專利名稱：何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生方法，特別涉及何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法。

背景技術(shù)：
何首烏作為我國一種名貴的大宗中草藥材，除了應(yīng)用于中藥外，還可用于制取洗發(fā)水、首烏酒、保健品、食品和飼料添加劑等，開發(fā)前景十分廣闊，但是，近幾十年來對野生何首烏掠奪性采挖現(xiàn)象非常嚴重，導(dǎo)致何首烏野生資源急劇下降，對當?shù)刂脖缓蛥^(qū)域生態(tài)平衡造成嚴重破壞。因此，保護現(xiàn)有何首烏野生資源，大力發(fā)展何首烏人工栽培，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟意義。目前在廣東、山東及河南等地雖有人工栽培，但品種混雜、產(chǎn)量較低。何首烏的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)為其優(yōu)良種源快速選育、遺傳改良以及工廠化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的無菌苗具有重要意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法，以便進行工廠化生產(chǎn)以滿足市場需求。
本發(fā)明的何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法，其步驟如下 (1)何首烏一年生枝條外植體經(jīng)消毒后切成1～2cm長的帶側(cè)芽莖段，接種到具有6-芐基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，以下簡稱6-BA)和萘乙酸(naphthyleneacetic acid，以下簡稱NAA)或6-BA和吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，以下簡稱IBA)的MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog mediums)中進行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)30～35天形成叢生芽； (2)將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽切成1～2cm長的單個小芽，接種到具有6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)； (3)當芽苗長至4～5cm時接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)至生根成苗。
本發(fā)明優(yōu)選消毒方式是將外植體莖段用洗衣粉溶液浸泡并用柔軟毛刷輕輕涮洗表面5min，然后用自來水沖洗干凈，再在無菌操作條件下用0.1％氯化汞消毒4～5min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分。
其中，優(yōu)選初代誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA1.0～1.2mg/L+NAA0.08mg/L或6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L；繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA0.75～1.5mg/L+IBA0.05～0.1mg/L，優(yōu)選6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L或6-BA0.75mg/L+0.05mg/L；生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA0.5mg/L+IBA0.5～1.0mg/L。
其中，MS培養(yǎng)基中蔗糖重量用量為3％，瓊脂重量用量為0.7％，培養(yǎng)基消毒方式為在121℃下滅菌17min，培養(yǎng)基的pH值為5.8；優(yōu)選培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，采用光照強度為1000～2000lx的日光燈照明，光照時間10～14h/d。
采用本發(fā)明的方法繁殖何首烏，不僅可以節(jié)約大量外匯，而且不受外界條件的限制，四季皆可進行，節(jié)約育苗占地面積，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的何首烏組織培養(yǎng)快繁方法利用細胞的全能性，采取植物體上的細胞團或一塊組織，通過人為條件的控制，使這些組織形成千百萬植株，并且保存了母本的全部優(yōu)良性狀，且遺傳性狀穩(wěn)定。這種方法可在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良試管苗，進行規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)。
本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點 1.誘導(dǎo)培養(yǎng)中采用IBA作為調(diào)節(jié)劑時，腋芽開始萌動生長的時間較短，僅為為10天左右，因此可以節(jié)約培育成本，并且提高了生產(chǎn)效率。
2.培養(yǎng)基中采用IBA作為生長調(diào)節(jié)劑，只要采用具有很低濃度生長調(diào)節(jié)劑(僅為0.05～1.0mg/L)的培養(yǎng)基就可促進何首烏莖段的生根、生長并達到較高的增殖率，繼代培養(yǎng)30天后的芽增值率達到3.56-4.02，生根培養(yǎng)20天后的生根率達到91.6-96.3％，繼代培養(yǎng)兩三代之后，試管苗生長更好，枯死現(xiàn)象幾乎不存在，經(jīng)繼代培養(yǎng)之后試管苗生活力和抗逆性明顯提高。而且，由于培養(yǎng)基中采用的生長調(diào)節(jié)劑濃度較低，降低了在工廠化組培育苗中的生產(chǎn)成本投入。

具體實施例方式 下面結(jié)合實例說明本發(fā)明何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法。
實施例1 采取以下步驟繁殖何首烏 1.取何首烏一年生枝條，用洗衣粉溶液浸泡并用柔軟毛刷輕輕涮洗表面5min，然后用自來水沖洗干凈，再在超凈工作臺內(nèi)進行無菌操作，用0.1％氯化汞消毒4～5min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分，最后將其切成1～2cm長的帶側(cè)芽莖段，接種入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
2.初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。將帶腋芽的莖段接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成是以MS為基本培養(yǎng)基，加入6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L，蔗糖用量為3％，瓊脂為0.7％，pH值為5.8。培養(yǎng)基在121℃下滅菌17min。培養(yǎng)溫度為25+2℃，采用日光燈照明，光照強度為1000～2000lx，光照時間為10～14h/d。其中采用IBA作為調(diào)節(jié)劑時，腋芽開始萌動生長的時間為10天左右，培養(yǎng)30～35d后均形成叢生芽。
3.繼代培養(yǎng)。將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的不定芽切成，1～2cm長的單個小芽，接種在附加不同生長調(diào)節(jié)劑的繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基的組成是以MS為基本培養(yǎng)基，加入6-BA0.75mg/L+IBA0.05mg/L，蔗糖用量為3％，瓊脂用量為0.7％，pH值為5.8。培養(yǎng)基在121℃下滅菌17min。培養(yǎng)溫度為25±2℃，采用日光燈照明，光照強度為1000～2000lx，光照時間為10～14h/d。
在本步驟中，芽培育到第20天時，取25株測量其株高，取其平均值為原始平均高H1；培養(yǎng)至第30天時測量的每組各株高的平均值為平均高度H2，根據(jù)測得的H1和H2的值，計算出實際的增高值ΔH(ΔH＝H2-H1)。另外，計算增殖率(增殖率＝培養(yǎng)30天后分化總芽數(shù)/接種外植體數(shù))。具體數(shù)據(jù)見表一。
4.生根培養(yǎng)。當芽苗長至4～5cm時，接于不同生長調(diào)節(jié)劑濃度的生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基的組成是以1/2MS(大量元素減半，其它成分不變)為基本培養(yǎng)基，加入6-BA0.5mg/L+IBA0.5mg/L。蔗糖用量為3％，瓊脂為0.7％，pH值為5.8。培養(yǎng)基在121℃下滅菌17min。培養(yǎng)溫度25±2℃，采用日光燈照明，光照強度為1000～2000lx，光照時間為10～14h/d。4～5d后，芽基部開始出現(xiàn)一層白色半透明的愈傷組織。10～12d時，開始有少量根須出現(xiàn)。至15d時，仍僅有少量植株發(fā)根，且根量少、短，未能體現(xiàn)出各處理間的差異。至20d時，處理的優(yōu)劣已能很好地體現(xiàn)出來，生長調(diào)節(jié)劑配比不同則何首烏芽苗生根率、根數(shù)及根的長度表現(xiàn)出差異。
在本步驟中，將芽苗培養(yǎng)至20天時，取50株苗計算其生根率(生根率＝生根個數(shù)/接種個數(shù)×100％)，取其平均值為平均生根率；記錄根數(shù)，并計算根平均長度(根平均長度＝根總長/根數(shù))具體數(shù)據(jù)見表二。
實施例2 除生根培養(yǎng)基中所用生長調(diào)節(jié)劑的濃度和配比為6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L外，其余均與實施例1相同。
實施例3 除繼代培養(yǎng)基中所用生長調(diào)節(jié)劑的濃度和配比為6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L、外，其余均與實施例1相同。
實施例4 除繼代培養(yǎng)基中所用生長調(diào)節(jié)劑的濃度和配比為6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L外，生根培養(yǎng)基中所用生長調(diào)節(jié)劑的濃度和配比為6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L外，其余均與實施例1相同。
下面的表一和表二分別給出了實施例1至4中植物激素對繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段何首烏生長的影響數(shù)據(jù)。
表一繼代培養(yǎng)基對何首烏莖段培養(yǎng)的影響 表二生根培養(yǎng)基對何首烏生根培養(yǎng)的影響
權(quán)利要求
1.一種何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于包括以下步驟
(1)何首烏一年生枝條外植體經(jīng)消毒后切成1～2cm長的帶側(cè)芽莖段，接種到具有6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基中進行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)30～35天形成叢生芽；
(2)將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽切成1～2cm長的單個小芽，接種到具有6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)；
(3)當芽苗長至4～5cm時接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)至生根成苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述消毒是將一年生外植體用洗衣粉溶液浸泡并用柔軟毛刷輕輕涮洗表面5min，然后用自來水沖洗干凈，再在無菌操作條件下用0.1％氯化汞消毒4～5min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L或6-BA1.0～1.2mg/L+NAA0.08mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA0.75～1.5mg/L+IBA0.05～0.1mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于所述分化繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA1.5mg/L+IBA0.1mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于所述分化繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中含有6-BA0.75mg/L+IBA0.05mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有6-BA0.5mg/L+IBA0.5～1.0mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一所述方法，其特征在于所述MS培養(yǎng)基中蔗糖重量用量為3％，瓊脂重量用量為0.7％，培養(yǎng)基滅菌方式為在121℃下滅菌17min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，采用光照強度1000～20001x的日光燈照明，光照時間10～14h/d。
全文摘要
本發(fā)明提供一種何首烏的組織培養(yǎng)快繁方法，包括準備外植體、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，具體步驟為1)何首烏一年生枝條經(jīng)0.1％升汞消毒后切成1～2cm長的帶側(cè)芽的莖段，接種到具有6－BA和IBA的MS培養(yǎng)基中進行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)30～35天形成叢生芽；2)將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽分成1～2cm長的單個小芽，接種到具有6－BA和IBA的MS培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)；3)當芽苗長至4～5cm時接種到1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。本發(fā)明方法繁殖何首烏，不僅可以節(jié)約培育成本、提高生產(chǎn)效率，而且不受外界條件的限制，四季皆可進行，節(jié)約育苗占地面積，可在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良試管苗，進行規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)。
文檔編號C12N5/04GK1934933SQ20061014043
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月8日
發(fā)明者曹福亮, 汪貴斌 申請人:南京林業(yè)大學(xué)