專利名稱：植物來源分子、其編碼遺傳序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供編碼植物花防御素樣分子的遺傳分子及其在產(chǎn)生對植物害蟲包括昆蟲、微生物、真菌和/或病毒具有抗性、或至少敏感性下降的轉(zhuǎn)基因植物中的用途。本發(fā)明另外提供花和種子來源的防御素在產(chǎn)生昆蟲抗性植物中的用途。該植物可能是單子葉植物或雙子葉植物，特別是作物植物和觀賞花卉類植物。該遺傳分子還用于產(chǎn)生重組防御素樣分子，用于局部施用的組合物，以預(yù)防或者防止植物的害蟲侵染。本發(fā)明的花防御素樣分子或其編碼遺傳分子可單獨(dú)使用，或與其它物質(zhì)例如蛋白酶抑制因子前體或其編碼核酸分子、或者其它分子或其編碼核苷酸序列聯(lián)合使用。
背景技術(shù)：
本說明書參考的任何現(xiàn)有技術(shù)不是也不應(yīng)視為認(rèn)可或任何形式的暗示，該現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成澳大利亞或任何其它國家普通常識的一部分。
重組DNA技術(shù)日臻完善，極大促進(jìn)了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的研究和開發(fā)。園藝領(lǐng)域，包括作物研究領(lǐng)域尤其如此。開發(fā)除草劑抗性植物和病原體抗性植物尤為重要。
已經(jīng)采用了許多方法誘導(dǎo)植物的除草劑抗性。例如，在植物中表達(dá)失活或中和除草劑活性組分的酶的編碼基因。雖然該方法取得了一些成功，但它只是作物和作物產(chǎn)品獲得最高產(chǎn)量以及從農(nóng)藝和園藝產(chǎn)業(yè)的其它活動中獲得最大回報(bào)的多學(xué)科、多策略方法的一個(gè)部分。
農(nóng)藝和園藝產(chǎn)業(yè)面臨的主要困難之一是控制昆蟲及其它病原體的植物侵染。昆蟲及其它病原體每年造成數(shù)百萬噸的產(chǎn)量損失。盡管成功使用殺蟲劑及其它抗病原性化學(xué)試劑，但連續(xù)使用化學(xué)試劑控制植物害蟲存在一系列環(huán)境和管理問題。此外，化學(xué)農(nóng)藥使用增多正在產(chǎn)生選擇性壓力，使害蟲群體出現(xiàn)抗性。顯然需要進(jìn)一步研究誘導(dǎo)植物對病原體(例如昆蟲、微生物、真菌、蜘蛛類和病毒)抗性的選擇性機(jī)制。
已經(jīng)采用了許多遺傳方法進(jìn)行試驗(yàn)。雖然取得了一些成功，開發(fā)新的、其它的遺傳方法，與抗性難題作斗爭仍很重要。
已建議的方法使用一組通稱為″防御素″(defensins)的蛋白質(zhì)。防御素以前稱為γ-硫素(thionins)，其結(jié)構(gòu)上不同于α-和β-硫素家族。迄今分離和研究的大多數(shù)防御素來自種子，特別是蘿卜(Raphanus sativus)及其它十字花科(Brassicaceae)家族成員的種子。種子防御素是小(～5kDa)骨架、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，許多具有抗真菌活性。
前幾年從茄科(solanaceous)植物和擬南芥(Arabidopsis)的花器中分離了幾種編碼種子防御素相關(guān)蛋白質(zhì)的cDNA克隆。與種子防御素不同，花防御素由除防御素結(jié)構(gòu)域之外還有酸性C端結(jié)構(gòu)域的前體蛋白質(zhì)生成。該酸性結(jié)構(gòu)域的作用未知。
除了高度保守的8個(gè)半胱氨酸殘基以外，該防御素結(jié)構(gòu)域幾乎沒有序列與種子來源的防御素相同。盡管分離了幾種編碼花防御素的cDNA，但尚未分離相應(yīng)的蛋白質(zhì)，也未研究其生物學(xué)功能。本發(fā)明人從觀賞性煙草植物花煙草(Nicotiana alata)中分離了cDNA及其對應(yīng)的花防御素。已經(jīng)確定該防御素前體經(jīng)蛋白水解加工，從酸性C端結(jié)構(gòu)域釋放成熟的防御素。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人確定，花防御素具有用于防止植物害蟲攻擊或侵染的有用特性。另外證明花煙草的花防御素控制昆蟲攻擊特別有效。本發(fā)明還提供了種子和已知的花防御素在控制植物害蟲侵染中的新用途。
發(fā)明概述貫穿本說明書，除非上下文需要，否則單詞包含(comprise)或其變體(例如comprises或comprising)應(yīng)當(dāng)理解為，是指包含所述成分或整體、或者成分或整體組，而不排除任何其它的成分或整體、或者成分或整體組。
通過序列識別編號(SEQ ID NO)提及核苷酸和氨基酸序列。SEQID NOs以數(shù)字對應(yīng)序列標(biāo)識符<400>1、<400>2等。于權(quán)利要求書之后提供序列表。
本發(fā)明一般涉及單獨(dú)或與其它遺傳分子聯(lián)合的遺傳分子，及其在誘導(dǎo)植物或植物部分對病原體侵染(例如但不限于昆蟲侵染)的抗性中的用途。更特別而言，本發(fā)明提供了編碼防御素樣分子的遺傳分子，單獨(dú)的或與編碼蛋白酶抑制因子或其前體的遺傳分子或其它活性分子聯(lián)合，以防止植物中昆蟲、微生物、真菌、蜘蛛類或病毒的攻擊或其它形式的侵染。本發(fā)明另外包括包含單獨(dú)的或與蛋白酶抑制因子或其前體或其它活性分子聯(lián)合的防御素樣分子的組合物，用于局部施用給植物或植物部分，以有助于控制植物的昆蟲、微生物、真菌、蜘蛛類或病毒的侵染。本發(fā)明進(jìn)一步包含該目的遺傳分子在制備對昆蟲、微生物、真菌、蜘蛛類或病毒的攻擊或其它形式的侵染具有抗性或至少敏感性降低的轉(zhuǎn)基因植物中的用途。該防御素分子也可能用作攜帶異源氨基酸序列的分子構(gòu)架，該處的分子折疊改變?yōu)楦呋钴S的形式。本發(fā)明進(jìn)一步包括包含天然結(jié)合該防御素樣分子編碼基因的啟動子和/或其它調(diào)節(jié)序列的遺傳構(gòu)建體。該啟動子和/或其它調(diào)節(jié)序列可能可操作性地連接編碼防御素樣蛋白質(zhì)的cDNA分子，或者可操作性連接另一目的基因或核苷酸序列，例如但不限于編碼蛋白酶抑制因子前體的基因。本發(fā)明還另外涉及對昆蟲、微生物、真菌和/或病毒的攻擊或其它形式的侵染具有抗性或至少敏感性降低的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物的部分。特別優(yōu)選的植物是糧食和非糧食作物，例如棉花植物。
因此，本發(fā)明一方面提供包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
本發(fā)明另一方面涉及包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域包含以下結(jié)構(gòu)a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有對抗一種或多種植物害蟲的活性，附帶條件是該多肽不是FST或TPP3。
本發(fā)明另一方面包括包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花瓣和萼片的表皮層、花柱的皮層細(xì)胞以及花藥的結(jié)締組織中生成，其成熟結(jié)構(gòu)域包含以下結(jié)構(gòu)a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有對抗一種或多種植物害蟲的活性，附帶條件是該多肽不是FST或TPP3。
本發(fā)明另一方面提供了包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該成熟結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列、或與其具有至少約70％相似性的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO7所示核苷酸序列、或與其具有至少約70％相似性的核苷酸序列、或在42℃低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能夠與SEQ IDNO7雜交的核苷酸序列編碼。
本發(fā)明另一方面提供了包含與編碼來源于花的防御素樣分子的核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物的遺傳構(gòu)建體，該防御素樣分子具有包含以下氨基酸序列的成熟結(jié)構(gòu)域a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII
其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲(例如昆蟲害蟲)的抑制性活性，附帶條件是該防御素樣分子不是FST或TPP3。
本發(fā)明另一方面涉及該成熟結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，其包含以下氨基酸序列[SEQ ID NO58]X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61C其中X30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或G
X50＝T，S，I，或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或H本發(fā)明另一方面涉及可操作性連接包含以下氨基酸序列[SEQ IDNO59]的信號結(jié)構(gòu)域的成熟結(jié)構(gòu)域編碼序列MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或M
X13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或VX25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸，A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或Q本發(fā)明另一方面涉及可操作性連接包含以下氨基酸序列[SEQ IDNO60]的酸性C端結(jié)構(gòu)域的成熟結(jié)構(gòu)域編碼序列X62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94X95其中X62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或S
X69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E本發(fā)明另一方面涉及包含以下序列[SEQ ID NO61]的防御素樣分子
MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61CX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或V
X25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸或A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或QX30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或R
X54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或HX62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或L
X83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E本發(fā)明另一方面涉及遺傳構(gòu)建體，其包含選自SEQ ID NO7、SEQID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17的核苷酸序列，或與SEQID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18中的一個(gè)或多個(gè)具有至少約70％相似性的核苷酸序列，或能夠與SEQ IDNO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17或其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面涉及用于產(chǎn)生昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物的遺傳構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)基因植物生成防御素或防御素樣分子，其選自SEQ IDNO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18以及SEQ IDNO20到SEQ ID NO49、或者與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQID NO16和SEQ ID NO18中任何一個(gè)具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面還包含產(chǎn)生對植物害蟲抗性提高或增強(qiáng)的植物的方法，該方法包含將遺傳構(gòu)建體引入一個(gè)或一群植物細(xì)胞的基因組中，該遺傳構(gòu)建體包含與來源于花的防御素樣分子的編碼核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物，該防御素樣分子具有包含以下氨基酸序列的成熟結(jié)構(gòu)域a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲(例如昆蟲害蟲)的抑制性活性，并從該細(xì)胞或細(xì)胞群再生出植物。
本發(fā)明另一方面涉及包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO58]的成熟結(jié)構(gòu)域的防御素樣分子X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56RX57CX59CTX60X61C其中X30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝Λ，Y或VX47＝I，L，Q或H
X48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I，或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或H本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生對昆蟲抗性提高或增強(qiáng)的植物的方法，該方法包含將遺傳構(gòu)建體引入一個(gè)或一群植物細(xì)胞的基因組中，該遺傳構(gòu)建體包含與防御素樣分子的編碼核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物，該防御素樣分子具有包含以下氨基酸序列的成熟結(jié)構(gòu)域a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲(例如昆蟲害蟲)的抑制性活性，并從該細(xì)胞或細(xì)胞群再生出植物。
本發(fā)明另一方面提供了來自植物或轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，該細(xì)胞、組織或器官包含含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
本發(fā)明另一方面涉及包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域包含以下結(jié)構(gòu)a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
本發(fā)明另一方面在其范圍內(nèi)涉及改造為表達(dá)防御素樣分子或其變體或同系物的編碼核酸分子的植物，進(jìn)一步延伸到該植物的子代，以及該植物的營養(yǎng)、繁殖和再生部分，例如花(包括切或割的花)、植物部分、植物的纖維物質(zhì)(例如棉)以及再生部分，包括插枝、花粉、種子和愈傷組織。
本發(fā)明另一方面提供能夠生成此處所述異源防御素樣分子的遺傳修飾的植物細(xì)胞、或多細(xì)胞植物或其子代、或遺傳修飾植物的部分，其中該轉(zhuǎn)基因植物對植物害蟲例如昆蟲具有抗性或敏感性降低。
本發(fā)明另一方面包含一種或多種單獨(dú)或聯(lián)合的包含與第一核苷酸序列可操作性連接的第一啟動子的遺傳構(gòu)建體，其中該第一核苷酸序列編碼能夠防止植物害蟲例如昆蟲的防御素樣分子，該構(gòu)建體進(jìn)一步包含與第二核苷酸序列可操作性連接的第二啟動子，其中該第二核苷酸序列編碼蛋白酶抑制因子或其前體。
附圖簡述圖1代表花煙草花防御素的編碼cDNA NaPdf1(花煙草植物防御素1)的核苷酸序列(SEQ ID NO17)和預(yù)測的氨基酸序列(SEQ IDNO18)。只顯示了具有mRNA極性的一條鏈，核苷酸在上方編號。核苷酸序列下方給出了單字母編碼的氨基酸序列，從成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸開始編號為1。推定的信號肽由負(fù)數(shù)表示，并加下劃線。成熟蛋白質(zhì)加亮表示，箭頭所指為預(yù)測的信號肽斷裂位點(diǎn)以及成熟蛋白質(zhì)的末端。第一個(gè)終止密碼子標(biāo)記為星號(*)，兩個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)為粗體。詳情參看實(shí)施例7。
圖2為圖解表示各種花煙草組織中NaPdf1表達(dá)的RNA凝膠印跡分析。從花煙草(自交不親和性基因型S2S2)發(fā)育I期(5-10mm花蕾)、II期(20-30mm花蕾)和III期(50-70mm花蕾)的花藥、花粉粒以及成熟雌蕊、子房、花瓣、葉和根組織中分離總RNA，如圖A所示。圖B顯示經(jīng)溴化乙錠染色的相同RNA樣品。
圖3放射自顯影圖，顯示NaPdf1 RNA的原位定位。(A)1cm長花蕾的橫切面，與35S標(biāo)記的NaPdf1反義RNA探針雜交。檢測到花瓣(Pe)和萼片(Se)的表皮細(xì)胞、雌蕊(Pi)的皮質(zhì)細(xì)胞以及花藥(A)的結(jié)締組織為重標(biāo)記。(B)與A相同的切面，較高放大倍數(shù)。(C)與B類似的切面，與35S標(biāo)記的NaPdf1有義RNA探針雜交。觀察到雌蕊(Pi)、花藥(A)、花瓣(Pe)或萼片(Se)的任何細(xì)胞均未標(biāo)記。
圖4A顯示細(xì)菌性表達(dá)N端六聚組氨酸標(biāo)簽的NaPdf1 cDNA編碼的前防御素(6H.NaproPdf1)。泳道11mM IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)后提取的總蛋白，處于1xSDS載樣緩沖液中。泳道2處于8M尿素溶解物中的可溶性蛋白質(zhì)。泳道3IMAC純化的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)。利用15％w/vSDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，考馬斯藍(lán)染色。分子大小標(biāo)志為Bio-Rad的寬范圍標(biāo)準(zhǔn)。誘導(dǎo)的～12kDa蛋白質(zhì)(箭頭所示)經(jīng)固化金屬親合層析(IMAC)，基本純凈。
圖4B顯示金屬親合純化的6H.NaproPdf1蛋白質(zhì)(A的IMAC)樣品的反相HPLC層析，如實(shí)施例5所示洗脫。
圖5顯示利用針對細(xì)菌表達(dá)NaPdf1 cDNA克隆編碼的前防御素(6H.NaproPdf1)產(chǎn)生的抗體，對植物提取物的免疫印跡分析。(A)圖示花煙草花發(fā)育的5個(gè)期。(B)來自(A)中所示花發(fā)育期的花的緩沖液可溶性蛋白質(zhì)(60μg)的免疫印跡圖。利用15％w/v SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素(0.22μm)，利用針對細(xì)菌表達(dá)的6H.NaproPdf1(參見圖4)產(chǎn)生的抗體(1∶2500)進(jìn)行免疫印跡。該抗體特異性結(jié)合三種蛋白質(zhì)。最小的是預(yù)計(jì)的成熟防御素大小(～5kDa)，兩個(gè)較大的可能是前體和加工中間體。詳情參見實(shí)施例4和5。
圖6顯示純化來自花蕾的成熟的花煙草防御素。(A)AquaporeRP-300 C8柱(4.6mm×100mm，Brownlee)的反相HPLC。從花蕾提取蛋白質(zhì)，RP-HPLC之前經(jīng)凝膠過濾層析(參見實(shí)施例5)部分純化。蛋白質(zhì)處于0.1％v/v TFA中，用60％v/v乙腈的0.089％v/v TFA(緩沖液B)洗脫，梯度為40分鐘內(nèi)0-100％緩沖液B，流速1mL/分鐘。利用215nm吸光值檢測洗脫的蛋白質(zhì)。通過15％w/v SDS PAGE分離峰A中(插入的)蛋白質(zhì)，利用抗6H.NaproPdf1抗體進(jìn)行免疫印跡(實(shí)施例4)。(B)N端測序和質(zhì)譜分析術(shù)證實(shí)峰A為NaPdf1 cDNA克隆編碼的成熟防御素結(jié)構(gòu)域?！鍃″對應(yīng)于未確定的氨基酸，從cDNA序列預(yù)測可能為半胱氨酸。
圖7是顯示花煙草防御素在10mm花蕾的花藥和子房中定位的一系列電子顯微照片。(A)觀察花藥顯示液泡內(nèi)電子致密沉積區(qū)的結(jié)締組織細(xì)胞(箭頭所示)。(B)防御素于花藥的結(jié)締組織細(xì)胞的免疫金定位?？贵w與液泡的電子致密沉積區(qū)(v)相結(jié)合，而不結(jié)合細(xì)胞質(zhì)(ct)或細(xì)胞壁(cw)。(C)防御素于子房的皮質(zhì)細(xì)胞的免疫金定位?？贵w特異性結(jié)合液泡中的電子致密沉積區(qū)，未觀察到結(jié)合細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞壁。
圖8為從編碼花和種子防御素的cDNA克隆預(yù)測的前體蛋白質(zhì)的示意圖。(A)某些花防御素生成為具有三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域的前體蛋白質(zhì)ER信號序列(圖示左部)、主要的基本結(jié)構(gòu)域(圖示中部)以及富含酸性氨基酸的C端結(jié)構(gòu)域(圖示右部)。圖下所示花煙草防御素每個(gè)結(jié)構(gòu)域的預(yù)計(jì)大小。成熟的花防御素在蛋白水解斷裂(箭頭所示)之后釋放。(B)種子來源的防御素cDNAs編碼的蛋白質(zhì)具有ER信號序列以及基本的防御素結(jié)構(gòu)域，但無C端酸性結(jié)構(gòu)域。
圖9為NaPdf1的氨基酸序列與其它五個(gè)來源于花的cDNA克隆編碼的預(yù)計(jì)氨基酸序列的比對，如下所述FST Gu等人，Mol.Gen.Genet.23489-96，(花特異性硫素)1992；TPP3 Milligan和Gasser，Plant Mol.Biol.28691-711，1995；NTS 13Li和Gray，Plant Physiology 120633，1999；PPT Karunanandaa等人，Plant Mol.Biol.，26459-464，1994；ATPIIIa Yu等人，直接提交，登錄號S30578，1999.
某些而非所有的花防御素具有32-33個(gè)氨基酸的C端酸性結(jié)構(gòu)域。
圖10為NaPdf1成熟結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與植物防御素家族其它成員的成熟結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比對?！錺Q″代表的Rs-AFP1、Rs-AFP2、M1、M2A和M2B序列中的N端氨基酸為焦谷氨酸。序列來自下列來源FST Gu等人，(1992；同上)(SEQ ID NO25)；TPP3Milligan和Gasser(1995；同上)(SEQ IDNO26)；p322Steikema等人，Plant Mol.Biol.11255-269，1988(SEQ ID NO27)；PPT Karunanandaa等人，(1994；同上)(SEQ IDNO28)；SE60Choi等人，Plant Physiology 101699-700，1993；Choi等人，Mol.Gen.Genet.246266-268，1995(SEQ ID NO29)；γ1-H Mendez等人，Eur.J.Biochem.194533-539，1990(SEQ ID NO30)；
M2A，M1和Neumann等人，Int.J.Protein & PeptideM2BResearch 47437-446，1996(分別為SEQ IDNO31，SEQ ID NO35和SEQ ID NO36)；Pth-St1Moreno等人，Eur.J.Biochem.223135-139，1995(SEQ ID NO32)；Rs-AFP1和Terras等人，J.Biological Chemistry 267Rs-AFP215301-15309，1992；Terras等人，F(xiàn)EBSLetters 316233-240，1993；Terras等人，Plant Cell 7573-588，1995；以及Fant等人，The solution structure by 1H-NMR of Rs-AFP1，a plant antifungal protein fromradish seeds.InLP Ingman，J Jokissaari，J Lounila(eds)，Abstracts of the 12thEuropean Experimental NMR Conference，p247，1994(分別為SEQ ID NO33和SEQ IDNO34)；γ1-P Collila等人，F(xiàn)EBS Letters 270191-194，1990(SEQ ID NO37)；γ2-P Collila等人，(1990；同上)(SEQ ID NO38)；10kDa Ishibashi等人，Plant Mol.Biol.1559-64，1990(SEQ ID NO39)；SIα2，SIα3 Bloch和Richardson，F(xiàn)EBS Letters 279101-和SIα1104，1991以及Nitti等人，Eur.J.Biochem.
228250-256，1995(分別為SEQ ID NO40，SEQ ID NO41和SEQ ID NO43)；Dm-AMP2，Ah-AMP1，Hs-AFP1，Dm-AMP1和
Ct-AMP1Osborn等人，F(xiàn)EBS Letters 368257-262，1995(分別為SEQ ID NO42，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47和SEQ IDNO49)；pI230和P Chiang and Hagwiger，Mol.Plant-Microbe139Interact.4324-331，1991(分別為SEQ IDNO44和SEQ ID NO48)；NeThio1和Yamada等人，Plant Physiology 115314，NeThio21997；(SEQ ID NO50和SEQ ID NO51)；以及NpThio1Komori等人，Plant Physiology 115314，1997(SEQ ID NO52).
圖11顯示通過監(jiān)控595nm吸光值得到的各種試劑抗灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)的生長抑制曲線。每種處理按一式四份進(jìn)行。測定20μg/ml的純化NaPdf1蛋白質(zhì)。水和卵清蛋白(20μg/ml)作為陰性對照，抗真菌蛋白質(zhì)α-和β-嘌呤硫素(purothionin)的混合物(20μg/ml)用作陽性對照。
圖12顯示通過監(jiān)控595nm吸光值得到的各種試劑抗尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)f.sp.diantgi(A)和f.sp.vasinfectum(B和C)的生長抑制曲線。每種處理按一式四份進(jìn)行。測定20μg/ml(A和B)以及10μg/ml(C)的純化NaPdf1蛋白質(zhì)。水和卵清蛋白(20μg/ml，A和B；10μg/ml，C)作為陰性對照，抗真菌蛋白質(zhì)α-和β-嘌呤硫素的混合物(20μg/ml，A和B；10μg/ml，C)用作陽性對照。
圖13圖示用于轉(zhuǎn)化煙草和棉花的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pFL1和pHEX3。兩個(gè)構(gòu)建體均包含位于CaMV35S啟動子/終止子控制下的花煙草防御素NaPdf1。命名為″surB″的區(qū)域編碼除草劑glean抗性，名為″nptII″的區(qū)域編碼抗生素卡那霉素抗性。
圖14顯示蛋白質(zhì)印跡圖，表明在轉(zhuǎn)基因煙草植物中表達(dá)(A)花煙草蛋白酶抑制因子(NaPI)蛋白質(zhì)和(B)NaPdf1蛋白質(zhì)。在A中，泳道125ng NaPI；泳道2100ng NaPI；泳道3pHEX3.4；泳道4未轉(zhuǎn)化的W38以及泳道5pFL1/W19。在B中，泳道1pHEX3.4；泳道2pFL1/W19；泳道3未轉(zhuǎn)化的W38以及泳道4花煙草花蕾提取物。(C)表明在轉(zhuǎn)基因棉株中表達(dá)NaPdf1蛋白質(zhì)。泳道125ng純化的NaPdf1；泳道2植物CT28.14.1(利用無關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)以及泳道3植物CT35.9.1(利用pHEX3轉(zhuǎn)化)。
圖15顯示飼喂NaPdf1基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草(N.tabacum)葉(pHEX3.4和pFL1/W19系)以及未轉(zhuǎn)化的W38親本植物的澳洲棉鈴蟲(H.punctigera)和棉鈴蟲(H.armigera)的生長曲線。(A)第2-18天測定的澳洲棉鈴蟲幼蟲的存活率，(B)第7-18天測定的澳洲棉鈴蟲幼蟲的平均重量，(C)第3-23天測定的棉鈴蟲幼蟲的存活率，(D)第6-23天測定的棉鈴蟲幼蟲的平均重量。
圖16顯示飼喂包含0.03％NaPdf1、0.3％NaPdf1、0.3％NaPI或酪蛋白(對照)而非待測蛋白質(zhì)的人工食物的棉鈴蟲幼蟲平均重量。飼喂6、9、12和14天以后測定幼蟲重量。
圖17顯示飼喂NaPdf1轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉(CT35.9.4和CT35.125.1系)以及未轉(zhuǎn)化的親本Coker 315的棉鈴蟲幼蟲在第8天的平均重量。
表1概述了氨基酸和核苷酸序列的標(biāo)識符。
表2用于棉鈴蟲飼喂試驗(yàn)的人工食物成分表1
表2
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明部分基于花來源的植物防御素樣分子的生物學(xué)特性的確定，以及闡明種子來源的防御素和先前已知的花來源的防御素的新特性。重要的是描述顯示抗植物病原體、特別是植物害蟲例如昆蟲和真菌活性的新的花來源的防御素樣分子。也描述了預(yù)期顯示抗昆蟲活性的其它防御素分子。
因此，本發(fā)明一方面提供包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
本發(fā)明這一方面不涉及防御素FST[花特異性硫素](Gu等人，{1992；同上})或TPP3(Milligan和Gasser，{1995；同上})。
此處涉及到的″多肽″包括肽或蛋白質(zhì)。多肽一般包含半胱氨酸殘基，其在花及非花來源的防御素分子中的位置是保守的?？扇缦麓_定八個(gè)半胱氨酸殘基的位置a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基。
因此，本發(fā)明另一方面涉及包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域包含以下結(jié)構(gòu)a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字表示的位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性，條件是該多肽不是FST或TPP3。
術(shù)語″分離″是指核酸分子經(jīng)受至少一個(gè)從更復(fù)雜的溶液或來源中分離、或濃縮、或富集的步驟。例如，術(shù)語″分離″包括核酸分子通過沉淀、離心、電泳、微濾、電穿孔或?qū)游鰪纳飳W(xué)或化學(xué)樣品中濃縮或富集。然而術(shù)語″分離″決不意在將核酸分子限制于特定位置或狀態(tài)，本發(fā)明涉及引入細(xì)胞基因組中的核酸分子、或者其基因組中已經(jīng)引入核酸分子的細(xì)胞子代中存在的核酸分子。
此處涉及的″核酸分子″包括涉及的DNA或RNA(例如mRNA)或DNA/RNA雜合體。核酸分子可特別視為遺傳分子、核苷酸序列或多核苷酸序列。優(yōu)選地，盡管本發(fā)明涉及基因組形式的核酸分子，核酸分子是cDNA分子。本發(fā)明的核酸分子也可能分別編碼N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域和/或酸性C端結(jié)構(gòu)域或其組合。例如，核酸分子可能編碼可操作性連接成熟結(jié)構(gòu)域的N端信號結(jié)構(gòu)域。另外，它可能編碼可操作性連接酸性C端結(jié)構(gòu)域的成熟結(jié)構(gòu)域。核酸分子也可能編碼所有三個(gè)結(jié)構(gòu)域或包含來自其它防御素或防御素樣分子的異源結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明包括異源防御素樣分子的開發(fā)，并提供拓寬抗昆蟲或抗害蟲譜的方法。異源分子也可能包含多個(gè)成熟結(jié)構(gòu)域和隨機(jī)重復(fù)的成熟結(jié)構(gòu)域、或者活性所需的其它結(jié)構(gòu)域。
此處涉及到″花發(fā)育″期間的多肽生成包括涉及在花部分的生成，例如但不限于在花區(qū)的雌蕊、花藥、子房、萼片和花瓣的生成。優(yōu)選地，在花瓣和萼片表皮層、花柱皮層細(xì)胞以及花藥的結(jié)締組織生成多肽。
因此，本發(fā)明另一方面包括包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花瓣和萼片的表皮層、花柱的皮層細(xì)胞以及花藥的結(jié)締組織中生成，其成熟結(jié)構(gòu)域包含以下結(jié)構(gòu)a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII
其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字表示的位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性，附帶條件是該多肽不是FST或TPP3。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽包含兩個(gè)或多個(gè)具有抗一種或多種植物害蟲活性的成熟結(jié)構(gòu)域以及可選的N端信號結(jié)構(gòu)域和可選的酸性C端結(jié)構(gòu)域。后一實(shí)施方案的多肽應(yīng)視為融合多肽。
本發(fā)明多肽的生成部位可能依據(jù)表達(dá)該核酸分子所用的遺傳構(gòu)建體而變化。例如，可能使用發(fā)育調(diào)節(jié)和/或組織特異性啟動子，在任何組織種直接表達(dá)該核酸分子。然而，天然存在的多肽在花發(fā)育期間生成，更特別地，在花的上述組織中生成。
術(shù)語″植物害蟲″對于本發(fā)明防御素樣分子針對的生物體類型沒有任何限制。植物害蟲包括昆蟲、蜘蛛類、微生物、真菌或病毒。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物害蟲是昆蟲。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，從花煙草及相關(guān)物種、或其變種或種株中分離該防御素樣分子或其編碼核酸分子?；煵莘烙爻墒旖Y(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如下(單字母編碼)RECKTESNTF PGICITKPPC RKACISEKFT DGHCSKILRR CLCTKPC[SEQ ID NO8]SEQ ID NO8的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO7所述。
本發(fā)明涉及SEQ ID NO8的新變體，例如氨基酸序列與SEQ IDNO8所示序列具有至少約70％相似性的變體，或者由能夠在42℃、低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與SEQ ID NO8的編碼核苷酸序列(即SEQ ID NO7)雜交的核苷酸序列編碼的變體。
因此，本發(fā)明另一方面提供了包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該成熟結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO8所示序列、或與其具有至少約70％相似性的氨基酸序列，或SEQ ID NO7所示核苷酸序列、或與其具有至少約70％相似性的核苷酸序列、或能夠在42℃、低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與SEQ ID NO7或其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
此處所用術(shù)語″相似性″包括所比較的序列之間在核苷酸或氨基酸水平上完全一致。如果在核苷酸水平上不一致，″相似性″包括導(dǎo)致氨基酸不同、但不過在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的序列間的差異。如果在氨基酸水平上不一致，″相似性″包括仍然在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的氨基酸。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在一致性而非相似性水平上進(jìn)行核苷酸及序列比較。
用于描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸或多肽之間序列關(guān)系的術(shù)語包括″參考序列″、″比較窗口″、″序列相似性″、″序列一致性″、″序列相似性百分比″、″序列一致性百分比″、″基本相似″和″基本一致″?！鍏⒖夹蛄小彘L度為至少12個(gè)、但往往15-18個(gè)、通常至少25個(gè)或以上，例如30個(gè)單體單位，包括核苷酸和氨基酸殘基。由于兩個(gè)多核苷酸可能各包含(1)兩個(gè)多核苷酸之間的相似序列(即只是完整多核苷酸序列的一部分)，以及(2)兩個(gè)多核苷酸之間的差異序列，一般通過在″比較窗口″比較兩個(gè)多核苷酸序列，鑒別和比較局部區(qū)域的序列相似性，進(jìn)行兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較?！灞容^窗口″是指一般12個(gè)連續(xù)殘基的與參考序列比較的概念性片段。為了兩個(gè)序列的最佳比對，比較窗口可能包含與參考序列(不包含添加或缺失)相比大約20％或更少的添加或缺失(即空位)。排列比較窗口，進(jìn)行序列的最佳比對，可通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)，或者通過所選任何方法得到的校驗(yàn)和最佳比對(即在比較窗口產(chǎn)生最高同源性百分比)來進(jìn)行。也可以參考BLAST程序家族，例如Altschul等人(Nucl.Acids Res.253389，1997)公開的程序?？梢栽贏usubel等人的19.3單元找到序列分析的詳細(xì)論述(″CurrentProtocols in Molecular Biology″John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章)。
此處所用術(shù)語″序列相似性″和″序列一致性″是指序列比較窗口內(nèi)，基于核苷酸比核苷酸、或氨基酸比氨基酸的一致或者功能或結(jié)構(gòu)上相似的程度。因此，例如″序列一致性百分比″是通過比較窗口比較中兩個(gè)最佳比對的序列，確定兩個(gè)序列中存在的相同的核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數(shù)，得到匹配的位置數(shù)，將匹配的位置數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)(即窗口大小)，結(jié)果乘以100，得到序列一致性百分比。為了本發(fā)明目的，″序列一致性″應(yīng)當(dāng)理解為是指通過DNASIS計(jì)算機(jī)程序(windows版本2.5；得自Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA)，采用軟件所附參考手冊中使用的標(biāo)準(zhǔn)缺省值計(jì)算的″匹配百分比″。類似說明適用于有關(guān)序列相似性。
此處提及的″低嚴(yán)謹(jǐn)性″包括并包含至少大約0-15％v/v甲酰胺和至少大約1-2M鹽用于雜交，以及至少大約1M-2M鹽用于洗滌條件。低嚴(yán)謹(jǐn)性一般為大約25-30℃到大約42℃。溫度可能變化，較高溫度用于替換甲酰胺和/或給出另一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)性條件。必要時(shí)可應(yīng)用另一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)性條件，例如中等嚴(yán)謹(jǐn)性，其包括并包含至少大約16％-30％v/v甲酰胺和至少大約0.5M-0.9M鹽用于雜交，以及至少大約0.5M-0.9M鹽用于洗滌條件，或者高嚴(yán)謹(jǐn)性，其包括并包含至少大約31％-50％v/v甲酰胺和至少大約0.01M-0.15M鹽用于雜交，以及至少大約0.01M-0.15M鹽用于洗滌條件。一般在Tm＝69.3+0.41(G+C)％進(jìn)行洗滌(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5109，1962)。但雙鏈DNA錯配堿基對的數(shù)目每增加1％，其Tm降低1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.4683，1974)。在這些雜交條件中，甲酰胺是可選的。因此，如下確定特別優(yōu)選的嚴(yán)謹(jǐn)性水平低嚴(yán)謹(jǐn)性為6xSSC緩沖液、0.1％w/v SDS、25-42℃；中度嚴(yán)謹(jǐn)性為2xSSC緩沖液、0.1％w/v SDS、溫度20℃-65℃；高嚴(yán)謹(jǐn)性為0.1xSSC緩沖液、0.1％w/v SDS、溫度至少65℃。
本發(fā)明此處舉例說明有關(guān)花煙草的防御素樣分子。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明涉及任何植物的任何新的花來源的防御素樣分子，只要該分子具有抗植物害蟲、特別是昆蟲的活性。本發(fā)明涉及防御素樣分子的衍生物，包括異源分子，以及已知的防御素作為抗昆蟲分子的用途。
提及″防御素樣分子″是為了強(qiáng)調(diào)本發(fā)明涉及防御素分子同系物的事實(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供遺傳構(gòu)建體，用于在植物中表達(dá)防御素樣分子的編碼核苷酸序列，以保護(hù)植物免受植物害蟲。
因此，本發(fā)明另一方面提供了包含與來源于花的防御素樣分子的編碼核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物的遺傳構(gòu)建體，該防御素樣分子的成熟結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸序列a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字表示的位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲(例如昆蟲害蟲)的抑制性活性，附帶條件是該防御素樣分子不是FST或TPP3。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該成熟結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列包含以下氨基酸序列[SEQ ID NO58]X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61C其中X30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或E
X33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I，或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或H
該成熟結(jié)構(gòu)域編碼序列可能可操作性地連接包含以下氨基酸序列[SEQ ID NO59]的信號結(jié)構(gòu)域MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或V
X25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸或SX27＝無氨基酸，A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或Q有時(shí)該成熟結(jié)構(gòu)域編碼序列可能可操作性連接包含以下序列[SEQID NO60]的酸性C端結(jié)構(gòu)域X62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94其中X62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或K
X81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E在另一實(shí)施方案中，該防御素樣分子包含以下序列[SEQ IDNO61]MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X2X28AX29X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X23CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58X59CTX60X61CX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79X80X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或S
X8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或VX25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸或A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或QX30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或R
X37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或HX62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或K
X66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該遺傳構(gòu)建體包含選自SEQ ID NO8、SEQID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18的氨基酸序列的編碼核苷酸序列。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該遺傳構(gòu)建體包含選自SEQ IDNO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17的核苷酸序列，或與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ IDNO18中的一個(gè)或多個(gè)具有至少約70％相似性的核苷酸序列，或能夠與SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17或其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列。
最優(yōu)選地，該氨基酸序列相應(yīng)于成熟結(jié)構(gòu)域，并包含SEQ IDNO8所示氨基酸序列。
提及的SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ IDNO18包括與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQID NO18中任何一個(gè)具有至少約70％相似性的新變體。這些序列也可能用于產(chǎn)生多聚或異源分子。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，該構(gòu)建體用于產(chǎn)生對植物害蟲(例如昆蟲)、攻擊或侵染的抗性提高或增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，該構(gòu)建體單獨(dú)用于此目的。但該構(gòu)建體可能用于在微生物(例如細(xì)菌)中產(chǎn)生重組防御素樣分子。本發(fā)明涉及編碼用于對抗昆蟲侵染的任何防御素或防御素樣分子的遺傳構(gòu)建體。例如，該構(gòu)建體可能用來產(chǎn)生對抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物。
因此，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生昆蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的遺傳構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生防御素或防御素樣分子，其選自SEQ IDNO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18以及SEQ IDNO20到SEQ ID NO49、或者與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQID NO16和SEQ ID NO18中任何一個(gè)具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
如上所述，植物包括單子葉植物或雙子葉植物。特別地，有用的植物為食物作物，例如小麥、稻、大麥、大豆和甘蔗。特別有用的非食物普通作物包括棉花?；ê陀^賞性作物包括玫瑰、康乃馨、矮牽牛、洋桔梗(lisianthus)、百合、鳶尾、郁金香、小蒼蘭、飛燕草、補(bǔ)血草和天竺葵。
本發(fā)明進(jìn)一步包括產(chǎn)生對植物害蟲抗性提高或增強(qiáng)的植物的方法，該方法包含將遺傳構(gòu)建體引入一個(gè)或一群植物細(xì)胞的基因組中，該遺傳構(gòu)建體包含與花來源的防御素樣分子的編碼核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物，該防御素樣分子的成熟結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸序列a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字表示的位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲(例如昆蟲害蟲)的抑制性活性，并從該細(xì)胞或細(xì)胞群再生出植物。在一方面，該實(shí)施方案不涉及防御素樣分子FST和TPP3。
優(yōu)選的植物害蟲是昆蟲。
優(yōu)選地，該防御素樣分子包含具有以下氨基酸序列[SEQ IDNO58]的成熟結(jié)構(gòu)域X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61C其中X30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或H
X38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I，或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或H更優(yōu)選地，該成熟結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示氨基酸序列。
最優(yōu)選地，該成熟結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生對昆蟲抗性提高或增強(qiáng)的植物的方法，該方法包含將遺傳構(gòu)建體引入一個(gè)或一群植物細(xì)胞的基因組中，該遺傳構(gòu)建體包含與防御素樣分子的編碼核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物，該防御素樣分子的成熟結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸序列a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字表示的位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲(例如昆蟲害蟲)的抑制性活性，并從該細(xì)胞或細(xì)胞群再生出植物。
優(yōu)選的防御素選自SEQ ID NO8、SEQ ID NO18和SEQ IDNO20至SEQ ID NO49。
上述成熟結(jié)構(gòu)域包括這些結(jié)構(gòu)域的片段和衍生物。
此處所用術(shù)語″片段″是指該成熟結(jié)構(gòu)域親本的一段或一部分，其優(yōu)選保持親本成熟結(jié)構(gòu)域的活性。術(shù)語″片段″包括包含上述抗植物害蟲活性的、例如至少5個(gè)、優(yōu)選至少約10個(gè)、更優(yōu)選至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失體、突變體和小肽。此類肽可能采用標(biāo)準(zhǔn)的重組核酸技術(shù)獲得，或者利用所述傳統(tǒng)的液相或固相合成方法合成，例如Blackwell Scientific Publications出版的Nicholson所編出版物″Synthetic Vaccines″中收入的第九章，Atherton和Shephard″Peptide Synthesis″。另外，可以利用蛋白酶消化本發(fā)明的氨基酸序列制備肽，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶。例如通過高效液相層析(HPLC)技術(shù)，可以純化消化片段。
″衍生物″是指通過修飾，例如與其它化學(xué)部分綴合或復(fù)合，或者本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解的翻譯后修飾技術(shù)，從基本序列得到的多肽。術(shù)語″衍生物″的范圍內(nèi)也包括對親本序列所做的改變，包括添加或缺失，得到功能等價(jià)的分子。因此，術(shù)語″衍生物″包括以其所來源的親本氨基酸序列相同的方式影響植物表現(xiàn)型的分子。也包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被不同氨基酸取代的多肽。本領(lǐng)域相當(dāng)理解，如下文所述，某些氨基酸可能改變?yōu)槠渌哂写笾孪嗨铺匦缘陌被?，而不改變該多肽的天然活?保守性置換)。這些術(shù)語也包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、或刪除、或替換為不同氨基酸的多肽。
此處可互換使用術(shù)語″蛋白質(zhì)″、″多肽″、″肽″和″氨基酸序列″，是指氨基酸殘基的多聚體及其變體和合成的類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是合成的非天然存在氨基酸的氨基酸的多聚體，例如相應(yīng)天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物，還適用于天然存在的氨基酸多聚體。
術(shù)語″變體″和″同系物″是指顯示與參考核苷酸序列具有基本序列一致性的核苷酸序列、或在此處定義的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與參考序列雜交的多核苷酸。術(shù)語″核酸分子″、″核苷酸序列″、″多核苷酸″和″核酸分子″此處可互換使用，并包括其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)添加、或刪除或替換為不同核苷酸的多核苷酸。在這方面，本領(lǐng)域相當(dāng)理解，可以對參考核苷酸序列進(jìn)行某些改變，包括突變、添加、缺失和置換，該改變的多核苷酸保持參考多核苷酸的生物功能或活性。該變體多肽序列可能編碼其氨基酸組成包含某些差異的多肽，但編碼具有相同或相似活性的蛋白質(zhì)。此處包括產(chǎn)生的變體多肽序列。術(shù)語″變體″也包括天然存在的核苷酸等位變體。
術(shù)語″表達(dá)″用其廣義，包括瞬時(shí)性、半永久性和穩(wěn)定性表達(dá)，以及可誘導(dǎo)性、組織特異性、組成性和/或發(fā)育調(diào)節(jié)性表達(dá)。優(yōu)選穩(wěn)定的組織特異性表達(dá)。
為了有效表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列，可能方便地引入特別包含以下一種或多種序列的嵌合遺傳構(gòu)建體啟動子序列、5’非編碼區(qū)、順式調(diào)節(jié)區(qū)例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白或翻譯調(diào)節(jié)蛋白的功能性結(jié)合位點(diǎn)、上游活化子序列、增強(qiáng)子元件、沉默子元件、TATA盒基序、CCAAT盒基序、上游開放閱讀框架、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和/或編碼前導(dǎo)序列的核苷酸序列、終止密碼子、翻譯終止位點(diǎn)和3’非翻譯區(qū)。該嵌合遺傳構(gòu)建體優(yōu)選設(shè)計(jì)為轉(zhuǎn)化下述植物。
術(shù)語″5’非編碼區(qū)″此處使用其最廣的范圍，包括除編碼包含該基因的多肽產(chǎn)物的氨基酸殘基的序列以外的所有來自可表達(dá)基因上游區(qū)的核苷酸序列，其中5’非編碼區(qū)引起、或活化、或至少部分促進(jìn)該基因的表達(dá)。
術(shù)語″基因″使用其最廣的范圍，包括對應(yīng)于該基因的基因組DNA區(qū)域以及對應(yīng)于外顯子的cDNA序列、或者改造為編碼功能形式產(chǎn)物的重組分子。
此處所用術(shù)語″順式作用序列″或″順式調(diào)節(jié)區(qū)″或類似術(shù)語應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是指來自可表達(dá)性遺傳序列的任何核苷酸序列，其中該核苷酸序列至少部分調(diào)節(jié)第一個(gè)遺傳序列的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，順式調(diào)節(jié)區(qū)也許能夠活化、沉默、增強(qiáng)、抑制或改變?nèi)魏谓Y(jié)構(gòu)基因序列的表達(dá)水平和/或細(xì)胞類型特異性和/或發(fā)育特異性。
此處提及的″啟動子″利用其最廣的范圍，并包括典型基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒、有或無CCAAT盒序列以及響應(yīng)發(fā)育和/或環(huán)境刺激、或以組織特異性或細(xì)胞特異性方式改變基因表達(dá)的其它調(diào)節(jié)元件(即上游活化序列、增強(qiáng)子和沉默子)。啟動子一般但不必須位于其所調(diào)節(jié)表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的上游或5’。此外，包含啟動子的調(diào)節(jié)元件一般位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的2kb以內(nèi)。
在此上下文中，術(shù)語″啟動子″也用于描述在植物細(xì)胞中引起、活化或增強(qiáng)結(jié)構(gòu)基因或其它核酸分子表達(dá)的合成的或融合分子或衍生物。本發(fā)明的優(yōu)選啟動子可能包含一個(gè)或多個(gè)特異性調(diào)節(jié)元件的另外拷貝，以進(jìn)一步增強(qiáng)在細(xì)胞中的表達(dá)、和/或改變其可操作性連接的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)時(shí)間。
此上下文中術(shù)語″可操作性相連″或″可操作性連接″是指將結(jié)構(gòu)基因置于啟動子的調(diào)節(jié)控制之下，從而控制基因的轉(zhuǎn)錄以及可選的翻譯。在構(gòu)建異源啟動子/結(jié)構(gòu)基因的組合中，一般優(yōu)選將遺傳序列或啟動子置于遠(yuǎn)離基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，大約與其天然設(shè)置(即該遺傳序列或啟動子所來源的基因)中該遺傳序列或啟動子及其控制的基因之間的距離相同。據(jù)本領(lǐng)域已知，可以調(diào)節(jié)該距離的某些變化，而不損失功能。類似地，調(diào)節(jié)性序列元關(guān)于置于其控制之下的異源基因件的優(yōu)選定位，按該元件在其天然設(shè)置(即其來源于的基因)中的定位而定。
本發(fā)明包含的啟動子序列可能是待轉(zhuǎn)化的宿主植物天生的，或者可能來自其它來源，其中該區(qū)域在宿主植物中具有功能性。其它來源包括土壤桿菌T-DNA基因，例如胭脂堿、octapine、mannopine生物合成啟動子或其它opine的啟動子；植物啟動子，例如泛素啟動子；組織特異性啟動子(參見例如Conkling等人美國專利號5,459,252；Advanced Technologies的WO 91/13992)；病毒啟動子(包括宿主特異性病毒)，或者部分或全部合成的啟動子。本領(lǐng)域熟知在單和雙子葉植物中具有功能性的眾多啟動子(參見，例如Greve，J.Mol.Appl.Genet.1499-511，1983；Salomon等人，EMBO J.31984；Garfinkel等人，Cell 27143-513，1983；Barker等人，PlantMol.Biol.2235-350，1983)，包括從植物(例如來自玉米u(yù)bi-1基因的Ubi啟動子)(參見，例如美國專利號4,962,028)和病毒(例如花椰菜花葉病毒啟動子，CaMV 35S)中分離的各種啟動子。
啟動子序列可能包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，其中該調(diào)節(jié)包括，例如化學(xué)或物理性抑制或誘導(dǎo)(例如基于代謝物、光或其它物理化學(xué)因素進(jìn)行的調(diào)節(jié)；參見，例如WO 93/06710公開的線蟲反應(yīng)性啟動子)，或者基于細(xì)胞分化進(jìn)行的調(diào)節(jié)(例如與植物中葉子、根、種子等有關(guān)；參見，例如美國專利號5,459,252公開的根特異性啟動子)。因此，從受如此調(diào)節(jié)的合適基因獲得啟動子區(qū)或該區(qū)的調(diào)節(jié)性部分。例如，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶基因受光誘導(dǎo)，可能用于轉(zhuǎn)錄起始。已知其它基因受壓力、溫度、創(chuàng)傷、病原體作用等誘導(dǎo)。
本發(fā)明的嵌合遺傳構(gòu)建體也可能包含3’非翻譯序列。3’非翻譯序列是指包含含有多聚腺苷酸化信號以及能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的任何其它調(diào)節(jié)信號的DNA片段的基因部分。多聚腺苷酸化信號的特征在于將多聚腺苷酸片段添加到mRNA前體的3’端。一般通過與5’-AATAAA-3’的典型形式同源性的存在而識別多聚腺苷酸化信號，盡管變異并不少見。
3’非翻譯的調(diào)節(jié)性DNA序列優(yōu)選包括約50-1,000個(gè)核苷酸堿基對，除多聚腺苷酸信號以及能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的任何其它調(diào)節(jié)信號之外，可能包含植物轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止序列。合適的3’非翻譯序列的例子有，包含根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂堿合酶(nos)基因多聚腺苷酸信號的3’轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(Bevan等人，Nucl.Acid Res.11369，1983)以及根瘤土壤桿菌章魚堿合酶基因T7轉(zhuǎn)錄本的終止子。另外，合適的3’非翻譯序列可能來源于植物基因，例如馬鈴薯或番茄蛋白酶抑制因子I或II基因、大豆貯存蛋白基因以及豌豆E9核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)基因的3’端，盡管還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它3’元件。另外，可以從頭獲得3’非翻譯調(diào)節(jié)性序列，例如An所述(Methods in Enzymology 153292，1987)，此處引入供參考。
嵌合遺傳構(gòu)建體還可以引入載體例如質(zhì)粒中。質(zhì)粒載體包括供表達(dá)盒在原核和真核細(xì)胞中易于選擇、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化的其它DNA序列，例如pUC來源的載體、pSK來源的載體、pGEM來源的載體、pSP來源的載體、或pBS來源的載體。其它DNA序列包括，供載體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)志基因(優(yōu)選編碼抗生素或除草劑抗性)、提供多個(gè)位點(diǎn)以供插入嵌合遺傳構(gòu)建體中編碼的DNA序列或基因的唯一多克隆位點(diǎn)、以及增強(qiáng)原核和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列。
載體優(yōu)選包含使載體或其中包含的嵌合遺傳構(gòu)建體穩(wěn)定整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組、或使載體在細(xì)胞中獨(dú)立于細(xì)胞基因組進(jìn)行自主復(fù)制的元件。載體或其中包含的構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞時(shí)，可能整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。為了整合，載體可能依靠其中存在的外源或內(nèi)源性DNA序列或載體的任何其它元件，以供載體通過同源重組穩(wěn)定整合進(jìn)基因組中。另外，載體可能包含其它核酸序列，以通過同源重組直接整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。其它核酸序列能夠使載體或其中包含的構(gòu)建體在染色體的精確位點(diǎn)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。為提高在精確位點(diǎn)整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含與對應(yīng)的目標(biāo)序列高度同源的足夠數(shù)目核酸，例如100-1,500堿基對、優(yōu)選400-1,500堿基對、最優(yōu)選800-1,500堿基對，以增加同源重組的可能性。
整合元件可能是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非編碼或編碼核酸序列。
為克隆和亞克隆之目的，載體可能進(jìn)一步包含能夠使載體在宿主細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌性復(fù)制起點(diǎn)的例子有，容許在大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)以及容許在芽胞桿菌(Bacillus)中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAM/β1的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可能帶有突變，使其在芽胞桿菌細(xì)胞中的功能具有溫度敏感性(參見，例如Ehrlich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751433，1978)。
為便于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，載體理想包含含有可選擇或篩選標(biāo)志基因的另一遺傳構(gòu)建體。只要與所選植物細(xì)胞在一起具有功能性(即選擇性)，標(biāo)志的實(shí)際選擇并不重要。標(biāo)志基因和目的核苷酸序列不必相連，因?yàn)槲催B接的基因共轉(zhuǎn)化也是植物轉(zhuǎn)化的有效方法，例如美國專利號4,399,216所述。
術(shù)語可選擇性或可篩選性標(biāo)志基因包括編碼″可選擇性標(biāo)志″的基因，可以檢測該標(biāo)志的分泌，用以鑒定或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。例子包括編碼能夠經(jīng)抗體相互作用而識別的可分泌性抗原、或者能夠通過其催化活性而檢測的可分泌性酶的標(biāo)志。可篩選性蛋白質(zhì)包括但不限于，插入或陷入細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)(例如包括前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)，如伸展蛋白或煙草PR-S的表達(dá)單元中存在的序列)；可以通過諸如ELISA檢測的小的可擴(kuò)散性蛋白質(zhì)；可以在細(xì)胞外溶液中檢測的小的活性酶，例如α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
細(xì)菌性可選擇性標(biāo)志的例子有，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)或地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或者賦予抗生素抗性的標(biāo)志，例如氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。選擇植物轉(zhuǎn)化體的代表性可選擇標(biāo)志包括但不限于，編碼潮霉素B抗性的hyg基因；賦予卡那霉素、巴龍霉素、G418等抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因，例如Potrykus等人所述(Mol.Gen.Genet，199183，1985)；賦予谷胱甘肽衍生的除草劑抗性的大鼠肝谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，例如EP-A 256 223所述；過表達(dá)時(shí)賦予谷氨酰胺合成酶抑制因子例如膦絲菌素抗性的谷氨酰胺合成酶基因，例如WO 87/05327所述；賦予選擇性試劑膦絲菌素抗性的產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，例如EP-A 275 957所述；賦予N-磷酸甲基甘氨酸耐受的5-enolshikimate-3-磷酸合酶(EPSPS)的編碼基因，例如Hinchee等人所述(Biotech.6915，1988)；賦予抗bialaphos抗性的bar基因，例如WO 91/02071所述；賦予溴苯腈(bromoxynil)抗性的臭鼻克雷白氏桿菌(Klebsiella ozaenae)腈水解酶基因，例如bxn(Stalker等人，Science 242419，1988)；賦予氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(Thillet等人，J.Biol.Chem.26312500，1988)；賦予咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化學(xué)劑抗性的突變型乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP-A-154 204)；賦予5-甲基色氨酸抗性的突變的鄰氨基苯甲酸合酶基因；或賦予除草劑抗性的茅草枯(dalapon)脫鹵素酶基因。
優(yōu)選的可篩選性標(biāo)志包括但不限于，uidA基因，編碼其各種生色底物已知的β-葡糖醛酸酶(GUS)；β-半乳糖苷酶基因，編碼其各種生色底物已知的酶；水母發(fā)光蛋白基因，可用于鈣敏感性生物發(fā)光檢測(Prasher等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1261259，1985)；綠色熒光蛋白質(zhì)基因(Niedz等人，Plant Cell Reports 14403，1995)；螢光素酶(luc)基因，可檢測生物發(fā)光(Ow等人，Science 234856，1986)；β-內(nèi)酰胺酶基因，編碼其各種生色底物(例如PADAC，生色的頭孢菌素)已知的酶(Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 753737，1978)；R-座位基因，編碼調(diào)節(jié)植物組織生成花青苷色素(紅色)的產(chǎn)物(Dellaporta等人，ChromosomeStructure and Function，pp.263-282，1988)；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，Biotech.8241，1990)；酪氨酸酶(yrosinase)基因，編碼能夠氧化酪氨酸為多巴和多巴醌的酶，并依次凝結(jié)成易于檢測的化合物黑色素(Katz等人，J Gen.Microbiol.1292703，1983)；或xylE基因，其編碼兒茶酚雙加氧酶，能夠轉(zhuǎn)換生色的兒茶酚(Zukowsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801101，1983)。
可選擇性標(biāo)志遺傳構(gòu)建體也可能包含上述任何一種或多種5’和3’非編碼區(qū)、順式調(diào)節(jié)區(qū)、增強(qiáng)子、活化子等。
本發(fā)明一方面提供了來自植物或轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，該細(xì)胞、組織或器官包含含有編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
優(yōu)選地，該核酸分子包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域包含以下結(jié)構(gòu)a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a28a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
本發(fā)明的載體和嵌合遺傳構(gòu)建體可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)引入細(xì)胞中。該技術(shù)可能根據(jù)特定生物體已知的成功技術(shù)而改變。
將載體、嵌合遺傳構(gòu)建體等引入細(xì)胞的技術(shù)包括但不限于，使用CaCl2進(jìn)行轉(zhuǎn)化及其變化、原生質(zhì)體直接攝取DNA、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體攝取、微粒轟擊、電穿孔、DNA顯微注射、組織外植體或細(xì)胞的微粒轟擊、核酸真空滲入組織以及T-DNA介導(dǎo)從土壤桿菌轉(zhuǎn)入植物組織。
關(guān)于細(xì)胞的微粒轟擊，驅(qū)動微粒進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞。任何合適的沖擊(ballistic)細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法和儀器可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。Sanford和Wolf公開了典型方法(美國專利4,945,050，5,036,006，5,100,792，5,371,015)。使用沖擊轉(zhuǎn)化方法時(shí)，可將遺傳構(gòu)建體引入能夠在待轉(zhuǎn)化細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒中。
適用于該系統(tǒng)的微粒例子包括0.1-10μm、更特別是10.5-5μm的鎢或金球?？衫萌魏芜m當(dāng)技術(shù)，例如沉淀，將DNA構(gòu)建體沉積在微粒上面。
可利用本發(fā)明的嵌合遺傳構(gòu)建體，轉(zhuǎn)化其后能夠通過器官發(fā)生抑或胚胎發(fā)生進(jìn)行無性繁殖的植物組織，并由此產(chǎn)生整株植物。根據(jù)可獲得的并最適合待轉(zhuǎn)化的特定品種的無性繁殖系統(tǒng)，選擇的特定組織會有所不同。典型的靶組織包括葉片、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、現(xiàn)有分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)以及誘導(dǎo)分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。
再生的轉(zhuǎn)化植物可利用各種方法繁殖，例如無性繁殖或傳統(tǒng)的育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可自交產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步利用傳統(tǒng)育種技術(shù)繁殖T2植物。
因此，本發(fā)明這一方面涉及改造為表達(dá)防御素樣分子或其變體或同系物的編碼核酸分子的植物，進(jìn)一步延伸到該植物的子代，以及該植物的營養(yǎng)、繁殖和再生部分，例如花(包括切或割的花)、植物部分、植物的纖維物質(zhì)(例如棉)以及再生部分，包括插枝、花粉、種子和愈傷組織。
本發(fā)明另一方面提供遺傳修飾的植物細(xì)胞、或多細(xì)胞植物或其子代、或能夠生成此處所述異源防御素樣分子的遺傳修飾植物的部分，其中該轉(zhuǎn)基因植物對植物害蟲例如昆蟲具有抗性或敏感性降低。
更特別地，本發(fā)明提供遺傳修飾的植物細(xì)胞、或多細(xì)胞植物、或其子代或部分，其包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列或片段或衍生物。
術(shù)語″遺傳修飾″使用其廣義，包括將基因引入細(xì)胞、在細(xì)胞中突變基因以及改變或控制細(xì)胞中的基因調(diào)節(jié)。
該遺傳構(gòu)建體可能是單個(gè)分子或多個(gè)分子，例如一組分子，其組合可能包含能夠編碼其它抗植物病原體的分子的核苷酸序列，例如但不限于蛋白酶抑制因子或其前體。在儲存器官和葉子中，往往對創(chuàng)傷作出反應(yīng)而積累蛋白酶抑制因子，例如絲氨酸蛋白酶抑制因子。蛋白質(zhì)抑制活性針對微生物和動物來源的多種蛋白酶類。
因此，本發(fā)明另一方面包含一種或多種包含與第一核苷酸序列可操作性連接的第一啟動子的單獨(dú)或聯(lián)合的遺傳構(gòu)建體，其中該第一核苷酸序列編碼能夠抑制植物害蟲例如昆蟲的防御素樣分子或其部分，該構(gòu)建體進(jìn)一步包含與第二核苷酸序列可操作性連接的第二啟動子，其中該第二核苷酸序列編碼蛋白酶抑制因子或其前體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該防御素樣分子和/或其編碼DNA序列選自SEQ ID NO7至SEQ ID NO18。在另一實(shí)施方案中，該防御素樣分子和/或其編碼DNA序列選自SEQ ID NO7至SEQ ID NO18、或SEQID NO20至SEQ ID NO24。特別優(yōu)選SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所確定的防御素樣分子和/或其編碼DNA序列。在另一實(shí)施方案中，該防御素樣分子和/或其編碼DNA序列選自SEQ ID NO7或SEQ IDNO8、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18、或SEQ ID NO20至SEQID NO55。
在另一實(shí)施方案中，該蛋白酶抑制因子是I或II型絲氨酸蛋白酶抑制因子。特別有用的蛋白酶抑制因子包含SEQ ID NO57和SEQID NO56分別所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列。國際專利申請PCT/AU93/00659(WO 94/13810)也描述了該分子。
本發(fā)明涉及攜帶全部或部分使植物或植物部分對植物害蟲包括昆蟲具有抗性或敏感性降低的遺傳構(gòu)建體及任選上述第二遺傳構(gòu)建體的植物和植物部分，包括植物再生部分。
本發(fā)明進(jìn)一步包括組合物，其包含單獨(dú)或聯(lián)合另一試劑例如蛋白酶抑制因子的防御素或防御素樣分子。該組合物特別用于植物、例如棉花植物的局部施用，有助于控制昆蟲侵染。
本發(fā)明進(jìn)一步包括與SEQ ID NO7所示核苷酸序列的基因組形式結(jié)合的啟動子。本發(fā)明這一方面提供了具有啟動子活性并對應(yīng)于植物基因組中該基因組區(qū)域的分離的核酸分子，其可操作性連接對應(yīng)于全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列、或與其具有70％相似性的核苷酸序列、或能夠與SEQ ID NO7或其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1制備植物材料如Anderson等人所述(Plant Cell 1483-491，1989)，于溫室條件下培養(yǎng)自交不親和性混合基因型的花煙草(Link et Otto)植物。采集花和花蕾，兩小時(shí)內(nèi)用鑷子和解剖刀片分離雌蕊、子房和花藥，花瓣則用手分離。也采集開裂花藥的花粉粒以及不同發(fā)育期的整花。所述組織組織于液氮中冷凍，-70℃保存，直至使用。
實(shí)施例2克隆花煙草cDNA(a)分離RNA利用無菌研缽和研杵，在液氮中將處于花瓣呈色發(fā)育階段的花煙草花的70個(gè)雌蕊(1.3g)研磨成細(xì)粉，制備總RNA。利用TRIzol(trademark)Reagent(Gibco BRL)，根據(jù)廠家說明書提取RNA(參見Gibco BRL表格#3796，TRIzol(trademark)ReagentTotal RNA isolation reagent)。
(b)利用PCR進(jìn)行花防御素序列的cDNA合成及擴(kuò)增利用Superscript Preamplification System(Gibco BRL)從雌蕊總RNA制備第一鏈cDNA。用于PCR的寡核苷酸引物特異性針對發(fā)表的煙草花特異型硫素(FST，Gu等人[1992；同上])的DNA序列。
引物FST15’GGAATTCCATATGGCTCGCTCCTTGTGC 3’[SEQ IDNO1]引物FST2 5’GCGGATCCTCAGTTATCCATTATCTCTTC 3’[SEQ IDNO2]引物FST1和FST2分別匹配FST序列的核苷酸49-66和346-363。利用單鏈cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼花煙草花防御素前體的cDNA克隆(NaPdf1)。將NaPdf1產(chǎn)物克隆入pBluescript SK+II(Stratagene)載體(pBS-NaPdf1)，供測序。該產(chǎn)物長318bp，編碼無5’和3’非翻譯區(qū)的完整編碼序列。
然后使用NaPdf1 PCR產(chǎn)物篩選先前構(gòu)建的花煙草雌蕊cDNA文庫(Schultz等人，Plant Mol Biol 35833-845，1997)。使用隨機(jī)九聚體引物(Megaprime(trademark)DNA labelling kit，Amersham Life Technologies)，以[α32P]dCTP標(biāo)記的NaPdf1 cDNA探測薄膜。利用Bio-Rad Bio-Spin column 30，按廠家說明書所述去除未摻入的[α32P]dCTP。用探針在50％v/v甲酰胺、5xSSPE、5xDenhardt’s液以及200μg/ml鯡魚精DNA的溶液中，與印跡42℃雜交16小時(shí)，然后用2xSSPE和0.1％w/v SDS于室溫洗滌兩次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的探針。將印跡對X光膠片曝光，顯現(xiàn)雜交的探針。切下篩選陽性克隆，測序。
實(shí)施例3NaPdf1基因表達(dá)(a)RNA凝膠印跡分析從花煙草(自交不親和性基因型，S1S2)發(fā)育I期(5-10mm花蕾)、II期(20-30mm花蕾)和III期(50-70mm花蕾)的花藥、花粉粒以及成熟雌蕊、子房、花瓣、葉和根組織中分離總RNA。利用1％w/v瓊脂糖甲醛變性凝膠分離RNA樣品(12.5μg)，轉(zhuǎn)移到Hybond-N(Amersham Life Sciences)膜。放射性標(biāo)記的NaPdf1 cDNA探針的制備以及雜交條件與上文實(shí)施例2(b)所述cDNA文庫篩選相同。在0.2xSSPE、0.1％SDS中，分別于45℃和55℃進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌30分鐘。結(jié)果如圖2所示。將印跡對儲磷光屏(storage phosphorscreen)曝光24小時(shí)，顯現(xiàn)雜交探針。在Molecular Dynamics 400B磷光成像儀中，利用ImageQuant軟件讀取結(jié)果。
(b)原位雜交基本上按Drews等人(Cell 65991-1002，1991)以及Cox和Goldberg(Analysis of plant genes expression In PlantMolecular BiologyA Practical Approach.C.H.Shaw(ed)1-34頁，IRL Press，Oxford，United Kingdom，1988)所述，進(jìn)行原位雜交。利用EcoRI和BamHI線性化pBS-NaPdf1 DNA，分別經(jīng)T7和T3RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，制備35S標(biāo)記的有義和反義RNA探針(Ausubel等人[1994；同上]；Drews等人[1991；同上])。從植物切取10mm花蕾，在50％v/v乙醇、5％v/v乙酸和3.7％v/v甲醛中固定。將固定的組織脫水，石蠟包埋(Sigma)。然后將組織切成10μm切片，附于Superfrost*/plus玻片上(Menzel-Glaser，Germany)。用二甲苯處理切片，然后水化、蛋白酶K處理、乙酰化并脫水。將35S標(biāo)記的有義和反義核探針?biāo)鉃殚L度約100個(gè)核苷酸，與切片在42℃雜交17小時(shí)。然后用RNA酶A處理切片、洗滌，然后玻片包被膠片乳膠。切片曝光一周后顯色。
結(jié)果表明，NaPdf1轉(zhuǎn)錄物在花藥結(jié)締組織、花柱皮層細(xì)胞以及花瓣和萼片的表皮細(xì)胞中積累(參見圖3)。該積累方式與所編碼蛋白質(zhì)在繁殖器官的防衛(wèi)中所起作用一致。
實(shí)施例4為制備抗體的蛋白質(zhì)表達(dá)(a)分子克隆和細(xì)菌性蛋白質(zhì)表達(dá)pBS-NaPdf1(參見實(shí)施例2(b))用于PCR擴(kuò)增前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(NaproPdf1，前體去除N端ER信號結(jié)構(gòu)域)的編碼DNA片段。結(jié)構(gòu)示意圖參見圖8。利用寡核苷酸引物PDF1和PDF2獲得NaproPdf1 DNA片段，引物分別引入BamHI和SacI限制酶切位點(diǎn)，用于隨后克隆。
引物PDF1 5’CCGGATCCAGAGAATGCAAAACAG 3’[SEQ ID NO3]
引物PDF2 5’GGGAGCTCTTAGTTATCCATTATCTC 3’[SEQ ID NO4]根據(jù)廠家說明書，將NaproPdf1 DNA片段直接從PCR克隆到pGEM-T載體(Promega)，然后亞克隆到pQE30(Qiagen)載體，在大腸桿菌菌株M15細(xì)菌(Qiagen)中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。
在細(xì)菌中表達(dá)NaproPdf1蛋白質(zhì)，為帶有N端六聚組氨酸標(biāo)志的融合蛋白。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞生長于包含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(12.5μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，至595nm處讀取的吸光度為～0.8，然后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1mM)誘導(dǎo)6小時(shí)。離心沉淀細(xì)胞，重懸于裂解緩沖液中(10mM Tris-HCl pH8.0、100mM磷酸鈉緩沖液pH 8.0，8M脲；30ml裂解緩沖液/升培養(yǎng)物)，然后冰上溫育30分鐘。然后裂解物通過18號針頭，離心收集上清(25,000g，15分鐘，4℃)。利用Clontech TALON(trademark)Metal Affinity Resin User Manual(PT1320-1)概述的變性蛋白質(zhì)純化方案，從裂解的細(xì)菌細(xì)胞中純化六聚組氨酸標(biāo)志的蛋白質(zhì)(6H.NaproPdf1)。在100mM EDTA，pH 8.0中從樹脂上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。冷凍干燥洗脫的蛋白質(zhì)。利用SDS-PAGE(15％w/v聚丙烯酰胺)分析純化過程各個(gè)步驟對應(yīng)的蛋白質(zhì)提取物，通過考馬斯藍(lán)染色觀察(參見圖4A)。利用Waters 510型泵和Waters 481型UV檢測器，將金屬親合純化的6H.NaproPdf1蛋白質(zhì)樣品上樣AquaporeRP300反相C8分析柱(4.6×100mm，Brownlee)。利用30分鐘內(nèi)0-100％緩沖液B(60％v/v乙腈的0.089％v/v三氟乙酸溶液)的梯度洗脫蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)洗脫為單個(gè)峰(圖4B)，N端序列和質(zhì)譜分析證實(shí)它是6H.NaproPdf1。
(b)制備多克隆抗血清如Harlow和Lane所述(AntibodiesA Laboratory Manual.Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Springs Harbor，New York，1988)，利用戊二醛將細(xì)菌性表達(dá)的6H.NaproPdf1蛋白質(zhì)(1.3mg)與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH，0.3mg，Sigma)綴合，然后注射家兔。然后將綴合的蛋白質(zhì)對PBS透析過夜。蛋白質(zhì)綴合物(100μg，在1mL PBS中)與等體積弗氏完全佐劑(Sigma)混合。初級免疫包括4×400μL皮下注射。加強(qiáng)免疫于5和9周后給予，包含混合弗氏不完全佐劑(Sigma)的蛋白質(zhì)綴合物(100μg，在1mL PBS中)。在注射之前采集免疫前血清，第二次免疫9天后采集免疫血清。
(c)蛋白質(zhì)A純化全血清中IgGs利用蛋白質(zhì)A Sepharose CL-4B柱(2.5mL，Pharmacia)，按照廠家說明書，純化免疫前血清和免疫血清中的IgG組分。免疫前血清(2mL)在等體積0.1M Tris-HCl中(pH 7.5)稀釋，上樣用0.1MTris-HCl(pH 7.5)平衡過的柱子。收集洗脫液，再上樣三次。用80mL 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)洗柱，再用80mL 0.01M Tris-HCl(pH 7.5)去除任何未結(jié)合物。用100mM甘氨酸(pH 2.5)洗脫IgGs，在包含50μl 1M Tris-HCl(pH 8.8)的微離心管中收集500μl組分。混合包含IgGs的組分，在4℃用PBS廣泛透析。通過用0.1MTris-HCl(pH 7.5)洗滌，再生蛋白質(zhì)-A Sepharose柱。當(dāng)pH達(dá)到7.5時(shí)，上樣免疫血清(3mL，第二次取血)，如免疫前血清所述進(jìn)行純化。
(d)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使用Mini Protean II電泳裝置(Bio-Rad)，將來自圖5(A)所示花煙草花發(fā)育階段的緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA，0.5M NaCl)可溶性蛋白質(zhì)樣品(60μg)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，4％w/v堆積膠及15％w/v分離聚丙烯酰胺凝膠)(Laemmli，Nature 227680-685，1970)。蛋白質(zhì)通過考馬斯染色觀察，并與Bio-Rad寬范圍分子量標(biāo)志(6.5-200kDa)比較。
(e)免疫印跡分析使用Mini-Protean II Trahs-Blot裝置(Bio-Rad)，在轉(zhuǎn)移緩沖液中(48mM Tris(羥甲基)氨基甲烷，192mM甘氨酸，20％v/v甲醇)，將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜(MicronSeparations Inc.，0.22μm孔徑)。在100V轉(zhuǎn)移1小時(shí)以后，將膜用異丙醇固定1分鐘，然后TBS(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)洗滌5分鐘。通過氨基黑染色(0.1％w/v氨基黑的40％v/v甲醇和10％v/v乙酸溶液，按1∶50稀釋)，觀察分子量標(biāo)志。
用5％w/v脫脂奶封閉膜1小時(shí)，然后與抗6H.NaproPdf1抗體溫育1.5小時(shí)(用TBS按1∶2500稀釋)。將膜用TBST(0.1％v/v Tween20的TBS)洗滌3×10分鐘，然后與綴合辣根過氧化物酶的驢抗兔IgG溫育1.5小時(shí)(Amersham Pharmacia Biotech；用TBS按1∶5000稀釋)。再洗滌3×10分鐘，然后利用Enhanced Chemi-Luminescence(ECL)檢測試劑(Amersham Pharmacia Biotech)，按照廠家說明書處理該免疫印跡。免疫印跡對ECL Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)曝光。三種蛋白質(zhì)特異性與抗體反應(yīng)，發(fā)育早期的蛋白質(zhì)水平最為豐富(參見圖5B)。
質(zhì)譜分析和N端氨基酸測序證實(shí)，較低分子量物質(zhì)為成熟防御素(5.3kDa)；參見下文實(shí)施例5(c)。
實(shí)施例5從花蕾純化(a)蛋白質(zhì)提取利用從大麥粉中提取硫素的改進(jìn)方法，從花中提取成熟的NaPdf1蛋白質(zhì)(Ozaki等人，J.Biochem.87549-555，1980)。使用研缽和研杵，用液氮將直至花發(fā)育的花瓣呈色階段的所有花煙草花(5-50mm，650g濕重)研磨成細(xì)粉，在Ultra-Turrax勻漿器(Janke和Kunkel，Germany)中用50mM硫酸(3mL/g重量)再加工。在4℃攪拌1小時(shí)以后，用Miracloth(Calbiochem)過濾然后離心(25,000xg，15分鐘，4℃)，去除不溶物。漿液中緩慢加入10M NaOH，調(diào)節(jié)pH至7.8，4℃攪拌1小時(shí)，然后離心去除沉淀物(25,000xg，15分鐘，4℃)。加入固體硫酸銨，至80％(w/v)飽和度，混合物于4℃攪拌4小時(shí)或過夜，以沉淀防御素蛋白質(zhì)。離心收集沉淀，溶于50mL凝膠過濾緩沖液(150mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0)，然后90℃加熱10分鐘。離心以后，上清上樣Sephadex G-50凝膠過濾柱(85×2.54cm，Pharmacia)。收集組分(50mL)，用抗6H.NaproPdf1抗體通過免疫印跡進(jìn)行分析。混合包含NaPdf1的組分，通過45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，0.22μm針筒過濾器(Millipore)過濾，再用RP-HPLC純化。
(b)反相高效液相層析利用連接Beckmann 166檢測器的Beckman System Gold HPLC進(jìn)行RP-HPLC。分析型RP-HPLC利用Aquapore RP300反相C8柱(4.6×100mm，Brownlee)進(jìn)行，而制備型使用Vydac C8反相柱(22×250mm)。利用流速分別為1mL/分鐘或10mL/分鐘、40分鐘內(nèi)的0-100％緩沖液B(60％v/v乙腈的0.089％v/v三氟乙酸溶液)的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。分析柱的結(jié)果如圖6A所示。下述N端測序和質(zhì)譜分析證實(shí)主峰的同一性。
(c)電噴射離子化質(zhì)譜分析電噴射離子化質(zhì)譜分析(ESI-MS)之前，RP-HPLC的蛋白質(zhì)組分在冷凍干燥機(jī)中真空濃縮，重溶于milli-Q水中。使用2-4μL包含0.1％w/v甲酸的50％v/v乙腈中的1-100pmol蛋白質(zhì)，進(jìn)行ESI-MS。以0.2μL/分鐘的流速，將樣品注入配備微離子噴射離子源的三聯(lián)四聯(lián)Perkin-Elmer Sciex API-300。利用單電荷聚(丙二醇)離子校準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)度，使質(zhì)量精確度等于±1％。使用每單位電荷0.6daltons的恒定峰寬(峰最大值一半處的全寬)，在質(zhì)量范圍為每個(gè)電荷m/z 200-3000 daltons的第一個(gè)四聯(lián)(Q1)掃描模式中記錄質(zhì)譜。使用Perkin-Elmer Sciex Bio Multiview軟件，進(jìn)行30-100次掃描的信號平均、手工質(zhì)量確定以及將質(zhì)荷比譜轉(zhuǎn)化為真實(shí)的質(zhì)量標(biāo)度。利用小樣本統(tǒng)計(jì)并算入校準(zhǔn)不確定性，計(jì)算95％置信界限的不確定性。
結(jié)果表明，圖6A中峰A的蛋白質(zhì)以及圖5B所示較低分子量物質(zhì)(～5kDa)對應(yīng)于由NaPdf1 cDNA克隆編碼的成熟防御素結(jié)構(gòu)域(參見圖6B)。
(d)氨基酸測序利用Applied Biosystems 470A氣相肽測序儀連接供自動在線PTH氨基酸分析的Applied Biosystems 130A分離系統(tǒng)，通過Edman降解，進(jìn)行氨基酸測序。峰A中蛋白質(zhì)所得N端序列的八個(gè)氨基酸與由NaPdf1 cDNA克隆預(yù)測的序列匹配(參見圖6B)。
實(shí)施例6免疫金定位用于電子顯微術(shù)為固定和免疫金標(biāo)記從處于不成熟花蕾階段(10mm)的花煙草花中分離花藥和子房，在4％(w/v)甲醛和0.5％(w/v)戊二醛的60mM PIPES/KOH溶液，pH7.2中室溫固定2小時(shí)，然后4℃過夜。組織固定后，用60mMPIPES/KOH，pH 7.2洗滌，在酸化的二甲氧基丙烷中(濃鹽酸∶二甲氧基丙烷，1∶2000[v/v]))室溫脫水3小時(shí)。脫水的部分浸入含Benzil(London Resin Co.Ltd.)的LR Gold中，利用PhillipsTUV 15-W UV燈，在10cm遠(yuǎn)處25℃聚合12小時(shí)。如Anderson等人所述(Planta 171438-442，1987)，進(jìn)行超薄切片的免疫金標(biāo)記。蛋白質(zhì)A純化的抗6H.NaproPdf1抗體分別在64μg/mL IgG和21μg/mL IgG的終濃度下，與花藥和子房切片溫育。用相同濃度的純化自免疫前血清的抗體替換第一抗體，檢測標(biāo)記的特異性。為觀察超微結(jié)構(gòu)，切片用3％(w/v)醋酸雙氧鈾水溶液染色15分鐘，Sato三鉛(Sato，J.Electron Microsc.17158-159，1968)染色2分鐘，然后用Joel 1200電子顯微鏡觀察。
實(shí)施例7序列及序列比較花煙草防御素核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列如圖1所示。該cDNA克隆代表的基因命名為NaPdf1(花煙草植物防御素1)。所示DNA序列是重疊的cDNA克隆與下列引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合序列1-49，引物延伸產(chǎn)物克隆；50-541，cDNA克隆NaPdf1。核苷酸序列下方顯示由該復(fù)合cDNA序列預(yù)測的蛋白質(zhì)。該cDNA克隆包含318個(gè)核苷酸的單個(gè)開放閱讀框架，編碼105個(gè)氨基酸。原始的pBS-NaPdf1克隆(參見實(shí)施例2)中的PCR擴(kuò)增序列對應(yīng)于圖1所示NaPdf1克隆的1-318核苷酸。
圖9顯示NaPdf1的105-氨基酸序列(SEQ ID NO18)，與從其它五個(gè)花來源的cDNA克隆編碼的預(yù)測的氨基酸序列比對。序列依次如下花特異性硫素(FST)，來自Gu等人[1992；同上](SEQ ID NO20)，來源于煙草花；TPP3，來自Milligan和Gasser[1995；同上](SEQ ID NO21)，來源于番茄雌蕊；NTS13，來自Li和Gray[1999；同上](SEQ ID NO22)，來源于煙草花柱；PPT，來自Karunanandaa等人[1994；同上](SEQ ID NO23)，來源于矮牽牛雌蕊；以及ATPIIIa，來自Yu等人[1999；同上]，直接提交，登錄號S30578(SEQ ID NO24)，來源于擬南芥(Arabidopsis)。
組成NaPdf1蛋白質(zhì)成熟中央結(jié)構(gòu)域的47個(gè)氨基酸(SEQ IDNO8)，也與植物防御素家族其它成員的成熟結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO25-SEQ ID NO49)進(jìn)行比對。利用ClustalW計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行比對(http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clustalw.html)。結(jié)果如圖10所示。獲得每個(gè)序列的相關(guān)參考文獻(xiàn)及其各自的序列標(biāo)識符細(xì)節(jié)，參見


。
實(shí)施例8真菌生長抑制分析使用Broekaert等人的96孔微滴定板分析(EMS MicrobiologyLetters 6955-60，1990)，測定純化的NaPdf1蛋白質(zhì)對灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)(分離自迷迭香，Brunswick，Victoria)、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)(f.sp.dianthi，Race 2；Florigene Limited，Collingwood，Victoria分離自康乃馨)以及尖孢鐮孢(f.sp.vasinfectum，棉花分離株VCG 01111；Departmentof Primary Industries，Queensland提供)生長的影響。通過加入無菌水并使用涂布器，從半強(qiáng)度馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，Difco)、或γ照射的水瓊脂中的康乃馨葉子上生長的成孢子培養(yǎng)物中，分離真菌孢子。懸浮液用雙層滅菌過的細(xì)棉布過濾，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定濾液中的孢子濃度。孢子直接使用，或于無菌的20％v/v甘油溶液中-20℃保存后使用。
在無菌條件下，于96孔平底微孔板(Greiner)中進(jìn)行真菌分析。將孢子濃度用PDB調(diào)節(jié)為約2×104孢子/mL，在加有20μl過濾消毒(0.22μm針筒過濾器，Millipore)的待測蛋白質(zhì)(10、50或100μg/mL)或水的每個(gè)孔中，加入80μl該懸浮液。使用之前，通過RP-HPLC分析確定每個(gè)蛋白質(zhì)的純度和濃度。在其它孔中加入無菌水和卵清蛋白(Sigma)，作為陰性對照，抗真菌蛋白質(zhì)α-和β-嘌呤硫素(Sigma)的混合物作為陽性對照。將平板在軌道振蕩器上振搖幾秒鐘，混合孢子和待測蛋白質(zhì)。讓平板靜置30分鐘，使孢子沉積，然后利用Spectra Max Pro 250微板閱讀儀(Molecular Devices)，在595nm吸光度處測定平板的光密度。平板于暗處22℃溫育，在100小時(shí)過程中進(jìn)行測定。吸光度相對于初始讀數(shù)的增加與真菌菌絲的生長有關(guān)，將其對時(shí)間作圖。所有分析按一式四份進(jìn)行。
圖11和12所示生長抑制曲線，顯示純化的NaPdf1防御素蛋白質(zhì)分別對灰色葡萄孢(圖11)、尖孢鐮孢(f.sp.dianthi，圖12A)以及尖孢鐮孢(f.sp.vasinfectum，圖12B和12C)的作用。結(jié)果清楚表明，20μg/mL NaPdf1有效對抗所有三種真菌微生物實(shí)施例9產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草植物(a)構(gòu)建二元質(zhì)粒(binary plasmid)以下所示引物FLOR1和FLOR2，用于通過常規(guī)PCR擴(kuò)增NaPdf1的完整DNA編碼序列，以引入5’EcoRI和3’XbaI限制酶位點(diǎn)，用于后續(xù)克隆步驟。
引物FLOR1(EcoRI-間隔-ATG-序列，31聚體)5’GGAATTCTAAACAATGGCTCGCTCCTTGTGC 3’[SEQ ID NO5]引物FLOR2(XbaI-終止-序列，29聚體)5’GCTCTAGATCAGTTATCCATTATCTCTTC 3’[SEQ ID NO6]
得到的PCR產(chǎn)物直接亞克隆到TA載體(pCR2.1-TOPO，Invitrogen)，通過核酸測序確證該序列。用EcoR1和XbaI限制酶從TA載體切下NaPdf1 DNA，凝膠純化并亞克隆到預(yù)先用適當(dāng)?shù)南拗泼柑幚淼膒FB98/06載體(得自Florigene Limited，Collingwood，Australia)，產(chǎn)生p35-PDF1。該構(gòu)建體(p35-PDF1)包含側(cè)接35S花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV35S)和終止子序列的防御素cDNA。構(gòu)建體p35-PDF1再用SphI限制酶消化，去除啟動子-基因-終止子盒，并凝膠純化。用T4 DNA聚合酶將SphI產(chǎn)生的3’突出端平端化，并凝膠純化。此時(shí)將表達(dá)盒插入預(yù)先經(jīng)平端切具SmaI限制酶處理的二元載體pGCP1988(Florigene)或pBIN19(Bevan等人[1983；同上])。得到的構(gòu)建體命名為(i)pFL1(包含于pCGP1988)，其具有位于CaMV35S啟動子/終止子控制下的glean(surB)可選擇性標(biāo)志基因，以及(ii)pHEX3(包含于pBIN19)，其具有位于nos啟動子/終止子控制下的卡那霉素(nptII)可選擇性標(biāo)志基因。構(gòu)建體pFL1和pHEX3在分別相對于可選擇性標(biāo)志基因的相對(convergent)或串聯(lián)方向上具有防御素基因盒。構(gòu)建體pFL1和pHEX3的示意圖如圖13所示。
(b)轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌LBA4404制備電感受態(tài)的根瘤土壤桿菌(LBA4404)，利用Gene Pulser(注冊商標(biāo))/0.2cm電極間距的大腸桿菌小槽(Bio-Rad)以及GenePulser(Bio-Rad)中1.8kV、25μFD電容和600Ω電阻，通過常規(guī)電穿孔轉(zhuǎn)化pFL1或pHEX3。電穿孔細(xì)胞與1mL SOC培養(yǎng)基混合，28℃振蕩溫育3小時(shí)，然后取出150μl，涂布于LB瓊脂，對于pFL1轉(zhuǎn)化子，在瓊脂中補(bǔ)充有20μg/mL利福平，而pHEX3轉(zhuǎn)化子則補(bǔ)充有20μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素。平板于28℃溫育過夜。
從隨機(jī)挑選克隆中制備質(zhì)粒DNA，進(jìn)行分析性限制性消化，瓊脂糖凝膠電泳分析插入序列，選擇轉(zhuǎn)化子。
(c)土壤桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化煙草栽培品種Wisconscin 38(W38)的種子用1％v/v次氯酸鈉表面滅菌60分鐘，然后用無菌水洗滌幾次。將滅菌的種子播種于MS培養(yǎng)基(MS；0.44％w/v Murashige和Skoog培養(yǎng)基(ICNBiomedicals)[Plant Physiology 1573-97，1962]、3％w/v蔗糖和0.8％w/v Bacto瓊脂、pH 5.8)，在溫控箱中溫育5周。用pFL1或pHEX3構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根瘤土壤桿菌(LBA4404)在分別補(bǔ)充有抗生素利福平(20μg/mL)或者卡那霉素(50μg/mL)和利福平的10ml LB培養(yǎng)基中，于28℃生長2-3天。離心(5分鐘，3,500xg)收集細(xì)胞，重懸于20ml MS中，與新切的葉片(1cm2方形)短暫溫育。將葉片吸附在無菌3MM紙上，然后轉(zhuǎn)移到SIM瓊脂(0.44％w/v Murashige和Skoog培養(yǎng)基(ICN Biomedicals)[1962；同上]、3％w/v蔗糖、1.0mg/L BAP、0.5mg/L吲哚乙酸(IAA)和0.8％w/v Bacto瓊脂，pH5.8)，在亮處25℃溫育3天。對照葉片只用MS同樣處理。共培養(yǎng)以后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基，誘導(dǎo)新芽形成。將pFL1轉(zhuǎn)化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有1.5mg/L glean和250mg/L頭孢噻肟(cefotaxamine)的SIM瓊脂，而pHEX3轉(zhuǎn)化的愈傷組織用100mg/L卡那霉素和250mg/L頭孢噻肟進(jìn)行選擇。從愈傷組織切下再生的新芽，在IBA(1mg/mL)溶液中短暫浸泡，轉(zhuǎn)移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RIM；0.44％w/v Murashige和Skoog培養(yǎng)基[1962；同上]、3％w/v蔗糖、150mg/L timentin和0.8％w/v Bacto瓊脂)，其中對于pFL1或pHEX3分別補(bǔ)充有1.5mg/L glean或100mg/L卡那霉素，如前所述溫育。生根足夠多時(shí)，將小植株栽入土中，于標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下生長。
(d)檢測轉(zhuǎn)基因煙葉中的NaPdf1在溫室生長植物的葉柄切下葉子(第四或第五位)。將組織在液氮中冷凍，用研缽和研杵研磨成細(xì)粉。將組織加入提取緩沖液中50mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA和0.5M NaCl(1mL/g新鮮濕重)。將混合物置于冰上15分鐘，然后13,500xg、4℃離心15分鐘，使其澄清。利用Bradford方法(1976)估計(jì)蛋白質(zhì)濃度，試劑來自Bio-Rad，使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)。利用15％w/v或預(yù)制的4-12％w/v聚丙烯酰胺梯度凝膠(Novex)，如以上實(shí)施例4(d)所述，通過SDS-PAGE分離總可溶性葉蛋白(100μg)。電泳以后，蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)色，或者轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，如以上實(shí)施例4(e)所述，進(jìn)行NaPdf1的免疫檢測。比較結(jié)果如圖14A和B所示。
實(shí)施例10昆蟲飼養(yǎng)試驗(yàn)(a)昆蟲來源澳洲棉鈴蟲幼蟲(Helicoverpa punctigera)來自在Victoria，Australia采集的群體，在La Trobe University，Melbourne維持培養(yǎng)，棉鈴蟲得自La Trobe University，Melbourne或位于Narrabri，NSW的Australian Cotton Research Institute，Entomology Department of the Commonwealth Scientific andIndustrial Research Organisation保存的群體。
(b)轉(zhuǎn)基因煙草葉的生物學(xué)分析利用轉(zhuǎn)基因植物pFL1/W19(由pFL1構(gòu)建體轉(zhuǎn)化)和轉(zhuǎn)基因植物pHEX3.4(由pHEX3構(gòu)建體轉(zhuǎn)化)的無性系材料進(jìn)行三個(gè)實(shí)驗(yàn)。利用未轉(zhuǎn)化的W38植物作為陰性對照。
在實(shí)驗(yàn)1和2中，每次處理分別選擇31和40個(gè)新孵化的澳洲棉鈴蟲幼蟲。在各個(gè)包含1.5％w/v Bacto瓊脂的帶蓋塑料杯(Solo(注冊商標(biāo))塑料杯，28mL)中飼養(yǎng)幼蟲，飼喂葉子碎片，每2-3天或消耗75％以上時(shí)更換。幼蟲達(dá)到第五齡時(shí)，增加葉子材料的數(shù)量。全部生物學(xué)分析采用未開花植物的新葉。為了避免創(chuàng)傷反應(yīng)，新近用干凈的解剖刀片從葉柄切下葉子，在主葉脈之間小心切開，分成碎片(2×2cm)，以使葉子碎片中的任何創(chuàng)傷反應(yīng)減到最小。幼蟲在24±1℃的控溫房間內(nèi)，于光下飼養(yǎng)。每2-3天測定幼蟲的重量，直至第23天，計(jì)算平均重量。實(shí)驗(yàn)3在與澳洲棉鈴蟲生物學(xué)分析所述相同的條件下，使用40只棉鈴蟲幼蟲。結(jié)果如圖15所示。
(c)利用人工飼料的生物學(xué)分析為了證實(shí)該殺蟲活性應(yīng)歸于防御素、而非其它內(nèi)源性防衛(wèi)分子的上調(diào)，利用包含從花蕾純化的防御素的人造棉葉飼料進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。使用富含半胱氨酸的6kDa花煙草蛋白酶抑制因子(NaPI)(Atkinson等人，Plant Cell 5203-213，1993)作為陽性對照，酪蛋白用作陰性對照。除人工飼料基于棉葉以外，如Heath等人所述(J.InsectPhysiology 43833-842，1997)進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)(表2)。從花煙草的花蕾中純化30mg防御素，用于兩個(gè)濃度的人工飼料。飼喂0.3％(w/v)防御素的棉鈴蟲幼蟲比對照小40％(圖16)，而飼喂相同濃度NaPI的幼蟲比對照小約60％。
實(shí)施例11產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植物(a)土壤桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化陸地棉(Gossypium hirsutum)栽培品種Coker 315的種子在2％v/v次氯酸鈉中表面滅菌60分鐘，然后用無菌水洗滌幾次。將滅菌的種子播種在半強(qiáng)度的MS培養(yǎng)基中(MS；0.22％w/v Murashige和Skoog鹽混合物(Gibco BRL)[1962；同上]、0.2％ Gelrite(PhytoTechnology Laboratories)，pH 5.8)，在暗處30℃溫育7天。用pHEX3構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根瘤土壤桿菌(LBA4404)，在補(bǔ)充有抗生素卡那霉素(50μg/mL)的25ml LB培養(yǎng)基中，于28℃生長過夜。測定550nm處吸光度，細(xì)胞在MS液體培養(yǎng)基(0.43％w/v Murashige和Skoog鹽[1962；同上]，pH 5.8)中稀釋到2×108細(xì)胞/ml。將棉花下胚軸切成1.5-2cm小塊，在稀釋的土壤桿菌培養(yǎng)物中短暫混合(0.5-3分鐘)。將外植體干貼在無菌3MM紙上，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液1中(0.43％w/vMurashige和Skoog鹽混合物(GibcoBRL)[1962；同上]、0.1％v/vGamborg’s維生素B5溶液(Sigma)、0.1g/L肌醇、0.9g/L MgCl2(六水合物)、1.9g/L硝酸鉀、0.2％w/v Gelrite、3％w/v葡萄糖，pH 5.8)，用無菌濾紙覆蓋，于光下26℃溫育3天。
共培養(yǎng)以后，將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基2中(培養(yǎng)基1加上0.1mg/L激動素、0.1mg/L 2，4-D、500mg/L羧芐青霉素、35mg/L卡那霉素)，于弱光下30℃培養(yǎng)。4周以后，將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基3中(培養(yǎng)基1加上500mg/L羧芐青霉素、35mg/L卡那霉素)，于弱光下30℃培養(yǎng)。每4周在培養(yǎng)基3中繼代培養(yǎng)外植體和愈傷組織，于弱光下30℃培養(yǎng)。從組織中切下胚，在培養(yǎng)基4中萌發(fā)(1.2mMCaCl22H2O、5.0mM KNO3、2.0mM MgSO47H2O、3.0mm NH4NO3、0.2mMKH2PO4、4μM煙酸、4μM鹽酸吡哆醇、4μM鹽酸硫胺素、30μMH3BO3、30μM MnSO4H2O、9μM ZnSO47H2O、1.5μM KI、0.9μMNa2MoO42H2O、0.03μM CuSO45H2O、0.03μM CoCl26H2O、0.5％w/v葡萄糖、0.3％w/v Gelrite，pH 5.5)，于強(qiáng)光下30℃培養(yǎng)。
然后將萌發(fā)的胚轉(zhuǎn)移到包含培養(yǎng)基5(1.2mM CaCl22H2O、40.0mM KNO3、2.0mM MgSO47H2O、15mM NH4Cl、0.2mM KH2PO4、4μm煙酸、4μm鹽酸吡哆醇、4μm鹽酸硫胺素、30μm H3BO3、30μmMnSO4H2O、9μm ZnSO47H2O、1.5μm KI、0.9μm Na2MoO42H2O、0.03μm CuSO45H2O、0.03μm CoCl26H2O、2.0％w/v蔗糖、0.2％w/vGelrite，pH 5.5)的Magenta箱中，于強(qiáng)光下30℃培養(yǎng)。一旦植物形成良好的根系并長出幾片新葉，便將其轉(zhuǎn)移到盆土中，在生長室中于28℃適應(yīng)，然后在溫室中于(白天27-29℃、夜晚20-24℃)生長。
(b)檢測轉(zhuǎn)基因棉的NaPdf1從生長室或溫室中生長的植物上切下葉子(第一位，直徑為3-4cm)。將組織(100mg)在液氮中冷凍，用研缽和研杵研磨成細(xì)粉。粉末中加入2x樣品緩沖液(300μl，Novex NuPAGE LDS樣品緩沖液，10％v/v β-巰基乙醇)，渦旋30秒，煮沸5分鐘，然后14,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，留取上清。在Novex X Cell II微型細(xì)胞電泳裝置中，利用預(yù)制的4-12％w/v聚丙烯酰胺梯度凝膠(Novex，NuPAGEbis-tris，MES緩沖液)，200V 35分鐘，通過SDS-PAGE分離總可溶性葉提取物。包括預(yù)染的分子量標(biāo)志(Novex SeeBlue)作為標(biāo)準(zhǔn)。利用Novex X Cell II微型細(xì)胞電泳裝置，在含10％v/v甲醇的NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖液中，于30V 60分鐘，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(Micron Separations Inc.0.22μm孔徑)。轉(zhuǎn)移后將膜在異丙醇中溫育1分鐘，然后TBS洗滌5分鐘。
將膜用3％w/v BSA室溫封閉1小時(shí)，然后與初級抗體室溫溫育過夜(用TBS按1∶2500稀釋)。將膜用TBST洗滌5×10分鐘，然后與綴合辣根過氧化物酶的山羊抗兔IgG室溫溫育60分鐘(Pierce，用TBS按1∶100,000稀釋)。再次TBST洗滌5×10分鐘，然后按照廠家說明書，將膜與SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)溫育。將膜用ECL Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)曝光。結(jié)果如圖14C所示。
實(shí)施例12轉(zhuǎn)基因棉的昆蟲飼養(yǎng)試驗(yàn)利用兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉系的T2代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該植物通過初級轉(zhuǎn)基因系CT35.9.4和CT35.125.1(均用pHEX3構(gòu)建體轉(zhuǎn)化)自交產(chǎn)生，由純合和半合植物的混合物組成。使用未轉(zhuǎn)化的親本Coker315植物作為陰性對照。
選擇20只新孵化的棉鈴蟲幼蟲。在各個(gè)包含1.5％w/v Bacto瓊脂的帶蓋塑料杯(Solo(注冊商標(biāo))塑料杯，28mL)中飼養(yǎng)幼蟲，飼喂葉子碎片，每2-3天或消耗75％以上時(shí)更換。采用未開花植物的新葉進(jìn)行生物學(xué)分析。幼蟲在25±1℃溫控房間于光下飼養(yǎng)。第4、6和8天記錄死幼蟲的數(shù)目。第8天測定每個(gè)成活幼蟲的重量，計(jì)算平均重量。結(jié)果如圖17所示。
實(shí)施例13產(chǎn)生昆蟲抗性植物(a)多個(gè)物種基因的分子克隆使用圖10所示序列中的任何一個(gè)氨基酸序列(SEQ ID NO25-SEQ ID NO49)設(shè)計(jì)合適的寡核苷酸引物，用于酌情篩選cDNA或基因組DNA文庫。例如以上實(shí)施例4(a)和9(a)所述，利用例如PCR克隆對應(yīng)的完整核苷酸編碼序列。然后將表達(dá)盒插入目的載體，例如pBIN19或pCGP1988，如實(shí)施例9(a)所述使用。
(b)昆蟲性植物的轉(zhuǎn)化和再生利用已知的、本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，利用包含帶有相應(yīng)品種抗昆蟲序列的表達(dá)盒的一種或多種載體，轉(zhuǎn)化所選目標(biāo)植物品種的植物材料。合適的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于實(shí)施例9(b)、9(c)和9(d)所示土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，針對特定植物品種進(jìn)行必要的修改。特定植物品種的其它轉(zhuǎn)化方法廣為人知，并包括例如生物彈(biolistic)轉(zhuǎn)化方法。
植物再生以后，分析其對常見植物害蟲、包括昆蟲侵襲的抗性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，此處所述本發(fā)明容許除明確描述之外的變化和修改。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所有這類變化和修改。本發(fā)明也包括本說明書涉及或表明的全部方法、特征、組合物和復(fù)合物，不論單個(gè)或全體，以及任何兩個(gè)或多個(gè)所述方法或特征的任一及全部組合。
序列表<110>Hexima Ltd<120>植物來源分子、其編碼遺傳序列及其用途<130>2497993/EJH<140>國際上尚未得到的<141>2002-02-08<150>USSN 60/267,271<151>2001-02-08<160>61<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>28<212>DNA<213>引物<400>1ggaattccat atggctcgct ccttgtgc 28<210>2<211>29<212>DNA<213>引物<400>2gcggatcctc agttatccat tatctcttc29<210>3<211>24<212>DNA<213>引物<400>3ccggatccag agaatgcaaa acag 24<210>4<211>26<212>DNA<213>引物<400>4gggagctctt agttatccat tatctc 26<210>5<211>31<212>DNA<213>引物<400>5
ggaattctaa acaatggctc gctccttgtg c 31<210>6<211>29<212>DNA<213>引物<400>6gctctagatc agttatccat tatctcttc29<210>7<211>141<212>DNA<213>花煙草<220>
<221>CDS<222>(1)..(141)<400>7aga gaa tgc aaa aca gaa agc aac aca ttt cct gga ata tgc att acc48Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr1 5 10 15aaa cca cca tgc aga aaa gct tgt atc agt gag aaa ttt act gat ggt96Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly20 25 30cat tgt agc aaa atc ctc aga agg tgc cta tgt act aag cca tgt141His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys35 40 45<210>8<211>47<212>PRT<213>花煙草<400>8Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr1 5 10 15Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly20 25 30His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys35 40 45<210>9<211>75<212>DNA<213>花煙草<220>
<221>CDS<222>(1)..(75)<400>9
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<221>CDS<222>(1)..(99)<400>11gtg ttt gat gag aag atg act aaa aca gga gct gaa att ttg gct gag48Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu1 5 10 15gaa gca aaa act ttg gct gca gct ttg ctt gaa gaa gag ata atg gat96Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp20 25 30aac99Asn<210>12<211>33<212>PRT<213>花煙草<400>12Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu1 5 10 15Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp20 25 30Asn<210>13<211>216
<212>DNA<213>花煙草<220>
<221>CDS<222>(1)..(216)<400>13atg gct cgc tcc ttg tgc ttc atg gca ttt gct atc ttg gca agg atg48Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Arg Met1 5 10 15ctc ttt gtt gcc tat gag gtg caa gct aga gaa tgc aaa aca gaa agc96Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser20 25 30aac aca ttt cct gga ata tgc att acc aaa cca cca tgc aga aaa gct144Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala35 40 45tgt atc agt gag aaa ttt act gat ggt cat tgt agc aaa atc ctc aga192Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg50 55 60agg tgc cta tgt act aag cca tgt216Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys65 70<210>14<211>72<212>PRT<213>花煙草<400>14Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Arg Met1 5 10 15Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser20 25 30Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala35 40 45Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg50 55 60Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys65 70<210>15<211>240<212>DNA<213>花煙草<220>
<221>CDS<222>(1)..(240)
<400>15aga gaa tgc aaa aca gaa agc aac aca ttt cct gga ata tgc att acc48Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr1 5 10 15aaa cca cca tgc aga aaa gct tgt atc agt gag aaa ttt act gat ggt96Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly20 25 30cat tgt agc aaa atc ctc aga agg tgc cta tgt act aag cca tgt gtg144His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val35 40 45ttt gat gag aag atg act aaa aca gga gct gaa att ttg gct gag gaa192Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu Glu50 55 60gca aaa act ttg gct gca gct ttg ctt gaa gaa gag ata atg gat aac240Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn65 70 75 80<210>16<211>80<212>PRT<213>花煙草<400>16Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr1 5 10 15Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly20 25 30His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val35 40 45Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu Glu50 55 60Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn65 70 75 80<210>17<211>541<212>DNA<213>花煙草<220>
<221>CDS<222>(1)..(318)<400>17atg gct cgc tcc ttg tgc ttc atg gca ttt gct atc ttg gca agg atg48Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Arg Met1 5 10 15
ctc ttt gtt gcc tat gag gtg caa gct aga gaa tgc aaa aca gaa agc96Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser20 25 30aac aca ttt cct gga ata tgc att acc aaa cca cca tgc aga aaa gct144Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala35 40 45tgt atc agt gag aaa ttt act gat ggt cat tgt agc aaa atc ctc aga192Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg50 55 60agg tgc cta tgt act aag cca tgt gtg ttt gat gag aag atg act aaa240Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys65 70 75 80aca gga gct gaa att ttg gct gag gaa gca aaa act ttg gct gca gct288Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala85 90 95ttg ctt gaa gaa gag ata atg gat aac taa ttagagatta gaagaaatta 338Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn100 105aggatgcagt atcacacata ataaagtttc tacctttctt aaaagtgtag ctaatgttgt 398gttttaattg gcttttagta gccttttatt acactttaaa taagtgtggc acttcaatcc 458tttgtgcaat cttgcactaa gtttatttgt gtacttttaa tgaaaatgac cttctatggt 518ctttggttaa aaaaaaaaaa aaa 541<210>18<211>105<212>PRT<213>花煙草<400>18Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Arg Met1 5 10 15Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser20 25 30Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala35 40 45Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg50 55 60Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys65 70 75 80Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala85 90 95Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn
100 105<210>19<211>223<212>DNA<213>花煙草<400>19ttagagatta gaagaaatta aggatgcagt atcacacata ataaagtttc tacctttctt60aaaagtgtag ctaatgttgt gttttaattg gcttttagta gccttttatt acactttaaa120taagtgtggc acttcaatcc tttgtgcaat cttgcactaa gtttatttgt gtacttttaa180tgaaaatgac cttctatggt ctttggttaa aaaaaaaaaa aaa 223<210>20<211>105<212>PRT<213>肽<400>20Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Met Met1 5 10 15Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser20 25 30Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala35 40 45Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Leu Leu Arg50 55 60Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Ile Lys65 70 75 80Thr Gly Ala Glu Thr Leu Val Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala85 90 95Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn100 105<210>21<211>105<212>PRT<213>肽<400>21Met Ala Arg Ser Ile Phe Phe Met Ala Phe Leu Val Leu Ala Met Met1 5 10 15Leu Phe Val Thr Tyr Glu Val Glu Ala Gln Gln Ile Cys Lys Ala Pro20 25 30Ser Gln Thr Phe Pro Gly Leu Cys Phe Met Asp Ser Ser Cys Arg Lys35 40 45Tyr Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Gly Gly His Cys Ser Lys Leu Gln50 55 60
Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Lys Ile Ser Ser65 70 75 80Glu Val Lys Ala Thr Leu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ser Glu Val85 90 95Val Leu Glu Glu Glu Ile Met Met Glu100 105<210>22<211>78<212>PRT<213>肽<400>22Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Ile Ala Leu1 5 10 15Leu Val Thr Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg20 25 30Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ser Arg Asp35 40 45Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Arg50 55 60Cys Pro Trp Ile Pro Pro Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys65 70 75<210>23<211>78<212>PRT<213>肽<400>23Met Gly Arg Ser Ile Arg Leu Phe Ala Thr Phe Phe Leu Ile Ala Met1 5 10 15Leu Phe Leu Ser Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ser Ala Glu Ala Arg20 25 30Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe His Gly Thr Cys Val Arg Glu35 40 45Ser Asn Cys Ala Ser Val Cys Gln Thr Glu Gly Phe Ile Gly Gly Asn50 55 60Cys Arg Ala Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Arg Asn Cys65 70 75<210>24<211>77<212>PRT<213>肽<400>24
Met Lys Leu Ser Met Arg Leu Ile Ser Ala Val Leu Ile Met Phe Met1 5 10 15Ile Phe Val Ala Thr Gly Met Gly Pro Val Thr Val Glu Ala Arg Thr20 25 30Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Thr Cys Val Ser Ala Ser35 40 45Asn Cys Ala Asn Val Cys His Asn Glu Gly Phe Val Gly Gly Asn Cys50 55 60Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Arg His Cys65 70 75<210>25<211>47<212>PRT<213>肽<400>25Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr1 5 10 15Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly20 25 30His Cys Ser Lys Leu Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys35 40 45<210>26<211>47<212>PRT<213>肽<400>26Gln Ile Cys Lys Ala Pro Ser Gln Thr Phe Pro Gly Leu Cys Phe Met1 5 10 15Asp Ser Ser Cys Arg Lys Tyr Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Gly Gly20 25 30His Cys Ser Lys Leu Gln Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys35 40 45<210>27<211>47<212>PRT<213>肽<400>27Arg His Cys Glu Ser Leu Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Thr Arg1 5 10 15Asp Ser Asn Cys Ala Ser Val Cys Glu Thr Glu Arg Phe Ser Gly Gly20 25 30
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<213>肽<400>42Glu Val Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn1 5 10 15Thr Gly His Cys20<210>43<211>47<212>PRT<213>肽<400>43Arg Val Cys Met Lys Gly Ser Gln His His Ser Phe Pro Cys Ile Ser1 5 10 15Asp Arg Leu Cys Ser Asn Glu Cys Val Lys Glu Glu Gly Gly Trp Thr20 25 30Ala Gly Tyr Cys His Leu Arg Tyr Cys Arg Cys Gln Lys Ala Cys35 40 45<210>44<211>45<212>PRT<213>肽<400>44Asn Thr Cys Glu Asn Leu Ala Gly Ser Tyr Lys Gly Val Cys Phe Gly1 5 10 15Gly Cys Asp Arg His Cys Arg Thr Gln Glu Gly Ala Ile Ser Gly Arg20 25 30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Trp Cys Thr Lys Asn Cys35 40 45<210>45<211>50<212>PRT<213>肽<400>45Leu Cys Asn Glu Arg Pro Ser Gln Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn1 5 10 15Thr Ala His Cys Asp Lys Gln Cys Gln Asp Trp Glu Lys Ala Ser His20 25 30Gly Ala Cys His Lys Arg Glu Asn His Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe35 40 45Asn Cys50
<210>46<211>51<212>PRT<213>肽<400>46Lys Leu Cys Asp Val Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly His Cys Gly Ser1 5 10 15Ser Ser Lys Cys Ser Gln Gln Cys Lys Asp Arg Glu His Phe Ala Tyr20 25 30Gly Gly Ala Cys His Tyr Gln Phe Pro Ser Val Lys Cys Phe Cys Lys35 40 45Arg Gln Cys50<210>47<211>50<212>PRT<213>肽<400>47Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn1 5 10 15Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His20 25 30Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe35 40 45Asn Cys50<210>48<211>46<212>PRT<213>肽<400>48Asn Thr Cys Glu His Leu Ala Asp Thr Tyr Arg Gly Val Cys Phe Thr1 5 10 15Asn Ala Ser Cys Asp Asp His Cys Lys Asn Lys Ala His Leu Ile Ser20 25 30Gly Thr Cys His Asp Trp Lys Cys Phe Cys Thr Gln Asn Cys35 40 45<210>49<211>49<212>PRT<213>肽<400>49
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100 105<210>52<211>106<212>PRT<213>肽<400>52Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Val Leu Ala Met Met1 5 10 15Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Lys Ser Thr Cys Lys Ala Glu20 25 30Ser Asn Thr Phe Pro Gly Leu Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys35 40 45Ala Cys Leu Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly Lys Cys Ser Lys Ile Leu50 55 60Arg Arg Cys Ile Cys Tyr Lys Pro Cys Val Phe Asp Gly Lys Met Ile65 70 75 80Gln Thr Gly Ala Glu Asn Leu Ala Glu Glu Ala Glu Thr Leu Ala Ala85 90 95Ala Leu Leu Glu Glu Glu Met Met Asp Asn100 105<210>53<211>47<212>PRT<213>肽<400>53Arg Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Asp Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly20 25 30Arg Cys Pro Trp Ile Pro Pro Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys35 40 45<210>54<211>19<212>PRT<213>肽<400>54Arg Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe His Gly Thr Cys Val Arg1 5 10 15Glu Ser Asn<210>55<211>47
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<221>CDS<222>(1)..(1104)<400>56aag gct tgt acc tta aac tgt gat cca aga att gcc tat gga gtt tgc48Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys1 5 10 15ccg cgt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc96Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys20 25 30gca ggc acg aag ggt tgt aag tac ttc agt gat gat gga act ttt gtt144Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val35 40 45tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gct tgt acc tta aac192Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn50 55 60tgt gat cca aga att gcc tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag240Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys65 70 75 80aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt288Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys85 90 95aag tac ttc agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat336Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp100 105 110cct aga aat cca aag gct tgt cct cgg aat tgc gat cca aga att gcc384Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala115 120 125tat ggg att tgc cca ctt gca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc432Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ala Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys
130 135 140acc aac tgt tgc gca ggc aaa aag ggt tgt aag tac ttt agt gat gat480Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp145 150 155 160gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aaa aat cca aag gcc528Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala165 170 175tgt cct cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt576Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu180 185 190tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgc tgc gca ggc624Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly195 200 205aaa aag ggt tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa672Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu210 215 220gga gag tct gat cct aaa aat cca aag gct tgt cct cgg aat tgt gat720Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp225 230 235 240gga aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat768Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn245 250 255gat cgg ata tgc aca aac tgt tgc gca ggc aaa aag ggc tgt aag tac816Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr260 265 270ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga864Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg275 280 285aat cca aag gcc tgt cct cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat gga912Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly290 295 300att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aat960Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn305 310 315 320tgt tgc gca ggc aag aag ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act1008Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr325 330 335ttt att tgt gaa gga gaa tct gaa tat gcc agc aaa gtg gat gaa tat1056Phe Ile Cys Glu Gly Glu Ser Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr340 345 350gtt ggt gaa gtg gag aat gat ctc cag aag tct aag gtt gct gtt tcc1104Val Gly Glu Val Glu Asn Asp Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser355 360 365
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<221>misc_特征<222>(2)..(2)<223>X＝E或I或T<220>
<221>misc_特征<222>(2)..(2)<223>X＝E或I或T<220>
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<221>misc_特征<222>(6)..(6)<223>X＝E或P或Q<220>
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<221>misc_特征<222>(11)..(11)<223>X＝P或K或H<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(13)<223>X＝I或L或P或T<220>
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<220>
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<220>
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<221>misc_特征<222>(105)..(105)<223>X＝無氨基酸或L<220>
<221>misc_特征<222>(106)..(106)<223>X＝無氨基酸或E<220>
<221>misc_特征<222>(107)..(107)<223>X＝無氨基酸或E<220>
<221>misc_特征<222>(108)..(108)<223>X＝無氨基酸或E<220>
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<221>misc_特征<222>(111)..(111)<223>X＝無氨基酸或D或M<220>
<221>misc_特征<222>(112)..(112)<223>X＝無氨基酸或N或E
<400>61Met Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa20 25 30Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Phe Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Glu Xaa Phe Xaa Xaa Gly50 55 60Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Thr Xaa Xaa Cys Xaa65 70 75 80Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa85 90 95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa100 105 110
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多肽的成熟結(jié)構(gòu)域的下列位點(diǎn)包含半胱氨酸殘基a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a8a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中所述成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性，附帶條件是該多肽不是FST或TPP3。
3.權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子，其中所述的多肽包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO58]的成熟結(jié)構(gòu)域X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61C其中X30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I，或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或H。
4.權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子，其中所述的多肽包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO59]的信號結(jié)構(gòu)域MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或VX25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸，A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或Q。
5.權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子，其中所述多肽包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO60]的C端結(jié)構(gòu)域X62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94X95其中X62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E。
6.權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子，其中所述多肽包含以下氨基酸序列[SEQ ID NO61]MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61CX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或VX25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸或A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或QX30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或HX62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E。
7.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的核酸是DNA。
8.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的核酸是RNA。
9.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的多肽在植物花的雌蕊、子房或花藥中的一個(gè)或多個(gè)中生成。
10.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的多肽在植物花的雌蕊中生成。
11.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的多肽在花瓣和萼片的表皮層、花柱的皮層細(xì)胞和/或花藥的結(jié)締組織中生成。
12.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的植物害蟲是昆蟲。
13.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子從花煙草或其變種或株系中分離。
14.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述多肽的成熟結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列、或者經(jīng)最佳比對與SEQ IDNO8具有至少70％相似性的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO7所示編碼成熟結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列、或與SEQ ID NO7具有至少約70％相似性的核苷酸序列、或在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能夠與SEQ ID NO7或其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列。
16.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述多肽包含SEQ IDNO8所示氨基酸序列。
17.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO7所示核苷酸序列。
18.權(quán)利要求1或13的分離的核酸分子，其包含于可操作性連接啟動子的構(gòu)建體中。
19.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多肽包含選自SEQID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18的氨基酸序列、或與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ IDNO18中任何一個(gè)具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的核酸分子包含選自SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17的核苷酸序列，或與SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17之一具有至少約70％相似性的核苷酸序列，或者在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能夠與SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17或其互補(bǔ)形式雜交的核酸分子。
21.用于產(chǎn)生抗昆蟲轉(zhuǎn)基因植物的遺傳構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)基因植物生成防御素或防御素樣分子，其選自SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18以及SEQ ID NO20到SEQ IDNO49、或者與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQID NO18中任何一個(gè)具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求21的遺傳構(gòu)建體，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物。
23.權(quán)利要求21的遺傳構(gòu)建體，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物。
24.權(quán)利要求21的遺傳構(gòu)建體，其中所述的植物選自小麥、稻、大麥、大豆和甘蔗。
25.權(quán)利要求21的遺傳構(gòu)建體，其中所述的植物選自玫瑰、康乃馨、矮牽牛、洋桔梗、百合、鳶尾、郁金香、小蒼蘭、飛燕草、補(bǔ)血草和天竺葵。
26.產(chǎn)生對植物害蟲抗性提高或增強(qiáng)的植物的方法，該方法包含將遺傳構(gòu)建體引入一個(gè)或一群植物細(xì)胞的基因組中，該遺傳構(gòu)建體包含與花來源的防御素樣分子的編碼核苷酸序列可操作性連接的啟動子或其功能等價(jià)物，該防御素樣分子具有包含以下氨基酸序列的成熟結(jié)構(gòu)域a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a8a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域顯示出對植物害蟲、例如昆蟲害蟲的抑制性活性，并從該細(xì)胞或細(xì)胞群再生出植物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的防御素樣分子包含具有SEQID NO58所示氨基酸序列的成熟結(jié)構(gòu)域。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的防御素樣分子包含成熟結(jié)構(gòu)域，其具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的氨基酸序列、或與SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6之一具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的防御素樣分子包含SEQ IDNO8所示氨基酸序列。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述的植物害蟲是昆蟲。
31.來自植物或轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，該細(xì)胞、組織或器官包含含有編碼多肽的、或與編碼多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子，該多肽的前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
32.權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，其中所述的多肽包含具有以下結(jié)構(gòu)的成熟結(jié)構(gòu)域a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a8a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
33.權(quán)利要求32的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，其中所述的多肽包含選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的氨基酸序列、或與SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6之一具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求3的方法，其中所述的防御素樣分子包含SEQ IDNO8所示氨基酸序列。
35.改造為表達(dá)此處定義的防御素樣分子或其變體或同系物的編碼核酸分子的植物子代，以及該植物的營養(yǎng)、繁殖和再生部分，例如花(包括切或割的花)、植物部分、植物的纖維物質(zhì)(例如棉)以及再生部分，包括插枝、花粉、種子和愈傷組織。36.能夠生成此處所述異源防御素樣分子的遺傳修飾的植物細(xì)胞、或多細(xì)胞植物或其子代、或遺傳修飾植物的部分，其中該轉(zhuǎn)基因植物對植物害蟲例如昆蟲具有抗性或敏感性降低。
37.單獨(dú)或聯(lián)合包含與第一核苷酸序列可操作性連接的第一啟動子的一個(gè)或多個(gè)遺傳構(gòu)建體，其中所述的第一核苷酸序列編碼能夠抑制植物害蟲例如昆蟲的防御素樣分子，所述的構(gòu)建體進(jìn)一步包含與第二核苷酸序列可操作性連接的第二啟動子，其中該第二核苷酸序列編碼蛋白酶抑制因子或其前體。
38.分離的多肽，其前體形式包含N端信號結(jié)構(gòu)域、成熟結(jié)構(gòu)域以及酸性C端結(jié)構(gòu)域，其中該多肽在花發(fā)育期間生成，其成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性。
39.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中該多肽的成熟結(jié)構(gòu)域在下列位點(diǎn)包含半胱氨酸殘基a1a2CIa3a4a5a6a7a8a9a10a11a12CIIa13a14a15a16a17CIIIa18a19a20CIVa21a22a23a24a25a26a27a8a29CVa30a31a32a33a34a35CVIa36CVIIa37a38a39CVIII其中″a″可能相同或不同，并代表任何氨基酸殘基，每個(gè)″a″的數(shù)字下標(biāo)代表其在氨基酸序列中的位置，″C″代表處于羅馬數(shù)字所示位置的半胱氨酸殘基，其中該成熟結(jié)構(gòu)域具有抗一種或多種植物害蟲的活性，附帶條件是該多肽不是FST或TPP3。
40.權(quán)利要求39的分離的多肽，其中所述的多肽包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO58]的成熟結(jié)構(gòu)域X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61C其中X30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I，或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或H。
41.權(quán)利要求39的分離的多肽，其中所述的多肽包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO59]的信號結(jié)構(gòu)域MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或VX25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸，A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或Q。
42.權(quán)利要求39的分離的多肽，其中所述的多肽包含具有以下氨基酸序列[SEQ ID NO60]的C端結(jié)構(gòu)域X62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94X95其中X62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E。
43.權(quán)利要求39的分離的多肽，其中所述的多肽包含以下氨基酸序列[SEQ ID NO61]MX1X2SX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28AX29X30X31CX32X33X34SX35X36FX37GX38CX39X40X41X42X43CX44X45X46CX47X48EX49FX50X51GX52CX53X54X55X56X57X58CX59CTX60X61CX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X86X87X88X89X90X91X92X93X94其中X1＝A，G或KX2＝R，N或LX3＝L，I或MX4＝C，F(xiàn)或RX5＝F或LX6＝M，F(xiàn)或IX7＝A或SX8＝F，T或AX9＝A，L，V或FX10＝I，V，L或FX11＝L或IX12＝A，I或MX13＝M，A或FX14＝M或LX15＝L或IX16＝F或VX17＝V，T或LX18＝A，T或SX19＝Y(jié)或TX20＝E或GX21＝V或MX22＝無氨基酸或GX23＝無氨基酸或PX24＝無氨基酸，M或VX25＝無氨基酸或TX26＝無氨基酸，I或SX27＝無氨基酸或A或VX28＝Q或EX29＝無氨基酸或QX30＝R或QX31＝E，I或TX32＝K或EX33＝T，A或SX34＝E，P或QX35＝N，Q或HX36＝T或RX37＝P，K或HX38＝I，L，P或TX39＝I，F(xiàn)，S或VX40＝T，M，R或SX41＝K，D，E或AX42＝P或SX43＝P，S或NX44＝R或AX45＝K，T，S或NX46＝A，Y或VX47＝I，L，Q或HX48＝S，K，T或NX49＝K或GX50＝T，S，I或VX51＝D或GX52＝H，R，或NX53＝S，P或RX54＝K，W，A或GX55＝I，L或FX56＝L，Q，P或RX57＝R或PX58＝R或KX59＝L或FX60＝K，S或RX61＝P，N或HX62＝無氨基酸或VX63＝無氨基酸或FX64＝無氨基酸或DX65＝無氨基酸或E或KX66＝無氨基酸或K或IX67＝無氨基酸或M或SX68＝無氨基酸或T，I或SX69＝無氨基酸或K或EX70＝無氨基酸或T或VX71＝無氨基酸或G或KX72＝無氨基酸或AX73＝無氨基酸或EX74＝無氨基酸或I或TX75＝無氨基酸或LX76＝無氨基酸或A，V或GX77＝無氨基酸或EX78＝無氨基酸或EX79＝無氨基酸或AX80＝無氨基酸或KX81＝無氨基酸或TX82＝無氨基酸或LX83＝無氨基酸或A或SX84＝無氨基酸或A或EX85＝無氨基酸或A或VX86＝無氨基酸或L或VX87＝無氨基酸或LX88＝無氨基酸或EX89＝無氨基酸或EX90＝無氨基酸或EX91＝無氨基酸或IX92＝無氨基酸或MX93＝無氨基酸或D或MX94＝無氨基酸或N或E。
44.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的多肽在植物花的雌蕊、子房或花藥中的一個(gè)或多個(gè)中生成。45.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的多肽在植物花的雌蕊中生成。
46.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的多肽在花瓣和萼片的表皮層、花柱的皮層細(xì)胞和/或花藥的結(jié)締組織中生成。
47.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的植物害蟲是昆蟲。
48.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的多肽從花煙草或其變種或株系中分離。
49.權(quán)利要求44的分離的多肽，其中所述的多肽的成熟結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列、或者經(jīng)最佳比對與SEQ ID NO8具有至少70％相似性的氨基酸序列。
50.權(quán)利要求44的分離的多肽，其由SEQ ID NO7所示核苷酸序列、或與SEQ ID NO7具有至少約70％相似性的核苷酸序列、或在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能夠與SEQ ID NO7或其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列編碼。
51.權(quán)利要求44的分離的多肽，其中所述的多肽包含SEQ IDNO8所示氨基酸序列。
52.權(quán)利要求44的分離的多肽，其由SEQ ID NO7所示核苷酸序列編碼。
53.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的多肽包含選自SEQID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18的氨基酸序列，或與SEQ ID NO8、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ IDNO18中任何一個(gè)具有至少約70％相似性的氨基酸序列。
54.權(quán)利要求38的分離的多肽，其中所述的多肽由選自SEQ IDNO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO17的核苷酸序列、或與SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ IDNO17之一具有至少約70％相似性的核苷酸序列、或者在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能夠與SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ IDNO17或其互補(bǔ)形式雜交的核酸分子編碼。
55.防御素分子的分離的抗體，其中所述防御素分子包含基本上如SEQ ID NO8所示的成熟結(jié)構(gòu)域。
56.權(quán)利要求55的分離的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
57.權(quán)利要求56的分離的抗體，其中所述抗體是IgG組分抗體。
58.權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)的分離的抗體，其能與具有SEQID NO12所示C-端氨基酸序列的防御素分子反應(yīng)。
59.權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)的分離的抗體，其能與具有SEQID NO10所示N-端氨基酸序列的防御素分子反應(yīng)。
60.權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)的分離的抗體，其能與具有SEQID NO18所示N-端氨基酸序列的防御素分子反應(yīng)。
61.權(quán)利要求55-60任意一項(xiàng)的分離的抗體，其被報(bào)道分子標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼植物花防御素樣分子的遺傳分子及其在產(chǎn)生對植物害蟲包括昆蟲、微生物、真菌和/或病毒具有抗性、或至少敏感性下降的轉(zhuǎn)基因植物中的用途。本發(fā)明另外提供花和種子來源的防御素在產(chǎn)生昆蟲抗性植物中的用途。該植物可能是單子葉植物或雙子葉植物，特別是作物和觀賞花卉類植物。該遺傳分子還用于產(chǎn)生重組防御素樣分子，用于局部施用的組合物，以預(yù)防或者延遲植物害蟲侵染。本發(fā)明的花防御素樣分子或其編碼遺傳分子可單獨(dú)使用，或與其它物質(zhì)例如蛋白酶抑制因子前體或其編碼核酸分子、或者其它分子或其編碼核苷酸序列聯(lián)合使用。
文檔編號C12N15/82GK101029308SQ20061017327
公開日2007年9月5日 申請日期2002年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月8日
發(fā)明者M·A·安德森, 賴卓峰, R·L·希斯 申請人:赫?，斢邢薰? 拉特羅布大學(xué)