專利名稱：披甲rna及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種披甲R(shí)NA及其制備方法。
背景技術(shù)：
RNA病毒性傳染病具有普遍性、適應(yīng)性、惡毒性、頑固性和難預(yù)防性等特點(diǎn)，常使 數(shù)以千萬的人喪失生命，經(jīng)濟(jì)損失巨大。上世紀(jì)50年代的流感大流行，2003年SARS引 發(fā)的嚴(yán)重疫情，這些突發(fā)性的公共衛(wèi)生事件每發(fā)生一次，都會(huì)對經(jīng)濟(jì)和社會(huì)穩(wěn)定帶來嚴(yán)重 的負(fù)面影響。世界衛(wèi)生組織稱，禽流感對亞洲的威脅可能比非典更嚴(yán)重。在病毒檢測和基 因的表達(dá)研究中，常需要RT-PCR來進(jìn)行定量或定性，這就需要RNA質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品。
為了更好對傳染性疾病進(jìn)行監(jiān)控，各個(gè)國家甚至全球范圍內(nèi)相繼建立了各種網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn) 室，并成為一種發(fā)展趨勢， 一些高危險(xiǎn)性的RNA病毒傳染病的檢測工作也逐漸在地方實(shí) 驗(yàn)室開展。網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室需實(shí)行統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)和程序，因此也需要RNA質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品 來對檢測的整個(gè)過程包括RNA的提取和RT-PCR等進(jìn)行質(zhì)量控制。
流感病毒的高度變異性導(dǎo)致流行性感冒每年不同規(guī)模的小流行和若干年一次世界范圍的 大流行。甲型流感病毒廣泛存在禽類和哺乳動(dòng)物中，也是目前致人類和各種動(dòng)物流感的主 型，在人類和動(dòng)物間流行時(shí)可導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率(Potter CW. A History of influenza [J]. J Appl Microbiol, 2001， 91:572 - 9.)。人禽流感是由甲型流感病毒某些亞型的毒株引起的急性呼吸 道傳染病，發(fā)病后死亡率高于60%。近年來人感染高致病性禽流感時(shí)有發(fā)生和流行，使得 世界范圍內(nèi)都加大了流感的檢測力度，流感/人禽流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)運(yùn)而生。某些 地方區(qū)縣也設(shè)立監(jiān)測點(diǎn)，開展流感的分子生物學(xué)檢測工作。網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室需要進(jìn)行統(tǒng)一的培 訓(xùn)和考核，檢測操作需使用統(tǒng)一的程序性文件，使用病原體顆?；蚣?xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控 品，具有傳染的危險(xiǎn)性，2005年美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)誤將含有H2N2病毒的能力驗(yàn)證樣品向 18個(gè)國家中的3747個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)發(fā)送，后一經(jīng)發(fā)現(xiàn)H2N2病毒，參與能力驗(yàn)證的所 有實(shí)驗(yàn)室緊急銷毀了含有 H2N2 病毒的樣本 (http:〃www.who.int/csr/disease/influenza/h2n2_2005—04—12/zh/index.html)。另夕卜區(qū)縣級(jí)監(jiān)觀U點(diǎn)不具 有分離培養(yǎng)流感病毒的能力，那么在運(yùn)送過程中也存在著樣品穩(wěn)定性和生物安全問題，而 通常裸露的RNA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品不夠穩(wěn)定，這就需要無生物傳染危險(xiǎn)性和高穩(wěn)定性的 RNA標(biāo)準(zhǔn)品。
披甲R(shí)NA(armored RNA)是通過MS2包膜蛋白將目的RNA包裹起來，可耐受DNase 和RNase，且沒有生物傳染危險(xiǎn)性的噬菌體樣顆粒。MS2/R17(血清I型)噬菌體是二十面 體結(jié)構(gòu)，屬于正極性單鏈RNA球形病毒，其RNA因包膜蛋白的保護(hù)可以耐受DNase和RNase。 MS2噬菌體結(jié)構(gòu)上是由180個(gè)包膜蛋白分子、 一分子的成熟酶蛋白及包裹著的一 分子正鏈RNA基因組組成，基因組長3569nt。成熟酶蛋白具有保護(hù)噬菌體RNA免受核 酸酶降解的作用，同時(shí)也是大腸桿菌F菌毛的受體。裂解酶蛋白具有裂解大腸桿菌細(xì)胞從 而釋放噬菌體粒子的作用。復(fù)制酶和三個(gè)大腸桿菌的蛋白形成蛋白質(zhì)復(fù)合體負(fù)責(zé)噬菌體 RNA的復(fù)制。包膜蛋白具有表達(dá)調(diào)控的功能，包膜蛋白二聚體可識(shí)別并結(jié)合到一個(gè)包含 有復(fù)制酶啟動(dòng)子的莖環(huán)序列上，從而可以有效的抑制復(fù)制酶的表達(dá)(Ni CZ， et al. Structure 1995, 3 (3):255-63)。包膜蛋白與此RNA莖環(huán)序列組成的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體通常被認(rèn)為是引發(fā)噬 菌體特異性RNA包裹的信號(hào)，RNA莖環(huán)序列稱為packaging位點(diǎn)(即pac位點(diǎn))，該pac 位點(diǎn)同時(shí)是復(fù)制酶操縱子的一部分。RNA莖環(huán)序列為21nt或19nt，并且只有其中幾個(gè)堿 基是非常關(guān)鍵的(Stockley PG. Nucleic Acids Research, 1995， 23 (13) :2512-8) 。 Pickett GG等(Pickett GG Nucleic Acids Research, 1993, 21(19): 4621-6.)提出其他序列對噬菌體RNA的特異性包裹或 許不是必需的。并試圖通過實(shí)驗(yàn)證明這個(gè)pac位點(diǎn)能否在體外介導(dǎo)MS2包膜蛋白對異源 性RNA的包裹，選用兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一個(gè)細(xì)胞， 一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)MS2包膜蛋白，另一個(gè)表 達(dá)含有pac位點(diǎn)的lacZ基因，但由于屬于兩套表達(dá)系統(tǒng)，MS2包膜蛋白的表達(dá)和lacZ基 因的轉(zhuǎn)錄沒有一個(gè)共同的阻遏調(diào)控系統(tǒng)，二者的比例無法有效調(diào)控，因而實(shí)驗(yàn)中MS2包 膜蛋白包裹lacZ基因RNA的效率非常低，并沒有得到預(yù)期的結(jié)果。
Pasloske BL等(Pasloske BL, et al. J Clin Microbiology, 1998, 36(12): 3590~4.)利用質(zhì)粒表達(dá)系 統(tǒng)將HIV-B保守區(qū)部分142nt的RNA包裹成披甲R(shí)NA;該質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括5'端非編碼區(qū)、 成熟酶蛋白、包膜蛋白及pac位點(diǎn)及預(yù)包裹的外源基因的DNA序列。使用同一表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)包膜蛋白和外源核酸序列，可以自行調(diào)控基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，因而可以較為高效地實(shí)現(xiàn) 包膜蛋白的表達(dá)和組裝。WalkerPeach CR等(WalkerPeach CR. C"" C力ew, 1999,45(12): 2079-85 .) 利用質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)將HCV-2b保守區(qū)部分412nt的RNA包裹成披甲R(shí)NA; Hietala SK等(Hietala SK, etal. J Clin microbiol， 2006， 44(1):67-70.)將口蹄疫病毒、古典型豬瘟病毒、水泡性口炎病毒 新澤西血清亞群和印第安血清亞群的部分基因序列共462nt包裹成披甲R(shí)NA，作為動(dòng)物檢驗(yàn) 檢疫中活病毒的替代品。他們包裹的片段均小于500nt，披甲R(shí)NA的純化方法均使用傳統(tǒng) 的CsCl梯度離心法，均沒有為人類呼吸道傳染病病毒提供一種耐核糖核酸酶的穩(wěn)定的病毒 替代品。國內(nèi)李金明等也表達(dá)出耐核糖核酸酶的病毒樣顆粒，如內(nèi)含HIV、 HCV、 SARS RNA的部分序列的耐核糖核酸酶的病毒樣顆粒，他表達(dá)的均為正鏈RNA病毒，且為單種 RNA。
流感病毒和SARS病毒為可引起嚴(yán)重爆發(fā)流行的呼吸道傳染病，可通過飛沫傳播，易 于形成較大的公共衛(wèi)生事件。現(xiàn)在人感染高致病性禽流感在各個(gè)國家包括我們中國均時(shí)有 發(fā)生，流感的監(jiān)測力度也在逐步加大。流感病毒、SARS病毒等病毒性呼吸道傳染病因其 危害的嚴(yán)重性、易傳播性和難預(yù)防性等特點(diǎn)，在呼吸道傳染病病毒的監(jiān)測過程中，使用安 全穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的需求更加迫切。此外，在RT-PCR檢測過程中，由于實(shí)驗(yàn)的影
響因素眾多，如操作者的習(xí)慣差異、批間差異、試劑問題、抑制物的殘存問題等都會(huì)直接 影響實(shí)驗(yàn)，容易造成假陰性結(jié)果，嚴(yán)重時(shí)會(huì)貽誤疫情，造成不必要的損失。因而使用內(nèi)含 特定RNA的披甲R(shí)NA可以為RNA病毒的RT-PCR檢測提供一種安全穩(wěn)定的病毒替代品，具 有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有病毒檢測中存在的安全性差和穩(wěn)定性低的問題，本發(fā)明提供一種披甲 RNA，本發(fā)明還提供所述披甲R(shí)NA的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供一種披甲R(shí)NA，其特征在于，所述披甲R(shí)NA是由MS2包膜蛋白包裹的 RNA。
所述披甲R(shí)NA由MS2包膜蛋白包裹的RNA包含有SEQ ID No.l或SEQ ID No.2所示的 核苷酸序列。
作為優(yōu)化方案，所述披甲R(shí)NA由MS2包膜蛋白包裹的RNA還包含有SEQ ID No.3或 SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供所述披甲R(shí)NA的制備方法，其特征在于，所述制備方法采用的純化步驟 如下
(1) .將RNaseA和DNasel37'C消化的披甲R(shí)NA于瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于雙鏈DNA Marker的900-1000bp處，割膠取目的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體條帶；
(2) .將上述目的條帶放到電洗脫/透析管中，透析膜與電泳方向垂直，進(jìn)行電洗脫，先 正向電泳后反向電泳，用槍頭反復(fù)吹打透析膜數(shù)次，將透析管置入ddH20中，室溫放置2-4h。 吸出的電洗脫/透析管中的液體即為純化后的披甲R(shí)NA。
含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的披甲R(shí)NA的制備方法歩驟如下
(1) 以pMS27質(zhì)粒為模板，SEQ ID No.5所示核苷酸序列與SEQ ID No.6所示核苷 酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列與SEQ ID No.7所示核苷酸序列為引 物進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列和SEQ ID No.4所示 核苷酸序列，分別連接到表達(dá)載體pET30b中，得到包含SEQIDNo.3所示核 苷酸序列的重組載體pAR-1和包含SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重組載體 pAR-2;
(2) 以SEQIDN0.8和SEQIDN0.9所示核苷酸序列為引物，以SARS病毒RNA為 模板，進(jìn)行RT-PCR，得RT-PCR產(chǎn)物；
(3) 分別以SEQ ID No.8與SEQ ID No.lO所示核苷酸序列和SEQ ID No.9與SEQ ID No. 11所示核苷酸序列為引物，步驟(2)所述RT-PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR
反應(yīng)，SOE法(Gene splicing by over lap extension, overlap PCR)將PCR產(chǎn)物 拼接；
(4) 分別以SEQ ID No.l2與SEQ ID No.l3所示核苷酸序列禾口SEQ ID No.l4與 SEQIDNo.l5所示核苷酸序列為引物，甲型流感病毒和乙型流感病毒RNA 為模板，進(jìn)行RT-PCR， RT-PCR產(chǎn)物通過SOE法拼接起來；
(5) 將步驟(3)和步驟(4)經(jīng)SOE法拼接的產(chǎn)物再經(jīng)SOE法拼接，得到拼接產(chǎn) 物Am-BM-Sars;
(6) 步驟(5)所得AM-BM-SARS鏈接到pAR-l質(zhì)?；騪AR-2質(zhì)粒，得到重組質(zhì) 粒pAR-3.1或pAR-3.2;
(7) 步驟(6)所得重組質(zhì)粒pAR-3.1或pAR-3.2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受 態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，得到含SEQIDNo.l所示核苷酸序列的披甲R(shí)NA。
含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列披甲R(shí)NA的制備方法歩驟如下
(1) 以pMS27質(zhì)粒為模板，SEQ ID No.5所示核苷酸序列與SEQ ID No.6所示核苷 酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列與SEQ ID No.7所示核苷酸序列為引 物進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列和SEQ ID No.4所示 核苷酸序列，分別連接到表達(dá)載體pET30b中，得到包含SEQIDNo.3所示核 苷酸序列的pAR-l質(zhì)粒和包含SEQ ID No.4所示核苷酸序列的pAR-2質(zhì)粒；
(2) 以甲型流感病毒為模板，SEQ ID No.l6所示核苷酸序列和SEQ ID No.l7所示 核苷酸序列為引物進(jìn)行RT-PCR，得到SEQ ID No.2所示核苷酸序列；
(3) 步驟(2)所得SEQ ID No.2所示核苷酸序列分別連接到步驟(1)所得pAR-l 質(zhì)?；騪AR-2質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pAR-4.1或重組質(zhì)粒pAR-4.2;
(4) 步驟(3)所得重組質(zhì)粒pAR-4.1或重組質(zhì)粒pAR-4.2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，得到含SEQ ID No.2所示核苷酸序列 的披甲R(shí)NA。
本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果如下
制備了內(nèi)含多種病毒RNA片段(約0.4kb)的披甲R(shí)NA和內(nèi)含病毒負(fù)鏈或正鏈RNA (約 l.lkb)的披甲R(shí)NA，可為多種病毒的核酸檢測提供安全穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
將甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒M基因和嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒CoV基因 的部分序列拼接起來，制備了內(nèi)含三種RNA片段的耐核糖核酸酶的披甲R(shí)NA，可以較大程 度地提高披甲R(shí)NA的利用效率，降低成本，可用于多種病毒的RT-PCR檢測和實(shí)時(shí)RT-PCR 檢測；通過將約l.lkb的PCR產(chǎn)物正向或反向連接到表達(dá)載體下游，既可誘導(dǎo)表達(dá)出將甲3 型流感M基因正鏈RNA包裹起來的披甲R(shí)NA，也可誘導(dǎo)表達(dá)出將甲3型流感M基因負(fù)鏈
RNA包裹起來的披甲R(shí)NA。包裹的核酸序列幾乎囊括了甲3型流感M基因的全長序列，只 要是甲型流感M基因相對保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物，即可用其作為標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，因而具有廣 泛的應(yīng)用范圍。
本發(fā)明提供的披甲R(shí)NA的特點(diǎn)l.穩(wěn)定，經(jīng)37卩2天、4'C1個(gè)月、-2(TC反復(fù)凍融，披 甲R(shí)NA的拷貝數(shù)無明顯減少，因耐RNase故可以避免被自然界中無所不在的RNase降解。 2.無生物傳染危險(xiǎn)性。披甲R(shí)NA僅含有病毒的部分核酸，本身不具有傳染性，披甲R(shí)NA實(shí) 際為一種沒有感染性的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。3.對病毒具有很好的模擬性。病毒RNA由MS2 包膜蛋白包裹起來組裝成病毒樣的顆粒，與病毒有很好的相似性，從RNA的提取到 RT-PCR，完全模擬病毒，可對實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程進(jìn)行質(zhì)量控制。
流感病毒血清型眾多，血凝素HA抗原有14種(H1 H14)，神經(jīng)氨酸酶NA抗原有9禾中 (N1 N9)，兩者之間可以構(gòu)成若干血清亞型，給流感的檢測工作帶來了很大的難度。本發(fā) 明在引物設(shè)計(jì)上選擇擴(kuò)增基質(zhì)蛋白M基因保守區(qū)，囊括了幾乎所有的甲型、乙型流感病毒 血清型，可用于甲型流感病毒和乙型流感病毒的分子篩選檢測。
本發(fā)明所包裹的SARS-CoV基因既可以用于對樣品進(jìn)行巢式RT-PCR，也可以進(jìn)行實(shí)時(shí) RT-PCR或巢式實(shí)時(shí)RT-PCR檢領(lǐng)U，對拷貝數(shù)較低的樣品，可將巢式RT-PCR與實(shí)時(shí)RT-PCR 兩種檢測方法相結(jié)合，用外套R(shí)T-PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測，可大大提高實(shí)驗(yàn)的 靈敏度及可靠性。
選用SOE法將不同病毒的核酸拼接起來，簡單易行，并為其它病毒拼接進(jìn)來提供了一 個(gè)平臺(tái)，其它病毒核酸可根據(jù)需要直接拼接在SEQIDNo.l序列的上游或者下游，即可表 達(dá)組裝成含有更多種病毒RNA的披甲R(shí)NA。
通過HindIII單酶切位點(diǎn)將RT-PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體中，既可誘導(dǎo)表達(dá)出將甲3型流 感M基因正鏈RNA包裹起來的披甲R(shí)NA，也可誘導(dǎo)表達(dá)出將甲3型流感M基因負(fù)鏈RNA包 裹起來的披甲R(shí)NA?？筛玫啬M流感病毒粒子。
披甲R(shí)NA的純化方法采用電洗脫法，將披甲R(shí)NA作為一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，瓊脂 糖凝膠電泳后割膠回收，操作簡單，回收率高。
披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性研究使用了實(shí)時(shí)RT-PCR的方法，使披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性更為量化、 更為直觀。


圖1: AR-l經(jīng)RNase A和DNase I單酶及雙酶切圖譜
1.超聲后的BL21 (DE3) 2.超聲后的pAR-l表達(dá)產(chǎn)物3. RNase A消化后的pAR-l表達(dá)產(chǎn)物4. DNaseI 消化后的pAR-l表達(dá)產(chǎn)物5.RNaseA和IDNaseI消化后的pAR-l表達(dá)產(chǎn)物6.空白7.人DNA Hindlll/Ecorl;
圖2: AR-1、 AR-2的表達(dá)比較
14為AR-2 (經(jīng)RNaseA和DNase I消化后的pAR-2表達(dá)產(chǎn)物)6-9為AR-1 (經(jīng)RNaseA和DNase I消 化后的pAR-l表達(dá)產(chǎn)物)5.入DNAHindlII/Ecorl 10. RNase A和lDNase I消化前的AR-1 11. RNase A禾口 DNase I消化前的AR-2;
圖3: SOE法擴(kuò)增SARS-CoV基因和Am-Bm-SARS基R的電泳圖譜
1.Am(130bp) 2. Bm(81bp) 3. Am-Bm(211bp) 4.SARS片段l( 142bp)5. SARS片段2 (157bp) 6.SARS(190bp)
7. Am-Bm-SARS(401bp) 8.100bp DNA ladder;
圖4: pAR-3.1和pAR-4.1 Hindin/BamHI的雙酶切及單酶切圖譜
1. lOObp DNA ladder 2.pET30b HindIII單酶切3.pAR-4.1 HindIII BamHI雙酶切4. pAR-4.1 HindIII單酶
切5. pAR-3.1 HindIII BamHI雙酶切6. pAR-3.1 HindIII單酶切7.入DNA Hindlll/Ecorl;
圖5: AR-3,1、 AR-3.2、 AR-4.1、 AR-4.2的表達(dá)及其耐RNase A和DNasel的酶切圖譜
1-8為經(jīng)RNase A和DNase I消化后的表達(dá)產(chǎn)物，其中1-2為AR-3.2, 3-4為AR-3.1, 5-6為AR-4.2, 7-8
為AR-4.1, 11-18為超生處理后未經(jīng)RNase A和DNase I消化的表達(dá)產(chǎn)物，其中11-12為AR-3.2, 13-14
為AR-3.1, 15-16為AR-4.2, 17-18為AR-4.1, 9. 100bp DNA ladder, 10.入DNA Hindlll/Ecorl;
圖6:甲型流感Am基因檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
檢測范圍為1(y l(f拷貝，曲線在Ct值17.02-39.84間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。CT = -3.847*log(conc) + 43.787; conc= 10A(-0.260*CT + 11.382)。
具體實(shí)施例方式
1. 使用儀器
熒光定量PCR儀(Rotor Gene公司產(chǎn)品，型號(hào)為RG-3000)， PCR儀(BiometraTgradient)， 紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)，紫外分光光度計(jì)(Bio-rad公司型號(hào)為Smart Spec 3000)，冷凍離心機(jī)(Beckman coulter,型號(hào)為AllegraTM X-22R)，普通離心機(jī)(Eppendorf 5415D),超生波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝科器研究所，型號(hào)JY92-II型)，恒溫金屬浴箱(杭 州博日科技有限公司)，振蕩培養(yǎng)箱(杭州博日科技有限公司)。
2. 材料與試劑
本專利申請所涉及生物材料均為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所常用生物材料，可由商業(yè)途徑獲得。對 于申請人保藏之生物材料，自專利申請之閂起三十年內(nèi)，任何以實(shí)施本專利為目的之公眾 均可以免費(fèi)向申請人所取。
￡.co//DH5a (本實(shí)驗(yàn)室保存)，￡.co//BL21 (DE3)、 pET30b質(zhì)粒(全序列見 http:〃www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/69910-000.html)購于Novaeen公司，甲型流感病 毒A/杭州/189/2005(H3N2)株(于2004-2005年流行季節(jié)分離)，乙型流感病毒B/杭州/42/ 2005株(于2004 - 2005年流行季節(jié)分離)，SARS CoV RNA (由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存，來源于2003
年SARS爆發(fā)期間病人樣本)，pMS27質(zhì)粒(購于比利時(shí)BCCMTM), EXtaq酶、T4DNA連 接酶試劑盒、one-step Real-time RT-PCR試劑盒、one-step RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn) 品)，pGEM陽T easy vector、 DNaseI、 RNaseA(promega公司產(chǎn)品)，B咖HI、 HindIII內(nèi)切酶 (MBI公司產(chǎn)品)，質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司產(chǎn)品)，凝膠回收純化試劑盒(上海生工)， 病毒RNA提取試劑盒(Qiagen)，凝膠電洗脫/透析管(以色列GeBAMWl2000-16000 cut-off)。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用引物為所述病毒的保守序列，因此所述流感病毒A/杭州/189/ 2005(H3N2)株可由任一甲型流感病毒替代，流感病毒B/杭州/42/2005株可由任一乙型流 感病毒替代，SARSCoVRNA可由任一SARS病毒RNA替代，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。 3.引物
引物設(shè)計(jì)使用primer premier 5.0軟件，由上海生工合成。 實(shí)施例l:
披甲R(shí)NA表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建
1. 表達(dá)載體的構(gòu)建
以pMS27質(zhì)粒為模板，用MS2F (5'ATGGATCCTCCTGCTCAACTTCCTGTCG3'， SEQ IDNo.5)、 MS2R1(5，GCAAGCTTTCTTCGACATGGGTAATCCT3', SEQIDNo.6)， MS2F、 MS2R2(5，GCAAGCTTTTAGTAGATGCCGGAGTTT3', SEQ ID No.7)為引物進(jìn)行擴(kuò)增，目 的條帶分別為1750bp(SEQIDNo.3)和1707bp(SEQ [DNo.4)，割膠純化后，連接到pGEM-T easy vector,提取質(zhì)粒，用BamHI、 HindIII進(jìn)行雙酶切，同時(shí)雙酶切pET30b質(zhì)粒并割膠回 收，將兩目的片斷分別連接到表達(dá)載體pET30b中，所得重組質(zhì)粒分別命名為pAR-l、 p AR-2，進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證并送上海生工測序驗(yàn)證。
2. 披甲R(shí)NA的表達(dá)及鑒定
將重組質(zhì)粒pAR-l、 pAR-2分別轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，鋪于卡那霉素抗 性平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)克隆至lj2mlLB培養(yǎng)基中(卡那霉素50u g/ml)， 37°C 200r/min培養(yǎng)過夜。次日，按2y。體積的量接種到6ml LB培養(yǎng)基中(卡那霉素50ug/ml) 培養(yǎng)到對數(shù)生長期，加入異丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)，終濃度為lmM，誘導(dǎo)表達(dá)4h。 離心取沉淀，加入2ml超聲緩沖液(50mM Tris.cl pH 8.0, 2mM EDTA， 0.1% Triton X-100) 和溶菌酶(終濃度100ii g/ml)，室溫作用0.5h。然后進(jìn)行超聲碎菌處理。4°C 12000r/min離 心3min，取上請。各取100ul表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行RNaseA和DNase I單酶及雙酶37。C消化 2h， 37'C消化過夜。將消化的表達(dá)產(chǎn)物各取20ul電泳，均可于900-1000bp處見熒光染色條 帶，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)RNaseA和DNaseI酶切后，大腸桿菌基因組DNA、 RNA及質(zhì)粒均被消化 掉，披甲R(shí)NA因可耐RNaseA和DNaseI酶切，故仍可于900-1000bp處見清晰熒光條帶。 pAR-l、 ？^-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于^丄0//81^1 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，均可表達(dá)出耐核糖核酸酶的 披甲R(shí)NA (分別命名為AR-1、 AR-2)。
AR-l或AR-2是成熟酶蛋白、包膜蛋白及其基因組裝成的噬菌體樣粒子，內(nèi)包裹含有MS2噬菌體的成熟酶蛋白基因和包膜蛋白基因的RNA。 AR-l經(jīng)RNase A和DNase I單酶及 雙酶切情況見圖l。
另分別取80ul經(jīng)RNaseA和DNaseI酶消化過夜的表達(dá)產(chǎn)物按Qiagen病毒RNA提取 試劑盒操作說明提取RNA，溶解于40 ii 1 ddH20水中，分別以MS2F、MS2R1和MS2F、 MS2R2 為引物進(jìn)行RT-PCR和普通PCR檢領(lǐng)ij。RT-PCR均為陽性，PCR均為陰性，證明表達(dá)出的AR-1 和AR-2已經(jīng)分別將本發(fā)明SEQ ID No.3所示的核酸序列和SEQ ID No.4所示的核酸序列對 應(yīng)的RNA序列完全包裹進(jìn)去。
3. AR-l和AR-2的表達(dá)比較
將pAR-l、 pAR-2轉(zhuǎn)化到五.co/ZBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，各挑取4個(gè)克隆到2ml LB培 養(yǎng)基中(卡那霉素50yg/ml)， 37°C 200r/min培養(yǎng)過夜。誘導(dǎo)方法同上。8個(gè)克隆培養(yǎng)誘 導(dǎo)時(shí)間方法完全相同。各取20ul表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行RNaseA和DNaseI雙酶切37。C消化 2h。瓊脂糖凝膠電泳。
pAR-l表達(dá)質(zhì)粒的4個(gè)克隆具有相近的表達(dá)和包裹效率，pAR-2表達(dá)質(zhì)粒的4個(gè)克隆也 具有相近的表達(dá)和包裹效率，但pAR-l質(zhì)粒與pAR-2質(zhì)粒的表達(dá)效率明顯不同，pAR-l質(zhì)粒 表達(dá)效率較高。見圖2。
4. AR-l和AR-2的純化及穩(wěn)定性
將RNaseA和DNaseI消化好的AR-l和AR-2分別瓊脂糖凝膠電泳，割下目的RNA-蛋 白質(zhì)條帶，膠塊要盡量小，放到電洗脫/透析管中進(jìn)行電洗脫，電泳20-30min，反向電泳2min。 用槍頭反復(fù)吹打幾次，可吸出備用。
將RNaseA和DNaseI消化好的AR-l和AR-2分別置于室溫、4'C和-20'C， 2周后，電 泳觀察，目的熒光條帶不見明顯減弱，兩者均具有較好的穩(wěn)定性。
內(nèi)含Am"Bm-Sars RNA片段的復(fù)合披甲R(shí)NA的制備
以構(gòu)建好的pAR-l質(zhì)粒與pAR-2質(zhì)粒為平臺(tái)，先通過SOE法(Gene splicing by over lap extension, overlap PCR)將Am、 Bm禾卩Sars目的片段拼接起來，將Am-Bm-Sars的拼接DNA 片斷通過HindIII酶切位點(diǎn)連接到SEQ ID No.3所示核酸序列或SEQ ID No.4所示核酸序列 的下游，誘導(dǎo)表達(dá)出含有Am-Bm-Sars脂A片段(SEQIDNo.l)的披甲R(shí)NA。 1. SOE法擴(kuò)增Am-Bm-Sars基因 1.1 SARS-CoV基因保守區(qū)的擴(kuò)增
N0.8)、 BN IoutAS(5'GTCAAGCTTCATAACCAGTCGGTACAGCTAC3, SEQ ID N0.9)為 弓I物(BN 1outS2引物下劃線部分為與Bm基因互補(bǔ)的PCR overlap區(qū)，BN IoutAS引物下劃線 部分為HindIII酶切位點(diǎn))，以SARS爆發(fā)期間病人咽拭子樣本RNA為模板，使用one-step RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)物片段為190bp。具體方案如下
10 X buffer 2jtd
MgCl2 (25mM) 4/xl
■P(lOmM) 2 pi
RNase inhibitor(40U/pil) 0.4 pil 雄V Reverse Transcriptase XL(5U/jd) 0.4/xl
AMV ^optimized Taq 0.4/xl
Pl/P2(20闊 0牟/0.4jul
RNA模板 5jbd
加水至總體積 20 ^
PCR反應(yīng)參數(shù)為50°C 30min合成cDNA，以94。C 10 s、 66°C 10 s、 72°C 30 s進(jìn)行 IO個(gè)循環(huán)，每l循環(huán)退火溫度降rC;然后以94'C 10s、56'C 10s、72°C 20s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
因模板濃度低，不能滿足需要，且反復(fù)擴(kuò)增無法增加其濃度，故應(yīng)先用半套式PCR對 其進(jìn)行擴(kuò)增，再應(yīng)用overlapPCR法將兩片段拼接起來。取上述PCR產(chǎn)物2jul為模板，分別 以BN IcmtS2、 BN IinAS(5，CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG3， SEQ ID No. 10)， BN IoutAS、 BN IinS(5，GAAGCTATTCGTCACGTTCG3' SEQ ID No.ll)為引物進(jìn)行半套式 PCR， PCR反應(yīng)條件同上。瓊脂糖凝膠電泳，割膠純化，兩PCR片斷分別為157bp和142bp。 按如下方案配置PCR反應(yīng)液進(jìn)行兩片段的SOE法拼接。
10 X buffer 5jul MgCl2 (25mM) 4/xl dNTP (2.5mMeach) 4/xl
EXTaq酶 0.25/xl
片段1 0.5/xl(約10ng)
片段2 0.5jul(約10ng) 加水至總體積 50 Ml
PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C 3min，以94'C 10 s、 66°Cl0s、 72°C 30s進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，加 入引物BNIoutS2、 BNIoutAS各ljLd。 94。C 10 s、 66。Cl0s、 72。C 30 s進(jìn)行10個(gè)循環(huán)每l循 環(huán)退火溫度降rC;然后以94。C 10 s、 56°C 10 s、 72°C 20s進(jìn)行32循環(huán)，94。C10s、 72。C20s 進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。電泳檢測，在190bp出可見熒光條帶，割膠純化后備用。將純化好的190bp SARS-CoV保守區(qū)連接至UpGEM-T easy vector,挑取克隆，測序，測序結(jié)果與ZJ0301株部 分序列完全一致。
1.2甲型流感、乙型流感M基因保守區(qū)的拼接
使用one-step RT-PCR試劑盒，以流感病毒A/杭州/189/ 2005(H3N2)株和B/杭州/42/ 2005 株RNA為模板，分別使用引物
AM 119F-SOEf 5，CTCAAGCTTAGGCACTCATGGAATGGCTAAAG3 ，, SEQ ID No.12)、AM248R-SOE(5，TAAGAAAGTGCCGCATTTTGGACAAAGCGTCTAC3，. SEQ ID No. 13) 和BM11F-S0E(5TGTCCAAAATGCGGCACTTTCTTAAAATGTCGCT3，. SEQ ID No.l4)、 BM91R-SOE(5TGGTAATTCATCTGCTTTGCCTTCTCCATCT3， SEQ ID No.l5)進(jìn)行 RT-PCR， AM119F-SOE引物下劃線部分為HindlII酶切位點(diǎn)，AM248R-SOE、 BMllF-SOE、 BM91R-SOE弓l物下劃線部分為PCRoverlap區(qū)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收后，通過SOE 法將甲型流感、乙型流感M基因保守區(qū)的部分序列(分別為130bp和81bp)拼接起來。反 應(yīng)條件同上。瓊脂糖凝膠檢測于211bp處可見熒光條帶，割膠純化后備用。
本發(fā)明在引物設(shè)計(jì)上選擇擴(kuò)增流感病毒基質(zhì)蛋白M基因保守區(qū)，囊括了幾乎所有的甲 型、乙型流感病毒血清型，可用于甲型流感病毒和乙型流感病毒的分子篩選檢測。 1.3 Am-Bm禾口SARS-CoV片斷的拼接
將割膠純化后的Am-Bm和SARS-CoV片斷進(jìn)行overlap PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同 1.1。電泳檢測可于401bp處見清晰熒光條帶。
overlap區(qū)成功退火是SOE法成功拼接目的片段的關(guān)鍵。本發(fā)明中使用Touch Down PCR 法進(jìn)行兩片段的拼接，解決了空間結(jié)構(gòu)影響overlap區(qū)退火的問題，成功地將三種不同的病 毒核酸拼接成Am-Bm-Sars片斷。
2. pAR-3.1表達(dá)載體的構(gòu)建
將SOE法獲得的Am-Bm-Sars片斷連接到pGEM-T easy vector,提取其克隆質(zhì)粒，用 HindlII內(nèi)切酶37'C酶切2h，割膠回收Am-Bm-Sars片斷，同時(shí)HindIII酶切pAR-l質(zhì)粒，37 'C作用1.5h，加入過量的去磷酸化酶作用0.5h，割膠回收pAR-l大片斷。使用T4DNA連接 酶試劑盒將Am-Bm-Sars片斷接到表達(dá)載體pAR-l中，命名為pAR-3.1。測序確定連接方向。 pAR-3.1所含的插入DNA片段為5'非編碼區(qū)(1-109)、成熟酶蛋白基因(110-1288)、包 膜蛋白基因(1315-1704)、 pac位點(diǎn)(1724-1744)、裂解酶基因(1658-1750)、 HindIII酶切 位點(diǎn)(1751-1756)、 Am-Bm-Sars片斷(1757-2157)。
3. AR-3.1的表達(dá)
將構(gòu)建好pAR-3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，pAR-3.1質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)方 法同上進(jìn)行，僅將IPTG誘導(dǎo)時(shí)間從實(shí)施例中的4h更改為16h，誘導(dǎo)表達(dá)16h，披甲R(shí)NA的 得率更高。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鑒定可耐DNaseI和RNaseA酶切，將此耐核糖核酸酶內(nèi)含SEQ ID No.3所示核酸序列及SEQIDNo.l所示核酸序列的披甲R(shí)NA命名為AR-3.1。
4. 按2.和3.所述的方法將Am-Bm-Sars片段連接到pAR-2質(zhì)粒中并誘導(dǎo)表達(dá)，將此內(nèi)含SEQ IDNo.4所示核酸序列及SEQIDNo.l所示核酸序列的披甲R(shí)NA命名為AR-3.2。
AM119F和BN IoutAS為引物，提取經(jīng)DNase I和RNaseA酶消化過夜的AR-3.1和AR-3.2 的核酸為模板，分別進(jìn)行RT-PCR和PCR， RT-PCR為陽性，PCR為陰性。 披甲R(shí)NA的純化
披甲R(shí)NA是一種噬菌體樣粒子，即為一種病毒樣粒子，Pasloske BL等均使用傳統(tǒng)的 CsCl梯度離心法、按病毒粒子的回收純化方法進(jìn)行披甲R(shí)NA的純化。本發(fā)明將披甲R(shí)NA 作為一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，因可以進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，故使用電洗脫的方法進(jìn)行披 甲R(shí)NA的純化。
1. 在GeBAflex管中加入2-3mlddH20，室溫孵育5min檢測純化管是否漏水，把水倒掉。
2. 將加入過量RNaseA和DNasel37"C消化過夜的披甲R(shí)NA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割下目 的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體條帶，膠塊盡量要小。
3. 將膠快放到透析管中，加入2-3ml的水，將純化/透析管固定在水平的托盤架上，透析膜 與電泳方向垂直，進(jìn)行電洗脫，正向電泳20-30min，反向電泳120s。用槍頭反復(fù)吹打透析 膜數(shù)次，可吸出備用。
4. 如要盡量去除電泳緩沖液中的小分子，可將透析管置入ddH20中(體積一般為透析樣 品體積的100-1000倍)，室溫2-4h。純化/透析后的樣品可用于穩(wěn)定性和定量分析。
披甲R(shí)NA的定量和穩(wěn)定性分析
1. Real-time RT-PCR對披甲R(shí)NA進(jìn)行定量
1.1提取Am-Bm-Sars基因的克隆質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，然后10倍系列稀釋， 終濃度為10G 104考貝4U，各取lnl做模板，以Real-time PCR方法檢領(lǐng)!l，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。coiK^ 10(M*CT + B)。反應(yīng)效率為10—M-1， 1/M-3.322時(shí)，反應(yīng)效率最高為l。相關(guān)系數(shù)R值均在0.99 以上。本發(fā)明選用Am檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線定量披甲R(shí)NA，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。 1.2將純化好的披甲R(shí)NA直接94'C 5min處理，可完全釋放被包裹的RNA，取l/il做模板， 使用one-step實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒進(jìn)行定量，并對待測披甲R(shí)NA進(jìn)行10倍和100倍稀釋，同 時(shí)進(jìn)行one-step實(shí)時(shí)RT-PCR來評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄的效率。各做3個(gè)重復(fù)。以105拷貝411的克隆質(zhì)粒 為內(nèi)參來校正批間差異。每lmlLB培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)即可獲得約7.8X10^個(gè)拷貝的AR-3.1， 約1.4 X 1012個(gè)拷貝的AR-3.2 。
將披甲R(shí)NA直接94'C 5min，可以破壞披甲R(shí)NA的包膜蛋白，將包裹著的RNA完全釋 放出來，釋放出的RNA可直接用于實(shí)時(shí)RT-PCR的模板，中間沒有任何損耗，RNA得率高。 使用Qiagen病毒RNA提取試劑盒提取披甲R(shí)NA的核酸，存在著過柱效率、RNA洗脫效率 等問題，RNA得率相對變低。因而使用將披甲R(shí)NA直接94'C 5min提取RNA進(jìn)行披甲R(shí)NA 的定量更為準(zhǔn)確。
2. 披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性分析
本發(fā)明中流感病毒和SARS病毒均為呼吸道病毒，故為更好地模擬實(shí)際采樣情況，將 披甲R(shí)NA按lXl(^c叩ies/Ml的量加入到JF常人咽拭子標(biāo)本中(不去除其中的上皮細(xì)胞、細(xì) 菌和唾液等)，平分成若干小份，分別置37'C 24h和48h， 4'C14天和1個(gè)月(各3個(gè)重復(fù))。 置-20'C反復(fù)凍融3次、6次、12次(各3個(gè)重復(fù))，到時(shí)統(tǒng)一置-2(TC冰箱儲(chǔ)存待測。對不同 時(shí)間和溫度下檢測的披甲R(shí)NA的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異不顯著(p>0.10)， AR-3.1中包 裹著的三基因的實(shí)時(shí)RT-PCR檢測結(jié)果見表2。說明本發(fā)明制備的披甲R(shí)NA在上述條件下是
穩(wěn)定的，且-2(TC反復(fù)凍融對其影響不大。雖然本發(fā)明沒有得到披甲R(shí)NA開始降解的時(shí)間 限度，但也說明披甲R(shí)NA穩(wěn)定性良好，環(huán)境溫度和儲(chǔ)存條件在一定范圍內(nèi)即使有所變化， 也不會(huì)影響披甲R(shí)NA的使用效能，完全可滿足網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室中樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分發(fā)和運(yùn)送所需 要的條件。 實(shí)施例2:
披甲R(shí)NA表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建
操作同實(shí)施例l。
內(nèi)含甲3型流感M基因RNA的披甲R(shí)NA的制備
提取甲型流感A/杭州/189/ 2005(H3N2)株RNA為模板，以M-petF (5 ，CTCAAGCTTGAAGGTAGATATTGAAAGATG3' SEQ ID NO. 16) 、 M-petR (5，CATAAGCTTGAAACAAGGTAGTTTTTTACTC3，SEO ID N0.17)為引物進(jìn)行RT陽PCR 擴(kuò)增M基因長片段。弓l物下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)。RT-PCR參數(shù)為50°C 30min合 成cDNA，以94'C 10 s、 56°C 10 s、 72°C lmin 15s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) 同實(shí)施例l。制備內(nèi)含甲3型流感病毒M基因保守區(qū)1016bpRNA (SEQIDN0.2)的耐核糖 核酸酶的披甲R(shí)NA，將此內(nèi)含SEQ ID No.3所示核酸序列及SEQ ID No.2所示核酸序列的披 甲R(shí)NA命名為AR-4.1，內(nèi)含SEQ ID No.4所示核酸序列及SEQ ID No.2所示核酸序列的披甲 RNA命名為AR-4.2。
AR-3.1、 AR-3.2、 AR-4.1、 AR-4.2的表達(dá)情況及其耐RNase A和DNaseI的酶切圖譜見圖5。
披甲R(shí)NA的純化
AR-4.1、 AR-4.2的純化同實(shí)施例1進(jìn)行。
披甲R(shí)NA的定量和穩(wěn)定性分析 1. Real-time PCR對披甲R(shí)NA進(jìn)行定量
1.1提取Am-Bm-Sars基因的克隆質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，然后10倍系列稀釋， 終濃度為1()G 1(^拷貝411，各取lpl做模板，以Real-timePCR方法檢須U，繪制Am檢測標(biāo)準(zhǔn) 曲線(見圖6)。 COnC=10(M'CT+B)。反應(yīng)效率為10—M—1， 1顏=3.322時(shí)，反應(yīng)效率最高為l。 相關(guān)系數(shù)R值在0.99以上。
實(shí)施例l中制備的披甲R(shí)NA內(nèi)含Am-Bm-Sars片斷RNA，其中Am片斷部分為甲型流感 病毒的保守區(qū)，可用于幾乎所有甲型流感病毒M基因的檢測，故本實(shí)施例中的內(nèi)含甲3型 流感病毒M基因RNA的披甲R(shí)NA的定量，可選用Am檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行。定量用引物探針 亦選用Am片斷設(shè)計(jì)的引物和探針。
1.2將純化好的披甲R(shí)NA直接94'C 5min處理，完全釋放被包裹的RNA，取l/xl做模板，使 用one-step實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒進(jìn)行定量，做3個(gè)重復(fù)。以l(^copies4il的克隆質(zhì)粒為內(nèi)參來校 正批間差異。每lmlLB培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)即可獲得約8.9Xl()U個(gè)拷貝的AR-4.1、約6.4X1011
個(gè)拷貝的AR-4.2。兩種內(nèi)含甲3型流感M基因RNA (1016bp)的披甲R(shí)NA均可得到較高的 表達(dá)量。
2.披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性分析
采用Am片斷設(shè)計(jì)的引物和探針，使用實(shí)時(shí)RT-PCR方法對AR-4.1、 AR-4.2進(jìn)行穩(wěn)定性 研究。披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性研究使用實(shí)時(shí)RT-PCR的方法，使披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性更為量化、
更為直觀。
流感病毒為呼吸道病毒，故為更好地模擬實(shí)際采樣情況，將披甲R(shí)NA按每1X106 copies/Ml的量加入到正常人咽拭子標(biāo)本中(不去除其中的上皮細(xì)胞、細(xì)菌和唾液等)，平分 成若干小份，分別置37'C 24h和48h, 4'C14天和1個(gè)月(各3個(gè)重復(fù))。置-2(TC反復(fù)凍融3 次、6次、12次(各3個(gè)重復(fù))，到時(shí)統(tǒng)一置-2(TC冰箱儲(chǔ)存待測。對不同時(shí)間和溫度下檢測 的披甲R(shí)NA的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異不顯著(p>0.10)，具有較好的穩(wěn)定性。AR-4.1實(shí) 時(shí)RT-PCR檢測結(jié)果見表2。雖然本發(fā)明沒有得到披甲R(shí)NA開始降解的時(shí)間限度，但也說明 披甲R(shí)NA穩(wěn)定性良好，環(huán)境溫度和儲(chǔ)存條件在一定范圍內(nèi)即使有所變化，也不會(huì)影響披甲 RNA的使用效能，完全可滿足網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室中樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分發(fā)和運(yùn)送所需要的條件。
表2實(shí)時(shí)RT-PCR分析披甲R(shí)NA的穩(wěn)定性 (以AR-3.1和AR-4.1為例，濃度為1X 106copies/ix 1,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。)
實(shí)吋RT-PCR檢測披甲R(shí)NA在不同條件下的Ct值
基因\條件37"Cld37'C2d4'C2w4'Clm-20'C凍融3次-20'。凍融6次-20'C凍融12次
Am23.7424,0123.6924.1223.51 (0.23)22.84 (0.09)23.89 (0.10)
(0.33)(0.20)(0.36)(0.05)
25.0024.7824.9924.6024.49 (0.23)24.卯(0.33).24.67 (0.16)
(0.04)(0.27)(0.18)(0.09)
Sars23.1623.1222.9222.9823.18(0.04)22.94 (0.46)23.18 (0.36)
(0.28)(0.32)(0.33)(0.42)
AR-4.123.7623.9823.8224.0223.81 (0.31)23.83 (0.49)24.11 (0.31)
(0.26)(0.19)(0.27)(0.01)
實(shí)施例3披甲R(shí)NA在病毒檢測中的應(yīng)用
披甲R(shí)NA可被用作穩(wěn)定且沒有生物傳染危險(xiǎn)性的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。 披甲R(shí)NA是病毒RNA由MS2包膜蛋白包裹起來組裝成的噬菌體樣顆粒，與病毒有很好 的相似性，可直接作為病毒核酸測定中的陽性對照，可為RT-PCR檢測試劑盒以及網(wǎng)絡(luò)實(shí) 驗(yàn)室培訓(xùn)提供穩(wěn)定且無生物傳染危險(xiǎn)性的樣本。將披甲R(shí)NA加入到血清或PBS或生理鹽水中，使用Qiagen病毒RNA提取試劑盒提取RNA，進(jìn)行RT-PCR，可對實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程進(jìn)行 質(zhì)量控制，包括RNA提取效率、逆轉(zhuǎn)錄效率、試劑質(zhì)量以及操作過程中的隨機(jī)誤差等。
在RNA病毒的定量中，可將披甲R(shí)NA作為檢測的內(nèi)參，可以更準(zhǔn)確地對病毒進(jìn)行定量， 具體方法如下將披甲R(shí)NA按確定的量加入到標(biāo)本中去(如咽拭子液或生理鹽水等)，完 全模擬病毒的采樣，使用Qiagen病毒RNA提取試劑盒提取病毒及披甲R(shí)NA中的RNA，然后 同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。將披甲R(shí)NA作為內(nèi)參來調(diào)整real-timePCRThreshold值，確定病毒 檢測的Ct值，從而對病毒進(jìn)行定量。使用披甲R(shí)NA作為內(nèi)參定量RNA病毒，可以最大程度 地消除RNA提取效率、逆轉(zhuǎn)錄效率以及操作過程中的隨機(jī)誤差對結(jié)果的影響，使得對RNA 病毒的定量更為準(zhǔn)確。
SEQUENCE LISTING <110>杭州市疾病預(yù)防控制中心 <120>披甲R(shí)NA及其制備方法 <130> 001 <160〉 17
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211〉 401
<212〉 DNA
<213〉 gene by per
<400> 1
aggcactcat ggaatggcta aagacaagac caattctgtc acctctgact aaggggattt 60
tggggtttgt gttcacgctc accgtgccca gtgagcgagg actgcagcgt agacgctttg 120
tccaaaatgc ggcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 180
tcattg3C3g asgatggaga aggcaaagca gstgaattec caagtc犯tg gtoccct犯 240
tatgtttatc acccgcgaag aagctattcg tcacgttcgt gcgtggattg gctttgatgt 300
agagggctgt catgcaacta gagatgctgt gggtactaac ctacctctcc agctaggatt 360
ttctacaggt gttaacttag tagctgtacc gactggttat g 401<210〉 2
<211〉 1016
<212> DNA
<213〉 gene by per
<400〉 2
gaaggtagat attgaaagat gagccttcta accgaggtcg aaacgtatgt tctctctatc 60
gttccatcag gccccctcaa agccgagatc gcgcagagac ttgaagatgt ctttgctggg 120
aaaaacacag atcttgaggc tctcatggaa tggctaaaga caagaccaat tctgtcacct 180
ctgactaagg ggattttggg gtttgtgttc acgctcaccg tgcccagtga gcgaggactg 240
cagcgtagac gctttgtcca aaatgccctc aatgggaatg gagatccaaa taacatggac 300
aaagcagtta aactgtatag gaaacttaag agggagataa cgttccatgg ggccaaagaa 360
atagctctca gttattctgc tggtgcactt gccagttgca tgggcctcat atacaatagg 420
atgggggctg taaccactga agtggcattt ggcctggtat gtgcaacatg tgagcagatt 480
gctgactccc agcacaggtc tcataggcaa atggtggtaa caaccaatcc attaataaga 540
catgagaaca gaatggtttt ggccagcact acagctaagg ctatggagca aatggctgga 600 tcaagtgagc aggcagcgga ggccatggag attgetagtc aggccaggca gatggtgcag 660
gcaatgagag ccattgggac tcatcctagt tccagtactg gtctaagaga tgatcttctt 720
gaaaatttgc agacctatca gaaacgaatg ggggtgcaga tgcaacgatt caagtgaccc 780gcttgttgtt gccgcgaata tcattgggat cttgcacttg atattgtgga ttcttgatcg 840 tctttttttc aaatgcgtat atcgactctt caaacacggc cttaaaagag gcccttctac 900 ggaaggagta cctgagtcta tgagggaaga atatcgaaag gaacagcaga atgctgtgga 960 tgctgacgac agtcattttg tcagcataga gttggagtaa aaaactacct tgUtc 1016
<210> 3
<211〉 1750
<212〉 DNA
<213> gene by per
<400〉 3
tcctgctcaa cttcctgtcg agetaatgee atttttaatg tetttagega gacgctacca 60
tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag gtttgacctg tgcgagcttt 120
tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc gttcgcgttt acgcggacgg 180 tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atategtteg aactggactc ccggtcgttt 240
taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc tetcegtatt cacggggggc 300
gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga agtgggtcat cgtggggtcg 360
cccgtacgag gagaaagecg gttteggett ctccctcgac gcacgctcct gctacagcct 420
cttccctgta agecaaaact tgacttacat cgaagtgccg cagaacgttg cgaaccgggc 480
gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt aaccttggtg ttgctttagc 540
agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc attgcgctcg tgaaggcgta 600
cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc taccttgccc taaacgaaga 660
tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg gagttgcagt tcggttggtt 720
accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt acgaaggttc accttcaaga 780
gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac atcaagttag atggccgtct 840
gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata tcgcgacgta tcgtgatatg 900
gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct ctaggtatct tgaacccact 960
aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc gactggctcc tacctgtagg 1020
taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc tacatgtcag gaacagttac 1080
tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct ccctacgggt ggactgtgga 1140
gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat cgaggggtac aatccgtatg 1200
gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg gtccatacct tagatgcgtt 1260
agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa ccggagtttg aagcatggct 1320
tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa ctggcgacgt gactgtcgcc 1380
ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct ctaactcgcg ttcacaggct 1440
tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga atcgcaaata caccatcaaa 1500 gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg tagagcttcc tgtagccgca 1560 tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt tcgctacgaa ttccgactgc 1620 gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg gaaacccgat tccctcagca 1680 atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca ttcaaacatg aggattaccc1740 atgtcgaaga
1750
<210> 4
<211〉 1707
<212> DNA
<213〉 gene by per
<400〉 4
tcctgctcaa cttcctgtcg agctaatgcc atttttaatg tctttagcga gacgctacca 60
tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag gtttgacctg tgcgagcttt 120
tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc gttcgcgttt aegeggaegg 180
tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg aactggactc ccggtcgttt 240
taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc tctccgtatt cacggggggc 300
gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga agtgggtcat cgtggggtcg 360
cccgtacgag gagaaagccg gtttcggctt ctccctcgac gcacgctcct gctacagcct 420
cttccctgta agccaaaact tgacttecat cgaagtgccg cagaacgttg cgaaccgggc 480 gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt aaccttggtg ttgctttagc 540
agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc attgcgctcg tgaaggcgta 600
cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc taccttgccc taaacgaaga 660
tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg gagttgcagt tcggttggtt 720
accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt acgaaggttc accttcaaga 780
gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac atcaagttag atggccgtct 840
gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata tcgcgacgta tcgtgatatg 900
gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct ctaggtatct tgaacccact 960
aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attegttgtc gactggctcc tacctgtagg 1020
taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc tacatgtcag gaacagttac 1080
tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct ccctacgggt ggactgtgga1140
gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat cgaggggtac aatccgtatg 1200
gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg gtccatacct tagatgcgtt 1260
agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa ccggagtttg aagcatggct 1320
tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa ctggcgacgt gactgtcgcc 1380ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct ctaactcgcg ttcacaggct 1440 tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga atcgcaaata caccatcaaa1500
gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg tagagcttcc tgtagccgca 1560
tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt tcgctacgaa ttccgactgc 1620
gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg gaaacccgat tccctcagca 1680
atcgcagcaa actccggcat ctactaa 1707
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> ARTIFICAL
<400〉 5
atggatcctc ctgctcaact tcctgtcg 28
<210> 6
<211> 28
<212〉 DNA
<213> ARTIFICAL
<400> 6
gcaagctttc ttcgacatgg gtaatcct 28
<210> 7 <211〉 27 <212> DNA <213> ARTIFICAL
<400> 7
gcaagctttt agtagatgcc ggagttt 27
<210〉 8
<211〉 36
<212> DNA
<213> artifical
<400> 8
aaggcaaagc agatgaatta ccaagtcaat ggttac 36
<210〉 9
<211> 31
<212> DNA
<213〉 ARTIFICAL
<400> 9
gtcaagcttc ataaccagtc ggtacagcta c 31
<210〉 10
<211> 22
<212> DNA
<213〉 ARTIFICAL
<400> 10
ctgtagaaaa tcctagctgg ag 22
<210> 11
<211> 20
<212〉 DNA
<213〉 ARTIFICAL
<400> 11
gaagctattc gtcacgttcg 20
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> ARTIFICAL
<400> 12
ctcaagctta ggcactcatg gaatggctaa ag 32
<210> 13
<2U〉 34
<212〉 DNA
<213> ARTIFICAL
<400> 13
taagaaagtg ccgcattttg gacaaagcgt ctac 34
<210〉 14 <211> 34
<212> DNA <213> ARTIFICAL
<400〉 14
tgtccaaaat gcggcacttt cttaaaatgt cgct 34
<210> 15
<2U> 31
<212> DNA
<213> ARTIFICAL
<400> 15
tggtaattca tctgctttgc cttctccatc t 31
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<211> 30
<212> DNA
<213〉 ARTIFICAL
<400〉 16
ctcaagcttg aaggtagata ttgaaagatg 30
<210〉 17
<211> 31
<212〉 DNA
<213> ARTIFICAL
<400> 17
cataagcttg aaacaaggta gttttttact c 3權(quán)利要求
1.一種披甲R(shí)NA，其特征在于，所述披甲R(shí)NA是由MS2包膜蛋白包裹的RNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的披甲R(shí)NA，其特征在于，所述披甲R(shí)NA由MS2包膜蛋白 包裹的RNA包含有SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的披甲R(shí)NA，其特征在于，所述披甲R(shí)NA由MS2包膜蛋白 包裹的RNA還包含有SEQ ID No.3或SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4. 權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述披甲R(shí)NA的制備方法，其特征在于，所述制備方 法采用的純化步驟如下(1) .將RNaseA和DNasel37t:消化的披甲R(shí)NA于瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于雙鏈 DNAMarker的900-1000bp處，割膠取目的RNA陽蛋白質(zhì)復(fù)合體條帶；(2) .將上述目的條帶放到電洗脫/透析管中，透析膜與電泳方向垂直，進(jìn)行電洗脫， 先正向電泳后反向電泳，用槍頭反復(fù)吹打透析膜數(shù)次，將透析管置入ddH20中，室 溫放置2-4h。吸出的電洗脫/透析管中的液體即為純化后的披甲R(shí)NA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的披甲R(shí)NA，其特征在于，含有SEQ ID No. l所示核苷酸 序列的披甲R(shí)NA的制備方法步驟如下(1) 以pMS27質(zhì)粒為模板，SEQIDNo.5所示核苷酸序列與SEQIDNo.6所 示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列與SEQ ID No.7所示核 苷酸序列為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別得到SEQ ID No.3所示核苷酸序 歹IJ和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，分別連接到表達(dá)載體pET30b中， 得到包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的重組載體pAR-l和包含SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重組載體pAR-2;(2) 以SEQIDN0.8和SEQIDN0.9所示核苷酸序列為引物，以SARS病毒 RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，得RT-PCR產(chǎn)物；(3) 分別以SEQ ID No.8與SEQ ID No.lO所示核苷酸序列禾口SEQ ID No.9 與SEQIDNo.ll所示核苷酸序列為引物，步驟(2)所述RT-PCR產(chǎn)物 為豐莫板進(jìn)虧亍PCR反應(yīng)，SOE法(Gene splicing by over lap extension, overlap PCR)將PCR產(chǎn)物拼接；(4) 分別以SEQ ID No.l2與SEQ ID No.l3所示核苷酸序列禾口SEQ ID No.l4與SEQIDNo.l5所示核苷酸序列為引物，甲型流感病毒和乙型 流感病毒RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR， RT-PCR產(chǎn)物通過SOE法拼接起 來；(5) 將步驟(3)和步驟(4)經(jīng)SOE法拼接的產(chǎn)物再經(jīng)SOE法拼接，得到拼接產(chǎn)物Am-Bm-Sars;(6) 步驟(5)所得Am-Bm-Sars鏈接至UpAR-l質(zhì)?；騪AR-2質(zhì)粒，得到重 組質(zhì)粒pAR-3.1或pAR-3.2;(7) 步驟(6)所得重組質(zhì)粒pAR-3.1或pAR-3.2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，得到含SEQIDNo.l所示核苷酸序列的披 甲R(shí)NA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的披甲R(shí)NA，其特征在于，含有SEQ ID No. 2所示的核苷 酸序列披甲R(shí)NA的制備方法步驟如下(1) 以pMS27質(zhì)粒為模板，SEQIDNo.5所示核苷酸序列與SEQIDNo.6所 示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列與SEQ E) No.7所示核 苷酸序列為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別得到SEQ ID No.3所示核苷酸序 列和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，分別連接到表達(dá)載體pET30b中， 得到包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的pAR-l質(zhì)粒和包含SEQ ID No.4所示核苷酸序列的pAR-2質(zhì)粒；(2) 以甲型流感病毒為模板，SEQIDNo.l6所示核苷酸序列和SEQID No.l7所示核苷酸序列為引物進(jìn)行RT-PCR，得到SEQ ID No.2所示核 苷酸序列；(3) 步驟(2)所得SEQIDNo.2所示核苷酸序列分別連接到步驟(1)所 得pAR-l質(zhì)粒或pAR-2質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pAR-4.1或重組質(zhì)粒 pAR-4.2;(4) 步驟(3)所得重組質(zhì)粒pAR-4.1或重組質(zhì)粒pAR-4.2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，得到含SEQIDNo.2所示核苷酸序列的披甲R(shí)NA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種披甲R(shí)NA及其制備方法。本發(fā)明提供一種披甲R(shí)NA，其特征在于，所述披甲R(shí)NA是由MS2包膜蛋白包裹的RNA。本發(fā)明還提供所述披甲R(shí)NA的制備方法。本發(fā)明提供的內(nèi)含多種病毒RNA片段的披甲R(shí)NA和內(nèi)含病毒負(fù)鏈或正鏈RNA的披甲R(shí)NA，可為多種病毒的核酸檢測提供安全穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101173252SQ200610150180
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日
發(fā)明者于新芬, 榕 葉, 宇 寇, 潘勁草, 黃志成 申請人:杭州市疾病預(yù)防控制中心