專利名稱：抑制sars冠狀病毒m蛋白基因表達(dá)的小干擾rna及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小干擾RNA及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及抑制SARS冠狀病毒M 蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA及其編碼基因與其在制備SARS治療性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
'
嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)是一種嚴(yán) 重威脅人類健康甚至生命的傳染性疾病。引起SARS的病原體SARS-CoV為一種新型的冠 狀病毒，具有棘突蛋白S (spike)，基質(zhì)蛋白M (matrix)，包膜蛋白E (Envel叩e) 和核蛋白N (Nuclear protein)等數(shù)種主要結(jié)構(gòu)蛋白(Holmes KV. SARS-associated coro譜irus. N Engl J Med， 2003， 348(20) : 1948-51.)。其中，M蛋白是包膜中的 主要結(jié)構(gòu)蛋白，可能與病毒的組裝和細(xì)胞內(nèi)出芽有關(guān)，在病毒感染中起到重要作用。 目前，尚未有直接而有效的治療SARS-CoV的方法。
RNA干擾技術(shù)(RNA interference,簡(jiǎn)稱RNAi)是在小雙鏈RNA (dsRNA)分子的 介導(dǎo)下特異性降解靶基因的生物技術(shù)，能使基因表達(dá)沉默，達(dá)到拮抗耙基因功能的作 用，因而，具有很好的生物(基因)治療潛力。長(zhǎng)度為21-22nt的小干擾RNA (siRNA， small interfering RNA)介導(dǎo)特異性干擾反應(yīng)，只降解與其長(zhǎng)度互補(bǔ)的特定基因的 mRNA (Elbashir， S. M. ， Harborth， J. ， Lendeckel， W. et al. ， Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001, 411 (6836): 494) 。 RNAi技術(shù)因其在疾病治療方面具有巨大潛力而 備受關(guān)注。RNA干擾技術(shù)為系統(tǒng)地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相對(duì)簡(jiǎn)便的途 徑，從而為疾病的防治提供了重要思路。迄今為止，有關(guān)siRNA可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)SARS 病毒基因RNA的干擾效應(yīng)，從而使該病毒的復(fù)制和蛋白表達(dá)受到抑制，對(duì)細(xì)胞形成保 護(hù)作用的報(bào)道已有多篇，但針對(duì)SARS-CoV M蛋白基因設(shè)計(jì)的利用載體發(fā)揮作用的 siRNA卻少有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供載體靶向的抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA。
本發(fā)明所提供的抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA，是下述雙鏈 RNA序列之一
1) 正義鏈為序列表中的序列1,反義鏈為序列表中的序列2的雙鏈RNA序列；
2) 正義鏈為序列表中的序列3，反義鏈為序列表中的序列4的雙鏈RNA序列。
將具有1 )的雙鏈RNA序列命名為siRNA-Ml,其反義鏈與SARS-CoV M mRNA(GenBank
號(hào):52100973)的220-241位置序列5， -gggugacuggcgggauugcgau-3，互補(bǔ)。序列表 中序列l(wèi)由22個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列2 由22個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端。
將具有2)的雙鏈RNA序列命名為siRNA-M2，其反義鏈與SARS-CoV M mRNA的 460-480位置序列5， -gggcgcugugacauuaaggac-3，互補(bǔ)。序列表中序列3由21個(gè)堿 基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列4由21個(gè)堿基組成， 序列的方向從左至右為5'端一3'端。
上述抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因可具有下述1) 和2)中至少一個(gè)雙鏈核苷酸序列
1) 有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列5的核苷酸序列 或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做 模板的DNA鏈)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序 列6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
2) 有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列7的核苷酸序列 或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做 模板的DNA鏈)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序 列8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在O. 1XSSPE (或O.IXSSC)， 0.1% SDS的溶液中，在65。C 下雜交并洗膜。
將具有l(wèi))的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNAl，編碼siRNA-Ml。序列表 中序列5由56個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列6 由60個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為3'端一5'端。
將具有2)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNA2，編碼siRNA-M2。序列表 中序列7由54個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列8 由58個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為3'端一5'端。
含有上述抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA編碼基因的表達(dá)載體及由 此產(chǎn)生的siRNA,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提供的小干擾RNA可對(duì)SARS冠狀病毒M蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)生干擾效應(yīng)， 干擾效率可達(dá)70%以上，且隨著含有siRNA-Ml (或siRNA-M2)編碼基因的RNAi干擾載體的轉(zhuǎn)染量的增加，SARS-CoV M蛋白的表達(dá)量逐漸下降，表明針對(duì)SARS-CoV M蛋
白設(shè)計(jì)的siRNA可顯著抑制SARS-CoV M蛋白的表達(dá)，并具有劑量效應(yīng)，從而為SARS冠 狀病毒M蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究SARS-CoV M蛋白在SARS-CoV的 致病機(jī)制中的作用提供了新的平臺(tái)，對(duì)于揭示SARS的致病機(jī)制具有重要意義，同時(shí) 也為預(yù)防和治療SARS及其相關(guān)疾病提供了新的思路和方法。本發(fā)明將在SARS的特異 性預(yù)防和治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，特別是在制備以抑制SARS冠狀病毒M蛋白基 因表達(dá)的小干擾RNA或攜帶所述抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA編 碼基因的表達(dá)載體為活性成分的藥物中將發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA靶向序列在SARS-CoV M基因
序列中的位置示意圖
圖2為抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的RNAi干擾載體的工作原理示意圖
圖3A為siRNA-Ml對(duì)SARS-CoV M蛋白基因mRNA表達(dá)水平抑制作用劑量效應(yīng)的
RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
圖3B為siRNA-Ml對(duì)SARS-CoV M蛋白基因mRNA表達(dá)水平抑制作用劑量效應(yīng)的半 定量分析結(jié)果
圖4A為siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因mRNA表達(dá)水平抑制作用劑量效應(yīng)的 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
圖4B為siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因mRNA表達(dá)水平抑制作用劑量效應(yīng)的半 定量分析結(jié)果
圖5為siRNA-Ml轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果
圖6為siRNA-M2轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)
《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。
實(shí)施例1、抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA的設(shè)計(jì)和RNAi干擾載體 的構(gòu)建
一、抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA的設(shè)計(jì) 按下述方法設(shè)計(jì)抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA:
根據(jù)SARS-CoV M基因mRNA序列(GenBank號(hào)52100973)，以及pBS/U6載體(Sui GC et al.PNAS.2002 April;99 (8) :5515-5520)中U6啟動(dòng)子的特殊要求，選取位 于SARS-CoV M基因mRNA序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)aug下游220和460bp處的兩段長(zhǎng)度分別 為22bp和21bp的序列(靶向序列在SARS-CoV M基因序列中的位置示意圖見(jiàn)圖1)，避 開(kāi)了不同病毒株之間的突變點(diǎn)，同時(shí)，所選取的這兩段序列均以GGG起始，GC含量為 63. 6%和57. 1%，并將選取的序列進(jìn)行了同源性比對(duì)分析以保證所篩選的抑制 SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的siRNA序列同除SARS-CoV外的其它種屬序列無(wú)同源性， 將用上述方法獲得的兩對(duì)抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA分別命名為 siRNA-Ml(序列表中序列1和序列2)和siRNA-M2(序列表中序列3和序列4)， siRNA-Ml 作用于SARS-CoV M mRNA的220-241位置序列5' -gggugacuggcgggauugcgau-3'， siRNA-M2作用于SARS-CoV M mRNA的460-480位置序列 5， -gggcgcugugacauuaaggac-3，。
二、抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的RNAi干擾載體的構(gòu)建
1、 根據(jù)siRNA-Ml和siRNA-M2所作用的靶序列以及載體pBS/U6的使用要求，設(shè) i十能夠產(chǎn)生siRNA-Ml和siRNA-M2的si腿序列，分別命名為siDNAl和siDNA2，具 體序列如下(下劃線堿基序列為針對(duì)SARS-CoV M mRNA的靶序列)
siDNA1鏈
5， 一gggtgactggcgggattgcgata agcttatcgcaatcccgccagtcaccctttttg -3'(序列5) siDNAl反義鏈
3， —cccactgaccgccctaacgctaUcga atagcgttagggcggtcagtgggaaaaacUaa-5,(序列6) siDNA2 IBC鏈
5， 一gggcgctgtgacattaaggaca agcttgtccttaatgtcacagcgccctttttg~3'(序歹!j 7) siDNA2飾連
3， 一cccgcgacactgtaattcctgttcga acaggaattacagtgtcgcgggaaaaacttaa-5 ， (序歹ij8)
2、 根據(jù)所設(shè)計(jì)的siDNAl和siMA2靜i恰成8條寡核苷酸，序列如下 la:5， -gggtgactggcgggattgcgata-3，
lb: 3， -cccactgaccgccctaacgctattcga-5， 2a: 5， -agcttatcgcaatcccgccagtcacccttttt『3， 2b: 3， -atagcgttagggcggtcagtgggaaaaacttaa-5，； la， 5， -gggcgctgtgacattaaggaca-3， lb，3， -cccgcgacactgtaattcctgttcga-5，2a， 5， —agcttgtccttaatgtcacagcgccctttttg -3， 2b, : 3， -ac鄉(xiāng)aattacagtgtcgcgggaaaaacttaa-5，
將上述8條兩兩互補(bǔ)的寡核苷酸片斷經(jīng)煮沸5分鐘后自然冷卻使之緩慢退火得到 lalb和2a2b， la， lb，和2a， 2b，兩對(duì)雙鏈dsDNA (即四條雙鏈dsDNA)。對(duì)含有U6啟 動(dòng)子的載體PBS/U6進(jìn)行以下操作用限制性內(nèi)切酶^9S I和,p" I分別進(jìn)行雙酶切，將 退火后的寡核苷酸雙鏈lalb克隆入經(jīng)酶切回收的載體pBS/U6中，將含有l(wèi)alb的載體命 名為pBS/U6 + lalb，將含有l(wèi)a， lb，的載體命名為pBS/U6 + la， lb，。再將2a2b克隆 入分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶歷'/^111和&07 I進(jìn)行雙酶切后的載體pBS/U6+lalb中，得到 以5， -gggugacuggcgggauugcgau-3，為靶序列的SARS-CoV M蛋白基因的RNAi載體，將 其命名為pBS/U6-siml;將2a' 2b，用同樣方法克隆入載體pBS/U6 + la， lb，中，得 到以5' -gggcgcugugacauuaaggac-3'為靶序列的SARS-CoV M蛋白基因的RNAi載體， 將其命名為pBS/U6-sim2。對(duì)pBS/U6-siml和pBS/U6-sim2分別用限制性內(nèi)切酶Z力o I和 i5b/ V進(jìn)行酶切鑒定(以空載體pBS/U6為對(duì)照)，結(jié)果空載體pBS/U6經(jīng)雙酶切可以釋 放長(zhǎng)度約為3200bp左右的DNA片段，而構(gòu)建的載體pBS/U6-siml和pBS/U6-sim2因插入 dsDNA使限制酶切位點(diǎn)缺失而不能釋放該長(zhǎng)度約為3200bp左右的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果 相符，表明正確構(gòu)建了分別含有siDNAl和silM2抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的RNAi干 擾載體，其工作原理示意圖如圖2所示(A)為線性化的pBS/U6-sim: pBS/U6-sim以U6 作為啟動(dòng)子，啟動(dòng)子之后緊接著GGG作為小RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；B)為插入到 pBS/U6-sira中的寡核苷酸雙鏈lalb和2a2b; C)為寡核苷酸片段la和2a被轉(zhuǎn)錄后形成 發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的siRNA，對(duì)目的基因發(fā)揮干擾效應(yīng)。U6: U6啟動(dòng)子；Ami/:氨芐青霉素抗 性基因；Pampl和Pamp2: An^擴(kuò)增引物)。
實(shí)施例2、檢測(cè)siRNA-Ml和siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)抑制的劑量效應(yīng)
一、含有SARS-CoV M蛋白基因的表達(dá)載體pCMV—Myc—M的構(gòu)建
以SARS-CoVM蛋白基因?yàn)槟０澹谝颬1: 5， -tatagaattctggcaacggtactatt-3， 禾口P2: 5， -tataggtaccgtcacttactgtactagcaaagc-3，的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增SARS-CoV M蛋白 基因的cds區(qū)(編碼序列)，并在序列兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶歷'/^III和ife^yi 識(shí)別位點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果得到了大小 約為670bp的DNA片段，回收并純化該目的片段，然后用限制性內(nèi)切酶歷';^III和萬(wàn)3y^ I對(duì)該目的片段進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的真核表達(dá)載體pCMV-Myc (購(gòu)自BD Biosciences公司)進(jìn)行連接，得到SARS-CoV M蛋白基因的亞克隆載體，命名為
pCMV-Myc-M。
二、檢測(cè)siRNA-Ml和siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)抑制的劑量效應(yīng)
1、 人胚腎細(xì)胞系293的培養(yǎng)
將人胚腎細(xì)胞系293培養(yǎng)于添加有體積百分濃度為10。/。的經(jīng)熱滅活的胎牛血清 (FBS)的Modified Eagle， s medium (MEM)培養(yǎng)基中，然后將293細(xì)胞以2 X 105/孔的 密度培養(yǎng)于6孔板中，將細(xì)胞置于37。C，含5%0)2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%。
2、 共轉(zhuǎn)染
將實(shí)施例1構(gòu)建的抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的RNAi干擾載體pBS/U6-siml和 pBS/U6-sim2以不同劑量(pCMV-Myc-M與干擾載體的質(zhì)量比分別為:1: 1、 1: 2、 1: 4、 1: 8)分別與步驟一構(gòu)建的SARS-CoV M蛋白基因的表達(dá)載體pCMV-Myc-M用磷酸鈣 法瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染步驟1培養(yǎng)的293細(xì)胞，對(duì)照組不加干擾載體，再將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。
3、 siRNA-Ml和siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)抑制劑量效應(yīng)的RT-PCR檢測(cè) 及半定量分析
收集293細(xì)胞，用RT-PCR的方法檢測(cè)siRNA-Ml、 siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因 表達(dá)抑制的劑量效應(yīng)，具體方法為利用Trizol(Invitrogen)提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA, 然后取提取的2ug總RNA為模板用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Promage公司)反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA， 再以該c腿為模板，在弓I物P3: 5， -tatagaattctggcagacaacggtactatt-3，禾口P4: 5， -tataggtaccgtcacttactgtactagcaaagc-3，的弓I導(dǎo)下PCR擴(kuò)土曾SARS-CoV M蛋白基 因，PCR反應(yīng)條件為先94'C變性30秒，然后56"C退火1分鐘，最后72'C延伸1分30秒。 同時(shí)以三磷酸甘油醛脫氫酶基因(W尸/W)片段作為PCR反應(yīng)的內(nèi)參，所用引物序列為 P5 (上游弓i物)5， -ggcaaagtggacattgtcgc-3，禾口P6 (下游弓l物)5, -agaag cagggatgatgttctgg-3'，反應(yīng)條件不變。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)SARS-CoV M蛋白基因的表達(dá)水平進(jìn)行半定量鑒定。
siRNA-Ml對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)水平干擾劑量效應(yīng)的RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果 如圖3A所示，內(nèi)參W尸/W基因的轉(zhuǎn)錄水平基本一致，實(shí)驗(yàn)組SARS-CoV M蛋白基因的 表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低，且隨著干擾載體pBS/U6-siml轉(zhuǎn)染劑量的增大(從左 至右)，SARS-CoV M蛋白基因的mRNA表達(dá)水平逐漸降低。siRNA-Ml對(duì)SARS-CoV M 蛋白基因表達(dá)水平干擾劑量效應(yīng)半定量分析結(jié)果如圖3B所示(橫軸質(zhì)粒pCMV-Myc-M 與pBS/U6-siml的質(zhì)量比，5個(gè)點(diǎn)分別為無(wú)干擾，1:1， 1:2， 1:4， 1:8;縱軸各組 RT-PCR跑膠后用紫外分光光度儀分析各條帶亮度得到的數(shù)值)，siRNA-Ml干擾組亮 度數(shù)值分別為82200 (對(duì)照)，72026 (1: 1) ， 63724 (1: 2) ， 52656 (1: 4) ， 32776(1: 8)，而各組相應(yīng)的內(nèi)參亮度數(shù)值分別為72026， 72213， 74067， 78409， 76652。 上述檢測(cè)結(jié)果表明與對(duì)照組相比，本發(fā)明的siRNA-M1對(duì)SARS-CoV M蛋白基因在細(xì)胞 中的表達(dá)具有較顯著的抑制作用，其干擾效應(yīng)可達(dá)70%以上，且隨著siRNA-Ml轉(zhuǎn)染 量的提高，抑制作用也更加顯著，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，同時(shí)本發(fā)明的小干擾RNA 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響，證明無(wú)毒性作用。
siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)水平千擾劑量效應(yīng)的RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果 如圖4A所示，內(nèi)參W/YW基因的轉(zhuǎn)錄水平基本一致，實(shí)驗(yàn)組SARS-CoV M蛋白基因的 表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低，且隨著干擾載體pBS/U6-sini2轉(zhuǎn)染劑量的增大(從左 至右)，SARS-CoV M蛋白基因的mRNA表達(dá)水平逐漸降低。siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M 蛋白基因表達(dá)水平干擾劑量效應(yīng)半定量分析結(jié)果如圖4B所示(橫軸質(zhì)粒pCMV-Myc-M 與pBS/U6-sim2的質(zhì)量比，5個(gè)點(diǎn)分別為無(wú)干擾，1:1 ,1:2 ,1:4 ，1:8;縱軸各組 RT-PCR跑膠后用紫外分光光度儀分析各條帶亮度得到的數(shù)值)，siRNA-M2干擾組亮 度數(shù)值分別為75682 (對(duì)照)，62784 (1: 1) ， 61754 (1: 2) ， 43016 (1: 4) ， 7732
(1: 8)，而各組相應(yīng)的內(nèi)參亮度數(shù)值分別為97578， 91032， 98567， 102981， 83904。 上述檢測(cè)結(jié)果表明與對(duì)照組相比，本發(fā)明的siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因在細(xì)胞 中的表達(dá)也具有較顯著的抑制作用，其干擾效應(yīng)可達(dá)70%以上，且隨著siRNA-M2轉(zhuǎn) 染量的提高，抑制作用也更加顯著，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，同時(shí)本發(fā)明的小干擾RNA 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響，證明無(wú)毒性作用。
實(shí)施例3、檢測(cè)siRNA-Ml和siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)抑制的特異性
一、 含有SARS-CoV M蛋白基因的表達(dá)載體pCMV—Myc—M的構(gòu)建
用與實(shí)施例2相同的方法PCR擴(kuò)增SARS-CoV M蛋白基因的cds區(qū)，并在序列兩端分
別添加上限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH識(shí)別位點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果得到了大小約為670bp的DNA片段，回收并純化該目的片 段，然后用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH對(duì)該目的片段進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙 酶切的含有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的真核表達(dá)載體 pEGFP-Nl (購(gòu)自BD Biosciences公司)進(jìn)行連接，得到SARS-CoV M蛋白基因的亞克隆 載體，命名為pEGFP-N1-M。
二、 檢測(cè)siRNA-Ml和siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)抑制的特異性
1、 人胚腎細(xì)胞系293的培養(yǎng)
用與實(shí)施例1相同的方法對(duì)人胚腎細(xì)胞系293進(jìn)行培養(yǎng)。
2、 共轉(zhuǎn)染
將實(shí)施例1構(gòu)建的抑制SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)的RNAi干擾載體pBS/U6-siml禾口 pBS/U6-sim2按質(zhì)量比l: 4分別與步驟一構(gòu)建的SARS-CoV M蛋白基因的表達(dá)載體 pEGFP-N1-M用磷酸鈣法瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染步驟l培養(yǎng)的293細(xì)胞，對(duì)照組共轉(zhuǎn)染有僅含紅色熒 光蛋白(green fluorescent protein ，野)基因的載體pDsRed-Nl (購(gòu)自BD Biosciences公司)和pBS/U6-siml (或pBS/U6-sim2，質(zhì)量比仍為l: 4)，同時(shí)以 pEGFP-Nl-M轉(zhuǎn)染組作為SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)量的參照，以含紅色熒光蛋白R(shí)FP基 因的載體轉(zhuǎn)染組作為RFP基因表達(dá)量的參照，再將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。
3、 siRNA-Ml和siRNA-M2對(duì)SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)抑制的特異性檢測(cè)
將SARS-CoV M蛋白基因克隆到pEGFP-Nl中，可表達(dá)SARS-CoV M蛋白與GFP形 成的融合蛋白，該融合蛋白因?yàn)閿y帶有GFP而發(fā)出綠色熒光，因此將構(gòu)建的融合蛋白 表達(dá)載體pEGFP-Nl-M與pBS/U6-siml (或pBS/U6-sim2)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，若干擾 載體攜帶的小干擾RNA對(duì)SARS-CoV M蛋白基因的表達(dá)具有抑制作用，則綠色熒光蛋 白GFP基因的表達(dá)將受到抑制，熒光強(qiáng)度將會(huì)降低。
siRNA-Ml轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(圖a)為pEGFP-Nl-M轉(zhuǎn)染組 的觀察結(jié)果；圖b)為pEGFP-N1-M與pBS/U6-siml共轉(zhuǎn)染組的觀察結(jié)果；c)紅色熒 光蛋白R(shí)FP基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組d)紅色熒光蛋白R(shí)FP基因表達(dá)載體與pBS/U6-siml 共轉(zhuǎn)染組)，與pEGFP-N1-M轉(zhuǎn)染組相比，pEGFP-Nl-M與pBS/U6-siral共轉(zhuǎn)染組的綠 色熒光強(qiáng)度顯著降低，而紅色熒光強(qiáng)度組間無(wú)明顯差別，表明pBS/U6-siml所攜帶的 siRNA-Ml對(duì)轉(zhuǎn)入的外源SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)具有顯著，而且特異性地抑制作用， 可用于制備SARS的治療性藥物的研究。
siRNA-M2轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(圖a)為pEGFP-Nl-M轉(zhuǎn)染組 的觀察結(jié)果；圖b)為pEGFP-Nl-M與pBS/U6-sim2共轉(zhuǎn)染組的觀察結(jié)果；c)紅色熒 光蛋白R(shí)FP基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組d)紅色熒光蛋白R(shí)FP基因表達(dá)載體與pBS/U6-sim2 共轉(zhuǎn)染組)，與pEGFP-Nl-M轉(zhuǎn)染組相比，pEGFP-Nl-M與pBS/U6-sim2共轉(zhuǎn)染組的綠 色熒光強(qiáng)度顯著降低，而紅色熒光強(qiáng)度組間無(wú)明顯差別，表明pBS/U6-sim2所攜帶的 siRNA-M2對(duì)轉(zhuǎn)入的外源SARS-CoV M蛋白基因表達(dá)也具有顯著，而且特異性地抑制作 用，同樣可用于制備SARS的治療性藥物。序列表
<160〉 8
〈210〉 1
〈211> 22
〈212> 腿 ' 〈213>人工序列
〈220〉 <223>
<400〉 1
gggugacugg cgggauugcg au
22
〈210〉 2 〈211〉 22 〈212> 腿 〈213〉人工序列
〈220〉 〈223〉
〈400> 2
aucgcaaucc cgccagucac cc 22
<210> 3
〈211〉 21
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈220〉
12〈223>
〈400〉 3
gggcgcugug acauuaagga c 21
〈210〉 4
〈211> 21
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
<400> 4
guccuuaaug ucacagcgcc c 21
〈210> 5
〈211> 56 〈212〉腿
〈213〉 人工序列
<220> <223>
<400> 5
gggtgactggcgggattgcgata agcttatcgcaatcccgccagtcaccctttttg 56
〈210〉 6 <211> 60 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220> <223〉
〈400〉 6
cccactgacc gccctaacgc tattcgaata gcgttagggc ggtcagtggg aaaaacttaa 60
<210> 7 '
<211> 54
<212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉 <223>
〈400〉 7
gggcgctgtg acattaagga caagcttgtc cttaatgtca cagcgccctt tttg 54
<210〉 8
<211> 58
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
〈400〉 8
cccgcgacac tgtaattcct gttcgaacag gaattacagt gtcgcggga aaacttaa 58
權(quán)利要求
1、抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA，是下述1)和2)中的至少一個(gè)雙鏈RNA序列1)正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾RNA，其特征在于所述小干擾RNA是一個(gè)正義 鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列的雙 鏈RNA序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾RNA，其特征在于所述小干擾RNA是一個(gè)正義 鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列的雙 鏈RNA序列。
4、 權(quán)利要求1-3任一所述的抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA的 編碼基因。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒M蛋白基 因表達(dá)的小干擾RNA的編碼基因是下述1)和2)中至少一個(gè)雙鏈核苷酸序列1) 有義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序 列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列6的核苷酸序列或 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2) 有義鏈具有序列表中序列7的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序 列7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列8的核苷酸序列或 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒M蛋白基 因表達(dá)的小干擾RNA的編碼基因?yàn)橐粋€(gè)雙鏈核苷酸序列，其有義鏈?zhǔn)切蛄斜碇行蛄? 的核苷酸序列；反義鏈?zhǔn)切蛄斜碇行蛄?的核苷酸序列。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒M蛋白基 因表達(dá)的小干擾RNA的編碼基因?yàn)橐粋€(gè)雙鏈核苷酸序列，其有義鏈?zhǔn)切蛄斜碇行蛄? 的核苷酸序列的核苷酸序列；反義鏈?zhǔn)切蛄斜碇行蛄?的核苷酸序列的核苷酸序列。
8、 含有權(quán)利要求4-7任一所述的抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA 編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞系和宿主菌。9、權(quán)利要求1所述的抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA或攜帶權(quán) 利要求4所述抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA編碼基因的表達(dá)載體 在制備SARS治療性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA及其編碼基因與應(yīng)用。該抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA，是下述1)和2)中的至少一個(gè)雙鏈RNA序列1)正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列。本發(fā)明將在制備以抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA或攜帶所述抑制SARS冠狀病毒M蛋白基因表達(dá)的小干擾RNA編碼基因的表達(dá)載體為活性成分的藥物中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101173275SQ200610114168
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日
發(fā)明者力 劉, 云 張, 穎 王, 王樹(shù)蕙 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所