專利名稱：雙歧桿菌等嚴(yán)格厭氧菌的雙層平板計數(shù)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以雙歧桿菌為代表關(guān)于嚴(yán)格厭氧菌的計數(shù)方法。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)是于1899年法國巴斯德研究所的Henri.Tissier博士從健康的母乳哺育嬰兒的糞便中首次發(fā)現(xiàn)并分離出來的一種多形態(tài)桿狀的細(xì)菌。雙歧桿菌對人體有很大的保健作用，近年來對雙歧桿菌的研究越來越受到人們的重視，雙歧桿菌的制品不斷問世。目前市場上銷售的雙岐桿菌制劑品種繁多，作為保健品的制劑，應(yīng)突出雙岐桿菌本身，并保持一定的活菌數(shù)，因為雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)到106個/ml才能發(fā)揮正常生理功能。為了確保雙岐桿菌微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量，加強對該類產(chǎn)品的監(jiān)督檢測顯得尤為重要。然而目前國際上卻還沒有統(tǒng)一的檢測手段，也沒有相應(yīng)的檢測培養(yǎng)基。不同的檢測機構(gòu)采用不同的檢測方法，不但不能保證每一個檢測機構(gòu)檢測的準(zhǔn)確性，還無法通過檢測結(jié)果對該類產(chǎn)品的質(zhì)量進行比較，使雙歧桿菌制品市場存在混亂現(xiàn)象。
現(xiàn)有的雙歧桿菌計數(shù)方法主要有半固體培養(yǎng)基計數(shù)法、單層平板培養(yǎng)基計數(shù)法。其中半固體培養(yǎng)基計數(shù)法存在計數(shù)面積小，小菌落易重計、漏計的問題；單層平板培養(yǎng)基計數(shù)法存在平板表面有低濃度氧氣存在，雙歧桿菌生長數(shù)量少計數(shù)不準(zhǔn)的問題。
因此發(fā)明一個較為理想的檢測方法，準(zhǔn)確地計出雙歧桿菌的活菌數(shù)，作為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一使用，填補國家標(biāo)準(zhǔn)中該類產(chǎn)品雙歧桿菌活菌數(shù)檢測的空白，是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有方法計數(shù)不準(zhǔn)而且混亂不清的問題，本發(fā)明提供一種雙歧桿菌等嚴(yán)格厭氧菌的雙層平板計數(shù)法，具體操作步驟如下(1)將待測的含有雙歧桿菌的菌懸液，稀釋到10-6～10-7數(shù)量級的濃度。(2)將稀釋好的菌液1ml加入到滅過菌的培養(yǎng)皿中。(3)待加熱融化過的固體PTYG培養(yǎng)基降至40～50℃時，快速倒入培養(yǎng)皿中，用量為10～20ml/平皿，混勻，鋪成平板。(4)待培養(yǎng)皿底層培養(yǎng)基凝固后，再倒入以隔離氧為目的的保護性覆蓋物，用量為10～20ml/平皿，鋪平，靜止片刻，待培養(yǎng)基凝固，開始恒溫培養(yǎng)。(5)待形成肉眼可見的菌落后，開始計數(shù)。
雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，對環(huán)境中氧氣的含量非常敏感，只要環(huán)境中含有極微量的氧氣就會抑制其生長。在厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中，平板計數(shù)其在平板表面上的生長情況也達(dá)不到重復(fù)性、重現(xiàn)性好的計數(shù)要求，這給雙歧桿菌的培養(yǎng)和計數(shù)帶來很大的不便。本發(fā)明的雙歧桿菌雙層平板計數(shù)法，可準(zhǔn)確簡單地進行制品(液體、固體)、培養(yǎng)液中雙歧桿菌的活菌計數(shù)。本發(fā)明在雙歧桿菌計數(shù)的時候，采用雙層培養(yǎng)基，其中下層采用PTYG培養(yǎng)基，PTYG培養(yǎng)基可以很好地滿足雙岐桿菌生長所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)；而上層采用瓊脂-水培養(yǎng)基，可以很好地隔離氧，從而避免氧氣對雙歧桿菌的毒害作用，雙岐桿菌處于兩層培養(yǎng)基的中間而不與外界環(huán)境相接觸，從而達(dá)到與氧氣隔離的目的，因此可以很好地生長；上層也可以用PTYG或其他含有瓊脂等凝膠的其他培養(yǎng)基代替瓊脂-水培養(yǎng)基。如果上層用的是瓊脂-水空白培養(yǎng)基還可避免其他雜菌的污染。此方法與以往各種雙歧桿菌地計數(shù)方法相比較，具有更準(zhǔn)確的特點。實驗證明，這種方法是雙岐桿菌比較理想的計數(shù)方法。而且本方法同時適合于其它嚴(yán)格厭氧菌的計數(shù)。


圖1為雙歧桿菌雙層平板培養(yǎng)基計數(shù)示意圖，其中1培養(yǎng)皿，2PTYG培養(yǎng)基，3雙歧桿菌菌落層，4瓊脂-水培養(yǎng)基，5培養(yǎng)皿蓋；圖2為雙歧桿菌菌落層菌落生長示意圖，6雙歧桿菌菌落。
具體實施例方式
具體實施方式
一如圖1和圖2所示，本實施方式的雙歧桿菌的雙層平板計數(shù)法按照如下步驟進行(1)將待測的含有雙歧桿菌菌懸液，稀釋到數(shù)量級10-6和10-7的濃度，試驗設(shè)置3個重復(fù)；(2)將稀釋好的菌液1ml加入到滅過菌的培養(yǎng)皿中；(3)待加熱融化的固體PTYG培養(yǎng)基降至45℃時，快速倒入培養(yǎng)皿中，約15ml/平皿，混勻，鋪成平板。
(4)待培養(yǎng)皿底層培養(yǎng)基凝固后，再倒入45℃的瓊脂-水培養(yǎng)基，約15ml/平皿，鋪平，靜止片刻，待培養(yǎng)基凝固。上層也可以用PTYG或其他含有瓊脂等凝膠的其他培養(yǎng)基代替瓊脂-水培養(yǎng)基。
(5)待形成肉眼可見的菌落后，開始計數(shù)。
本實施方式中的PTYG培養(yǎng)基配方如下胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母提取膏10g，葡萄糖10g，土溫801ml，0.1％刃天青1ml，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，半胱氨酸鹽酸鹽(培養(yǎng)基煮沸后，分裝前加入)0.5g，鹽溶液40mlpH＝6.8～7.0，113℃滅菌30min。
鹽溶液成分和制備CaCl20.2g、K2HPO41.0g、MgSO47H2O0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl2.0g?；旌螩aCl2和MgSO4·7H2O在300ml蒸餾水中直至溶解，加500ml水，一邊攪拌一邊緩慢加入其他鹽類，繼續(xù)攪拌直到溶解。加入200ml蒸餾水，混合后貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 本實施方式中的瓊脂-水培養(yǎng)基配方如下瓊脂15g、蒸餾水1000ml，121℃滅菌20min。
本實施方式中所述的采用范圍是包括雙歧桿菌在內(nèi)的一些常規(guī)微生物計數(shù)法不能很好計數(shù)的嚴(yán)格厭氧菌制品及其培養(yǎng)液的計數(shù)。
具體實施方式
二設(shè)置4個處理單層(P)、雙層(P+Q)、雙層(P+P)和半固體(P)；其中分別為單層PTYG、底層PTYG上層瓊脂-水培養(yǎng)基、底層和上層均為PTYG和PTYG0.7％瓊脂半固體培養(yǎng)基；試驗重復(fù)3次，分別放入?yún)捬跸浜推胀ㄅ囵B(yǎng)箱中，37℃恒溫靜止培養(yǎng)，24～48h后觀察，記錄各平板中菌落的個數(shù)，根據(jù)稀釋度計算出原菌液中雙歧桿菌的個數(shù)，實驗結(jié)果見表1。
表1實驗結(jié)果

1、由于雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧的，雖然在厭氧箱內(nèi)也不能完全滿足其生長的要求，所以單層培養(yǎng)法測定的活菌數(shù)比較少并且重復(fù)性不好；而用雙層培養(yǎng)法和半固體培養(yǎng)法都要優(yōu)于單層培養(yǎng)法；在厭氧箱雖然厭氧程度不是很高，但是要好于在普通培養(yǎng)箱中。
2、雙層(PQ)法、雙層(PP)法和半固體培養(yǎng)基法，無論是在厭氧箱內(nèi)還是在培養(yǎng)箱內(nèi)都可以準(zhǔn)確的計出活菌數(shù)目，都在1個數(shù)量級內(nèi)，差別不大，且重復(fù)性好。
3、使用雙層(PQ)法、雙層(PP)法和半固體培養(yǎng)基法三種方法，雖然在結(jié)果上差別不大，但是雙層(PQ)具有明顯的優(yōu)勢。因為雙層(PP)雖然測出的數(shù)量較大，但是與雙層(PQ)法測出的數(shù)同在一個數(shù)量級內(nèi)，可是由于雙層(PP)法第二層使用的是PTYG培養(yǎng)基，而這層培養(yǎng)基僅僅起到一個保護的作用，這樣就造成了巨大的浪費，增加了經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，同時上層培養(yǎng)基易受雜菌污染影響計數(shù)，因此本專利申請優(yōu)先推薦使用雙層(PQ)法；半固體培養(yǎng)基法是用直立的試管計數(shù)，菌落形成后很多菌落分布在直徑較小的同一個平面上，難以進行統(tǒng)計，有易重復(fù)和漏計等缺點。根據(jù)試驗結(jié)果雙層(PQ)法、雙層(PP)法可完全取代半固體培養(yǎng)基法，對雙歧桿菌進行活菌計數(shù)。
4、使用雙層(PQ)法、雙層(PP)法測定了雙歧桿菌生長曲線，符合細(xì)菌生長曲線的規(guī)律，從而進一步驗證了本發(fā)明方法的可行性。
權(quán)利要求
1.雙歧桿菌等嚴(yán)格厭氧菌的雙層平板計數(shù)法，其特征在于所述計數(shù)方法為(1)將待測含有雙歧桿菌的制品配成菌懸液，稀釋到數(shù)量級10-6～10-7的濃度；(2)取稀釋好的菌懸液1ml加入到滅過菌的培養(yǎng)皿中；(3)待加熱融化的固體PTYG培養(yǎng)基降至40～50℃時，快速倒入培養(yǎng)皿中，用量為10～20ml/平皿，混勻，鋪成平板；(4)待培養(yǎng)皿底層培養(yǎng)基凝固后，再倒入以隔離氧為目的的保護性覆蓋物，用量為10～20ml/平皿，鋪平，靜止片刻，待培養(yǎng)基凝固，開始恒溫培養(yǎng)；(5)待形成肉眼可見的菌落后，開始計數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙歧桿菌等嚴(yán)格厭氧菌的雙層平板計數(shù)法，其特征在于所述以隔離氧為目的的保護性覆蓋物為瓊脂-水培養(yǎng)基、PTYG或其他含有瓊脂等凝膠的其他培養(yǎng)基。
全文摘要
雙歧桿菌等嚴(yán)格厭氧菌的雙層平板計數(shù)法，涉及一種以雙歧桿菌為代表關(guān)于嚴(yán)格厭氧菌的計數(shù)方法。為解決現(xiàn)有方法計數(shù)不準(zhǔn)確且混亂不清的問題，本發(fā)明操作步驟如下將待測的含有雙歧桿菌的制品配成濃度數(shù)量級為10
文檔編號C12R1/01GK1940085SQ20061015083
公開日2007年4月4日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者趙敏, 李德斌, 王炎 申請人:東北林業(yè)大學(xué)