專利名稱：炭疽、鼠疫聯(lián)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同時(shí)抗炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌感染的聯(lián)合疫苗，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
炭疽是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，具有傳播速度快、病死率高、易引發(fā)公眾恐慌和社會(huì)混亂等特點(diǎn)，其病原體為炭疽桿菌。目前，人類炭疽在世界各大洲的老疫區(qū)仍有散發(fā)或局部地方性流行，主要在發(fā)展中國家，尤其以非洲西部流行較為嚴(yán)重。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年約有2萬～10萬病例。
鼠疫是由鼠疫桿菌所致的烈性傳染病。歷史上記載過3次鼠疫的世界性大流行給人類造了巨大的災(zāi)難。直到現(xiàn)在，非洲、印度、美國、印尼、緬甸和越南不斷發(fā)生小范圍流行。中國有19個(gè)疫源地省區(qū)，部分地區(qū)鼠間鼠疫流行猛烈，人間鼠疫時(shí)有發(fā)生。
目前，炭疽和鼠疫的化學(xué)治療藥物(鼠疫主要用慶大霉素、鏈霉素等，炭疽主要用青霉素等)不僅副作用大，而且隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn)，療效越來越不理想。接種炭疽和鼠疫疫苗已被證明是預(yù)防炭疽和鼠疫的有效手段。
目前國內(nèi)外人用炭疽疫苗主要有兩類，一類是由炭疽減毒株制備的活芽孢苗，主要在我國和俄羅斯使用；另一類是由炭疽減毒株培養(yǎng)上清制備的PA吸附疫苗，主要在歐美國家使用。這兩種疫苗都存在一些缺陷，目前僅限于特殊人群，如畜牧業(yè)者使用。近年來，國內(nèi)外都在加緊發(fā)展新型炭疽疫苗，主要是以重組PA為基礎(chǔ)構(gòu)建，個(gè)別研究已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
鼠疫疫苗有死菌苗、提純菌苗和減毒活菌苗，世界各國學(xué)者的研究認(rèn)為，減毒活菌苗比前兩者效果好。目前應(yīng)用的EV76鼠疫減毒活菌苗株(也是目前我國人用鼠疫疫苗)，雖然免疫原性良好，但由于其殘余毒力較高，人群接種反應(yīng)大，不能廣泛用于接種。國內(nèi)外都在加緊發(fā)展新型鼠疫疫苗，主要是以重組F1和V抗原為基礎(chǔ)構(gòu)建，個(gè)別研究已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
炭疽和鼠疫是我國法定報(bào)告的1類傳染病，我國存在較大范圍的炭疽和鼠疫自然疫原地，難于徹底消除；炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌是極其重要的生物恐怖劑/生物戰(zhàn)劑，有可能同時(shí)被施放；炭疽和鼠疫桿菌均是細(xì)胞外寄生菌，主要以體液免疫為主，且二者均有比較明確的保護(hù)性抗原?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為新型疫苗的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，從而使疫苗更加安全、有效、經(jīng)濟(jì)?；谝陨峡紤]，研制炭疽和鼠疫桿菌的基因工程聯(lián)合疫苗將為應(yīng)對(duì)與炭疽和鼠疫相關(guān)的突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能同時(shí)保護(hù)人或動(dòng)物免受炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌侵害的聯(lián)合疫苗，可以減少免疫次數(shù)、節(jié)省衛(wèi)生資源、增加被接種者的依從性，特別適用于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的緊急接種，有利于人口健康，國家安全。


圖1為表達(dá)質(zhì)粒pET-F1和pET-V的PCR鑒定圖譜圖2為表達(dá)質(zhì)粒pET-F1和pET-V的酶切鑒定圖譜圖3為鼠疫耶爾森氏菌F1和V抗原的SDS-PAGE檢測(cè)具體實(shí)施方式
實(shí)施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1 炭疽芽孢桿菌PA抗原的制備PA基因的克隆 參考GenBank發(fā)表的炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)基因序列(序列號(hào))和文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)引物，PA 5′端引物5′-AGGAGAACCGGTTATTAAATGAATC-3，PA 3′端引物5′-CGCrTATCCTATCTCATAGCCTT TTTTAG-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從培養(yǎng)A16R菌株的瓊脂平板上挑取少量細(xì)菌，置100uL純水中，煮沸10分鐘，離心后取5uL上清作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物克隆到pMD-T載體進(jìn)行序列測(cè)定，DNA序列測(cè)定確證合成的基因正確，基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，自5′端第1位-2292位核苷酸序列為編碼序列，其編碼序列表中序列2的氨基酸序列。
pAS-PA的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物用SacI酶切，形成5′平末端3′粘末端；載體pAS22用Stu I和Sac I切后，載體和片段連接后常規(guī)轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，PCR(引物與條件同步驟2)篩選陽性克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。序列正確的質(zhì)粒命名為pAS-PA。
重組炭疽保護(hù)性抗原-PA的表達(dá)及純化1、表達(dá)從固體LB培養(yǎng)基上挑取被質(zhì)粒pAS-PA轉(zhuǎn)化的E.coli DH5a工程菌單菌落，接入含100ug/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至OD600＝0.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250轉(zhuǎn)/分誘導(dǎo)表達(dá)5h，離心收集細(xì)菌沉淀。
2、細(xì)菌外周質(zhì)的分離1L誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心后的菌體，用100mL 20％蔗糖溶液(20mmol/L Tris pH 8.0，1mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF)重懸，冰上放置5min，4℃8000rpm離心20min。沉淀用100mL 5mmol/L Mg2SO4。(1mmol/L PMSF)重懸，冰上放置10min，4℃10000rpm離心10min，收集上清液用于純化rPA。
3、離子交換將步驟2中收集的上清液先用Q Sepharose進(jìn)行粗純化。以平衡緩沖液(20mmol/L Tris pH 8.0)平衡柱，調(diào)節(jié)樣品鹽濃度至20mmol/L Tris pH8.0后上樣。用含0.5mol/l NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫。分部收集洗脫液，進(jìn)行12％的SDS-PAGE分析。
含rPA的管合并后用Source 30Q進(jìn)行下一步純化。以平衡緩沖液(同上)平衡柱，樣品稀釋5倍后上樣。用含0～0.25mol/L NaCl的平衡緩沖液梯度洗脫。
4、疏水層析將步驟3的Source 30Q洗脫液合并后用phenyl sepharose疏水柱進(jìn)一步純化。
實(shí)施例2鼠疫候選疫苗F1和V的制備鼠疫標(biāo)準(zhǔn)菌株和炭疽芽孢桿菌菌株由本研究室保存，DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶和pMD-T載體購自TaKaRa公司。
E.coli質(zhì)粒的提取，采用Omega試劑盒；質(zhì)粒構(gòu)建的操作方法參考分子克隆一書。
參考GenBank發(fā)表的鼠疫桿菌莢膜抗原(Fraction 1，F(xiàn)1)基因序列(序列號(hào)AF542378.1)，設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)1up5′-GCCCATATGAAAAAAATCAGTTCCG-3′和F1 down5′-GGGGAATTCTTATTGG TTAGATACGGTTACG′-3(CATATG和GAATTC分別是Nde I和EcoR I的酶切位點(diǎn)，用于將PCR片段克隆到表達(dá)載體pET-32a(+))；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆到pMD-T載體進(jìn)行序列測(cè)定，DNA序列測(cè)定確證克隆的基因正確，基因具有序列表中序列3的核苷酸序列，自5′端第1位-第510位核苷酸序列為編碼序列，其編碼序列表中序列4的氨基酸序列。
參考GenBank發(fā)表的鼠疫桿菌V基因序列(序列號(hào)AF 074612.1)，設(shè)計(jì)引物，V up5′-GCGCATATGATTAGAGCCTACGAAC-3′和V down5′-CCCGAATTCTTATTTACCAGACGTGTCA TC-3′，(CATATG和GAATTC分別是NdeI和EcoR I的酶切位點(diǎn)，用于將PCR片段克隆到表達(dá)載體pET-32a(+))，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆到pMD-T載體進(jìn)行序列測(cè)定，DNA序列測(cè)定確證克隆的基因正確，基因具有序序列表中序列5的核苷酸序列，自5′端第1位-第978位核苷酸序列為編碼序列，其編碼序列表中序列6的氨基酸序列。
將DNA序列測(cè)定正確的F1和V基因用Nde I和Eco RI從pMD-T載體上切下，并凝膠回收純化，將純化的F1和V基因與經(jīng)過Nde I和Eco RI酶切pET-32a(+)(novagen)得到的5400bp的片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選氨芐青霉素(100μg/mL)抗性克隆，分別利用引物V up、V down和F1 UP、F1down(序列同上)進(jìn)行PCR鑒定，篩選得到陽性克隆(圖1中泳道1，2，分別約500bp和1000bp的條帶)。對(duì)PCR陽性克隆提取質(zhì)粒，構(gòu)建的表達(dá)載體命名為pET-V和pET-F1。進(jìn)一步用Nde I/Eco RI進(jìn)行雙酶切和鑒定，結(jié)果pET-V酶切后分別得到1000bp和5400bp的條帶，pET-F1酶切后分別得到500bp和5400bp的條帶，(圖2中泳道1，2)。挑選PCR和酶切鑒定都正確的克隆送博亞生物公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
V和F1抗原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和發(fā)酵培養(yǎng) 將測(cè)序正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB平板上生長的克隆，就是需要的表達(dá)菌。挑取單個(gè)菌落接種于含有抗生素(羧芐青霉素100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；次日，按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至菌密度為A600＝0.8-1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，在37℃繼續(xù)培5h，取1.0ml離心集菌，100μl水懸浮沉淀，加100μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5min，離心后取10μl進(jìn)行SDS-PAGE分析。接種單菌落于10ml LB培養(yǎng)基(含羧芐青霉素100μg/ml)，37℃培養(yǎng)10小時(shí)。按1∶100接種新鮮的LB培養(yǎng)基(含羧芐青霉素100μg/ml)，37℃、250rpm培養(yǎng)過夜，次日按1∶50接種至30L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)過至菌液A600＝0.8-1.0，加入IPTG至終濃度1mmol/L，在37℃繼續(xù)培5h，離心集菌，-20℃凍存。將凍存的細(xì)菌室溫融化，用磷酸鹽緩沖液懸浮菌體(10ml/g濕菌體)，超聲波粉碎(200W，超聲5s，間歇5s，共10min)后，14000rpm離心20min，上清為可溶性蛋白，沉淀即為包含體。
V和F1抗原蛋白的純化 F1抗原蛋白的純化將超聲波粉碎后的沉淀分別用1％的Triton X100和0.5M的尿素洗滌后，沉淀再用2.0M的尿素洗滌，14000rpm離心15min，上清為粗純的F1抗原蛋白，用20mM的磷酸鹽緩沖液透析，上疏水層析柱進(jìn)行純化，收集目的蛋白峰。V抗原蛋白的純化，超聲破碎后的上清，直接用疏水層析柱進(jìn)行純化，收集目的蛋白峰，用20mM的磷酸鹽緩沖液透析，上DEAE層析柱進(jìn)一步純化。
實(shí)施例3 炭疽和鼠疫聯(lián)合疫苗的制備及免疫評(píng)價(jià)炭疽和鼠疫聯(lián)合疫苗的配制免疫程序及劑量 設(shè)計(jì)單獨(dú)V、F1和PA免疫組以及F+V，F(xiàn)+V+PA免疫組共5個(gè)組。用純化的抗原蛋白免疫Balb/c小鼠，2周后測(cè)抗體的滴度，同時(shí)加強(qiáng)免疫，5周后測(cè)抗體滴度，第3次免疫并與SP2/O融合制備單抗。下面給出免疫的組別和劑量。
1、免疫F1抗原，原有蛋白濃度約4-5mg/mL，13μL/只，共3只。吸40ulAg+460ul生理鹽水+0.5ml福氏完全佐劑，免疫3只Balb/c。
2、免疫V抗原，原有Ag濃度4-5mg/ml，3μL/只，共3只。吸40ulAg+460ul生理鹽水+0.5ml福氏完全佐劑 免疫3只Balb/c。
3、免疫F+V抗原，分兩個(gè)劑量進(jìn)行免疫(1)F1 25ul+V 25ul+生理鹽水450ul+0.5ml完全佐劑，共免3只。
(2)F1 12.5ul+V 12.5ul+生理鹽水475ul+0.5ml完全佐劑，共免2只。
4、免疫F1+V+PA(1)F1 26ul+V 26ul+PA 34ul+457ul生理鹽水+0.5ml福氏完全佐劑，共免2只。
(2)F1 8ul+V 8ul+PA 12ul+472ul生理鹽水+0.5ml福氏完全佐劑，共免2只。
5、免疫PA Ag(3mg/ml)17ul/只，共吸34ulAg+466ul生理鹽水+0.5ml福氏完全佐劑，免2只。以上均攪拌混勻，皮下多點(diǎn)免疫Balb/C♀小鼠.
2周后取第一次免疫的Balb/C小鼠尾靜脈血，測(cè)定血清抗體的效價(jià)(見表1-3)取血后免疫第2針，劑量同首次，6周后重新測(cè)定抗體的效價(jià)(見表4-6)。
動(dòng)物預(yù)試驗(yàn)結(jié)果基本證實(shí)，該本發(fā)明所制備的聯(lián)合疫苗，具有良好的安全性和免疫原性。
表注表中左和尾表示標(biāo)記的老鼠。
表中數(shù)據(jù)均是取尾血測(cè)定的。
表中數(shù)據(jù)++++指測(cè)定的OD600值約為1.9，+++約1.0，++約0.5。
①50ug劑量組，②25ug劑量組表1用F1抗原包被酶聯(lián)板的檢測(cè)不同免疫組的抗體滴度情況

表2用V抗原包被酶聯(lián)板的檢測(cè)不同免疫組的抗體滴度情況

表3用PA抗原包被酶聯(lián)板檢測(cè)不同免疫組的抗體滴度情況

首次免疫后8周，2次免疫后6周抗體效價(jià)的測(cè)定表4用F抗原包被酶聯(lián)板檢測(cè)不同免疫組的抗體滴度情況

表5用V抗原包被酶聯(lián)板檢測(cè)不同免疫組的抗體滴度情況

表6用PA抗原包被酶聯(lián)板檢測(cè)不同免疫組的抗體滴度情況

序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>炭疽、鼠疫聯(lián)合疫苗<130>
<160>6<210>1<211>2295<212>DNA<213>炭疽芽孢桿菌<400>1atgaaaaaac gaaaagtgtt aataccatta atggcattgt ctacgatatt agtttcaagc60acaggtaatt tagaggtgat tcaggcagaa gttaaacagg agaaccggtt attaaatgaa120tcagaatcaa gttcccaggg gttactagga tactatttta gtgatttgaa ttttcaagca180cccatggtgg ttacctcttc tactacaggg gatttatcta ttcctagttc tgagttagaa240aatattccat cggaaaacca atattttcaa tctgctattt ggtcaggatt tatcaaagtt300aagaagagtg atgaatatac atttgctact tccgctgata atcatgtaac aatgtgggta360gatgaccaag aagtgattaa taaagcttct aattctaaca aaatcagatt agaaaaagga420agattatatc aaataaaaat tcaatatcaa cgagaaaatc ctactgaaaa aggattggat480ttcaagttgt actggaccga ttctcaaaat aaaaaagaag tgatttctag tgataactta540caattgccag aattaaaaca aaaatcttcg aactcaagaa aaaagcgaag tacaagtgct600ggacctacgg ttccagaccg tgacaatgat ggaatccctg attcattaga ggtagaagga660tatacggttg atgtcaaaaa taaaagaact tttctttcac catggatttc taatattcat720gaaaagaaag gattaaccaa atataaatca tctcctgaaa aatggagcac ggcttctgat780ccgtacagtg atttcgaaaa ggttacagga cggattgata agaatgtatc accagaggca840agacaccccc ttgtggcagc ttatccgatt gtacatgtag atatggagaa tattattctc900tcaaaaaatg aggatcaatc cacacagaat actgatagtc aaacgagaac aataagtaaa960aatacttcta caagtaggac acatactagt gaagtacatg gaaatgcaga agtgcatgcg1020tcgttctttg atattggtgg gagtgtatct gcaggattta gtaattcgaa ttcaagtacg1080gtcgcaattg atcattcact atctctagca ggggaaagaa cttgggctga aacaatgggt1140ttaaataccg ctgatacagc aagattaaat gccaatatta gatatgtaaa tactgggacg1200gctccaatct acaacgtgtt accaacgact tcgttagtgt taggaaaaaa tcaaacactc1260gcgacaatta aagctaagga aaaccaatta agtcaaatac ttgcacctaa taattattat1320ccttctaaaa acttggcgcc aatcgcatta aatgcacaag acgatttcag ttctactcca1380attacaatga attacaatca atttcttgag ttagaaaaaa cgaaacaatt aagattagat1440acggatcaag tatatgggaa tatagcaaca tacaattttg aaaatggaag agtgagggtg1500gatacaggct cgaactggag tgaagtgtta ccgcaaattc aagaaacaac tgcacgtatc1560atttttaatg gaaaagattt aaatctggta gaaaggcgga tagcggcggt taatcctagt1620gatccattag aaacgactaa accggatatg acattaaaag aagcccttaa aatagcattt1680ggatttaacg aaccgaatgg aaacttacaa tatcaaggga aagacataac cgaatttgat1740tttaatttcg atcaacaaac atctcaaaat atcaagaatc agttagcgga attaaacgca1800actaacatat atactgtatt agataaaatc aaattaaatg caaaaatgaa tattttaata1860
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200 205 210Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val215 220 225Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His230 235 240Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp245 250 255Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly260 265 270Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val275 280 285Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu290 295 300Ser Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr305 310 315Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser320 325 330Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile335 340 345Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr350 355 360Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp365 370 375Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn380 385 390Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn395 400 405Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu410 415 420Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln Ile Leu Ala425 430 435Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu440 445 450Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn Tyr455 460 465Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp470 475 480Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn485 490 495Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu
500 505 510Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys515 520 525Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser530 535 540Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala545 550 555Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln560 565 570Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln575 580 585Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala590 595 600Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys605 610 615Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn620 625 630Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His635 640 645Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile650 655 660Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile665 670 675Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp680 685 690Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile695 700 705Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn710 715 720Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr725 730 735Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile740 745 750Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly755 760<210>3<211>513<212>DNA<213>鼠疫耶爾森氏菌
<400>1atgaaaaaaa tcagttccgt tatcgccatt gcattatttg gaactattgc aactgctaat 60gcggcagatt taactgcaag caccactgca acggcaactc ttgtcgaacc agcccgcatc 120actcttacat ataaggaagg cgctccaatt acaattatgg acaatggaaa catcgataca 180gaattacttg ttggtacgct tactcttggc ggctataaaa caggaaccac tagcacatct 240gttaacttta cagatgccgc gggtgatccc atgtacttaa catttacttc tcaggatgga 300aataaccacc aattcactac aaaagtgatt ggcaaggatt ctagagattt tgatatctct 360cctaaggtaa acggtgagaa ccttgtgggg gatgacgtcg tcttggctac gggcagccag 420gatttctttg ttcgctcaat tggttccaaa ggcggtaaac ttgcagcagg taaatacact 480gatgctgtaa ccgtaaccgt atctaaccaa taa 513<210>4<211>170<212>PRT<213>鼠疫耶爾森氏菌<400>2Met Lys Lys Ile Ser Ser Val Ile Ala Ile Ala Leu Phe Gly Thr1 5 10 15Ile Ala Thr Ala Asn Ala Ala Asp Leu Thr Ala Ser Thr Thr Ala20 25 30Thr Ala Thr Leu Val Glu Pro Ala Arg Ile Thr Leu Thr Tyr Lys35 40 45Glu Gly Ala Pro Ile Thr Ile Met Asp Asn Gly Asn Ile Asp Thr50 55 60Glu Leu Leu Val Gly Thr Leu Thr Leu Gly Gly Tyr Lys Thr Gly65 70 75Thr Thr Ser Thr Ser Val Asn Phe Thr Asp Ala Ala Gly Asp Pro80 85 90Met Tyr Leu Thr Phe Thr Ser Gln Asp Gly Asn Asn His Gln Phe95 100 105Thr Thr Lys Val Ile Gly Lys Asp Ser Arg Asp Phe Asp Ile Ser110 115 120Pro Lys Val Asn Gly Glu Asn Leu Val Gly Asp Asp Val Val Leu125 130 135Ala Thr Gly Ser Gln Asp Phe Phe Val Arg Ser Ile Gly Ser Lys140 145 150Gly Gly Lys Leu Ala Ala Gly Lys Tyr Thr Asp Ala Val Thr Val155 160 165Thr Val Ser Asn Gln170
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Ile Ser Ile Lys Tyr Asp Pro Arg Lys Asp Ser Glu Val Phe Ala50 55 60Asn Arg Val Ile Thr Asp Asp Ile Glu Leu Leu Lys Lys Ile Leu65 70 75Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Asp Ala Ile Leu Lys Gly Gly His Tyr80 85 90Asp Asn Gln Leu Gln Asn Gly Ile Lys Arg Val Lys Glu Phe Leu95 100 105Glu Ser Ser Pro Asn Thr Gln Trp Glu Leu Arg Ala Phe Met Ala110 115 120Val Met His Phe Ser Leu Thr Ala Asp Arg Ile Asp Asp Asp Ile125 130 135Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala Arg140 145 150Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys155 160 165Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser170 175 180Ser Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp185 190 195Lys Asn Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser200 205 210Ala Glu Tyr Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln215 220 225Val Asp Gly Ser Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu230 235 240Gly Ser Glu Asn Lys Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn245 250 255Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala260 265 270Thr Thr Cys Ser Asp Lys Ser Arg Pro Leu Asn Asp Leu Val Ser275 280 285Gln Lys Thr Thr Gln Leu Ser Asp Ile Thr Ser Arg Phe Asn Ser290 295 300Ala Ile Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val305 310 315Met Gln Arg Leu Leu Asp Asp Thr Ser Gly Lys320 32權(quán)利要求
1.一種保護(hù)人和動(dòng)物免受炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌感染的聯(lián)合疫苗，其中含有炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原PA、鼠疫耶爾森氏菌V抗原和鼠疫耶爾森氏菌F1抗原，或這3種抗原的保護(hù)性表位部分。
2.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗，其中含有的3種抗原或保護(hù)性表位是分離和/或純化的重組蛋白。
3.編碼重組蛋白的基因包括炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。鼠疫耶爾森氏菌F1抗原基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №.4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。鼠疫耶爾森氏菌V抗原基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體、工程菌。
5.權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體包括原核細(xì)胞表達(dá)載體和酵母細(xì)胞表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求4所述工程菌包括用于表達(dá)的，適合發(fā)酵和規(guī)?；拇竽c桿菌和酵母菌。
7.權(quán)利要求1聯(lián)合疫苗的接種途徑包括皮下或肌肉注射，透皮吸收，口服，鼻內(nèi)粘膜滴/噴。
8.權(quán)利要求1聯(lián)合疫苗的劑型包括噴鼻劑，凍干粉劑，液體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能同時(shí)保護(hù)人或動(dòng)物免受炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌侵害的聯(lián)合疫苗。該疫苗包括一定形式的炭疽芽孢桿菌PA抗原、鼠疫耶爾森氏菌V抗原和鼠疫耶爾森氏菌F1或這三種抗原的保護(hù)性表位?？乖瓋?yōu)選以基因工程方法表達(dá)的經(jīng)分離和/或純化的重組蛋白質(zhì)。編碼完整或部分PA抗原，編碼完整或部分F1抗原以及編碼完整或部分V抗原的DNA可直接用作核酸疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1966074SQ20061013782
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日
發(fā)明者陳薇, 李建民, 徐俊杰, 侯利華, 付玲, 董大勇, 李冠霖 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所