專利名稱：用電流處理小體積的方法
用電流處理小體積的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用電流處理生物材料的方法。具體是將生物材料加入具有相對高離 子強(qiáng)度的小體積緩沖溶液中，和在所述緩沖溶液中，通過高電壓脈沖產(chǎn)生一段預(yù)設(shè) 持續(xù)時間的強(qiáng)電場。祖旦 冃豕將生物活性分子例如DNA、 RNA或蛋白質(zhì)引入活細(xì)胞是分析這些分子的生物學(xué)功 能的重要手段。將外來分子引入細(xì)胞的優(yōu)選方法是電穿孔方法，它與化學(xué)方法相反， 不依賴于其它生物活性分子的同時轉(zhuǎn)運(yùn)。電穿孔方法中，用短暫電流將外來分子從 適合細(xì)胞的緩沖溶液中或從細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中引入細(xì)胞。通過進(jìn)行短暫的電脈沖使細(xì) 胞膜對外來分子具有滲透性。此外，細(xì)胞懸液通常位于所謂的試管內(nèi)，即在頂端開 口的狹窄容器中，其內(nèi)部由兩對平行排列和彼此相對的側(cè)壁所形成。所述內(nèi)部可以 容納細(xì)胞懸液，即一般是待處理細(xì)胞懸浮于其中的水性緩沖溶液或細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。 這類試管通常在相對側(cè)壁對的較低位置具有一對電極，能夠施用電壓。這些電極的 放電會在電極之間透過細(xì)胞懸液產(chǎn)生電流，使核酸和其它分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，或根 據(jù)所選擇的條件引起細(xì)胞融合。短暫施加強(qiáng)電場，即高電流密度進(jìn)行短脈沖的結(jié)果是，還可以融合細(xì)胞、細(xì)胞 衍生物、亞細(xì)胞顆粒和/或小囊泡。在該所謂的電融合中，首先例如通過不均勻電交 變場使所述細(xì)胞接近并實(shí)現(xiàn)膜接觸。接下來施加電場脈沖使膜組分之間相互作用， 最終導(dǎo)致融合。對電融合而言，可以采用與用于電穿孔的那些裝置類似的裝置。電穿孔方法中，生物活性分子最初通過細(xì)胞膜上臨時產(chǎn)生的"孔"進(jìn)入胞質(zhì)。 在某些情況下，所述分子還可能已在胞質(zhì)中執(zhí)行了感興趣的功能，接下來，在某些 條件下，還可以進(jìn)入細(xì)胞核。具體是，當(dāng)生物活性分子只能在細(xì)胞核中執(zhí)行感興趣 的功能時，例如如果要分析基因的表達(dá)，和具體說，如果使用未分裂的或僅僅是低 分裂率的細(xì)胞，例如原代細(xì)胞時，則有利的是生物活性分子直接轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核。從公開于US2004014220(以其全文納入本文作為參考)的電穿孔方法中可知，在
此種情況下，為了獲得高轉(zhuǎn)染率，必須通過高電壓脈沖在緩沖溶液中產(chǎn)生至少lOps 預(yù)設(shè)持續(xù)時間的場強(qiáng)為至少2kV/cm的強(qiáng)電場。依靠高電流處理生物材料的方法也可從US2005064596中獲知，以其全文納入本 文作為參考。該文所公開的方法中，將所述生物材料加入離子強(qiáng)度為至少200mmo1/1 的緩沖溶液中來確保細(xì)胞死亡率低而轉(zhuǎn)染率高。主要是在不得不在盡可能短的時間內(nèi)同時檢測大量的反應(yīng)批次的生物化學(xué)和藥 物學(xué)應(yīng)用中，具體是在HT分析中(HT二高通)，需要提供數(shù)量盡可能多的反應(yīng)室，例 如96或384。本文中使用的反應(yīng)容器通常是指多孔板，微量滴定板或多個孔。這些 容器中的各反應(yīng)室('孔')相對較小，從而只可容納小體積。而且，使用較小的樣 品體積往往利于節(jié)約緩沖液和細(xì)胞材料。此外，尤其是對于昂貴的細(xì)胞材料，例如 原代細(xì)胞，通常只能獲得少量細(xì)胞。因此在某種必須處理小樣品體積的情況下，經(jīng) 常會有上述需求。當(dāng)在液體中產(chǎn)生強(qiáng)電場時必然會帶來的副作用是電水解。在最輕微的情況下， 可以通過電極表面形成的氣泡繼而形成泡沫而注意到發(fā)生了電解。極端情況下，由 于產(chǎn)生的頂替效應(yīng)引起電極間區(qū)域內(nèi)的樣品飛濺而會發(fā)生爆發(fā)式氣體形成(下文中 指"飛濺")。后者常引起樣品損失或至少引起在預(yù)期時間內(nèi)樣品未留在電場內(nèi)。從 而，樣品飛濺定性和/或定量地?fù)p害試驗(yàn)結(jié)果或樣品處理結(jié)果，而且對結(jié)果的再現(xiàn)性 產(chǎn)生消極影響。因此，在必須在電場中處理生物細(xì)胞的各種應(yīng)用中，尤其是在電穿 孔時，電解會產(chǎn)生不良副作用。理論上，可以通過減小電導(dǎo)率而降低飛濺發(fā)生的概率。然而，沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞 壁的高等細(xì)胞，通常僅能存活于具有特定摩爾滲透壓濃度的溶液中。通常，電解質(zhì) 也是能使溶液具有或多或少的高電導(dǎo)率的有效等滲溶質(zhì)。例如，為了完成電穿孔， 通常有需要將離子引入細(xì)胞懸液，如US2005064596所公開(以其全文納入本文作為 參考)，這樣做也是有利的。因此，出于實(shí)際的考慮，通過減小電導(dǎo)率來降低飛濺概 率有其局限性。因此，這種情況下，可以預(yù)期會有不同程度的電解。因此，飛濺的發(fā)生是一種隨機(jī)事件。這意味著該事件僅能通過概率來描述。根 據(jù)所述條件，不需要的飛濺發(fā)生的頻率可以，例如，低于5%，但也可以高于95%。 因此，當(dāng)在高電流密度下采用小體積時，飛濺發(fā)生的概率尤其高。為了開發(fā)一種針 對該生產(chǎn)狀況的方法，要解決的問題是用合適的方法來降低概率，例如，用戶用這 個方法將概率控制到低于1%。因此，本發(fā)明要解決的問題是提供一種前述類型的方法，其中，電極間區(qū)域
品不希望的飛濺的頻率顯著降低。 發(fā)明概述
本發(fā)明方法解決了該問題，其中，將生物材料加入離子強(qiáng)度至少約lOOmmol/1 的至多約50y 1的緩沖溶液中，通過至少一次電壓脈沖在至少10 y s的預(yù)設(shè)持續(xù)時 間內(nèi)產(chǎn)生場強(qiáng)至少約lkV/cm的電場。將電壓脈沖斷開至少一次，持續(xù)時間至少約 10(Vs，和接著再接通。從而使電壓脈沖的預(yù)設(shè)持續(xù)時間符合未被斷開的脈沖實(shí)際持 續(xù)時間，即符合電流實(shí)際流通的總凈時間。因此，由于電壓脈沖斷開時的額外時間 段，脈沖的總持續(xù)時間因此而延長，因此，電壓脈沖從釋放到結(jié)束，即直到達(dá)到預(yù) 設(shè)持續(xù)時間，實(shí)際上比預(yù)設(shè)持續(xù)時間要長。根據(jù)本發(fā)明方法，在預(yù)定時間后將所述 電壓脈沖斷開一段預(yù)定持續(xù)時間，然后再接通。每當(dāng)需要達(dá)到電壓脈沖的預(yù)設(shè)持續(xù) 時間時就重復(fù)這個過程。因此必須以足夠的頻率斷開所述電壓，以使緩沖溶液中產(chǎn) 生的氣體減少到足以防止電極間區(qū)域樣品飛濺的程度。而且，各次斷開的持續(xù)時間 要足夠長，以防止電極間區(qū)域樣品飛濺。因此，通過斷開電壓脈沖，可以在所述條 件下顯著降低飛濺頻率，而維持所用方法的效率，具體是轉(zhuǎn)染效率。
例如在電穿孔時，不需要的飛濺的頻率一方面取決于電流密度(場強(qiáng)x特定電導(dǎo) 率)和施加電場期間的時間間隔。因此電流密度和時間間隔與電解每份樣品體積所產(chǎn) 生氣體的量直接相關(guān)。場強(qiáng)和時間間隔決定了實(shí)現(xiàn)例如，高轉(zhuǎn)染效率或?qū)⒎肿又苯?轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)核所需的條件。這兩個參數(shù)之一比最佳細(xì)胞類型特異性條件低常會使檢測結(jié) 果定性和/或定量地降低。因此，不可能減小這些參數(shù)之一或只可能在限制程度內(nèi)減 小。另一方面，飛濺概率負(fù)取決于樣品體積(質(zhì)量)。這種依賴性起因于較大體積的 惰性較大。短時窗口內(nèi)，試管凹口內(nèi)更可能存在較大體積。因此，等效條件下的小 體積尤其經(jīng)常會發(fā)生飛濺。因此，飛濺問題對HT領(lǐng)域的方法起著特殊作用。然而， 對于特殊應(yīng)用，尤其是高通量領(lǐng)域，不能增加樣品體積。 一方面，自動化液體處理 系統(tǒng)無法處理大量的體積增加的樣品，或僅僅是費(fèi)用增加，另一方面，考慮到有關(guān) 的費(fèi)用，可獲得的細(xì)胞材料量(和可能的試劑)常常要受到限制。而且，使用大體積 就其它原因而言也可能是不利的。細(xì)胞濃度降低會使例如電穿孔期間的細(xì)胞存活率 或電融合期間的效率從之前的某點(diǎn)變成顯著更遭的結(jié)果。因此，尤其是采用HT方法 時，實(shí)際上不能選擇增加體積。因此，本發(fā)明方法在預(yù)定條件下能有效和可靠地顯 著降低飛濺發(fā)生的頻率。
本發(fā)明的一有利實(shí)施方式中，將所述電壓脈沖斷開2-10次，包括3、 4、 5、 6、
7、 8和/或9次。因此，斷開次數(shù)取決于預(yù)設(shè)條件，具體是電流密度、脈沖持續(xù)時間
和所提供的體積。針對各次運(yùn)用和/或采用的細(xì)胞類型，通常需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定最佳 斷開次數(shù)。但這種憑經(jīng)驗(yàn)確定還是在技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，對至少一次斷開可以預(yù)設(shè)的持續(xù)時間為約200ps-約2ms，優(yōu)選約 300|is、約400jas、約50(Vs、約600]us、約700ps、約800|is、約900ps、約lras或 約1.5ms。只要斷開間隔不超過某個長度，就可以防止樣品飛濺而不對方法結(jié)果質(zhì)量 產(chǎn)生負(fù)作用。因此，針對各次運(yùn)用和/或采用的細(xì)胞類型，通常需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)分別確 定最佳斷開持續(xù)時間和/或斷開。但這種憑經(jīng)驗(yàn)確定在技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。降低飛 濺發(fā)生概率所需的持續(xù)時間尤其還取決于預(yù)設(shè)條件，即電流密度、脈沖持續(xù)時間和 所提供的體積。
含有生物材料的緩沖溶液的體積可以是，例如，總量在約l-50nl，優(yōu)選約 10-40^1，特別優(yōu)選約15-25pl，具體是約10-20pl。而且，所采用的體積通常取決 于所提供的生物材料和/或化學(xué)工程條件。
本發(fā)明另一有利實(shí)施方式中，所述電壓脈沖產(chǎn)生電場的最大場強(qiáng)為約10kV/cm， 優(yōu)選約l-8kV/cm，尤其優(yōu)選約2-6kV/cm，具體約2-4kV/cm。這種高電壓脈沖尤其適 合于真核細(xì)胞的電穿孔，具體是將核酸引入細(xì)胞核中。
本發(fā)明再一有利實(shí)施方式中，所述電壓脈沖的預(yù)設(shè)持續(xù)時間最長為約5ms，優(yōu) 選約20ps-約2ms，尤其優(yōu)選約100-約1000|is，具體是約100-約600ps。因此，預(yù) 設(shè)持續(xù)時間是沒有斷開的電壓脈沖的預(yù)定長度，即分別是實(shí)際施加電流和電流流通 的時間段。預(yù)設(shè)持續(xù)時間通常是對各次運(yùn)用和/或采用的細(xì)胞類型而言是最佳的憑經(jīng) 驗(yàn)決定的值。具體說，可以預(yù)計由本發(fā)明方法提供的電壓脈沖的斷開引起效率稍微 降低，在某些情況下，可以通過例如在某一限度內(nèi)將預(yù)設(shè)持續(xù)時間延長超出經(jīng)驗(yàn)決 定值以外而改善這種效率的降低。用這種方式，在個例中，有可能彌補(bǔ)斷開電壓脈 沖可能帶來的負(fù)作用。
本發(fā)明有利實(shí)施方式中，還提供了大約在電壓間隔約5ps、約10ns、約20ps、 約30jus、約40ps、約50iis、約60ns、約lOOjas或約200ps之后斷開電壓脈沖?？?以在第一個電壓間隔或一個或多個后續(xù)電壓間隔時運(yùn)用。因此，電壓間隔分別是施 加電壓和在緩沖溶液中產(chǎn)生電場的時間段，它之后或之前是斷開間隔。某些條件下， 通過縮短一個或多個電壓間隔，可以進(jìn)一步降低飛濺概率和/或?qū)⑵浣档阶畹汀?br> 根據(jù)本發(fā)明，可以在兩個電極之間產(chǎn)生電場。在本發(fā)明一特別有利的實(shí)施方式 中，兩個電極之間的距離可以是約0. 5-5mm，優(yōu)選約1-4 mra，具體約1.5-2 mm
何情況下，電極間的距離大小根據(jù)所采用的反應(yīng)容器的幾何學(xué)構(gòu)造而定，這樣所提 供的緩沖溶液體積足以弄濕電極間區(qū)域。
本發(fā)明有利實(shí)施方式中，進(jìn)一步提供的是，在具有基本上是方形、矩形或圓形 的橫截面的反應(yīng)容器中處理生物材料。而且，所述反應(yīng)容器可以具有基本上是矩形 的反應(yīng)室，其側(cè)面由具有平行平面結(jié)構(gòu)的兩個電極所限定。
以下通過以實(shí)施例的方式參考附圖來更具體地描述本發(fā)明。
附圖簡述


圖1是基于電壓、高通量Nucleofecto,(HT-P ，德國埃麥克薩股份公司(Amaxa GmbH)) 、 20)il細(xì)胞懸液體積、1. 5mm試管缺口寬度、203mmo1/1緩沖溶液離子強(qiáng)度(電 導(dǎo)率11.3raS/cm)的飛濺頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣品的飛濺頻率，n =樣品數(shù)。
圖2是基于脈沖持續(xù)時間、高通量NucleofeCtor (HT-P ，德國埃麥克薩股份 公司)、20pl細(xì)胞懸液體積、1.5mm試管缺口寬度、129 ramo1/1緩沖溶液離子強(qiáng)度(電 導(dǎo)率7.2mS/cm)的飛濺頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣品的飛濺頻率，n = 樣品數(shù)。
圖3是基于電壓脈沖的斷開持續(xù)時間、高通量Nucleofector (HT-P ，德國埃 麥克薩股份公司)、20pl細(xì)胞懸液體積、L5mra試管缺口寬度、203ramo1/1緩沖溶液 離子強(qiáng)度(電導(dǎo)率11.3mS/cm)的飛濺頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣品的 飛濺頻率，n二樣品數(shù)。
圖4是基于未斷開的電壓間隔的最長持續(xù)時間、高通量Nucleofecto,(HT-P ， 德國埃麥克薩股份公司)、20pl細(xì)胞懸液體積、L5mm試管缺口寬度、203mmo1/1緩 沖溶液離子強(qiáng)度(電導(dǎo)率11.3mS/cm)的飛濺頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣 品的飛濺頻率，n二樣品數(shù)。
圖5是基于電導(dǎo)率和/或緩沖溶液離子強(qiáng)度、高通量Nucleofecto,(HT-e ，德 國埃麥克薩股份公司)、20nl細(xì)胞懸液體積、L5ram試管缺口寬度、緩沖溶液離子強(qiáng) 度的飛濺頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣品的飛濺頻率，11 =樣品數(shù)，緩沖 液l:離子強(qiáng)度203mmo1/1和電導(dǎo)率11. 3mS/cm，緩沖液2:離子強(qiáng)度129mmo1/1和 電導(dǎo)率7. 2raS/cm。
圖6是基于細(xì)胞懸液體積、高通量Nucleofecto,(HT-P，德國埃麥克薩股份 公司)、1.5mm試管缺口寬度、129mmol/l緩沖溶液離子強(qiáng)度電導(dǎo)率7.2mS/cm)的飛濺
頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣品的飛濺，11=樣品數(shù)。
圖7是基于細(xì)胞懸液體積、高通量Nucleofector (HT-{3 ，德國埃麥克薩股份 公司)、1.5mm試管缺口寬度、203mraol/l緩沖溶液離子強(qiáng)度電導(dǎo)率11.3mS/cm)的飛 濺頻率的條形圖，黑色陰影部分顯示各個樣品的飛濺頻率，11 =樣品數(shù)。
圖8是基于電壓脈沖斷開持續(xù)時間、高通量Nucleofecto,(HT-e，德國埃麥 克薩股份公司)、1.5mm試管缺口寬度、203mmo1/1緩沖溶液離子強(qiáng)度(電導(dǎo)率 11.3mS/cm)的轉(zhuǎn)染效率的條形圖，為了檢測轉(zhuǎn)染效率，相應(yīng)地將2 x 105個HEK293 細(xì)胞加入20|ia緩沖溶液中，再加入0. lpg的pEGFP-Cl (美國英杰生命技術(shù)有限公司 (Invitrogen))和暴露于4kV/cm的電場中，然后將細(xì)胞加入帶有100叫/ml鏈霉素、 100U/ml青霉素和10。/。馬血清(ATCC)的極限必需伊格爾培養(yǎng)基(ATCC)中，在加濕培養(yǎng) 箱中在37。C和5%0)2下培養(yǎng)24小時，最后用流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur，碧迪公司 (Becton Dickinson))檢測樣品的GFP表達(dá)，顯示各個GFP表達(dá)細(xì)胞的百分比雙倍值， 條形圖正文涉及場暴露的斷開；所有數(shù)據(jù)都用^表示，開始和結(jié)束時的數(shù)字表示未 斷開電壓間隔的持續(xù)時間，水平線之間的數(shù)字表示它們之間的斷開持續(xù)時間(P-間 歇)。
圖9是基于電壓脈沖斷開持續(xù)時間、高通量Nucle0fector (HT-f3 ，德國埃麥 克薩股份公司)、1.5腿試管缺口寬度、203rmno1/1緩沖溶液離子強(qiáng)度(電導(dǎo)率 11.3mS/cm)的轉(zhuǎn)染效率的條形圖，為了檢測轉(zhuǎn)染效率，相應(yīng)地將2 x 105加卡特E6. 1 (jurkat E6. 1)細(xì)胞加入20pl緩沖溶液中，再加入lpg的pmaxGFP(埃麥克薩)和暴 露于L25kV/cm的電場中，然后將細(xì)胞加入帶有100pg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素 和10%FCS(ATCC)的RPMI-1640培養(yǎng)基(ATCC)中，在加濕培養(yǎng)箱中在37。C和02下 培養(yǎng)24小時，最后用流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur，碧迪公司)檢測樣品的GFP表達(dá)， 顯示各個GFP表達(dá)細(xì)胞的百分比雙倍值，條形圖正文涉及場暴露的斷開；所有數(shù)據(jù) 都用^is表示，開始和結(jié)束時的數(shù)字表示未斷開電壓間隔的持續(xù)時間，水平線之間的 數(shù)字表示它們之間的斷開持續(xù)時間$=間歇)。
各種和優(yōu)選實(shí)施方式詳述
圖1顯示基于電壓的飛濺頻率的條形圖，比較了分別在有和沒有斷開的情況下 進(jìn)行的兩種不同的電壓脈沖所得的結(jié)果。第一種電壓脈沖在外部施加電壓為800V時 的預(yù)設(shè)持續(xù)時間為100w。這樣提供了可以從電壓和電極間距離計算出的約為4kV/cm 的場強(qiáng)。第二種電壓脈沖的預(yù)設(shè)持續(xù)時間也是100^is，但施加電壓是1000V，場強(qiáng)可
以由電壓計算得到，為約5kV/cm。這兩種電壓脈沖在40ps(Tl最大)后被分別斷開兩 次，即在40ns后將脈沖斷開，然后再接通，又一個40ns后再次斷開和最后在電壓 間隔20|as時結(jié)束，從而達(dá)到總預(yù)設(shè)持續(xù)時間100ns。斷開的持續(xù)時間分別為800ps(Tl 間歇)?？傮w上，各電壓脈沖由3次電壓間隔和2次斷開間隔組成，脈沖的完整持續(xù) 時間加起來總共有1700ps。這很清楚，在預(yù)設(shè)條件下施加較低電壓和/或場強(qiáng)的電壓 脈沖不會引起樣品噴濺，即在這種情況下，樣品不會飛濺。相反，較高電壓和/或場 強(qiáng)的電壓脈沖會引起樣品噴濺(第三條)。可以通過兩次斷開電壓脈沖(最后的條)可 以防止該不希望的飛濺。因此，本圖顯示， 一方面，在其它條件恒定時，隨場強(qiáng)的 升高，飛濺概率增加，另一方面，即使在非常高的場強(qiáng)下，也可以通過斷開電壓脈 沖而防止樣品從反應(yīng)容器中噴濺。至少通過斷開脈沖可以顯著降低發(fā)生飛濺的概率。
圖2顯示基于脈沖持續(xù)時間的飛濺頻率的條形圖，采用強(qiáng)度為700V(3. 5 kV/cm 場強(qiáng))的電壓脈沖，預(yù)設(shè)持續(xù)時間分別增加為200、 350、 400和600w。圖中顯示飛 濺頻率百分比隨脈沖持續(xù)時間的增加而增加。在60(^s的最長預(yù)設(shè)持續(xù)時間下，按 本發(fā)明所述斷開電壓脈沖，可以有效防止樣品的飛濺。為此，電壓脈沖在20(^s(Tl 最大)后分別斷開2次，即在2(KHis后斷開脈沖，然后再接通，又一個200)is后再次 斷開，最后在電壓間隔再次達(dá)到200(is時結(jié)束，從而達(dá)到總預(yù)設(shè)持續(xù)時間600 ns。 斷開持續(xù)時間相應(yīng)為2. 5 ras(Tl間歇)?？傮w上，各電壓脈沖是由3次電壓間隔和2 次斷開間隔組成，脈沖的總持續(xù)時間加起來總共5.6ms。這清楚說明了在電壓脈沖的 預(yù)設(shè)持續(xù)時間相對長時，引起樣品飛濺的概率高(第四條)?？梢酝ㄟ^兩次斷開電壓 脈沖來防止不希望的飛濺(最后的條)。因此， 一方面，在其它條件恒定時，飛濺概 率隨脈沖持續(xù)時間的增加變得更高；另一方面，即使在相對長的預(yù)設(shè)持續(xù)時間時， 也可以通過斷開電壓脈沖而防止樣品從反應(yīng)容器中噴濺出來。
圖3顯示基于電壓脈沖斷開持續(xù)時間的飛濺頻率的條形圖。該實(shí)施例中清楚顯 示了至少在特定的運(yùn)用和/或條件下，通過延長斷開的持續(xù)時間，可以進(jìn)一步減少樣 品飛濺。采用不斷開(第一條)、斷開11次X每次40(Vs(第二條)或斷開11次X每次 800|is (第三條)的電壓為700V(3. 5kV/cm場強(qiáng))的電壓脈沖和600ps的預(yù)設(shè)持續(xù)時間。 斷開的脈沖由長度各50pS的12次電壓間隔(T1最大)和各為40(His或800ps的11 次斷開間隔(T1間歇)組成。如果在這些條件下沒有根據(jù)本發(fā)明斷開電壓脈沖，每次 測試和/或每個樣品均會發(fā)生飛濺。在斷開持續(xù)時間為400pS時，約70%的樣品同時 發(fā)生飛濺，然而，在這些條件下，通過是斷開持續(xù)時間加倍可以完全防止飛濺。自 然狀態(tài)下，緩沖溶液中的物質(zhì)間的關(guān)系隨斷開時間的增加而'平靜'下來，因此，
在斷開后的電壓間隔期間，樣品中不會再形成氣體。圖4顯示基于未斷開電壓間隔的最大持續(xù)時間的飛濺頻率的條形圖。本試驗(yàn)實(shí) 際在與如圖3所示試驗(yàn)相同的條件下進(jìn)行，區(qū)別在于斷開持續(xù)時間(T1間歇)保持恒定在400|is，而電壓間隔的最大長度(T1最大)即產(chǎn)生電場的持續(xù)時間發(fā)生了變化。 當(dāng)對Tl最大=100^和Tl最大二40ps的試驗(yàn)進(jìn)行比較時，結(jié)果清楚顯示電壓間隔 (即直到電壓脈沖被斷開時的時間段)縮短，飛濺概率降低。而且，本實(shí)施方式中， 多個因素表明在40-5(Vs間存在閾值，即此例中，飛濺概率對T1最大不成正比關(guān)系。圖5顯示基于電導(dǎo)率和/或緩沖溶液離子強(qiáng)度的飛濺頻率的條形圖。當(dāng)采用較高 離子強(qiáng)度的緩沖液(緩沖液1:離子強(qiáng)度203mmo1/1和電導(dǎo)率11.3 mS/cm)時，飛濺 的風(fēng)險明顯高于采用較低離子強(qiáng)度的緩沖液(緩沖液2:離子強(qiáng)度129mmo1/1和電導(dǎo) 率7.2 mS/cm)發(fā)生飛濺的風(fēng)險。然而，這兩個所示實(shí)施例中，還是可以按照本發(fā)明 通過斷開電壓脈沖來防止飛濺。圖6和7分別顯示基于細(xì)胞懸液體積的飛濺頻率的條形圖。這兩張圖清楚顯示 了細(xì)胞懸液和/或緩沖溶液的體積越小，飛濺概率越高。就這點(diǎn)而言，圖6實(shí)施例顯 示，甚至在采用的體積非常小的應(yīng)用中仍可以將飛濺概率實(shí)際減少到零。圖8和9分別顯示基于電壓脈沖斷開持續(xù)時間的轉(zhuǎn)染效率的條形圖。令人驚奇 的是，轉(zhuǎn)染效率沒有受本發(fā)明電壓脈沖斷開的負(fù)面影響。本方法的效率總是維持在 大致同樣高的水平，而不管電壓脈沖是否斷開斷開(第2-5個雙柱)或未斷開(第1 和第6個雙柱)。總體上，顯示了在其它所述條件(場強(qiáng)和/或電流密度、電壓脈沖預(yù)設(shè)持續(xù)時間、 緩沖溶液體積)下，為了充分防止飛濺的發(fā)生和/或樣品從反應(yīng)容器中噴濺的概率， 電壓間隔不可以超過特定未斷開長度。這樣，在其它預(yù)設(shè)條件下的飛濺問題可通過 斷開脈沖和/或使電壓間隔不超過關(guān)鍵未斷開長度而得以解決。因此，斷開電壓脈沖 會顯著降低飛濺概率，而不會削弱方法的質(zhì)量，此情況下尤其指轉(zhuǎn)染效率。
權(quán)利要求
1.一種用電流處理生物材料的方法，包括提供不超過約50μl的離子強(qiáng)度為至少約100mmol/l的緩沖液，往所述緩沖液中加入生物材料，向所述緩沖溶液施加預(yù)設(shè)持續(xù)時間至少約10μs的至少一次電壓脈沖以產(chǎn)生場強(qiáng)為至少約1kV/cm的電場，其中所述電壓脈沖至少斷開一次接著再接通，所述斷開持續(xù)至少約100μs。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述電壓脈沖斷開2-10次。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述電壓脈沖至少一次斷開的 持續(xù)時間預(yù)設(shè)為約200ns-2ms。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)時間為約300pS、約400pS、 約500ns、約600ps、約700|iis、約800ps、約900ps、約lms或約1. 5ms。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含生物材料的緩沖溶液的總 體積為約1^1到約50pl。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述體積為約10-40|il，為約15-25^1 或約10-20^1。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述電壓脈沖產(chǎn)生了最高場強(qiáng)約為 10kV/cra的電場。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述場強(qiáng)為約1-8kV/cm，約2-6kV/cm 或約2-4kV/cm。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述電壓脈沖的預(yù)設(shè)持續(xù)時間最長 為約5ms。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述預(yù)設(shè)持續(xù)時間最長約為 20ps-2ms，約為100-lOOOps或約100-600 |as。
11. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述電壓脈沖在電壓間隔約5ps、 約10(is、約20ps、約30(is、約40ps、約50ps、約60|as、約IOOjlis或約200|as后被斷開。
12. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述電場由兩個電極產(chǎn)生，兩個電 極間的距離為約O. 5-5 mm。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述距離為約1-4mm或約1. 5-2mm。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在橫截面基本上是正方形、矩形或 圓形的反應(yīng)容器中處理所述生物材料。
15. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)容器具有基本上為矩形的 反應(yīng)室，該反應(yīng)室兩側(cè)由具有平行平面構(gòu)造的兩個電極所限定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用電流處理生物材料的方法，其中該生物材料被加入到具有相對高離子強(qiáng)度的小體積緩沖溶液中。預(yù)設(shè)好持續(xù)時間的高電壓脈沖會在緩沖溶液中產(chǎn)生強(qiáng)電場。將生物材料加入到最多50μl的離子強(qiáng)度至少為100mmol/l的緩沖溶液中。通過預(yù)設(shè)持續(xù)時間為至少10μs的至少一電壓脈沖，在緩沖溶液中產(chǎn)生場強(qiáng)至少1kV/cm的電場。電壓脈沖至少斷開至少100μs的持續(xù)時間一次，然后再次接通。
文檔編號C12N15/87GK101213306SQ200680024248
公開日2008年7月2日 申請日期2006年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日
發(fā)明者H·穆勒-哈特曼, M·哈比戈 申請人:埃麥克薩股份公司