中的各密碼子(除了AUG,其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；和UGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼本發(fā)明的多肽的核酸的各沉默變異在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明包括達(dá)到使該活性部分、片段、衍生物、突變體和功能變體保持mRNA干擾酶的任何生物學(xué)性質(zhì)的程度的該mRNA干擾多肽的活性部分、片段、衍生物、突變體和功能變體。mRNA干擾酶多肽的"活性部分"是指比全長(zhǎng)多肽短但其仍保持可測(cè)量的生物學(xué)活性的肽。mRNA干擾酶的"片段"是指至少5至7個(gè)連續(xù)氨基酸、通常至少大約7至9個(gè)連續(xù)氨基本、通常至少大約9至13個(gè)連續(xù)氨基酸和最優(yōu)選至少大約20至30或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸殘基的片段。mRNA干擾酶的"衍生物"或其片段是指通過(guò)例如通過(guò)操作編碼蛋白的核酸或通過(guò)改變蛋白本身來(lái)改變蛋白的氨基酸序列修飾的多肽。此類氨基酸序列的衍生物可包括插入、添加、缺失或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，和可以改變或可以不改變?cè)糾RNA干擾酶的基本活性。3-磷酸甘油醛脫氫酶此處縮寫為GAPDH。術(shù)語(yǔ)"基因"是指位于DM片段上的特定位置中的編碼特定功能產(chǎn)物(即，蛋白或RNA分子)的有序的核苷酸序列。其可包括處于編碼性DNA之前或之后的區(qū)域以及外顯子之間的內(nèi)含子。此處使用的術(shù)語(yǔ)"免疫細(xì)胞"是指免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，所述細(xì)胞在保護(hù)受試者免受侵入物傷害的過(guò)程中促進(jìn)、警戒、幫助、刺激、包圍、殺死、清除或合成和分泌信使、調(diào)節(jié)劑或輔助物，其包括但不限于清除細(xì)胞(例如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)、天然殺傷(NK)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(包括但不限于B細(xì)胞和T細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)"誘導(dǎo)"或"可誘導(dǎo)的"是指通過(guò)將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)劑或條件來(lái)增加其轉(zhuǎn)錄或合成的基因或基因產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"誘導(dǎo)物，，或"誘導(dǎo)劑"是指與阻遏蛋白結(jié)合以產(chǎn)生不再可結(jié)合操縱基因的復(fù)合物的低分子量化合物或物理試劑。將核酸插入細(xì)胞的背景中的術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入"、"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)導(dǎo)"包括核酸至原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)的整合，其中可將核酸整合入細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或染色體DNA),轉(zhuǎn)移入自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語(yǔ)"分離的"是指基本上不含有當(dāng)在其天然發(fā)生的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)時(shí)通常伴隨其或與其相互作用的組分的材料例如核酸或蛋白。分離的材料任意地包含在其天然環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)與所述材料在一起的材料；或如果材料存在于其天然環(huán)境中，通過(guò)有意的人為干涉通過(guò)合成(非天然地)改變所述材料。例如，"分離的核酸"可包括插入載體例如質(zhì)?；虿《据d體的DNA分子或整合入原核或真核細(xì)胞或宿主生物的基因組DNA內(nèi)的DNA分子。當(dāng)用于RNA時(shí)，術(shù)語(yǔ)"分離的核酸"主要指由上面定義的分離的DNA分子編碼的RNA分子?？蛇x擇地，該術(shù)語(yǔ)可指已與在其天然狀態(tài)中(即，在細(xì)胞或組織中)通常與其結(jié)合的其他核酸充分分離的RNA分子。分離的核酸(DNA或RNA)還可代表由生物學(xué)分離的分子。此處使用的術(shù)語(yǔ)"MazE"是指抗毒素的一般種類，所述抗毒素拮抗MazF和其活性片段和衍生物(所述衍生物具有與本發(fā)明的MazF多肽的作用相符的、對(duì)其結(jié)構(gòu)和序列的同源性)核糖核酸內(nèi)切酶活性。此處使用的術(shù)語(yǔ)"MazF"是指核糖核酸內(nèi)切酶的一般種類，是指具有特定名稱的酶和其活性片段和衍生物(具有與本發(fā)明的MazF多肽的作用相符的、對(duì)其結(jié)構(gòu)和序列的同源性)。本發(fā)明包括的酶家族稱為"mRNA干擾酶，，。希望本發(fā)明擴(kuò)展至具有與本發(fā)明的該酶家族的作用相符的結(jié)構(gòu)和功能相似性的分子。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"核酸"或"核酸分子"包括任何DNA或RNA分子，單鏈的或雙鏈的，如果是單鏈的，包括以線性或環(huán)形形式存在的其互補(bǔ)序列的分子。在討論核酸分子中，此處可按照以5'至3'方向提供序列的常規(guī)描述特定核酸分子的序列或結(jié)構(gòu)。除非另外限定，術(shù)語(yǔ)包括已知的類似物。術(shù)語(yǔ)"操縱基因"是指位于基因上游(50并且與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控蛋白(阻遏物或激活物)結(jié)合以控制該基因表達(dá)的DM區(qū)域。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"操縱子"是指用于控制基因表達(dá)的功能上整合的遺傳單位。其由一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)多肽的基因和通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄控制其表達(dá)的相鄰位置(啟動(dòng)子和操縱基因)組成。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)操縱子"是指可具有轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、翻譯起始信號(hào)、多腺苷酸化信號(hào)、終止子等的的核酸片段以及促進(jìn)多肽編碼序列在宿主細(xì)胞或生物中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸片段。術(shù)語(yǔ)"有效連接"包括啟動(dòng)子與第二序列之間的功能連接，其中啟動(dòng)子序列起始和介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，有效連接的是指被連接的核酸序列是連續(xù)的，當(dāng)必需連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，所述序列是連續(xù)的并且在相同的讀框內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白"此處可互換使用，表示氨基酸殘基的多聚體。術(shù)語(yǔ)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)的天然發(fā)生的氨基酸的人造化學(xué)類似物的氨基酸聚合物和用于天然發(fā)生的氨基酸聚合物?？s寫"PCR，，是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其是用于擴(kuò)增DNA的量從而使MA更容易分離、克隆和進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,656,493、5，33，675、5，234，824和5，187,083,其各自在此引用作為參考。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"包括位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游(50并且參與RNA聚合酶和其他蛋白的識(shí)別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"是指啟動(dòng)子響應(yīng)特定化合物即誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)劑的存在或響應(yīng)確定的外部條件例如提高的溫度的激活。此處使用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)控"是指根據(jù)一些標(biāo)準(zhǔn)或原理進(jìn)行抑制、促進(jìn)、控制、操縱、指導(dǎo)或調(diào)整的作用或被抑制、促進(jìn)、控制、操縱、指導(dǎo)或調(diào)整的狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)"阻遏物"包括結(jié)合基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的特定DNA序列(操縱基因)、可通過(guò)打開(kāi)或關(guān)閉基因來(lái)調(diào)控其的蛋白或試劑。術(shù)語(yǔ)"核糖體RNA"(rRM)是指核糖體(所有活細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)機(jī)器)的中心組分。這些機(jī)器在多種核糖體蛋白存在的情況下自我裝配成兩個(gè)復(fù)雜的折疊結(jié)構(gòu)(大亞基和小亞基)。在細(xì)菌、古細(xì)菌(Archaea)、線粒體和葉綠體中，小亞基核糖體亞基包含16SrRNA，其中16S中的S代表斯維勃格單位；大亞基包含兩種rRNA種類(5S和23SrRNA)。細(xì)菌16S、23S和5SrRNA基因通常組織為共轉(zhuǎn)錄操縱子?；蚪M中可散布一個(gè)或多個(gè)拷貝的該操縱子。真核細(xì)胞通常具有許多拷貝的以串聯(lián)重復(fù)方式組織的rRNA基因。大多數(shù)真核細(xì)胞中的18SrRNA存在于小核糖體亞基中，大亞基包含三種rRNA(5S、5.8S和25S/28SrRM)。術(shù)語(yǔ)"總RNA"包括信使RNA("mRNA"，在其被翻譯成蛋白的細(xì)胞中將來(lái)自DNA的信息攜帶至蛋白質(zhì)合成的核糖體位點(diǎn)的RNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA("tRM"，在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中將特定氨基酸轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)的多肽鏈的小RM鏈)、核糖體RNA("rRNA")和非編碼RNA(也稱為RM基因或小RNA，是指編碼不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA的基因)。術(shù)語(yǔ)"十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳"縮寫為SDS-PAGE。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"或"復(fù)數(shù)形式的干細(xì)胞"可互換使用，表示未分化的細(xì)胞(表示不具有特化的即成熟的結(jié)構(gòu)或功能的細(xì)胞)，所述未分化的細(xì)胞具有高度增殖的潛能和可遷移至損傷區(qū)域并且產(chǎn)生子代細(xì)胞(所述子代細(xì)胞可經(jīng)歷終末分化形成多種獨(dú)特細(xì)胞表型)的自我更新的能力。術(shù)語(yǔ)核酸的特定序列的"變體"、"突變體"和"衍生物"是指生的變化的核酸序列。對(duì)于"緊密相關(guān)"，其是指至少大約60%，但通常超過(guò)85%的序列的核苷酸在確定的核酸序列長(zhǎng)度上匹配。緊密相關(guān)的核酸序列之間的核苷酸序列的變化或差異可代表特定核酸序列的正常復(fù)制或天然加倍過(guò)程中產(chǎn)生的序列的核苷酸改變。可特別地設(shè)計(jì)其他改變并將其導(dǎo)入用于特定目的的序列。使用各種誘變技術(shù)在體外進(jìn)行此類特定的改變。此類特定地產(chǎn)生的序列變體可稱為原始序列的"突變體"或"衍生物"。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣可產(chǎn)生具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失、添加或取代的蛋白質(zhì)變體。此類變體除其他以外可包括(a)其中至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸置換的變體；(b)其中加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的變體；(c)其中至少一個(gè)氨基酸包含取代基的變體；(d)其中來(lái)自一個(gè)物種的氨基酸殘基在保守或非保守性位點(diǎn)取代另一個(gè)物種中的對(duì)應(yīng)殘基的變體；和(d)其中將靶蛋白與可給該靶蛋白賦予有用性質(zhì)的另一種肽或多肽例如融合伴侶、蛋白標(biāo)記或其他化學(xué)部分(例如抗體的表位)融合的變體。獲得此類變體的技術(shù)，包括遺傳(抑制、缺失、突變等)、化學(xué)和酶促技術(shù)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"載體"和"表達(dá)載體"是指復(fù)制子，即用作載體或運(yùn)載體的任何媒介物(例如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、桿粒、噬菌體或病毒)，可將另一個(gè)基因序列或元件(DNA或RNA)附著至其從而使附著的序列或元件復(fù)制和因此可將序列或元件轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞的任何媒介物。必須指出，如此處和所附的權(quán)利要求中使用的，除非上下文明確指出，單數(shù)形式"a"、"和"以及"the"包括復(fù)數(shù)指代物。此處使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有相同的意思。除非明確定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意思相同。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中也可使用類似于或等同于此處描述的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法和材料。此處引用此處提到的所有出版物以公開(kāi)和描述引用的出版物涉及的方法和/或材料。實(shí)施例提供下列實(shí)施例以為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何產(chǎn)生和使用本發(fā)明的完全公開(kāi)內(nèi)容和描述，并且所述實(shí)施例不希望限定本發(fā)明者視作他們的發(fā)明的內(nèi)容的范圍，他們也不希望認(rèn)為下列實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行的所有或僅有的實(shí)驗(yàn)。已對(duì)確保使用的數(shù)字(例如量、溫度等)精確性作出了努力，但應(yīng)當(dāng)解釋一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外指出，部分是按重量計(jì)算的部分，分子量是平均分子量的重量，溫度以攝氏度表示，壓力是在大氣下或接近大氣壓。實(shí)施例1-材料和方法質(zhì)?？寺〖夹g(shù)通常可見(jiàn)于J.Sambrook和D.W.Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManua1，第3版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)，其在此引用作為參考。通過(guò)將MazF編碼區(qū)插入pcDNA4/T0載體(Invitrogen，Carlsbad,CA)的和^co7/位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)型MazF表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/T0/mazF。通過(guò)將MazE編碼區(qū)與用fco7/和A^//降解的pcDNA3栽體(Invitrogen，Carlsbad,CA)連接來(lái)產(chǎn)生MazE表達(dá)質(zhì)粒pc應(yīng)3/mazE。pcDNA6/His/LacZ購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad,CA)。細(xì)胞系將永生化的幼鼠腎("iBMK")細(xì)胞系(W2)和等基因6"—A和6<^A(D3)、6"v—(X2)和^sf7—(Kl)細(xì)胞系(Degenhardt，K.，等人，CancerCell2:193-203(2002);Degenhardt，K"等人，LBiol.Chem.277:14127-14134(2t)02))在38.5。C下在補(bǔ)充有5%胎牛血清(FBS)的醒M(Gibco，Carlsbad,CA)中培養(yǎng)。為建立穩(wěn)定地單獨(dú)表達(dá)MazF或共表達(dá)MazE和MazF的人胚胎腎細(xì)胞系(T-Rex-293),按照廠商i兌明書使用PolyFect轉(zhuǎn)染劑(QIAGENInc，Valencia,CA)用pc廳4/T0/mazF和pcDNA3或pcDNA4/T0/mazF和pcDNA3/mazE共轉(zhuǎn)染用四環(huán)素阻遏物表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA6/TR)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T-Rex-293細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)，然后如下進(jìn)行選擇pcDM6/TR;5g/ml滅痘素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、pcDNA4T0/邁azF;40/yg/mlzeocin(Invitrogen,Carlsbad,CA)和pcDNA3/則zf;0.5//g/ml遺傳霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)和環(huán)形克隆(ringcloning)。選擇一個(gè)單個(gè)的克隆進(jìn)行分析。將兩個(gè)細(xì)胞系T-Rex-293(mazF/pcDM3)和T-Rex-293(mazF/mazE)保持在含有40^g/ml的zeocin、5//g/ml的滅瘟素和Q.5//g/ml的遺傳霉素的10%胎牛血清DMEM中。錐藍(lán)排除法如前面所述(Degenhardt,K.，等人，J.Biol.Chem.277:14127-14134(2002))使用錐藍(lán)排除法確定T-Rex-293細(xì)胞的存活率。在四環(huán)素處理之前培養(yǎng)T-Rex-293(mazF/pcDNA3)和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞24小時(shí)，然后在10〃g/ml四環(huán)素存在或不存在的情況下在37。C下溫育0、24、48和72小時(shí)。處理后，通過(guò)離心上清液和通過(guò)胰蛋白酶消化收獲的粘附細(xì)胞來(lái)收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸浮于500〃1含有0.1。/。錐藍(lán)溶液(Sigma，St.Louis,MO)的新配制的培養(yǎng)基中，然后在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)以估量死亡的藍(lán)色細(xì)胞的數(shù)目和計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)目。作為凋亡細(xì)胞死亡的對(duì)照，與四環(huán)素處理同時(shí)進(jìn)行，用1〃M星孢菌素(Sigma,St.Louis,M0)處理T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞，進(jìn)行相同的時(shí)間。P半乳糖苷酶測(cè)定法如前面所述(Han，J.，Sabbatini，P.，和White,E.Mol.Cell.Biol.16:5857-5864(1996))進(jìn)行確定共表達(dá)LacZ和MazF的iBMK細(xì)胞的存活率的P半乳糖苷酶測(cè)定法。將用pcDNA6/His/LacZ和pcDNA4/T0/mazF或pcDM3共轉(zhuǎn)染48小時(shí)的W2、D3、X2和Kl固定在1%的戊二醛中，然后在37。C用0.2%X-gal溶液染色，進(jìn)行24小時(shí)。在6cm直徑的皿上獨(dú)立地計(jì)數(shù)P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞的數(shù)目和總細(xì)胞數(shù)目(大約200個(gè)細(xì)胞)。MTT測(cè)定法如前面所述(loffe，M.L.,等人，Prostate61:243-247.(2004))進(jìn)行測(cè)量用紫杉醇、CHX或小鼠TNF-oc和CHX兩者處理的iBMK細(xì)胞的存活率的3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測(cè)定法。熒光激活的細(xì)胞分選儀(FACS)分析通過(guò)胰蛋白酶消化收獲用四環(huán)素處理0、24、48和72小時(shí)的T-Rex-293(mazF/pcDNA3)細(xì)月包和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)月包，通過(guò)離心沉淀所述細(xì)胞，然后重懸浮于PBS中。用冰冷的70%乙醇固定細(xì)胞進(jìn)行30分鐘，然后用硪化丙啶(10/^/1111)和RNA酶A(100//g/ml)染色過(guò)夜。在BectonDickinsonFACSCalibur系統(tǒng)(SanJose,CA)中分析所述細(xì)月包。Western印跡法如前面所述(Perez,D.，和White,E.J.CellBiol.141:1255-1266(1998);Perez,D.，和White,E.Mol.Cell6:53-63(2000))進(jìn)行Western印跡和免疫熒光。術(shù)語(yǔ)"Western印跡法"是指鑒定復(fù)雜混合物中的蛋白的方法；在凝膠介質(zhì)中通過(guò)電泳分離蛋白；將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至結(jié)合蛋白的紙或膜；然后將含有分離的蛋白的紙或膜暴露于結(jié)合、定位和使得能夠顯現(xiàn)目的蛋白的特異性抗體。在用四環(huán)素或星形孢菌素處理后第0、24、48和72小時(shí)通過(guò)刮除和離心收獲T-Rex-293(mazF/pc艦3)和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞。在2xLaemmli緩沖液中裂解所有細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞裂解物在15%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至Immobilon-P膜(Millipore，Bedford,MA)。用下列抗體溫育印跡抗活性caspase-3兔多克隆抗體(CellSignalingTechnology,Beverly,MA)、抗BAX、抗BAK兔多克隆抗體(NT)(UpstateBiotechnologyInc.,LakePlacid,NY)、抗BID山羊多克隆抗體(廳Systems,Inc，Minneapolis,MN)、抗Bim兔多克隆抗體(AlexisBiochemical,SanDiego，CA)、抗BCL-2倉(cāng)鼠單克隆抗體(PharMingen，SanDiego，CA)、抗BCL-XL鼠單克隆抗體(Trevigen，Gaithersburg，MD)、抗MCL-1兔多克隆抗體(StressgenBiotechnologies,Victoria,BritishColumbia,Canada)、抗PARP鼠單克隆抗體(PharMingen，SanDiego，CA)、抗PUMA兔多克隆抗體(Nelson,D.A.，等人，GenesDev.18:2095-2107(2004))、抗E1A單克隆抗體、抗肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(OncogeneResearchProducts)和抗Xpress單克隆抗體(Invitrogen)。通過(guò)在細(xì)菌中表達(dá)編碼N末端78個(gè)氨基酸區(qū)域、GST標(biāo)記的人NBK/BIK融合蛋白和免疫兔子(Cocalico)產(chǎn)生針對(duì)人NBK/BIK的抗體。使用ECL系統(tǒng)(Amersham-PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)用辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗顯示W(wǎng)estern印跡。免疫熒光將通過(guò)電穿孔用質(zhì)粒pcDNA6/His〃acZ和pcDNA4/T0/mazF或pcDNA3的混合物共轉(zhuǎn)染的W2、D3、X2和Kl細(xì)胞在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)24小時(shí)，然后在-20。C在100%甲醇中固定10分鐘。在37X:下于1%BSA-PBS中封閉1小時(shí)后，在37。C下用抗活性caspase-3兔多克隆抗體和抗Xpress鼠單克隆抗體(Invitrogen，Carlsbad,CA)溫育蓋玻片上的細(xì)胞1小時(shí)，然后在37。C下用羅丹明綴合的抗兔IgG和FITC綴合的抗鼠IgG抗體溫育1小時(shí)。使用配備熒光落射熒光光學(xué)裝置(epifluorescenceoptics)的NikonFXA顯微鏡(NikonInc.，GardenCity，NY)顯現(xiàn)染色。通過(guò)對(duì)各個(gè)蓋玻片上的50至IOO個(gè)細(xì)胞評(píng)分來(lái)確定對(duì)于活性caspase-3為陽(yáng)性的細(xì)胞的百分比。RNA分析如前面所述(Zhang，Y.，等人，Mol.Cell12:913-923(2003);Cuconati，A.，等人，GenesDev.17:2922-2932(2003))進(jìn)行Northern印跡分析和實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)。通過(guò)4吏用Trizol試劑(GibcoCarlsbad,CA)分離來(lái)自四環(huán)素處理的(0、24、48和72小時(shí))或未處理的(0、24、48和72小時(shí))T-Rex-293(mazF/pcDNA3)和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞的總RNA。為進(jìn)行Northern印跡分析，將來(lái)自各狀況的10|ag總RNA進(jìn)行曱醛-瓊脂糖凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至GeneScreenPlus膜(麵UfeScienceProducts,Boston,MA)。用32P標(biāo)記的人GAPDH或P肌動(dòng)蛋白cDNA雜交印跡。使用由廠商提供的推薦的條件，將100ng總RNA進(jìn)行使用TaqmanEZ-RTPCR試劑盒(PEAppliedBiosystems，LincolnCentreDriveFosterCity,CA)的實(shí)時(shí)RT-PCR。從AppliedBiosystems獲得分析人GAPDHmRNA的水平的引物，提供GAPDH的探針，該探針5'連接受體染料2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基-焚光素(J0E),3'連接摔滅劑6-羧基-四曱基羅丹明(TAMURA)。P肌動(dòng)蛋白引物序列是5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'和5'-CGGATGTCCACGTCACACTT-3'。P肌動(dòng)蛋白探針序列是FAM-5'-ATCACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3'-TAMURA。以一式三份進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)第24、48和72小時(shí)的樣品中的熒光信號(hào)與對(duì)應(yīng)的0小時(shí)樣品相比的差異來(lái)計(jì)算人GAPDH和P肌動(dòng)蛋白mRNA的相對(duì)量35S曱硫氨酸代謝標(biāo)記將T-Rex-293(mazF/pcDNA3)和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞在包含四環(huán)素的完全DMEM中溫育0、24和48小時(shí)，然后在含有10yCi/ml35S甲硫氨酸的新配制的不含甲硫氨本的DMEM中溫育1小時(shí)。然后用PBS洗滌細(xì)胞2次，在2xLaemmli緩沖液中裂解所述細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE,然后進(jìn)行放射自顯影和考馬斯藍(lán)染色。使用PhosphoimagerSTORM860(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)施例2-MazF誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞mRM降解。在大腸桿菌中，MazF充當(dāng)切割細(xì)胞mRNA的mRNA干擾酶，而抗毒素MazE拮抗MazF的核糖核酸內(nèi)切酶活性(Zhang,Y.，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。受這些發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)，探索MazF是否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中充當(dāng)核糖核酸內(nèi)切酶的問(wèn)題。關(guān)于這一點(diǎn)，通過(guò)穩(wěn)定地共轉(zhuǎn)染四環(huán)素誘導(dǎo)型MazF表達(dá)質(zhì)粒與pcDNA3或組成型MazE表達(dá)質(zhì)粒來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)四環(huán)素阻遏物的T-Rex-293細(xì)胞中的四環(huán)素(Tet)誘導(dǎo)型MazF表達(dá)系統(tǒng)。使用針對(duì)MazF或MazE編碼區(qū)的特異性引物的RT-PCR證明在已建立的T-Rex-293細(xì)胞系中存在MazFmRM的四環(huán)素依賴性表達(dá)和MazE的組成型表達(dá)(表示基因在其表達(dá)不受控制的情況下連續(xù)表達(dá))(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)使用該系統(tǒng)，第一次檢查了在誘導(dǎo)MazF表達(dá)后細(xì)胞mRNA是否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被降解。為了估量細(xì)胞mRNA水平，從四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞的完整細(xì)胞分離總RNA，然后使用人GAPDH和P肌動(dòng)蛋白cDNA使所述RNA進(jìn)行Northern印跡分析。此處使用的術(shù)語(yǔ)"Northern印跡法"是指其中通過(guò)電泳在凝膠上將來(lái)自樣品的RM分離成其組成部分，然后將其轉(zhuǎn)移至特殊修飾的紙支持物以使mRM固定在其電泳位置中的技術(shù)。然后將對(duì)被尋找的特定raRNA互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記的單鏈DNA片段與結(jié)合的mRNA雜交，然后使用合適的方法檢測(cè)標(biāo)記。選擇GAPDH和P肌動(dòng)蛋白mRNA作為MazF的靶，因?yàn)橐阎狦APDH和P肌動(dòng)蛋白基因是管家基因，兩種mRNA都豐富地存在，并且兩者在不同條件下是穩(wěn)定的。此外，GAPDH和P肌動(dòng)蛋白raRNA在其各自的蛋白質(zhì)編碼區(qū)具有20和22個(gè)ACA序列，所述序列是MazF切割的靶(Zhang，Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。如圖1中所示，MazF表達(dá)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞mRM的降解。圖框(A)顯示人GAPDH和(3肌動(dòng)蛋白的Northern印跡分析。用"P標(biāo)記的人GAPDH和P肌動(dòng)蛋白cDNA探測(cè)來(lái)自指定時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞的總RNA。通過(guò)瓊脂糖-甲醛凝膠電泳，然后進(jìn)行溴化乙錠染色顯現(xiàn)28S和18S核糖體RM。圖框(B)顯示mRNA水平的定量。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR定量人GAPDH和P肌動(dòng)蛋白mRNA水平。通過(guò)將第24、48和72小時(shí)的樣品中的熒光信號(hào)與對(duì)應(yīng)的笫0小時(shí)的樣品比較來(lái)計(jì)算mRNA的相對(duì)量。數(shù)據(jù)顯示GAPDH和P肌動(dòng)蛋白mRNA的水平在24小時(shí)后在T-Rex-293(則zF/pcDNA3)細(xì)胞中顯著減少，所述mRNA在MazF的誘導(dǎo)后48小時(shí)幾乎完全消失(圖1A)。相反地，類似于未用四環(huán)素處理的對(duì)照，在整個(gè)誘導(dǎo)時(shí)程中通過(guò)共表達(dá)MazE和MazF保持了兩種mRNA的水平(圖IA)。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR分析，使用特異性引物擴(kuò)增人GAPDH或P肌動(dòng)蛋白cDM(各自包含2個(gè)ACA序列)的序列獲得相同的結(jié)果(圖IB)。數(shù)據(jù)顯示在MazF的誘導(dǎo)進(jìn)行72小時(shí)后兩種mRNA都顯著減少(>90°/。)，然而類似于未用四環(huán)素處理的對(duì)照，在同時(shí)表達(dá)MazE和MazF的細(xì)胞中兩種mRNA的水平保持恒定。此外，值得注意的是，甚至當(dāng)MazF表達(dá)72小時(shí)后，28S和18S核糖體RM的水平未發(fā)生變化(圖1A),這表明細(xì)胞中與核糖體蛋白相互作用的核糖體RNA可受到保護(hù)而免受MazF的降解。總之，這些數(shù)據(jù)表明MazF特異性消除包含ACA序列的細(xì)胞mRNA但不消除核糖體RNA，表明如在大腸桿菌細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的一樣，MazE在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中中和MazF的核糖核酸內(nèi)切酶功能(Zhang,Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。實(shí)施例3.MazF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制蛋白質(zhì)的合成。在大腸桿菌中，MazF的誘導(dǎo)通過(guò)降解細(xì)胞mRNA導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成被抑制，這表明MazF是蛋白質(zhì)合成的通用抑制劑(Zhang,Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。因此研究T-Rex293中MazF對(duì)蛋白質(zhì)合成的效應(yīng)。如圖2中所示，MazF抑制抑制哺乳動(dòng)物中的蛋白質(zhì)合成。圖框(A)顯示T-Rex-293細(xì)胞中35S甲硫氨酸的整合。將來(lái)自指定時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的T-Rex-293細(xì)胞的35S甲硫氨酸標(biāo)記的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和放射自顯影術(shù)(左)，然后用考馬斯藍(lán)染色(右)。圖框(B)顯示"S甲硫氨酸標(biāo)記的蛋白的定量。使用PhosphoimagerSTORM860(MolecularDynamics)掃描圖框(A)中的凝膠上的蛋白質(zhì)條帶，然后計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度。在MazF的誘導(dǎo)后第0、24和48小時(shí)就35S甲硫氨酸的整合估量來(lái)自四環(huán)素處理的T-Rex-293(mazF/pcDNA3)和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞的總細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析證明蛋白質(zhì)的合成在快至24小時(shí)內(nèi)被顯著抑制(圖2A)。相反地，MazE的共表達(dá)明顯地阻止了MazF對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制效應(yīng)(圖2A和2B)。此外，35S曱硫氨酸的整合的喪失不是由于表達(dá)MazF的細(xì)胞中的細(xì)胞蛋白的總體消失造成的，因?yàn)樵?8小時(shí)的誘導(dǎo)期中總蛋白水平保持恒定(圖2A)。數(shù)據(jù)表明如在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一樣，MazF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成的抑制劑，而MazE抑制由MazF導(dǎo)致的蛋白質(zhì)合成的抑制(Zhang,Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。實(shí)施例4.MazF誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡細(xì)胞死亡。在大腸桿菌中，由MazF產(chǎn)生的序列特異性mRNA干擾導(dǎo)致快速的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和最終的細(xì)胞死亡(Zhang，Y，等人，Mol.Cell12:913-923(2003))。因此，檢查MazF表達(dá)、mRNA的消除和蛋白質(zhì)合成的抑制對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖和存活率的影響。圖3顯示MazF誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞死亡。圖框(A)顯示四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞的相差照片(放大率IOOX)。圖框(B)顯示(A)中的T-Rex-293細(xì)胞的存活率分析。將指定的時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的或未處理的T-Rex-293細(xì)胞進(jìn)行錐藍(lán)排除法。存活率表示為時(shí)間為0時(shí)的總細(xì)胞的百分比。圖框(C)是說(shuō)明在四環(huán)素處理的或星孢T-Rex-293細(xì)胞中通過(guò)FACS測(cè)量的石典化丙錠標(biāo)記的代表性例子。圖框(D)是來(lái)自T-Rex-293細(xì)胞的裂解物的Western印跡分析。使用抗活性caspase-3抗體(上)、抗PARP抗體(中)和抗肌動(dòng)蛋白抗體(下)免疫印跡來(lái)自指定時(shí)間點(diǎn)上的四環(huán)素處理的或星形孢菌素處理的T-Rex-293細(xì)胞的完全細(xì)胞裂解物。T-Rex-293中MazF的誘導(dǎo)在MazF誘導(dǎo)的時(shí)程中終止了細(xì)胞的積累并且誘導(dǎo)了累進(jìn)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)(表示細(xì)胞的退化性變化)(圖3A)。值得注意的是，在MazF誘導(dǎo)后72小時(shí)附著的細(xì)胞的數(shù)目顯著減少(圖3A)。相反地，在其中MazE與MazF共表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)學(xué)保持與無(wú)MazF誘導(dǎo)的細(xì)胞(則z尸/pcDNA3Tet(-)和廳z尸/鵬z^Tet(-))相似(圖3A)。因此，MazE能夠中和MazF對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性效應(yīng)。也通過(guò)錐藍(lán)排除法定量表達(dá)MazF的T-Rex-293細(xì)胞的存活率。當(dāng)誘導(dǎo)MazF表達(dá)時(shí)，T-Rex-293(raazF/pcDM3)細(xì)胞的細(xì)胞存活率顯著下降(圖3B)。相反地，MazE和MazF的共表達(dá)賦予對(duì)MazF介導(dǎo)的殺傷的抗性(圖3B)，無(wú)MazF或只具有MazE的細(xì)胞也保持存活(圖3B)。也通過(guò)針對(duì)DNA含量的熒光激活的細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析存活率，對(duì)于亞Gl峰的積累顯示的MazF的誘導(dǎo)引起的凋亡細(xì)胞死亡，這些結(jié)果顯示與錐藍(lán)排除法相同的趨勢(shì)。T-Rex-293(mazF/pcDNA3)中的亞Gl峰以四環(huán)素處理的時(shí)間依賴性方式增加，在誘導(dǎo)的第72小時(shí)增加至65.9%,而T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞中的亞Gl峰保持較低水平(在誘導(dǎo)的72小時(shí)為11.4%)(圖3C)。這些數(shù)據(jù)證明MazF毒素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中資導(dǎo)細(xì)胞死亡，證明MazE抗毒素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中阻止MazF依賴性細(xì)力包死亡。MazF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的時(shí)間依賴性誘導(dǎo)與人293細(xì)胞中MazF誘導(dǎo)的凋亡的發(fā)生一致。為驗(yàn)證由MazF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是凋亡，我們檢查caspase-3(凋亡途徑中的一個(gè)執(zhí)行caspases)是否在表達(dá)MazF的T_Rex-293細(xì)胞中被激活。使用識(shí)別被切割的和被激活的caspase-3的抗體的Western印跡分析顯示來(lái)自用四環(huán)素處理的T-Rex-293(則zF/pcDNA3)細(xì)胞的提取物中存在caspase-3的經(jīng)加工的活性形式(圖3D)。也在來(lái)自用星形孢菌素(已知的凋亡誘導(dǎo)物)處理的T-Rex-293Usz尸/則z^)細(xì)胞的提取物中檢測(cè)到活性caspase-3(圖3D)。相反地，通過(guò)MazE和MazF的共表達(dá)(四環(huán)素處理的T-Rex-293(則z尸/則^)細(xì)胞，圖3D)抑制caspase-3的激活。此外，我們也檢查了PARP(激活的caspase-3的底物)的切割。在來(lái)自用四環(huán)素處理48小時(shí)的T-Rex-293(則z尸/pcDNA3)細(xì)胞的提取物中檢測(cè)到被切割的PARP，其水平在MazF誘導(dǎo)后72小時(shí)進(jìn)一步增加，類似于星形孢菌素處理的T-Rex-293(邁az尸/則zi)細(xì)胞。如所預(yù)期的，在表達(dá)MazE和MazF的細(xì)胞的提取物中，當(dāng)未檢測(cè)到經(jīng)加工的活化caspase-3時(shí)，被切割的PARP也不存在(圖3D)。總之，數(shù)據(jù)清楚地證明MazF毒素(來(lái)自大腸桿菌的序列特異性核糖核酸內(nèi)切酶)誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡細(xì)胞死亡，這可被MazE抗毒素的共表達(dá)阻止。實(shí)施例5.BCL-2家族蛋白的水平在MazF誘導(dǎo)的凋亡期間不改變。為了研究處于caspase-3活化上游的MazF產(chǎn)生的凋亡誘導(dǎo)的機(jī)制，就MazF介導(dǎo)的mRNA的切割引起的調(diào)節(jié)檢查抗凋亡(BCL-2、BCL-XL和MCL-l)或促凋亡(BAK、BAK、BID、BIM、NBK/BIK和PUMA)蛋白水平。將來(lái)自用四環(huán)素處理0、24、48和72小時(shí)的T-Rex-293(mazF/pcDNA3)和T-Rex-293(mazF/mazE)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡分析。圖4顯示BCL-2家族蛋白的水平在MazF誘導(dǎo)期間保持恒定。使用特異性識(shí)別圖中指示的抗凋亡和促凋亡蛋白的抗體免疫印跡來(lái)自四環(huán)素處理的T-Rex-293細(xì)胞的完全細(xì)胞裂解物。BCL-2家族蛋白的水平保持不變，在MazF誘導(dǎo)的凋亡期間也未檢測(cè)到截短的BID(tBID)。這些數(shù)據(jù)表明抗凋亡BCL-2家族成員BCL-2、BCL-^和MCL-1的消失或促凋亡BAX、BAK、BIM、BID、NBK/BIK和PUMA蛋白的上調(diào)不是形成MazF介導(dǎo)的凋亡的原因。最后，表達(dá)MazF的細(xì)胞中tBID的不存在表明不涉及通過(guò)tBID進(jìn)行的死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑。實(shí)施例6.MazF誘導(dǎo)的凋亡需要BAK但不需要BAX。BCL-2家族的促凋亡成員BAX和BAK在由處于BH3-only蛋白下游的許多凋亡刺激物誘導(dǎo)的凋亡途徑中起著至關(guān)重要但主要是功能冗余的作用(Danial，N.N.，和Korsmeyer，S.J.,Cell116:205-219(2004);Gelinas，C.，和White,E.(2005).GenesDev.19:1263-1268(2005);Tsujimoto，Y，J.CellPhysiol.195:158-67(2003);Willis,S.N.，和Adams,J.M.Curr.Opin.inCellBiol.17:1-9(2005))。為檢測(cè)BAX和/或BAK在MazF介導(dǎo)的凋亡中的潛在參與，利用W263ir+A)、D3(6a,—A6sf勺、X2(6afA6ai+A)和KliBMK細(xì)胞的有利方面(Degenhardt，K.，和White,E.Clin.CancerRes.即將出版.(2006);Degenhardt,K.，等人CancerCell,51-64(2006);Degenhardt,K.，等人，CancerCell2:193—203(2002);Degenhardt,K.，等人，J.Biol.Chem.277:14127-14134(2002))。腫瘤壞死因子ot(TNF-a)誘導(dǎo)W2、X2和KliBMK細(xì)胞的凋亡，然而，D3iBMK細(xì)胞對(duì)TNF-a誘導(dǎo)的凋亡和對(duì)由許多其他刺激物介導(dǎo)的凋亡具有抗性(Degenhardt,K.，等人，J.Biol.Chem.277:14127-14134(2002b))。首選，將MazF表達(dá)質(zhì)粒pcDM4/T0/邁szF與/ac/表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6/His/7ac/—起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入W2、D3、X2和Kl細(xì)胞，然后進(jìn)行P半乳糖苷酶測(cè)定以監(jiān)控MazF瞬時(shí)表達(dá)的影響。圖5顯示BAK的功能是MazF誘導(dǎo)的凋亡所必需的。圖框(A)顯示瞬時(shí)表達(dá)MazF的iBMK細(xì)胞的存活率。將瞬時(shí)共表達(dá)LacZ和MazF的W2、D3、X2和Kl細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第48小時(shí)進(jìn)行P半乳糖苷酶測(cè)定。將P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞計(jì)算為其總細(xì)胞的百分比。圖框(B)顯示iBMK細(xì)胞中的^皮激活的caspase-3的免疫熒光。用抗Xpress和抗活性caspase-3抗體共染色瞬時(shí)共表達(dá)LacZ和MazF的W2、D3、X2或Kl細(xì)胞。FITC(綠色)和羅丹明(紅色)染色分別表示細(xì)胞表達(dá)LacZ和激活的caspase-3。數(shù)字表示激活的caspase-3陽(yáng)性細(xì)月包的百分比。白色箭頭標(biāo)示來(lái)自匹配FITC染色的細(xì)胞的對(duì)應(yīng)的激活的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。圖框(C)顯示瞬時(shí)共表達(dá)MazF和MazE的iBMK細(xì)胞的存活率。將瞬時(shí)共表達(dá)LacZ和MazF和/或MazE的W2、D3、X2和Kl細(xì)胞進(jìn)行(3半乳糖苷酶測(cè)定。如上所述計(jì)算P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞。如圖5中所示，W2細(xì)胞中MazF的表達(dá)導(dǎo)致P半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的顯著減少(圖5A)。相反地，在表達(dá)MazF的D3細(xì)胞中觀察到對(duì)卩半乳糖苷酶表達(dá)的很小的影響(圖5A)。有趣地，類似于W2細(xì)胞，X2細(xì)胞中P半乳糖普酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，然而Kl細(xì)胞優(yōu)選抗MazF,這表明BAK的缺乏足以耐受MazF的表達(dá)。此外，Kl細(xì)胞中由MazF導(dǎo)致的P半乳糖苷酶表達(dá)的保存表明表達(dá)的喪失是由于凋亡而不是l3半乳糖苷酶rnRNA的消除造成的。為檢驗(yàn)W2和X2細(xì)胞中P半乳糖苷酶表達(dá)的缺乏是否由凋亡造成的，就活性caspase-3檢查表達(dá)MazF的細(xì)胞。使用抗活性caspase-3抗體的免疫熒光顯示與pcDNA3轉(zhuǎn)染的W2和X2細(xì)胞中存在低于0.1%的活性caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞相比，在58.1%的瞬時(shí)表達(dá)MazF的W2細(xì)胞中和47.2。/。的瞬時(shí)表達(dá)MazF的X2細(xì)胞中存在活性caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)(圖5B)。然而，瞬時(shí)表達(dá)MazF的D3和Kl細(xì)胞具有少數(shù)具有激活的caspase-3的細(xì)胞(<0.1°/。)(圖5B)，這表明主要是BAK的消失阻止了MazF導(dǎo)致的caspase-3激活。總之，數(shù)據(jù)表明MazFi秀導(dǎo)BAK依賴性而非BAX依賴性的激活caspase-3和凋亡的才幾制。為研究MazE是否可抑制由MazFi秀導(dǎo)的BAK介導(dǎo)的凋亡，將MazE和MazF在W2、D3、X2或Kl細(xì)胞中共表達(dá)。來(lái)自P半乳糖普酶測(cè)定的結(jié)果顯示具有MazF的W2和X2細(xì)胞中MazE的表達(dá)顯著抑制了MazF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，類似于用單獨(dú)的pcDM3或MazE表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的W2和X2細(xì)胞(圖5C)。實(shí)施例7.NBK/BIK是由蛋白合成的抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞殖死亡所必需的。為鑒定蛋白合成的抑制借以觸發(fā)BAK介導(dǎo)的凋亡的途徑，檢查BH3-only促凋亡蛋白上游的功能要求。就對(duì)MazF介導(dǎo)的凋亡的抗性檢測(cè)缺乏單個(gè)BH3-only促凋亡蛋白(PUMA、BIM、NOXA和NBK/BIK)(TanT.T，等人，CancerCell7:227-238.(2005))的iBMK細(xì)胞系。將MazF和ZacZ在pwws—A、6//zTA、^oxs^Mli'/61/6/ir—/_iBMK細(xì)月包中瞬時(shí)共表達(dá)并且監(jiān)控P半乳糖苷酶活性。圖6顯示NBK/BIK介導(dǎo)MazF或CHX誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。圖框(A)顯示瞬時(shí)表達(dá)MazF的iBMK細(xì)胞的存活率。將共表達(dá)LacZ和MazF的、6/邁_/-、/zoza—/-或iBMK細(xì)胞進(jìn)行P半乳糖苷酶測(cè)定法。將P半乳糖苷酶陽(yáng)性藍(lán)色細(xì)胞計(jì)算為其總細(xì)胞的百分比。圖框(B)和(C)顯示CHX處理的iBMK細(xì)胞的存活率。將用CHX處理的W2、D3、X2和Kl細(xì)胞(圖框B)和"M/Wir—AB、6//z/—/_、/2o;rav—或；咖a—〃細(xì)胞(圖框C)進(jìn)行MTT測(cè)定法。圖框(D)和(E)顯示TNF-ct/CHX-和紫杉醇處理的iBMK細(xì)胞的存活率。將用TNF-oc/CHX(0.05/ag/ml)(圖框D)和紫杉醇(圖框E)處理的W2、D3和三個(gè)獨(dú)立的"M/62'ir_/—細(xì)胞系(A、B和C)進(jìn)行MTT測(cè)定法。圖6顯示瞬時(shí)表達(dá)MazF的/畫_/—、6/邁_/_、/201<3_/_細(xì)胞中P半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目顯著減少(圖6A)，這類似于W2和X2細(xì)胞(圖5A)。有趣地，"W:/6/i〃細(xì)胞優(yōu)選抗MazF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖6A)，這類似于D3和Kl細(xì)胞(圖5A)。這表明MazF介導(dǎo)的凋亡需要通過(guò)BAK發(fā)信號(hào)的NBK/BIK。為檢驗(yàn)由一般翻譯抑制介導(dǎo)的凋亡是否依賴于特定的BH3-only蛋白，使用CHX檢驗(yàn)/7W/Z79V—、、"c^av—4'/^ir/6/ir—/_iBMK細(xì)胞對(duì)翻譯抑制的凋亡反應(yīng)。除了W2、D3、X2或K1細(xì)胞外，用濃度不斷增加的CHX(0.05、0.5、1.0、5.0和10,0//g/ml)處理；i/邁a一7—、6/邁—/_、/7o;ra—/_減nbk/bikv—細(xì)胞24小時(shí)以誘導(dǎo)翻譯抑制，然后估量存活率。用CHX處理的W2、X2、pwz7aA、6//zTA和/ow7—細(xì)胞的存活率以劑量依賴性的方式減少(圖6B和C)。相反地，當(dāng)用CHX處理D3、Kl(圖6B)和nbk/bik—7—(圖6C)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的存活率保持較高。此外，W2和三個(gè)獨(dú)立的/6ir/6/lv—iBMK細(xì)胞系明顯對(duì)TNF-a(圖6D)和紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖6E)敏感。相反地，D3細(xì)胞對(duì)由TNF-oc和紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有抗性(圖6D和E)。這些結(jié)果清楚地表明NBK/BIK是細(xì)胞死亡所必需的BH3-only促凋亡蛋白，所述細(xì)胞死亡是由響應(yīng)MazF誘導(dǎo)的mRNA降解的蛋白質(zhì)合成的抑制和CHX誘導(dǎo)的BAK上游的翻譯抑制誘導(dǎo)的。此外，NBK/BIK不是TNF-a介導(dǎo)的通過(guò)tBID發(fā)信號(hào)的凋亡(圖6D)所必需的(Li，H.，等人，Cell94:491-501(1998);Luo，X.，等人，Cell94:481-490(1998))，NBK/BIK也不是由紫杉烷類誘導(dǎo)的依賴于BIM的凋亡(圖6E)所必需的(Bouillet,P.，等人，Science286:1735-1738(1999);Tan，T.T，等人，CancerCell7:227-238.(2005))。這些發(fā)現(xiàn)支持特定BH3-only蛋白控制對(duì)個(gè)別的凋亡刺激物的反應(yīng)的作用。實(shí)施例8.NBK/BIK是由腺病毒感染誘導(dǎo)的凋亡的介體。生產(chǎn)性腺病毒感染消除了宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，從而觸發(fā)凋亡的誘導(dǎo)。為調(diào)查NBK/BIK是否是腺病毒誘導(dǎo)的、伴隨宿主蛋白合成中斷的凋亡所必需的，用野生型腺病毒5型(Ad5cf/309)和ElB19K基因缺失(抗凋亡vBCL-2)突變體(Ad5d/337)轉(zhuǎn)染W(wǎng)2、D3和i^l/Wir7—iBMK細(xì)胞，然后監(jiān)控CPE。圖7顯示NBK/BIK介導(dǎo)腺病毒誘導(dǎo)的凋亡。圖框(A)顯示腺病毒感染的iBMK細(xì)胞的相差照片(放大率IOOX)。圖框(B)顯示來(lái)自病毒感染的iBMK細(xì)月包的裂解物的Western印跡分析。用抗活性caspase-3抗體(上)、抗E1A抗體(中)和抗肌動(dòng)蛋白抗體(下)免疫印跡來(lái)自模擬物、Ad5《/309或Ad5d/337感染的W2、D3和/26i:/6/ir_/_B細(xì)胞的完全細(xì)胞裂解物。圖框(C)顯示由蛋白質(zhì)合成中斷誘導(dǎo)的凋亡途徑。Ad509感染的W2、D3和"6ir/6/i:+細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)得到保持，這類似于模擬物(mock)感染的W2、D3和/61/6/ir+細(xì)胞的情況，這表明E1B19K阻止了腺病毒誘導(dǎo)的凋亡(圖7A)。如所預(yù)期的(Cuconati，A.,等人，J.Virol.76:4547-4558(2002)),用Ad5d/337感染入W2細(xì)胞在感染后48小時(shí)導(dǎo)致標(biāo)志凋亡的單層細(xì)胞的幾乎完全破壞(圖7A)。相反地，如所預(yù)期的(Cuconati，A.，等人，J.Virol.76:4547-4558(2002)),Ad5d/337感染的D3細(xì)胞抗腺病毒誘導(dǎo)的凋亡(圖7A)。有趣地，在Ad5cT/337感染的"M/6/ir+細(xì)胞中未觀察到凋亡CPE(圖7A)。通過(guò)監(jiān)控caspase-3的激活估量感染的iBMK細(xì)胞的凋亡。如所預(yù)期的，在用Ad5d/309感染的W2和D3細(xì)胞中，未檢測(cè)出caspase-3的經(jīng)加工的活性形式(圖7B)。在用Ad5cT/309感染的/W/6/ir+細(xì)胞中也未看到激活的caspase-3(圖7B)。如所預(yù)期的，激活的caspase-3的豐富水平存在于來(lái)自Ad5d/337感染的W2細(xì)胞的提取物中，然而在來(lái)自Ad5d/337感染的D3細(xì)胞的提取物中未出現(xiàn)激活的caspase-3(圖7B)(Cuconati，A.，等人，J.Virol.76:4547-4558(2002))。有趣地，用Ad5d/307感染的—/_細(xì)胞中檢測(cè)到的激活的caspase-3的量顯著低于Ad5d/307感染的W2細(xì)胞中檢測(cè)到的量(圖7B)，這與/26ir/6/iT7—細(xì)胞對(duì)Ad5d/337i秀導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性相符(圖7A)。為了確保iBMK被感染和表達(dá)病毒蛋白，就E1A蛋白水平分析細(xì)胞裂解物。此處使用的術(shù)語(yǔ)"E1A"是指通過(guò)結(jié)合細(xì)胞蛋白和隔離細(xì)胞蛋白從而阻止其參與細(xì)胞過(guò)程來(lái)影響細(xì)胞功能的腺病毒蛋白。因此E1A用于使iBMK細(xì)胞永生化，在未感染的細(xì)胞保檢測(cè)到低水平的E1A蛋白表達(dá)(圖7B)。E1A水平在Ad5cT/309感染的W2、D3和/6ir/6/ir+細(xì)胞中顯著增加(圖7B)，這表明病毒感染的細(xì)胞從病毒基因組表達(dá)E1A。在Ad5cT/337感染的D3和/7M/62'ir—/_細(xì)胞中觀察到更高水平的E1A(圖7B)，這表明Ad5d/337感染的D3和/26ir/6ii:—/_細(xì)胞中的E1A的產(chǎn)生是由于凋亡的不存在(由BAX、BAK和NBK/BIK的缺乏導(dǎo)致的)引起的。因此，這些數(shù)據(jù)表明NBK/BIK是在BAX和BAK上游調(diào)控腺病毒感染誘導(dǎo)的凋亡的介體。盡管本發(fā)明已描述了其特定的實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可產(chǎn)生不同的改變和可替代不同的等同物而不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。此外，可進(jìn)行許多修飾以使特定的情況、材料、物質(zhì)的組合物、方法、方法步驟適應(yīng)本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有這些改變希望在其所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.選擇性調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡的方法，該方法包括步驟a.制備包含編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的第一表達(dá)載體；b.制備包含編碼mRNA干擾酶拮抗劑多肽、mRNA干擾酶拮抗劑多肽的衍生物或mRNA干擾酶拮抗劑多肽的片段的分離的核酸序列的第二表達(dá)載體；c.將第一表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；d.任意地將第二表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；e.選擇性地誘導(dǎo)編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的第一表達(dá)載體表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，和f.任意地選擇性地誘導(dǎo)編碼mRNA干擾酶拮抗劑多肽、mRNA干擾酶拮抗劑多肽的衍生物或mRNA干擾酶拮抗劑多肽的片段的第二表達(dá)載體表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的凋亡。2.權(quán)利要求1的方法，其中第一表達(dá)栽體和第二表達(dá)載體各自進(jìn)一步包含至少一個(gè)調(diào)控序列。3.權(quán)利要求2的方法，其中至少一個(gè)調(diào)控序列是至少一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。4.權(quán)利要求3的方法，其中第一表達(dá)栽體中的至少一個(gè)啟動(dòng)子有效連接至編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的4汙生物或mRNA干擾酶多肽的片段的核酸序列。5.權(quán)利要求3的方法，其中第二表達(dá)載體中的至少一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效連接至編碼mRM干擾酶拮抗劑多肽、mRM干擾酶拮抗劑多肽的衍生物或mRNA干擾酶拮抗劑多肽的片段的核酸序列。6.權(quán)利要求1的方法，其中mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，識(shí)別細(xì)胞信使RNA中的至少一個(gè)第一mRNA干擾酶識(shí)別序列。7.權(quán)利要求6的方法，其中至少一個(gè)第一mRNA干擾酶識(shí)別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤。8.權(quán)利要求l的方法，其中mRM干擾酶多肽是原核細(xì)胞多肽。9.權(quán)利要求8的方法，其中mRM干擾酶多肽是MazF。10.權(quán)利要求1的方法，其中mRM干擾酶拮抗劑多肽是原核細(xì)胞多肽。11.權(quán)利要求10的方法，其中mRM干擾酶拮抗劑多肽是MazE。12.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是Bak缺陷型。13.權(quán)利要求1的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是Bak和Bax缺陷型。14.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。15.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞被病原體感染。16.權(quán)利要求15的方法，其中病原體是細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或朊病毒。17.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是干細(xì)胞。18.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是已分化的細(xì)胞。19.權(quán)利要求18的方法，其中已分化的細(xì)胞是肌細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或感覺(jué)細(xì)胞。20.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是免疫細(xì)胞。21.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是遺傳損傷的細(xì)胞。22.權(quán)利要求l的方法，其中靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是毒素?fù)p傷的細(xì)胞。23.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中保持編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的方法，該方法包括步驟a.制備包含編碼mRM干擾酶多肽、mRM干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的表達(dá)載體；和b.將該表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡途徑;陂阻斷。24.權(quán)利要求23的方法，該方法在步驟(b)后進(jìn)一步包括誘導(dǎo)mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段表達(dá)的步驟c。25.權(quán)利要求23的方法，其中表達(dá)栽體還包含至少一個(gè)調(diào)控序列。26.權(quán)利要求25的方法，其中至少一個(gè)調(diào)控序列是至少一個(gè)有效連接至編碼mRNA干擾酶多肽、mRM干擾酶多肽的^f生物或mRM干擾酶多肽的片段的核酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。27.權(quán)利要求23的方法，其中mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，識(shí)別細(xì)胞信使RNA中的至少一個(gè)mRNA干擾酶識(shí)別序列。28.權(quán)利要求27的方法，其中至少一個(gè)mRM干擾酶識(shí)別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺噤呤。29.權(quán)利要求23的方法，其中mRNA干擾酶多肽是原核細(xì)胞多肽。30.權(quán)利要求29的方法，其中mRNA干擾酶多肽是MazF。31.權(quán)利要求23的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是BAK缺陷型、NBK/BIK缺陷型、或BAK缺陷型和NBK/BIK缺陷型。32.包含編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的分離的核酸序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡途徑纟皮阻斷。33.權(quán)利要求32的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中使用包含編碼mRNA干擾酶多肽、mRM干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的分離的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。34.權(quán)利要求33的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中表達(dá)載體還包含至少一個(gè)調(diào)控序列。35.權(quán)利要求34的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中至少一個(gè)調(diào)控序列是至少一個(gè)有效連接至編碼mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或mRNA干擾酶多肽的片段的核酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。36.片又利要求32的哺乳動(dòng)物細(xì)l包，其中mRNA干擾酶多肽、mRNA干擾酶多肽的衍生物或raRNA干擾酶多肽的片段，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，識(shí)別細(xì)胞信使RNA中的至少一個(gè)mRNA干擾酶識(shí)別序列。37.權(quán)利要求36的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中至少一個(gè)mRNA干擾酶識(shí)別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺噤呤。38.權(quán)利要求32的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中mRM干擾酶多肽是原核細(xì)胞多肽。39.權(quán)利要求38的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中mRNA干擾酶多肽是MazF。40.權(quán)利要求32的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是BAK缺陷型、NBK/BIK缺陷型、或BAK缺陷型和NBK/BIK缺陷型。全文摘要核糖核酸酶、抗生素、細(xì)菌毒素和病毒抑制蛋白質(zhì)合成，這導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。不清楚BCL-2蛋白家族響應(yīng)蛋白質(zhì)合成的中斷而調(diào)控凋亡的機(jī)制。根據(jù)本發(fā)明，大腸桿菌毒素MazF通過(guò)切割細(xì)胞mRNA抑制蛋白質(zhì)合成，從而誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。MazF誘導(dǎo)的凋亡需要促凋亡BAK和其上游調(diào)節(jié)劑促凋亡BH3-only蛋白NBK/BIK而非BIM、PUMA或NOXA。此外，NBK/BIK或BAK缺陷型細(xì)胞對(duì)由翻譯的藥理學(xué)抑制和由病毒介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的中斷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有抗性。因此，BH3-only蛋白NBK/BIK是響應(yīng)蛋白質(zhì)合成中斷的BAK依賴性凋亡途徑的最上游調(diào)節(jié)劑。盡管NBK/BIK對(duì)于發(fā)育不是必需的，但其是被病毒靶向而失活的BH3-only蛋白，這表明其通過(guò)凋亡激活在病原體/毒素反應(yīng)中起著重要作用。文檔編號(hào)C12N15/00GK101273127SQ200680035159公開(kāi)日2008年9月24日申請(qǐng)日期2006年8月22日優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日發(fā)明者E·懷特,K·德根哈特,M·井上,T·島津申請(qǐng)人:新澤西內(nèi)科與牙科大學(xué)