專利名稱：治療和預(yù)防骨損失的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及15-脂肪氧化酶抑制劑以及它們在治療和預(yù)防骨損失中的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明涉及15-脂肪氧化酶抑制劑減少骨損失和/或增加凈骨形成的應(yīng)用。
脂肪氧化酶是在植物和動物中發(fā)現(xiàn)的含非血紅素鐵的酶，催化某些多不飽和脂肪酸如脂類和脂蛋白的氧合。已知幾種不同的脂肪氧化酶，每種具有特征性的氧化作用。哺乳動物脂肪氧化酶由在被氧合的花生四烯酸中的位置來命名。酶5-脂肪氧化酶將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-氫過氧化二十四烯酸(5-HPETE)。這是產(chǎn)生5-羥二十四烯酸(5-HETE)和白三烯(LTs)的代謝途徑中的第一步。類似地，12-和15-脂肪氧化酶分別將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)?2-和15-HPETE。12-HPETE的生物化學(xué)還原產(chǎn)生12-HETE，而15-HETE是稱為脂毒素的化合物類的前體。
生物作用的不同排列與脂肪氧化酶活性的產(chǎn)物相關(guān)，并且很多作為介質(zhì)涉及各種疾病狀態(tài)。C4和D4LT是人支氣管平滑肌的有效收縮劑；在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中發(fā)現(xiàn)的LTB4和5-HETE是炎性細胞如多形核白細胞的有效趨化因子(Green和Lambeth，Tetrahedron，39，1687(1983))；在牛皮癬患者的表皮組織中已發(fā)現(xiàn)高水平的12-HETE；已經(jīng)表明脂毒素刺激中性白細胞釋放溶酶體酶和過氧化物離子。因此，脂肪氧化酶在哮喘、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和炎癥的介質(zhì)的生物合成中起重要作用，這些酶的抑制劑阻斷這些疾病狀態(tài)所包含的生物化學(xué)途徑。
人15-脂肪氧化酶(15-LO)催化由花生四烯酸形成15-S-羥二十四烯酸(15-S-HETE)(Kuhn和Borngraber，Lipoxygenases and Their Metabolites，Plenum Press，紐約，(1999))。在小鼠中，15-S-HETE的合成由12/15-脂肪氧化酶(Alox15)進行，它是人15-LO的小鼠同系物。小鼠12/15-LO將花生四烯酸以3∶1比例轉(zhuǎn)變?yōu)?2(S)-羥二十四烯和15-S-HETE，并可以另外將亞油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?3-羥十八碳二烯酸(13-HODE)。
以前15-脂肪氧化酶已經(jīng)包含在幾種疾病的發(fā)病機理中，所述疾病包括動脈粥樣硬化(Harats等Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，2100-2105，(2000))，哮喘(Shannon等，Am.Rev.Respir.Dis.，147，1024-1028，(1993))，癌癥(Shureiqi等，JNCI，92，1136-1142，(2000))，和腎小球性腎炎(Montero和Badr，Exp.Neph.，8，14-19(2000))。已經(jīng)鑒定出很多種類的化合物抑制15-脂肪氧化酶，包括酚類、異羥肟酸類和炔屬脂肪酸類(綜述于Kuhn和Borngraber，Lipoxygenases and Their Metabolites，Plenum Press，紐約，(1999))。這些試劑的抑制活性范圍有變化。例如，已表明去甲二氫愈創(chuàng)木酸是5-和15-脂肪氧化酶的抑制劑，已表明萘異羥肟酸抑制5-，12-和15-脂肪氧化酶(美國專利4,605,669)，和已經(jīng)報道苯并芴15-脂肪氧化酶抑制劑PD146176對15-脂肪氧化酶相對特異(Sendobry等，Br.J.Pharm.，120，1199-1206，(1997))。15-脂肪氧化酶參與動脈粥樣硬化的證據(jù)來自對靶缺失Alox15(Alox15-/-)的小鼠的研究。這些Alox15剔除小鼠最初顯示出具有較小的表型差異，包括5-LO活性增加(Sun和Funk，J.Biol.Chem.，271，24055-24062，(1996))。然而，Alox15的破壞大大減少了apoE缺陷(apoE-/-)的動脈粥樣硬化傾向小鼠的動脈粥樣硬化損害(Cyrus等，J.Clin Invest.，103，1597-1604，(1999))。
盡管5-LO已經(jīng)包含在幾種疾病的發(fā)病機理中，但是小鼠或人15-脂肪氧化酶的生物學(xué)作用尚未明確確定，15-脂肪氧化酶抑制劑的人臨床效用也沒有確立。尤其，以前也沒有發(fā)現(xiàn)15-脂肪氧化酶抑制劑治療人骨質(zhì)疏松癥和/或骨關(guān)節(jié)炎的效用。
骨質(zhì)疏松癥是由成熟骨中骨礦物質(zhì)密度降低引起的并導(dǎo)致微小創(chuàng)傷后的骨折。該疾病很普遍并且具有巨大的經(jīng)濟影響。最常見的骨折發(fā)生在脊椎、橈骨遠端和髖部。估計三分之一的年齡65歲以上的女性人群會有部分由骨質(zhì)疏松癥引起的脊椎骨折。而且，每三位女性中大約有一位和每六位男性中有一位可能因為年齡過大發(fā)生髖部骨折。
已經(jīng)鑒定了骨損失的兩個不同階段。一個是緩慢、年齡相關(guān)的過程，兩性都發(fā)生并且在大約35歲開始。這個階段在兩性中具有相似比例并導(dǎo)致類似量的皮質(zhì)和松質(zhì)(海綿或網(wǎng)格樣)骨損失。皮質(zhì)骨主要在附肢骨骼，而松質(zhì)骨集中在中軸骨骼，尤其是脊椎，以及長骨末端。已知年齡相關(guān)骨損失引起的骨質(zhì)疏松癥是II型骨質(zhì)疏松癥。
另一類型的骨損失是加速的，見于絕經(jīng)后女性和由雌激素不足引起。這個階段引起不成比例的松質(zhì)骨損失。已知由于雌激素減少引起的骨質(zhì)疏松癥是I型骨質(zhì)疏松癥。I型骨質(zhì)疏松癥的主要臨床表現(xiàn)是脊椎、髖部和前臂骨折。這些表現(xiàn)的骨骼部位包含大量脊柱骨。I型骨質(zhì)疏松癥的骨更新通常高。骨再吸收增加，但是補償性骨形成不足。骨質(zhì)疏松癥也與使用皮質(zhì)類固醇、固定術(shù)或長期臥床休息、酒精中毒、糖尿病、性腺毒性化療、高泌乳素血癥、神經(jīng)性厭食癥、原發(fā)和繼發(fā)閉經(jīng)、移植性免疫抑制和卵巢切除術(shù)有關(guān)。
認為骨質(zhì)疏松癥中骨損失的機制包括骨骼自身更新過程失衡。這個過程術(shù)語稱為骨質(zhì)重建。它發(fā)生在一系列分散的活動囊(pocket)中。這些囊自發(fā)出現(xiàn)在給定骨表面上的骨基質(zhì)內(nèi)作為骨再吸收的部位。破骨細胞(骨溶解或再吸收細胞)負責(zé)一部分大小通常恒定的骨再吸收。這個再吸收過程之后成骨細胞(骨形成細胞)出現(xiàn)，它們接著用新骨填充破骨細胞留下的腔隙。
在健康成年受試者中，破骨和成骨作用使得骨形成和骨再吸收處于平衡。然而，在骨質(zhì)疏松癥中，發(fā)生骨質(zhì)重建失衡，導(dǎo)致骨以比其損失速度慢的速度被替換。盡管這種失衡在某種程度上隨他們衰老而發(fā)生在多數(shù)個體中，但是在卵巢切除術(shù)后，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中，或在醫(yī)源性情況中如由使用皮質(zhì)類固醇或免疫抑制劑造成的那些情況中，它嚴(yán)重得多并且發(fā)生在較小年齡。
已提出各種方法來增加罹患骨質(zhì)疏松癥的人的骨質(zhì)量，包括給予雄激素、氟化鹽和甲狀旁腺激素和改進形式的甲狀旁腺激素。也提出雙磷酸鹽、降鈣素、鈣、1，25-二羥維生素D3和/或雌激素，單獨或組合，可以有效保持現(xiàn)存的骨質(zhì)量。
本發(fā)明基于15-脂肪氧化酶抑制劑能夠增加骨形成和/或增加骨增積和增加骨折愈合的發(fā)現(xiàn)。這些分子可單獨或與抑制骨再吸收和/或增加骨形成的另外試劑，尤其是合成代謝試劑組合遞送。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及減少受試者的骨損失的方法。該方法包括給受試者施予藥物有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及增加骨礦物質(zhì)密度的方法，它包括給受試者施予有效量的藥物可接受15-脂肪氧化酶抑制劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及診斷受試者骨損失易感性的方法，該方法包括檢測人染色體17上的多態(tài)性，尤其是檢測15-脂肪氧化酶基因中的多態(tài)性。
仍在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及篩選減少骨損失或增加骨礦物質(zhì)密度的化合物的方法，其通過使人間充質(zhì)干細胞接觸15-脂肪氧化酶抑制劑并確定細胞分化為參與骨形成的細胞。
參考下列詳細說明書和附圖，本發(fā)明的這些和其它發(fā)明將變得明顯。此外，這里列出了各種參考文獻，它們更詳細地描述了某些方法或組合物，因此其全部內(nèi)容并入作為參考。
除非另外指出，本發(fā)明的實施將采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。文獻中充分解釋了這種技術(shù)。見如T.E.Creighton，ProteinsStructures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等，Molecular CloningALaboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan主編，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，PennsylvaniaMack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。
這里引用的所有出版物、專利和專利申請，無論上述還是下述，因此其全部內(nèi)容并入作為參考。
在描述本發(fā)明時，將采用下列術(shù)語，并意欲如下所示定義。
“骨損失”是指骨形成與骨再吸收的比例失衡導(dǎo)致患者比期望的骨要少。骨損失可以由骨質(zhì)疏松癥、骨切開術(shù)、牙周炎或修復(fù)術(shù)松弛引起。骨損失也可以由繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥引起，包括糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥、甲狀腺功能亢進誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥、固定術(shù)誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥、肝素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥或免疫抑制誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥?？梢岳缡褂孟率龉堑V物質(zhì)密度測定術(shù)監(jiān)測骨損失。
術(shù)語“有效量”或“藥用有效量”是指無毒但足夠提供期望生物學(xué)結(jié)果的試劑的量。那個結(jié)果可以減少和/或減輕跡象、癥狀或病因，或任何其它期望的生物學(xué)系統(tǒng)改變。例如，治療應(yīng)用“有效量”是提供骨折修復(fù)的臨床愈合速度明顯增加；骨質(zhì)疏松癥中骨損失逆轉(zhuǎn)；軟骨缺陷或紊亂逆轉(zhuǎn)、預(yù)防或延遲骨質(zhì)疏松癥開始、刺激和/或增加骨折不愈合和內(nèi)脫位骨質(zhì)疏松癥中的骨形成；增加和/或加速骨長入假體裝置；和牙齒缺陷修復(fù)所需的包含這里的活性化合物的組合物的量。任何個體病例的適當(dāng)“有效”量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用常規(guī)實驗確定。
“增加骨增積”是指給予本發(fā)明15-脂肪氧化酶的受試者的骨累積增加超過沒有給予15-脂肪氧化酶抑制劑的可比較的受試者的骨累積。這種增加骨增積這里典型地通過測定骨礦物質(zhì)密度(BMD)來確定。例如，使用動物模型可以確定骨增積，如卵巢切除的小鼠、狗等等。檢測的化合物給予該動物，測定I型或II型骨質(zhì)疏松癥通常減少的骨中的骨礦物質(zhì)密度(BMD)，如附肢和/或中軸骨骼的骨，尤其是包括脊椎的脊柱，以及長骨遠端，如股骨、橈骨中段和橈骨遠端。確定BMD的幾種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以使用雙能量X-射線吸光分析或定量計算的X線斷層照相術(shù)等等進行BMD測定。(見實施例)。類似地，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法確定骨形成增加。例如，可以在來自腰椎和遠端股骨干骺端的四環(huán)素標(biāo)記的松質(zhì)骨上使用定量數(shù)字化形態(tài)測定法(見如Ling等，Endocrinology(1999)1405780-5788)進行骨形成速度(BFR)的動力學(xué)測定?？晒┻x擇地，可以估計骨形成標(biāo)志，如堿性磷酸酶活性和血清骨鈣素水平來間接確定是否發(fā)生了骨形成增加(見Looker等，Osteoporosis International(2000)11(6)467-480)。
“骨形成增加”是指給予本發(fā)明15-脂肪氧化酶抑制劑的受試者中骨形成的量增加超過沒有給予15-脂肪氧化酶抑制劑的受試者中骨形成速度。這里使用如定量數(shù)字化形態(tài)測定法，以及通過如上所述的骨形成的其它標(biāo)志確定這種骨形成增加。
“15-脂肪氧化酶抑制劑”是指以小于1μM，優(yōu)選低于100nM的IC50抑制15-脂肪氧化酶的化合物?？梢杂贸Ｒ?guī)方法確定IC50。一個特定方法是比色法，其中推測的抑制劑與15-脂肪氧化酶預(yù)溫育大約10分鐘，隨后添加亞油酸底物另外10分鐘。在pH 5的氯化血紅素存在下，通過將氫過氧化脂類的還原和N-苯甲?；?無色美藍偶合來定量產(chǎn)物13-HPODE。
氧化亞甲藍的吸光度與15-脂肪氧化酶形成的13-HPODE的量成正比，并可以在抑制劑存在和缺乏下測定。這是終點試驗，在″ASpectrophotometric Microtiter-Based Assay for the Detection of HydroperoxyDerivatives of Linoleic Acid″，Analytical Biochemistry，201，375-380(1992)；Bruce J.Auerbach，John S.Kiely和Joseph A.Cornicelli中更詳細描述。其它測定包括通過分光光度測定234nm下偶合二烯形成來確定起始酶反應(yīng)速度的那些。
這里使用的術(shù)語“治療(treat)”或“治療(treatment)”可以互換使用，意思是指骨損失癥狀發(fā)展延遲和/或預(yù)期將發(fā)展或發(fā)展這種癥狀的嚴(yán)重性降低。該術(shù)語進一步包括預(yù)防另外的癥狀，改善或預(yù)防癥狀之下的代謝原因，和/或促進骨生長。
“藥物可接受”或“藥理學(xué)可接受”是指不是生物性的或不期望有的，即該物質(zhì)可以給予個體，不引起任何不期望的生物學(xué)作用或不以有害方式與任何其中所含的組合物成分相互作用。
“生理pH”或“生理范圍中的pH”是指在大約7.2至8.0，包括7.2和8.0的范圍中包含的pH，更典型地在大約7.2至7.6，包括7.2和7.6的范圍中包含的pH。
這里使用的術(shù)語“受試者”包括哺乳動物和非哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限于哺乳動物類的任何成員人、非人靈長目如黑猩猩，和其它類人猿和猴類；農(nóng)畜如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜如兔子、狗和貓；實驗動物包括嚙齒動物，如大鼠，小鼠和豚鼠等等。非哺乳動物的實例包括但不限于鳥、魚等等。該術(shù)語不指示特定的年齡或性別。
這里使用的“多態(tài)性”是指在人群中出現(xiàn)兩個或更多遺傳學(xué)確定的可替換序列或等位基因。多態(tài)性標(biāo)記或位點是發(fā)生趨異的位點。優(yōu)選的標(biāo)記具有至少兩個等位基因，每個以大于1％，更優(yōu)選大于10％或20％人群的頻率發(fā)生。多態(tài)性可以包括一個或更多堿基改變、插入、重復(fù)或缺失。多態(tài)性位點可以小如一個堿基對。多態(tài)性標(biāo)記包括限制性片段長度多態(tài)性、可變量的串聯(lián)重復(fù)(VNTR′s)、高變區(qū)、微衛(wèi)星、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、簡單序列重復(fù)和插入元件。
單核苷酸多態(tài)性(SNP)發(fā)生在單一核苷酸占據(jù)的一個多態(tài)性位點，它是等位基因序列之間變異的位點。該位點通常在等位基因高度保守序列(如在人群中低于1/100或1/1000成員有變化的序列)之前和之后。單核苷酸多態(tài)性通常由于在多態(tài)性位點一個核苷酸置換另一個產(chǎn)生。轉(zhuǎn)換是一個嘌呤被另一個嘌呤或一個嘧啶被另一個嘧啶取代。易位是一個嘌呤被一個嘧啶取代或反之亦然。單核苷酸多態(tài)性也可以由相對于參照等位基因核苷酸缺失或核苷酸插入產(chǎn)生。
這里使用的術(shù)語“前體細胞”是指未完全分化或指定分化途徑，和通常不表現(xiàn)如同成熟、完全分化細胞的標(biāo)記或功能的細胞。
這里使用的術(shù)語“間質(zhì)細胞”或“間充質(zhì)干細胞”是指能夠分裂很多次，和其后代將產(chǎn)生骨骼組織，包括軟骨、骨、腱、韌帶、骨髓基質(zhì)和結(jié)締組織的多潛能祖細胞(見A.Caplan J.Orthop.Res.(1991)9641-50)。
這里使用的術(shù)語“成骨細胞”包括成骨細胞和成骨細胞前體細胞。
這里使用的“數(shù)量性狀位點”(QTL)是指表型測定，如骨礦物質(zhì)密度，它連續(xù)分布并可以用多基因確定。QTL是染色體上的一個位點，其等位基因影響數(shù)量性狀。
本發(fā)明中使用的化合物是抑制或降低15-脂肪氧化酶活性的化合物。在本文中，抑制和降低酶活性是指相對于其中酶、細胞或受試者沒有用檢測化合物處理的對照實驗，測定的活性水平較低。在特定實施方案中，測定活性的抑制或降低是至少降低或抑制10％。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會特定應(yīng)用可以優(yōu)選測定活性降低或抑制至少20％，50％，75％，90％或100％或10％和100％之間的任何整數(shù)。典型地，本發(fā)明中使用的15-脂肪氧化酶抑制劑將具有低于1μM的IC50，優(yōu)選低于100nM。
本發(fā)明部分基于15-脂肪氧化酶是骨質(zhì)量的重要調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)。尤其是，小鼠中100個微衛(wèi)星標(biāo)記的基因組掃描鑒定到染色體1，2，4和11上骨損失紊亂的易感性位點。基因表達的差異，尤其是染色體11上編碼的基因，鑒定到編碼15-脂肪氧化酶的基因表達的實質(zhì)差異，因此將15-脂肪氧化酶的表達與較低的骨礦物質(zhì)密度聯(lián)系起來。
骨質(zhì)量峰值是骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險的主要決定因素。家族和雙胞胎研究表明遺傳因素調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)密度(BMD)(綜述于Stewart和Ralston，J.Endocr.，(2000)166235-245)。這里發(fā)明人利用小鼠遺傳模型來鑒定控制BMD的位點。一個兩步方法用于鑒定調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)密度的基因組區(qū)域。最初，計算方法和微衛(wèi)星標(biāo)記用于掃描動物單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫，預(yù)知有助于獲得和維持骨骼質(zhì)量的染色體區(qū)域(實施例1)。隨后，動物模型用于鑒定和驗證有助于獲得和維持骨骼質(zhì)量的基因中的突變(實施例2)和用于表明15-脂肪氧化酶基因的破壞引起B(yǎng)MD增加(實施例4)，由此鑒定15-脂肪氧化酶是參與調(diào)節(jié)骨質(zhì)量的基因。
抑制15-脂肪氧化酶活性和預(yù)防骨再吸收或促進骨形成的化合物為努力治療骨質(zhì)疏松癥提供了重要的益處。抑制15-脂肪氧化酶活性的化合物可以用在治療骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎的方法中，其是通過抑制破骨骨再吸收或通過刺激成骨細胞分化和刺激新骨形成。實施例3表明15-脂肪氧化酶抑制劑體外促進人間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的能力。實施例4表明15-脂肪氧化酶基因的完全破壞在體內(nèi)導(dǎo)致BMD增加。實施例5表明在體內(nèi)模型中15-脂肪氧化酶抑制劑促進骨形成的能力。
根據(jù)本發(fā)明，15-脂肪氧化酶抑制劑可以用于制備減少哺乳動物受試者骨損失的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制劑的藥物。因此，本發(fā)明提供了減少哺乳動物受試者骨損失的方法，該方法包括給受試者施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑。優(yōu)選，骨損失與骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、Paget′s疾病或牙周病有關(guān)。更優(yōu)選，骨損失與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。
對此更多，根據(jù)本發(fā)明，15-脂肪氧化酶抑制劑可以用于制備增加哺乳動物骨礦物質(zhì)密度的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制劑的藥物。因此，本發(fā)明也提供了增加哺乳動物骨礦物質(zhì)密度的方法，通過給哺乳動物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明，15-脂肪氧化酶抑制劑可以用于制備治療哺乳動物骨質(zhì)疏松癥的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制劑的藥物。因此，本發(fā)明提供了治療哺乳動物骨質(zhì)疏松癥的方法，通過給哺乳動物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑。
此外，15-脂肪氧化酶抑制劑可以用于制備促進人間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制劑的藥物，來增加所述人的成骨細胞。因此，本發(fā)明提供了促進人間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的方法，包括給該人施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑來增加所述人的成骨細胞。優(yōu)選，15-脂肪氧化酶抑制劑具有低于1μM的IC50。
用15-脂肪氧化酶抑制劑進行的治療可以用于治愈骨折和骨切開，包括愈合性和不愈合性骨折。本發(fā)明方法可治療的各種骨折包括創(chuàng)傷性和骨質(zhì)疏松性骨折，如髖部、股骨頸、腕、脊椎、脊柱、肋骨、胸骨、喉和氣管、橈骨/尺骨、脛骨、髕骨、鎖骨、骨盆、肱骨、小腿、手指和腳趾、面部和踝骨折。這里公開的方法可以促進愈合速度以及促進否則保持不愈合骨折的骨折愈合。鑒定為處于骨折風(fēng)險的患者的預(yù)防性治療也可以降低那個患者的骨折風(fēng)險。
因此，15-脂肪氧化酶抑制劑可以用于制備降低哺乳動物骨折發(fā)生率的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制劑的藥物。因此，本發(fā)明提供了降低哺乳動物骨折發(fā)生率的方法，包括給哺乳動物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑。
此外，15-脂肪氧化酶抑制劑可以用于制備治愈哺乳動物骨折的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制劑的藥物。因此，本發(fā)明也提供了治愈哺乳動物骨折的方法，包括給哺乳動物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制劑。
優(yōu)選，以上描述的方法和用途的哺乳動物是人。更優(yōu)選，以上描述的15-脂肪氧化酶抑制劑具有低于1μM的IC50。
已知幾種15-脂肪氧化酶抑制劑，它們可以在主題方法中發(fā)現(xiàn)用途。該抑制劑包括合成的有機分子，植物提取物和其它天然產(chǎn)物，和抗15-脂肪氧化酶的抗體。Cornicelli JA，Trivedi BK.15-lipoxygenase and itsinhibitiona novel therapeutic target for vascular disease.[綜述][113篇參考文獻].Current Pharmaceutical Design 1999；5(1)11-20(描述了各種咖啡酸衍生物、炔丙基醚、兒茶酚和苯并硫代吡喃吲哚(benzothiopyranoindoles))；Cornicelli JA.15-lipoxygenase inhibitors as antiatherosclerotic agents.IDrugs1998；1(2)206-213；Fleischer R，F(xiàn)rohberg P，Buge A，Nuhn P，Wiese M.QSAR analysis of substituted 2-phenylhydrazonoacetamides acting asinhibitors of 15-lipoxygenase.Quant Struct-ActRelat 2000；19(2)162-172；Kuhn H.Inhibitors of 12/15-lipoxygenase are potential anti-atheroscleroticdrugs.Curr Opin Anti-Inflammatory Immunomodulatory Invest Drugs 1999；1(3)227-237；Mogul R，Johansen E，Holman TR.Oleyl sulfate revealsallosteric inhibition of soybean lipoxygenase-1 and human 15-lipoxygenase.Biochemistry 2000；39(16)4801-4807；Sexton K，Roark WH，Sorenson R，Cornicelli J，Sekerke C，Welch K.Thiourea inhibitors of 15-lipoxygenase.Abstracts of Papers American Chemical Society 1999；218(1-2)MEDI0；TaitBD，Dyer RD，Auerbach BJ，Bornemeier D，Guilds-Zamarka L，Oxender M等Catechol based inhibitors of 15-lipoxygenase.Bioorganic & MedicinalChemistry Letters 1996；6卷(1)93-96；Moreau RA，Agnew J，Hicks KB，Powell MJ.Modulation of lipoxygenase activity by bacterial hopanoids.Journal of Natural Products 1997；60卷(4)397-398；219th National Meetingof the American Chemical Society(2000)，Poster BIOL-15.作者E-N-Jonsson和T-R-Holman.University of California，Santa Cruz，CA(描述了從海綿中分離的15-脂肪氧化酶抑制劑)；和Lyckander IM，Malterud KE.Lipophilic flavonoids from Orthosiphon spicatus as inhibitors of15-lipoxygenase.Acta Pharm Nord 1992；4(3)159-166。此外，Conner等的美國專利6,268,387中的是15-脂肪氧化酶抑制劑硫脲和苯甲酰胺化合物(如3-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基-苯甲酰胺化合物3代表)，以及2-苯基-苯并[d]異硒唑-3-酮(ebselen)，6，11-二氫-5-硫雜-11-吖-苯并[a]氟(這里術(shù)語稱為化合物2)和3-(2-辛-1-炔-苯基)-丙烯酸化合物4代表的苯基炔化合物在這里描述的方法中也有用。WO01/96298(并入作為參考)中公開的化合物也有效，包括化合物6，[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺?；鵠-氨基甲酸-異丁酯。
另外的15-脂肪氧化酶抑制劑包括下面所示的那些；
在222nd National Meeting of the American Chemical Society，芝加哥，伊利諾州，USA，26-308月，2001.墻報，MEDI 270中描述。
2)PD148104 在218th ACS(New Orleans)，1999，MEDI 200中描述。
3)來自Parke Davis(現(xiàn)在的Prizer)的PD1461764)WO 92/1682中描述的A 78773(Abbott)。
5)QA-208-199(Novartis) ，在6th Int Conf Prostaglandins(佛羅倫薩)，1986，328中描述。
本發(fā)明的相關(guān)方面涉及增加骨形成的15-脂肪氧化酶抑制劑和其它活性劑如二膦酸鹽、雌激素、SERMS(選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、降鈣素或合成代謝治療的聯(lián)合治療。二膦酸鹽的實例包括阿侖膦酸鹽，伊班膦酸鹽，帕米膦酸鹽，依羥乙磷酸鹽和利塞膦酸鹽。SERMS的實例包括雷洛昔芬，二氫雷洛昔芬和拉索昔芬。降鈣素包括人和鮭魚降鈣素。合成代謝制劑包括甲狀旁腺激素(PTH)，例如hPTH(1-34)，PTH(1-84)和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)及其類似物?！癕ono-and Bicyclic Analogs of ParathyroidHormone-Related Protein.1.Synthesis and Biological Studies，”MichaelChorev等Biochemistry，363293-3299(1997)和“Cyclic analogs of PTHand PTHrP，”WO 96/40193和美國專利5,589,452和WO 97/07815描述了PTHrP的特定類似物。其它活性劑可以在15-脂肪氧化酶抑制劑之前或之后并行給予，和可以通過不同的傳遞方法給予。優(yōu)選，首先給予15-脂肪氧化酶抑制劑。給藥時期可以是任何長度，但是典型的范圍從六至二十四個月。這個治療接著跟隨用抗再吸收劑治療，如二膦酸鹽、SERM、降鈣素或激素替代療法。
因此，優(yōu)選，15-脂肪氧化酶抑制劑可以如上文所述使用，包括另外的活性劑。因此，上文描述的方法優(yōu)選包括另外的活性劑。更優(yōu)選，用途或方法中包括的所述活性劑可有效調(diào)節(jié)從骨再吸收鈣。更優(yōu)選，所述活性劑選自由雌激素、降鈣素、二膦酸鹽和IGF組成的組。
在優(yōu)選實施方案中，上文描述的用途和方法中的15-脂肪氧化酶抑制劑選自合成有機分子、天然產(chǎn)物和抗15-脂肪氧化酶抑制劑的抗體組成的組。在更優(yōu)選實施方案中，15-脂肪氧化酶抑制劑選自3-(2-壬-1-炔基苯基)-丙酸，6，11-二氫-5-硫雜-11-吖-苯并[a]芴，3-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺，反-3-(2-辛-1-炔基-苯基)-丙烯酸和[[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺?；鵠-氨基甲酸-異丁酯組成的組。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括給予治療有效量的反義寡核苷酸，它具有能夠與編碼15-脂肪氧化酶的基因組DNA或mRNA分子的任何序列特異性結(jié)合的序列，使得阻止15-脂肪氧化酶mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯?！胺戳x”是指含有核酸序列的成分，該核酸序列與特殊核酸序列的“有意義”鏈互補。一旦被導(dǎo)入細胞，該互補核苷酸結(jié)合細胞產(chǎn)生的內(nèi)源序列形成雙螺旋和阻斷轉(zhuǎn)錄或翻譯。見例如Agrawal，S.主編(1996)AntisenseTherapeutics，Humana Press Inc.，Totawa NJ；Alama等(1997)Pharmacol.Res.36171-178；Crooke，S.T.(1997)Adv.Pharmacol.401-49；和Lavrosky等(1997)Biochem.Mol.Med.62(1)11-22。反義序列可以是任何核酸材料，包括DNA、RNA或任何核酸模擬物或類似物。見例如Rossi等(1991)Antisense Res.Dev.1285-288；Pardridge等(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.925592-5596；Nielsen和Haaima(1997)Chem.Soc.Rev.9673-78；和Lee等(1998)Biochemistry37900-1010。反義序列的傳遞可以用各種方法完成，如通過使用重組載體細胞內(nèi)傳遞。
大約15至25個核酸堿基的反義寡核苷酸是典型優(yōu)選的，因為它們?nèi)菀缀铣刹⑶夷軌虍a(chǎn)生期望的抑制作用。反義寡核苷酸的分子類似物也可以用于這個目的并且可能具有另外的優(yōu)點如在制藥產(chǎn)品有益的穩(wěn)定性、分布或毒性有限。此外，化學(xué)反應(yīng)基團，如連鐵二乙胺基四乙酸(EDTA-Fe)可以與反義寡核苷酸連接，導(dǎo)致雜交部位RNA的切割。反義方法抑制基因體外翻譯的這些和其它用途是本領(lǐng)域熟知的。見例如Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem.172289。
盡管很多這里描述和已知很多15-脂肪氧化酶抑制劑，但是應(yīng)該理解很多其它的可以用于主題方法。這里描述的方法意欲包括目前已知的15-脂肪氧化酶抑制劑的用途以及隨后發(fā)現(xiàn)的那些。這里描述的測定和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些能夠容易鑒定和開發(fā)有效預(yù)防或治療骨損失的其它15-脂肪氧化酶抑制劑。
如實施例表明，在染色體11，對應(yīng)于15-脂肪氧化酶基因的等位基因位置中發(fā)現(xiàn)基因異?；虻任换颉Ｒ虼?，15-脂肪氧化酶的抑制和誘導(dǎo)在各種情況下有應(yīng)用?？赡芡ㄟ^抑制細胞內(nèi)15-脂肪氧化酶，可以減少骨更新和因此增加骨礦物質(zhì)密度和骨質(zhì)量。因此，15-脂肪氧化酶的抑制可以用于治療或預(yù)防骨過度再吸收，如骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)生的骨過度再吸收的方法。
本發(fā)明的15-脂肪氧化酶抑制劑也可以用于刺激骨形成細胞或它們的前體的生長，或誘導(dǎo)骨形成細胞前體的分化，在體外或非體內(nèi)。更特別地，15-脂肪氧化酶抑制劑可有效刺激含骨髓間充質(zhì)細胞的細胞群，由此增加那個細胞群中成骨細胞的數(shù)量。在優(yōu)選方法中，在用15-脂肪氧化酶抑制劑處理前或后，從該細胞群取出造血細胞。通過實施這種方法，可以擴充成骨細胞。擴充的成骨細胞可以輸注(或再輸注)到需要它的脊椎動物受試者。例如，受試者自己的間充質(zhì)干細胞可以體外接觸本發(fā)明的化合物，所得成骨細胞可以輸注或?qū)蚴茉囌邇?nèi)的期望部位，在那里可發(fā)生成骨細胞的更多增生和/或分化，沒有免疫排斥。備選地，暴露于15-脂肪氧化酶抑制劑的細胞群可以使人胎兒的成骨細胞或成骨細胞永生。如果這種細胞輸注或植入到脊椎動物受試者，免疫保護這些非自身的細胞，或免疫抑制(優(yōu)選局部)受體來增強移植和骨或軟骨修復(fù)是有益的。
治療的有效性可以接著監(jiān)測上文所述的方法和用途在受試者中的功效的方法，包括測定受試者中15-脂肪氧化酶的水平，其在本發(fā)明中也已提供。
可以使用鑒定也可以預(yù)防骨損失和/或促進骨形成的15-脂肪氧化酶抑制劑種類的幾種方法。一種用于鑒定抑制15-脂肪氧化酶活性的化合物的方法包括在15-脂肪氧化酶活性相容的緩沖液中使細胞、組織或優(yōu)選細胞提取物或含15-脂肪氧化酶的其它制劑接觸幾種已知濃度的檢測化合物。用酶產(chǎn)物的定量測定每種濃度的檢測化合物的15-脂肪氧化酶活性水平并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定該化合物的IC50(觀察到樣品制劑觀察到的活性降至其起初或?qū)φ罩档囊话霑r檢測化合物的濃度)。確定本發(fā)明化合物抑制15-脂肪氧化酶的濃度的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且基于這里公開的內(nèi)容將很明顯可以使用?？梢杂糜阼b定15-脂肪氧化酶抑制劑的特殊測定包括美國專利6,268,387B1和5,958,950(兔網(wǎng)狀細胞測定)和美國專利4,623,661(RBL-1細胞中放射性標(biāo)記的花生四烯酸)描述的那些。
例如，一旦配體結(jié)構(gòu)被確定，通?？梢园l(fā)現(xiàn)拮抗劑?；谑褂蒙矸磻?yīng)性細胞的高度自動測定方法的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)可能進行潛在配體類似物的檢測。尤其是，通過使用這里描述的篩選技術(shù)將發(fā)現(xiàn)新的激動劑和拮抗劑。
在另一個方法中，基于趨化因子分子形狀的結(jié)構(gòu)研究的理性藥物設(shè)計，其它效應(yīng)器或類似物，或受體可以用于鑒定三維結(jié)構(gòu)與15-脂肪氧化酶的活性部位互補的化合物。用各種技術(shù)包括分子機械計算法、分子動力學(xué)計算法、約束分子動力學(xué)計算法，其中NMR光譜學(xué)確定約束、距離幾何學(xué)，其中用NMR光譜學(xué)部分確定距離矩陣、X線衍射，或中子衍射技術(shù)來確定這些化合物。所有這些技術(shù)的情況下，可以在已知與15-脂肪氧化酶相互作用的任何配體存在或缺乏下確定結(jié)構(gòu)。
這種計算機程序包括但不限于AMBER(得自加利福尼亞大學(xué)，舊金山)，CHARMM(Chemistry at HARvard Molecular Mechanics，得自哈佛大學(xué))，MM2，SYBYL(Trypos Inc.)，CHEMX(Chemical Design)，MACROMODEL，GRID(Molecular Discovery Ltd)，和Insight II(Accelryl)。這種程序預(yù)期對確定兩個分子之間的相互作用有效，這兩個分子是分離的，或被溶劑分子如水分子包圍的，或使用逼近溶劑化相互作用分子的作用的計算。可以通過手工，視覺檢查，或使用產(chǎn)生大量可能方向的其它計算機程序確定兩者的相對方向。計算機程序的實例包括但不限于DOCK和AutoDOCK。使用該計算機程序檢測每個方向互補性的程度。因此，可以設(shè)計能夠抑制15-脂肪氧化酶的新化合物。
鑒定可以抑制15-脂肪氧化酶的化合物的另一種方法包括使用技術(shù)如UV/VIS光譜學(xué)、旋光測定術(shù)、CD或ORD光譜學(xué)、IR或Raman光譜學(xué)、NMR光譜學(xué)、熒光光譜學(xué)、HPLC、凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、滲析、折射法、電導(dǎo)分析法、原子力顯微鏡檢查、極譜法、dielectometry、量熱法、溶解度、EPR或質(zhì)譜分析術(shù)。這些方法的應(yīng)用可以是直接的，其中直接測定化合物與15-脂肪氧化酶的相互作用，或可以是間接的，其中具有有效光譜性能的特定試劑用作其它化合物結(jié)合15-脂肪氧化酶的能力的探針；例如，通過轉(zhuǎn)移或通過熒光淬火。
因此，本發(fā)明提供了鑒定增加骨礦物質(zhì)密度的化合物的方法，該方法包括化合物接觸15-脂肪氧化酶并確定該化合物是否抑制15-脂肪氧化酶的活性。優(yōu)選，所述方法進一步包括在證明該化合物對骨形成作用的功能性試驗中檢測化合物。更優(yōu)選，該功能性試驗包括使化合物接觸人間充質(zhì)干細胞并確定細胞分化為骨形成細胞。在另一個更優(yōu)選實施方案中，功能性試驗包括將該化合物給予非人動物并測定骨形成的指數(shù)。在最優(yōu)選實施方案中，測定的指數(shù)是骨礦物質(zhì)密度。在另一個最優(yōu)選實施方案中，該指數(shù)是骨的生物力學(xué)參數(shù)。
在另一個最優(yōu)選實施方案中，該功能性試驗包括使該化合物接觸人間充質(zhì)干細胞并確定細胞分化為骨形成細胞，其中確定細胞分化包括進行堿性磷酸酶試驗、鈣試驗、總DNA制備試驗或它們的組合。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定增加骨礦物質(zhì)密度的化合物的方法，該方法包括使15-脂肪氧化酶抑制劑接觸人間充質(zhì)干細胞并確定細胞分化為骨形成細胞。優(yōu)選，確定細胞分化包括進行堿性磷酸酶試驗、鈣試驗、總DNA制備試驗或它們的組合。
可以隨后測定由此鑒定或設(shè)計的15-脂肪氧化酶抑制劑預(yù)防骨損失和/或促進骨形成的能力。在一個實施方案中，使用上面討論的基于計算機的方法。在另一種方法中，檢測該化合物調(diào)節(jié)骨損失的已知靶的能力，例如，雌激素受體、腫瘤壞死因子受體、整合蛋白受體等等。仍在另一種方法中，檢測該化合物將干細胞分化為骨細胞的能力。
這里描述的方法使用藥物組合物，其包含上述分子和一種或多種藥物可接受載體，和任選其它治療和/或預(yù)防成分。這種載體包括液體如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、乙醇等。非液體制劑的合適載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的。藥物可接受鹽可以用于本發(fā)明的組合物，并且包括，例如，無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴化物、磷酸鹽、硫酸鹽等等；和有機酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。在Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版(Easton，PennsylvaniaMack PublishingCompany，1990)中可得到藥物可接受賦形劑和鹽的充分討論。
另外，輔助物質(zhì)，如濕潤或乳化劑，生物緩沖物質(zhì)，表面活性劑等等可以存在于這種載體中。生物緩沖液幾乎可以是藥理學(xué)可接受和提供具有期望pH，即生理可接受范圍內(nèi)的pH的制劑的任何溶液。緩沖液的實例包括鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、Tris緩沖鹽水、Hank’s緩沖鹽水等等。
根據(jù)期望的給藥方式，藥物組合物可以是固體、半固體或液體劑形，例如，片劑、栓劑、丸劑、膠囊、散劑、液體、混懸劑、乳膏、軟膏、洗劑或類似，優(yōu)選以適合精確劑量單一給藥的單位劑量形式。該化合物將包括有效量所選藥物與藥物可接受載體，和另外，可以包括其它藥物制劑、佐劑、稀釋劑、緩沖液等。
對于固體組合物，常規(guī)無毒固體載體包括例如制藥級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、鄰磺酰苯甲酰亞胺鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等等?？梢岳缤ㄟ^溶解、分散等這里描述的活性化合物和任選含藥物佐劑的賦形劑，例如，水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等等，由此形成溶液或懸液來制備可給藥的液體藥物組合物。如果需要，待給予的藥物組合物也可以含少量無毒輔助物質(zhì)如濕潤或乳化劑，pH緩沖劑等等，例如，醋酸鈉、單月硅酸脫水山梨醇、醋酸鈉三乙醇胺、油酸三乙醇胺等。制備這種劑量形式的實際方法是已知的，或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員將很明顯；例如，見上面引用的Remington’s Pharmaceutical Sciences。
對于口服給藥，該組合物將通常采用片劑、膠囊、軟凝膠膠囊形式或可以是水性或非水性溶液、混懸劑或糖漿。片劑和膠囊是優(yōu)選的口服給藥形式。口服使用的片劑和膠囊將通常包括一種或多種普遍使用的載體如乳糖和玉米淀粉。也可以典型添加潤滑劑，如硬脂酸鎂。當(dāng)使用液體懸液時，該活性試劑可以與乳化和懸浮劑組合。如果需要，也可以添加調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。并入這里的口服制劑的其它任選成分包括但不限于防腐劑、懸浮劑、增稠劑等等。
腸胃外制劑可以制備成常規(guī)形式，如液體溶液或混懸劑，適合增溶的固體形式或注射前液體中的混懸劑，或如乳劑。優(yōu)選，使用適當(dāng)載體、分散劑或濕潤劑和懸浮劑，根據(jù)本發(fā)明已知技術(shù)配制無菌注射混懸劑。無菌注射制劑也可以是無菌注射液或無毒腸胃外可接受稀釋劑或溶劑的懸液?？梢允褂玫目山邮茌d體和溶劑是水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油、脂肪酯或多元醇常規(guī)可采用作為溶劑或懸浮介質(zhì)。此外，腸胃外給藥可以包括使用緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，使得維持劑量恒定水平。
可供選擇地，本發(fā)明的藥物組合物可以以直腸給藥的栓劑形式給予。這些可以通過該試劑與室溫下是固體但在直腸溫度下是液體并因此將在直腸中溶解而釋放藥物的合適的無刺激賦形劑混合來制備。這種物質(zhì)包括可可黃油、蜂蠟和聚乙二醇。
本發(fā)明的藥物組合物也可以通過鼻氣霧劑或吸入劑給予?？梢愿鶕?jù)藥物制劑領(lǐng)域的熟知技術(shù)制備這種組合物并可以制備成鹽水中的溶液，使用苯甲基醇或其它合適的防腐劑，吸收促進劑來增加生物利用度，推進劑如碳氟化合物或氮，和/或其它常規(guī)增溶或分散劑。
局部藥物傳遞的優(yōu)選制劑是軟膏和乳膏。軟膏是典型地基于凡士林或其它凡士林衍生物的半固體制劑。如本領(lǐng)域已知，含有所選活性劑的乳膏是粘液或半固體乳劑，水包油或油包水。乳膏基礎(chǔ)是可洗滌水，并含有油相、乳化劑和含水相。油相，有時也稱作“內(nèi)”相，通常包括凡士林和脂肪醇如十六烷基或硬脂酰醇；盡管不是必須，含水相通常體積超過油相，并通常含有濕潤劑。乳膏制劑中的乳化劑通常是非離子、陰離子、陽離子或兩性表面活性劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會，待使用的具體軟膏或乳膏基質(zhì)是提供最佳藥物傳遞的那些。如具有其它載體或媒介物(vehicle)，軟膏基質(zhì)應(yīng)該是惰性、穩(wěn)定、無刺激和不致敏的。
口腔給藥的制劑包括片劑、錠劑、凝膠等等?？晒┻x擇地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知可以使用經(jīng)粘膜傳遞系統(tǒng)實行口腔給藥。也可以通過皮膚或粘膜組織傳遞本發(fā)明的化合物，使用常規(guī)經(jīng)皮藥物傳遞系統(tǒng)即經(jīng)皮“貼片”，其中該試劑典型地包含在作為藥物傳遞裝置固定在身體表面的層狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。在這種結(jié)構(gòu)中，藥物組合物典型地包含在層或“貯庫”中，在背襯層之下。層狀裝置可以含有單一貯庫，或它可以含有多個貯庫。在一個實施方案中，該貯庫含有作為藥物傳遞期間將該系統(tǒng)固定到皮膚的藥物可接受接觸粘合物質(zhì)的聚合基質(zhì)。合適的皮膚接觸粘合物質(zhì)實例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等等?？晒┻x擇地，含藥物的貯庫和皮膚接觸粘合劑作為分開的不同的層存在，粘合劑位于貯庫之下，在這種情況下，貯庫可以是上述的聚合基質(zhì)，或它可以是液體或凝膠貯庫，或可以采用一些其它形式。在這些層壓品中的背襯層，它作為該裝置的上表面，起著層狀結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)元件的作用并給裝置提供更多柔韌性。選擇作為背襯層的物質(zhì)應(yīng)該基本上不滲透存在的活性劑和任何其它物質(zhì)。
藥物或治療有效量的組合物將傳遞給受試者。對不同的受試者精確的有效量會變化，其依賴于物種、年齡、受試者的大小和健康、被治療情況的性質(zhì)和程度、治療醫(yī)師的推薦和所選擇給予的療法和療法組合。因此，給定情況的有效量可以用常規(guī)實驗確定。為了本發(fā)明的目的，通常治療量將在至少一個劑量中大約0.05mg/kg至大約40mg/kg體重的范圍內(nèi)，更優(yōu)選大約05mg/kg至大約20mg/kg體重。在更大哺乳動物中，指示的日劑量可以從大約1mg至100mg，每天一次或多次，更優(yōu)選在大約10mg至50mg的范圍內(nèi)?？梢越o予該受試者如降低和/或減輕跡象、癥狀或疑似紊亂原因，或產(chǎn)生其它任何生物系統(tǒng)期望改變所需劑量一樣多的劑量。
可以使用上述任何制劑，或通過使用重組表達載體，用或不用載體病毒或顆粒，來完成多核苷酸的傳遞，如傳遞15-脂肪氧化酶反義寡核苷酸。這種方法是本領(lǐng)域熟知的，見如美國專利6,214,804；6,147,055；5,703,055；5,589,466；5,580,859；Slater等(1998)J.Allergy Clin.Immunol.102469-475。例如，可以使用各種病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺伴隨病毒載體完成多核苷酸序列的傳遞。見如Miller A.D.(1990)Blood76271；和Uckert和Walther(1994)Pharmacol.Ther.63323-347?？梢岳脕磉M行反義基因治療的載體包括但不限于腺病毒、皰疹病毒、牛痘，或優(yōu)選，RNA病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒?？捎糜趯⒍嗪塑账嵝蛄袀鬟f到靶細胞的其它基因傳遞機制包括膠體分散體和脂質(zhì)體衍生系統(tǒng)、人工病毒被膜，和本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的其它系統(tǒng)。見例如Rossi，J.J.(1995)Br.Med.Bull.51217-225；Morris等(1997)Nucl.Acids Res.252730-2736；和Boado等(1998)J.Pharm.Sci.871308-1315。例如，傳遞系統(tǒng)可以使用高分子復(fù)合物，微膠囊，微球體，珠和基于脂類的系統(tǒng)，包括水包油乳劑，膠束，混合膠束和脂質(zhì)體。
如上討論，藥物制劑可以含有一種或多種有效調(diào)節(jié)鈣體內(nèi)平衡的活性劑。另外的活性劑可以是但不限于雌激素、降鈣素、二膦酸鹽(阿侖膦酸鹽，residronate，唑來膦酸鹽和伊班膦酸鹽)、維生素D3或其類似物、雄激素、氟化鹽、甲狀旁腺激素或其類似物，或IGF，改變骨代謝中包含的天然存在的激素調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)的物質(zhì)，及其組合。這個另外的活性劑可以在給予本發(fā)明的15-脂肪氧化酶抑制劑之前、與之并行或之后給予受試者。
本發(fā)明的另一個方面基于15-脂肪氧化酶基因多態(tài)性和骨礦物質(zhì)密度之間的相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)，其中某些多態(tài)性的存在與骨礦物質(zhì)密度降低有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)的另一方面是基因型與骨質(zhì)疏松癥的易感性有關(guān)。本發(fā)明有優(yōu)點，因為通過篩選該基因型的存在，可能鑒定出可能具有這個遺傳易感性的個體。因此，本發(fā)明另一方面提供了治療的方法，包括篩選個體對骨損失的易感性和，如果鑒定到易感性，治療該個體來延遲或降低或預(yù)防骨損失。
根據(jù)本發(fā)明的針對和預(yù)防方法，檢測野生型15-脂肪氧化酶位點中的編碼和非編碼區(qū)中的改變，包括缺失、插入和點突變。因此，在小鼠中，例如，優(yōu)選檢測染色體11上的改變，而在人，檢測染色體17上的改變。此外，可以通過檢測野生型15-脂肪氧化酶位點并證實在15-脂肪氧化酶位點缺乏骨損失紊亂的易感性來實施該方法。這種突變可以存在于具有或不具有骨損失癥狀的個體中。此外，與那些不攜帶的相比，攜帶15-脂肪氧化酶位點突變的有癥狀個體的藥物反應(yīng)或預(yù)后可能有差異。
因此，本發(fā)明的一個方面提供了一種診斷方法，包括確定15-脂肪氧化酶基因的基因型。典型地，該方法確定了個體的15-脂肪氧化酶基因多態(tài)性是純合還是雜合。典型地，通過體外分析個體細胞確定那個個體在15-脂肪氧化酶位點的基因型來實施本發(fā)明的方法。
有效的診斷技術(shù)包括但不限于微陣列分析、熒光原位雜交(FISH)、直接DNA測序、PFGE分析、Southern印跡分析、單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、RNA酶保護試驗、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、點印跡分析和PCR-SSCP，如本領(lǐng)域熟知。
通過檢測受試者，如人患者的任何組織15-脂肪氧化酶基因的突變可以確定骨損失疾病的易感性。例如，遺傳了種系15-脂肪氧化酶突變的一個人將傾向于發(fā)展骨損失疾病。通過測定該人身體的任何組織的DNA可以確定此。最簡單地，可以抽取血液和從血液細胞中提取DNA。此外，通過檢測胎兒細胞、胎盤細胞或羊膜細胞的15-脂肪氧化酶基因突變可以完成產(chǎn)前診斷。可以用這里討論的任何方法檢測野生型15-脂肪氧化酶等位基因的改變，無論是例如通過點突變或缺失。
存在可以用于檢測DNA序列變異的幾種方法。直接DNA測序，手工測序或自動熒光測序可以檢測序列變異。另一種方法是單鏈構(gòu)象多態(tài)性試驗(SSCA)，其中對SSCA凝膠上移動遷移率的片段進行測序來確定DNA序列變異的精確性質(zhì)。基于兩條互補DNA鏈之間錯配檢測的其它方法包括夾板(clamped)變性凝膠電泳(CDGE)、異雙螺旋分析(HA)和化學(xué)錯配切割(CMC)。一旦已知突變，可以利用等位基因特異性檢測方法如等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交來快速篩選大量其它樣品的那個相同突變(見如Saiki等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 866230-6234(1989))。
可以使用本領(lǐng)域熟知技術(shù)，通過15-脂肪氧化酶等位基因的分子克隆和測序該等位基因來完成點突變的檢測?？晒┻x擇地，使用已知技術(shù)，可以從組織的基因組DNA制劑直接擴增基因序列。接著可以確定擴增序列的DNA序列。單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE或CDGE)、RNA酶保護試驗、等位基因同源性寡核苷酸(ASOs)、等位基因特異性PCR或單核苷酸延伸試驗可以證實等位基因的存在，如本領(lǐng)域熟知。
在優(yōu)選方法中，使用微芯片技術(shù)鑒定等位基因。在這個技術(shù)中，成千不同的寡核苷酸探針或基因可以被合成(McGall等的美國專利5,412,087)或在硅或玻璃芯片上點成陣列(Shalon等的美國專利6,110,426)。待分析的核酸通常被熒光標(biāo)記或與芯片上的探針雜交。其它標(biāo)記包括32p和生物素。也可以使用這些微陣列研究核酸-蛋白相互作用。使用這個技術(shù)，鑒定15-脂肪氧化酶基因中突變的存在。
改變的(或突變型)15-脂肪氧化酶基因的存在與骨損失疾病的風(fēng)險增加有關(guān)。為了檢測15-脂肪氧化酶基因突變，制備生物樣品并分析正分析的15-脂肪氧化酶等位基因序列和野生型15-脂肪氧化酶等位基因之間的差異。接著可測序突變等位基因來鑒定特定突變等位基因的特異突變。15-脂肪氧化酶基因的突變，特別是小鼠的染色體11和人的染色體17上，接著用于本發(fā)明的診斷和預(yù)防方法。
因此，本發(fā)明也提供了診斷受試者骨損失的易感性的方法，該方法包括檢測人染色體17上的多態(tài)性，其中該多態(tài)性是骨損失易感性的標(biāo)志。在優(yōu)選實施方案中，該檢測包括基因分型。在更優(yōu)選實施方案中，基因分型由微衛(wèi)星標(biāo)記或一個或多個單核苷酸多態(tài)性組成。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷受試者對骨損失的易感性的方法，該方法包括檢測受試者15-脂肪氧化酶的多態(tài)性。本發(fā)明提供了15-脂肪氧化酶抑制劑用作治療活性物質(zhì)預(yù)防骨損失。它也提供了上文描述的方法所鑒定的化合物。此外，提供了一種藥物組合物，尤其是用于預(yù)防骨損失的，包含上文描述的化合物和載體。也提供了包含至少一種與骨損失相關(guān)的檢測15-脂肪氧化酶多態(tài)性的寡核苷酸的診斷對骨損失的易感性的試劑盒。
最后，也要求保護基本上如這里描述的化合物、方法、應(yīng)用、組合物和試劑盒，特別是根據(jù)前述實施例。


圖1描述了混合的DNA樣品基于SNP的基因分型與單個DNA樣品微衛(wèi)星基因分型檢測與骨礦物質(zhì)密度相關(guān)的多態(tài)性的比較。使用z-檢驗計算每個等位基因-頻率差異的顯著性，并作為LOD分值對所有染色體來繪圖。虛線表示LOD分值3.3，它設(shè)定作為基因組-野生型限制性的閾值。
圖2顯示了使用整個腎RNA定量小鼠腎中Alox15的基因表達，其中使用微陣列分析基因表達。
圖3顯示了對體外給予增加濃度的IL-4應(yīng)答的小鼠原代成骨細胞中Alox15基因表達的定量。
圖4顯示了鑒定的小鼠中Alox15基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的位置。
圖5顯示了相對于只有溶劑(DMSO)的對照，對15-脂肪氧化酶抑制劑化合物1或化合物2應(yīng)答的人間充質(zhì)干細胞(hMSC)中堿性磷酸酶活性的定量。
圖6顯示了用化合物3或化合物2作為15-脂肪氧化酶抑制劑和DMSO或1，25-維生素D3作為對照，hMSC中堿性磷酸酶活性的定量。
圖7顯示了用化合物3或化合物2作為15-脂肪氧化酶抑制劑和DMSO或1，25-維生素D3作為對照，hMSC的總鈣含量的定量。
圖8顯示了相對于僅(DMSO)對照溶劑，與5-LO抑制劑齊留通，AA-861，和Rev-5901培養(yǎng)9天的hMSC中堿性磷酸酶活性的定量。缺乏反應(yīng)是與15-脂肪氧化酶抑制劑見到的作用相比。
圖9顯示了相對于僅(DMSO)或1，25-維生素D3的溶劑對照，與5-LO抑制劑齊留通，AA-861，和Rev-5901培養(yǎng)16天的hMSC中總鈣含量的定量。缺乏反應(yīng)是與15-脂肪氧化酶抑制劑見到的作用相比。
下面是實施本發(fā)明的具體實施方案的實施例。提供這些實施例僅僅為了說明目的，并不想以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


化合物13-(2-壬-1-炔基苯基)-丙酸，美國專利5,972,980中描述。
化合物26，11-二氫-5-硫雜-11-吖-苯并[a]芴，WO97/12613中描述。
化合物33-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺，WO099/32433中描述。
化合物4反-3-(2-辛-1-炔基-苯基)-丙烯酸，在美國專利4,713,486中描述。
化合物5齊留通，美國專利4,873,259中描述。
化合物6[[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺?；鵠-氨基甲酸-異丁酯，WO01/96298中描述。
已努力確保有關(guān)使用數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的精確性，但是當(dāng)然應(yīng)當(dāng)允許一些實驗誤差和偏差。
實施例1SNP基因分型模型微衛(wèi)星(也稱作簡單串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性，或簡單序列長度多態(tài)性)構(gòu)成發(fā)展最快的遺傳標(biāo)記種類。它們包括簡單序列串聯(lián)重復(fù)(二、三、四個核苷酸重復(fù))的小陣列，它顯示了高度的長度多態(tài)性，因此提供了高水平信息。PCR衍生技術(shù)對稍超過5,000個微衛(wèi)星進行的簡單分型已經(jīng)在人基因組中排序(Dib等，Nature 380152(1996))。
通常依據(jù)Grupe等(2001)Science 2921915-1918描述的方法。為了鑒定調(diào)節(jié)BMD的遺傳因子，對16周齡的C57BL/6x DBA/2雜種(Jackson Labs，Bar Harbor，Maine)的1000個F2后代實施基因組掃描。F2后代顯示出BMD的無性別關(guān)聯(lián)的正態(tài)分布(Grupe等，Science，292，1915-1918，(2001))。通過100個微衛(wèi)星標(biāo)記對單個DNA樣品進行基因分型，最高(n＝145)和最低(n＝149)BMD的表型極端(頂和底15％)F2后代接受與BMD相關(guān)的全基因組掃描。此外，來自高和低F2后代的等量DNA用于形成兩個混合庫。使用等位基因特異性動態(tài)PCR方法測定mSNP數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的109個SNP的混合樣品中的等位基因頻率。對每個標(biāo)記的兩個極端之間等位基因-頻率的差異進行打分。如果一個標(biāo)記與BMD沒有關(guān)系，兩個極端的其期望頻率是50％。使用z-檢驗計算每個等位基因一頻率差異的顯著性并作為LOD分值繪圖(圖1)。用微衛(wèi)星和SNP基因分型方法發(fā)現(xiàn)四個區(qū)域的顯著性關(guān)系(LOD分值＞3.3)，位于染色體1，2，4和11。
這樣，使用SNP基因分型方法，鑒定了引起B(yǎng)MD的候選基因。
實施例2動物模型為了鑒定染色體11上鑒定區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)BMD的基因，使用微陣列分析DBA/2，C57BL6/J(Jackson Labs，Bar Harbor，Maine)和同系小鼠品系(D2.B6chr11，得自O(shè)regon Health Sciences University)之間基因表達差異。D2.B6chrll同系小鼠含有移入DBA2/J背景的從cM20至cM50的C57BL/6J染色體11間隔。含有來自小鼠基因組的基因的微陣列與得自整個腎、培養(yǎng)的原代成骨細胞和原代軟骨細胞的標(biāo)記cRNA雜交。與得自單個DBA/2J，C57BL/6J，和B6.D2chr11和同系小鼠的cRNA進行雜交。實施mRNA(2x poly(A)+)分離、cRNA合成和雜交。成對比較DBA/2J和C57BL/6小鼠，和成對比較DBA/2J和B6.D2chr11同系小鼠來估計差異表達。
選擇在染色體11上間隔(cM20-cM50)內(nèi)編碼的差異表達基因進一步描述其特性。所檢測的兩品系之間的單一基因(在染色體11上cM40的Alox15)基本上差異表達(圖2)。DBA/2J品系與D2.B6chr11和C57BL/6小鼠相比，具有高水平的Alox15表達并且相對于另兩個品系也具有降低的BMD。因此，DBA/2J小鼠中Alox15表達升高有助于骨礦物質(zhì)密度降低。
使用實時PCR估計成骨細胞中差異Alox15mRNA表達。從DBA/2J，C57BL/6J，和D2.B6chr11小鼠制備細胞(圖3)。用DnaseI處理總RNA以除去污染的基因組DNA。RNA在65℃加熱10分鐘以滅活DnaseI。所有PCR反應(yīng)在100μl體積中實施。使用rTh DNA聚合酶(2單位)(Perkin Elmer)在含5×EX緩沖液，Mn(OAc)(3mM)，溴化乙錠(1μg/ul)，dNTPs(200μM)，正向引物(200nM)和反向引物(200nM)的反應(yīng)混合物中，RNA(100ng)進行RT PCR。樣品在60℃溫育30分鐘產(chǎn)生cDNA。這之后是60個循環(huán)(95℃，20秒；58℃，20秒)的PCR，接著在72℃溫育20分鐘。每個循環(huán)的熒光與產(chǎn)生產(chǎn)物的量有關(guān)并使用動力熱循環(huán)儀測定和使用提供的軟件(Germer和Higuchi，Genome Research，9，72-78，(1999))分析。除了腎之外，與C57BL/6J小鼠相比，來自DBA/2J小鼠的成骨細胞也產(chǎn)生了Alox15 mRNA基礎(chǔ)水平升高。來自C57BL/6小鼠的成骨細胞中IL-4以相對于DBA/2小鼠更大程度地誘導(dǎo)Alox15RNA(圖3)。
為了鑒定Alox15表達的株特異性差異的分子學(xué)基礎(chǔ)，使用本領(lǐng)域已知方法來自DBA/2J和C57BL6/J小鼠基因組DNA的Alox15基因?qū)M行測序。鑒定到區(qū)分兩株的十四個DNA序列多態(tài)性(圖4和下表1圖示)。15LO的Ensembl基因命名為ENSMUSG00000018924。Seq ID No.1給出了包含小鼠基因組的70929619至70937482位置的基因序列。在小鼠基因組序列的70938498位置的表1的第一個SNP位于Seq ID No.2列出的Genbank登記號U04332序列的541位置。
表1與C57BL/6J小鼠相比在DBA/2J中鑒定的Alox15SNP小鼠基因 組核苷酸變化 內(nèi)含子/外A.A.位置中SNP的位C57BL/6J_DBA2/J顯子置(bp)70938498 C_G5’非翻譯區(qū)推定TATA盒的～1kb上游70937181 A_G內(nèi)含子170936977 T_C內(nèi)含子170936975 A_T內(nèi)含子170936918 C_T內(nèi)含子170936336 T_C外顯子262/Phe(TTT)-Phe(TTC)70936248 G_A外顯子291/Ser(TCG)-Ser(TCA)70936136 G_A內(nèi)含子2
70935775G_A內(nèi)含子370935765C_T內(nèi)含子370931174A_G內(nèi)含子1070930258A_G內(nèi)含子1370930156C_T外顯子14616/Pro(CCA)-Ser(TCA)70930151C_T外顯子14617/Asn(AAC)-Asn(AAT)70929999DBA/2J中T缺失 3’非翻譯區(qū)的第11個堿基實施例315-脂肪氧化酶抑制劑增加骨形成的能力為了確定15-脂肪氧化酶抑制劑刺激骨形成和骨增積的能力，在體外檢測15-LO抑制劑促進干細胞分化為骨形成細胞(成骨細胞)的能力。尤其是，通過測定成骨細胞分化的兩個標(biāo)志-細胞堿性磷酸酶活性和培養(yǎng)鈣含量來確定用文獻步驟制備的三種抑制劑-化合物1(3-(2-壬-1-炔基苯基)-丙酸、化合物2(6，11-二氫-5-硫雜-11-吖-苯并[a]芴)、化合物3(3-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺)促進人干細胞分化為成骨細胞的能力。
通常，在12孔膠原包被培養(yǎng)板中，以1ml培養(yǎng)基(Clonetics目錄號PT-4105加成骨細胞誘導(dǎo)劑(100nM Dex，0.05mM L-抗壞血酸-2-磷酸鹽，10mM β-甘油磷酸)每平方厘米3100個細胞培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞(hMSC，Poietics#PT-2501，BioWhittaker)。三種15-LO抑制劑逐個添加到每個的培養(yǎng)基中，除了對照孔中添加0.1％DMSO(陰性對照)或1nM 1，25-維生素D3(陽性對照)以外。抑制劑濃度如下化合物1以3和30μM；化合物2以0.1，0.2，0.3，或1.0μM和化合物以3，10，或30μM。制備每個劑量水平的四至八個獨立復(fù)制培養(yǎng)物。在實驗最末，刮擦孔到合適培養(yǎng)基中收集培養(yǎng)的細胞進一步分析堿性磷酸酶(Sigma kit#104-LL)或細胞鈣(Sigma kit#587-M)。收集進行堿性磷酸酶評定的培養(yǎng)物用刮擦細胞收集并重懸于250μl Tris緩沖的0.1％Triton X-100中，接著新鮮或凍融后檢測。刮擦待檢測總鈣含量的分開培養(yǎng)物并重懸于250μl 0.5M HCL中。這些實驗的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為總細胞DNA，因此標(biāo)準(zhǔn)化了細胞增殖的差異。同時收集那些培養(yǎng)物進行堿性磷酸酶和鈣檢測，刮擦細胞收集分開的復(fù)制培養(yǎng)物并重懸于250μl Hank’s平衡鹽溶液中，用DNA(DNeasy Tissue Kit，Qiagen目錄號69506)估計細胞數(shù)量。
成骨細胞體外分化的定量對于堿性磷酸酶活性的定量，抑制劑制備于0.1％DMSO中并在第1天和其后每隔2-3天添加到培養(yǎng)物中添加14-16天。實施三個不同組實驗。
在第一個實驗組，化合物1或化合物2(0.2μM或1μM)用作抑制劑，溶劑(DMSO)作為陰性對照，并制備每個劑量水平的四個分開復(fù)制培養(yǎng)物。板培養(yǎng)14天。圖5繪制了堿性磷酸酶的被DNA標(biāo)準(zhǔn)化的活性。
第二個實驗組包括化合物3(3，10和30μM)或化合物2(0.1，0.3，1.0μM)作為15-LO抑制劑的八個復(fù)制培養(yǎng)物。在第1天或第11天添加抑制劑。DMSO用作成骨細胞分化誘導(dǎo)的陰性對照，和1，25-維生素D3作為陽性對照。圖6和圖7中分別繪制了堿性磷酸酶和鈣含量的標(biāo)準(zhǔn)化活性?；衔?在第1天添加最有效，化合物3在第11天添加最有效。
作為15-LO抑制干細胞體外分化為成骨細胞的誘導(dǎo)的特異性的對照，第三組實驗研究了認識到對5-LO酶，而不是15-LO酶更特異的標(biāo)準(zhǔn)脂肪氧化酶抑制劑的八個復(fù)制物。每隔2-3天新鮮制備齊留通(1，10，50uM，在Roche as制備)化合物5，AA-861(1，10，50uM，Sigma#A3711)和Rev-5901(15uM，Sigma#R5523)并在人成骨細胞前體細胞中檢測。發(fā)現(xiàn)在第9天5-LO抑制劑缺乏誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性的能力或在培養(yǎng)后16天缺乏誘導(dǎo)培養(yǎng)鈣沉積的能力，如分別見圖8和9。
在hMSC培養(yǎng)物被刺激分化為成骨細胞的中，成骨細胞分化標(biāo)志-堿性磷酸酶活性和培養(yǎng)鈣含量的定量結(jié)果證明添加特異性15-脂肪氧化酶抑制劑促進人骨形成細胞的體外分化。
此外，使用同系試驗測定15-脂肪氧化酶抑制劑刺激骨形成和骨增積的能力，其中測定骨髓前體細胞的同系潛力。用15-脂肪氧化酶抑制劑處理成骨細胞和破骨細胞。在一種方法中，在體外溫育細胞和抑制劑。在另一種方法中，給哺乳動物施予抑制劑，分離骨髓前體接著鋪板。對于兩個方法，測定這些骨髓細胞得到的集落形成單位。如果它們可顯示出增加骨髓成骨細胞同系潛力或降低骨髓破骨細胞的同系潛力，人們可以篩選具有增加骨礦物質(zhì)密度潛力的化合物。
實施例415-脂肪氧化酶基因的破壞導(dǎo)致股骨骨礦物質(zhì)密度增加最初，15-LO缺陷小鼠顯示出具有較小表型變化，但是在小鼠模型中，隨后表明這些小鼠被保護不受動脈粥樣硬化損害(Sun和Funk，J.Biol.Chem.，271，24055-24062，(1996)；Cyrus等，J.Clin.Invest.，103，1597-1604，(1999))。而且，在15-LO缺陷小鼠中沒有測到BMD。為了檢測15-LO基因破壞對骨礦物質(zhì)密度的作用，將15-LO“剔除”(15-LO-KO)小鼠與其雙親小鼠比較關(guān)于骨礦物質(zhì)密度。用雙能量X線吸光分析(DEXA)確定骨礦物質(zhì)測定。用Lunar PIXImus光密度計(LunarCorp.，Madison，WI)實施所有研究。在完成了獲得成年骨質(zhì)量的4月齡麻醉小鼠上實施整個身體光密度分析。球形窗口定義為整個身體圖像減去顱蓋、下頜骨和牙齒。死亡后，小心取出右股骨并在DEXA掃描前清除粘附組織。15-LO-KO和C57BL/6雙親小鼠之間的整個身體骨礦物質(zhì)密度沒有顯著性變化(49.8+/-0.6mg/cm2vs.49.5+/-0.4mg/cm2)。然而重要地，與C57BL/6雙親品系相比，15-LO剔除小鼠的股骨BMD顯著增加(54.0+/-1.2mg/cm2vs.49.7+/-0.7mg/cm2)。這些結(jié)果證明15-LO的破壞導(dǎo)致股骨骨礦物質(zhì)密度增加。
實施例515-脂肪氧化酶抑制劑促進體內(nèi)骨形成通過測定骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中抑制劑改善骨參數(shù)的能力估計15-脂肪氧化酶抑制劑促進體內(nèi)骨形成的能力。C57BL/6小鼠中白介素4轉(zhuǎn)基因由Lck基因啟動子(Lck-IL4)的組成型表達導(dǎo)致模擬骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重骨表型。(Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，11618-22，(1993))，這些小鼠用于證明用15-LO抑制劑處理對骨質(zhì)量的作用。
表2顯示了使用的四個實驗組。在斷奶時，野生型C57BL/6或轉(zhuǎn)基因Lck-IL4小鼠在它們的食物中每天接受150mg/kg劑量的化合物2PD146176，進行84天(飲食500123％蛋白，10％脂肪，0.95％鈣和0.67％磷；PMI Feeds，Inc.，St.Louis，MO)。允許小鼠達到每日食物攝入的一半，以大約12小時間隔每天兩次，并每天監(jiān)測飲食攝入。水隨意獲得。對照組接受相同飲食，沒有化合物2。實驗過程中，所有組每天很好地等量消耗食物。
表2
表2.用于體內(nèi)抑制研究的實驗組。斷奶后(大約28天)，給小鼠喂含或不含15-LO抑制劑(化合物2)的食物84天。組中F，雌性和M，雄性動物等量出現(xiàn)。
表3顯示了IL4過表達和15-LO抑制對整個身體參數(shù)-股骨BMD和幾何學(xué)和股骨生物力學(xué)的作用。IL4過表達導(dǎo)致整個身體BMD、體重和血細胞比容顯著降低和體重脂肪百分比增加。與野生型C57BL/6小鼠相比，IL4過表達也減少股骨BMD、皮質(zhì)面積、慣性力矩和皮質(zhì)厚度。Lck-IL4小鼠的骨髓面積增加與血細胞比容降低有關(guān)并且與已報道的貧血相關(guān)。另外，IL4過表達對股骨生物力學(xué)有顯著作用，包括降低衰竭負荷、骨僵硬度和骨強度(表3)。喂給15-LO抑制劑(化合物2)的小鼠顯示對整個身體和股骨的有害作用的部分逆轉(zhuǎn)(表3)。相對于攜帶Lck-IL4轉(zhuǎn)基因的對照小鼠，藥物治療的小鼠的整個身體BMD、血細胞比容、股骨BMD和皮質(zhì)厚度顯著增加。重要地，15-LO抑制劑處理的小鼠的股骨生物力學(xué)，包括衰竭負荷、僵硬度和強度明顯增加。這與骨質(zhì)疏松癥特別相關(guān)，因為骨強度和衰竭負荷水平是接近發(fā)生骨折的患者的重要決定因素。總之，該結(jié)果表明15-LO的抑制在體內(nèi)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥動物模型中更高的BMD和更高的骨強度。
表3
表3.IL4過表達和15-LO對整個身體和股骨骨參數(shù)的作用。測定攜帶Lck-IL4轉(zhuǎn)基因?qū)е屡cC57BL/6對照相比IL4過表達的小鼠的整個身體和股骨骨參數(shù)。也測定與未處理的Lck-IL4對照相比喂給15-LO抑制劑化合物2的Lck-IL4小鼠的這些參數(shù)。NC，組間沒有變化。ns，P值沒有顯著性。
動物體內(nèi)實驗中使用的所有小鼠在源自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)的祖先的Portland VAVeterinary Medical Unit同等條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)的小鼠保持從得自The Jackson Laboratory的祖先至多三代。斷奶時，小鼠以12小時白天/黑夜循環(huán)(6:00 AM-6:00 PM)，在21±2℃分組居住(每個籠子9-10只動物)。所有步驟被VA Institutional Animal Care and UseCommittee認可并根據(jù)National Institutes of Health的研究動物的護理和使用指導(dǎo)實施。
骨測光密度術(shù)雙能量X線吸光分析(DEXA)確定骨礦物質(zhì)測定。用Lunar PIXImus光密度計(Lunar Corp.，Madison，WI)進行所有研究。在完成了獲得成年骨質(zhì)量的4月齡麻醉小鼠上實施整個身體光密度分析。球形窗口定義為整個身體圖像減去顱蓋、下頜骨和牙齒。死亡后，小心取出右股骨并在DEXA掃描前清除粘附組織。
樣品加工CO2吸入安樂殺死成年小鼠(16周齡)并稱重至最接近0.1gm。在死亡后立即獲得心臟血液提取物并保留整個身體的小部分進行血小板比容檢測。立即收集腰椎和兩根股骨，浸透磷酸鹽合成鹽水的無菌紗布包裹，并冷凍保存在低于大約-20℃進行隨后分析。
股骨干幾何學(xué)使用便攜式X線微型斷層照相儀(Model 1074，Skyscan，Antwerp，Belgium)確定股骨中骨干的橫截面幾何參數(shù)。以40秒間隔進行掃描，分析位于股骨中點的層的總面積(FCSA)、皮質(zhì)面積(CtAr)和髓管面積(MaAr)。此外，使用數(shù)字圖像皮質(zhì)區(qū)域含的象素，計算前后面從橫截面的質(zhì)心至外部纖維的半徑，彎曲面中慣性力矩面(Ixx)和平均皮質(zhì)厚度(Ct Th)。
生物力學(xué)研究在高分辨率材料檢測裝置(Instron Model 4442，Canton，MA)上檢測股骨在三點彎曲度的衰竭。使用軟件系統(tǒng)確定衰竭負荷和僵硬度。接著使用前面確定的橫截面尺度計算彎曲強度。
數(shù)據(jù)分析使用JMP軟件包(SAS Institute)，采用雙因素方差分析(ANOVA)分析所有數(shù)據(jù)。
實施例615-脂肪氧化酶抑制劑增加體內(nèi)骨形成的能力為了確定15-脂肪氧化酶抑制劑刺激骨形成和骨增積的能力，如WO0196298所述制備化合物6-[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺酰基]-氨基甲酸-異丁酯并用標(biāo)準(zhǔn)雌激素不足大鼠OVX骨質(zhì)減少試驗檢測。
切除三月齡大鼠的卵巢(Ovx)并經(jīng)口管飼法給予1mg/kg/天的化合物6或0.1μg/kg/天的1，25-二羥維生素D3(陽性對照，表中縮寫為Vit.D)，卵巢切除術(shù)后2周開始一天一次，持續(xù)7周。該劑量增加到2mg/kg/天并持續(xù)到11周。對照組，假組(sham)(沒有切除卵巢的大鼠)和Ovx僅接受載體。使用QDR-4500骨光密度計(Hologic，Walthan，MA)高分辨率軟件包確定脊柱和右髖的骨礦物質(zhì)密度。將動物置于仰臥位進行掃描使得右股骨與軀干垂直和脛骨與股骨垂直。下表4給出了對于化合物的髖部和脊柱的骨礦物質(zhì)密度(g礦物質(zhì)/cm2)。用15-LO抑制劑處理的動物在＞3周顯示脊柱BMD增加和在＞7周股骨遠端BMD增加。表4顯示了結(jié)果。
表4
括號中的值是在同一時間點對OVX對照的p值。Nd＝?jīng)]有數(shù)據(jù)實施例7對實驗室小鼠的降低15-脂肪氧化酶表達的基因操作導(dǎo)致骨質(zhì)量和強度提高為了檢測15-脂肪氧化酶表達和骨發(fā)育之間的關(guān)系，從兩個祖先品系-購自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)的B6.129S2-Aloxl5tmlFun(Alox15剔除或15LOKO)和DBA/2(D2)組成遺傳學(xué)雜合F2群。B6.129S2-Aloxl5tmlFun(15LOKO)小鼠是Alox15定向突變的純合體且因此不能表達花生四烯酸鹽15-脂肪氧化酶。相比之下，D2小鼠表現(xiàn)出高水平的Alox15。從Jackson Laboratory雙親系當(dāng)?shù)胤庇?5LOKO-D2F1小鼠并雜交產(chǎn)生共292只15LOKO-D2F2小鼠。斷奶時，小鼠分組居住(每個籠子2-5只)并用隨意攝水和實驗室嚙齒動物食物(飲食500123％蛋白，10％脂肪，0.95％鈣和0.67％磷；PMI Feeds，Inc.，St.Louis，MO)在21±2℃，以12小時白天/黑夜循環(huán)(早六點至晚六點)維持。
所有小鼠在完成了獲得成年骨質(zhì)量的4月齡(28)時進行研究。用人腰椎羥基磷灰石模型每天校準(zhǔn)的光束Hologic QDR 1500光密度計(Hologic，Waltham，MA)進行骨礦物質(zhì)測定。使用制造商友情提供的小鼠整個身體軟件(3.2版)(Hologic，Waltham，MA)實施分析。對麻醉小鼠實施光密度分析。在檢測前晚停止食物(以消除未消化的嚙齒動物食物對骨礦物質(zhì)密度估計的影響)，異氟烷吸入來麻醉小鼠。動物稱重至最接近0.1gm，接著進行骨密度掃描。CO2吸入安樂殺死小鼠，無菌取出脾臟和股骨，接著立即冷凍進行隨后分析。所有步驟被VA Institutional Animal Care and UseCommittee認可并根據(jù)National Institutes of Health的研究動物的護理和使用指導(dǎo)實施。
用臺式x線微型斷層照像掃描儀(SkyScan Model 1074，Aartselaar，Belgium)測定股骨結(jié)構(gòu)(中干皮質(zhì)骨面積和皮質(zhì)厚度)。用高分辨率材料裝置(Model 4442，Instron Corp.，Canton，MA)檢測左股骨的三點彎曲度。連接伸長計(Model 2630-113，Instron Corp.)和系統(tǒng)軟件(用于Windows 95的Series IX，Instron Corp.)用于以0.5％/秒的彎曲速度轉(zhuǎn)移驅(qū)動器直到發(fā)生衰竭。記錄負荷和轉(zhuǎn)移(使用伸長計測定)數(shù)據(jù)并使用系統(tǒng)軟件確定衰竭負荷(F)和僵硬度(k，由負荷的線性部分對轉(zhuǎn)移曲線計算)。
使用鹽析方法從各個小鼠的脾臟分離基因組DNA。對小鼠進行基因分型，采用設(shè)計產(chǎn)生野生型(266bp)和突變體(172bp)Alox15基因的不同大小產(chǎn)物的由The Jackson Laboratory(http//aretha.jax.org/pub-cgi/protocols/proto-cols.sh？objtype＝protocol& protocol id＝304)建議的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方案。在Perkin-Elmer 9700熱循環(huán)儀(Branchburg，New Jersey)上實施擴增。在4％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物并用溴化乙錠染色使其可見。
15LOKO-D2 F2群由大約相等數(shù)量的雄性(n＝141)和雌性(n＝151)小鼠組成，如下表5所示，Alox15基因型頻率符合Hardy-Weinberg原則，期望70(24％)剔除(無15-LO等位基因)純合小鼠，153(52％)雜合(來自D2的單一15-LO等位基因)小鼠，和69(24％)純合D2(來自D2的兩個15-LO等位基因)小鼠。盡管，在體重上沒有差異，但是Alox15剔除的純合F2小鼠表現(xiàn)出比D2純合或雜合小鼠明顯高的整個身體BMD(由ANOVA得到p＝0.006)。而且，Alox15剔除的純合F2小鼠顯示出股骨干皮質(zhì)骨(皮質(zhì)面積和皮質(zhì)厚度)量增加和如衰竭負荷和僵硬度尺度增加證明的結(jié)構(gòu)能力明顯提高(表6)。
表5 15LO基因型與15LOKO-D2F2群體種的BMD有關(guān)15LO D2等位基因的數(shù)量 ANOVA0 1 2 P值小鼠數(shù)量 69 127 70體重，g 28.2±0.61 27.5±0.4329.2±0.64NSBMD，g/cm266.1±0.33 64.9±0.2565.0±0.31P＝0.006表6 15LO D2等位基因的數(shù)量0 1 2 P值小鼠數(shù)量 15 1515體重，g 23.3±0.54 23.9±0.4523.7±0.40NSBMD，g/cm265.6±0.46 64.8±0.9563.4±0.65P＝0.005Ct Ar，mm20.76±0.03 0.78±0.030.70±0.02P＝0.046Ct Th，mm20.193±0.005 0.200±0.006 0.176±0.004 P＝0.006衰竭負荷，N 20.5±0.8 20.3±0.8 18.0±0.6 P＝0.013僵硬度， 126.5±4.6 108.7±5.1110.3±3.3P＝0.004N/mm(BMD＝全身BMD；Ct Ar＝股骨干皮質(zhì)面積；Ct Th＝股骨干皮質(zhì)厚度)因此，公開了治療或預(yù)防骨損失，增加骨礦物質(zhì)密度，和增加骨形成和增積的新方法。盡管已經(jīng)詳細地描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是應(yīng)該理解可以不背離本發(fā)明的精神和所附權(quán)利要求限定的范圍進行明顯的變化。
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇AG<120>治療和預(yù)防骨損失的方法<130>Case 21150<150>US60/355255<151>2002-02-08<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7864<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>Ensembl基因ENSMUSG00000018924<222>(1)..(7864)<223>
<220>
<221>小鼠基因組中位置70929619<222>(1)..(1)<223>
<220>
<221>小鼠基因組中位置70937482<222>(7864)..(7864)<223>
<400>1tctttgcaac attttattta aaataattag gtccctgttc ttttctatca ctagcccaaa60acatctttta ttgttgctat tagactctat taaggcttga gatctatttg attcatagac120
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<221>小鼠白細胞型12-脂肪氧化酶基因<222>(1)..(1557)<223>2003年1月7日GenBank登記號U04332<220>
<221>SNP<222>(541)..(541)<223>
<400>2gtgaaggtaa aaatcacaag cttggtacct cctgttgaaa tagttgtgat gcccattagc60aagcaggaca ggataggaac gtttaagaag aatagggcac atttgtgtca ccatggcatt120tctgtttgat tcgggagcag agagccttgc atttacagaa acagaacaat tcaggttagc180gaacgttcca gtaagtacca tacgtgcctg agagtaatgc tgacctcagt tccaccggcg240
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1.一種鑒定增加骨礦物質(zhì)密度的化合物的方法，該方法包括使化合物接觸15-脂肪氧化酶并確定該化合物是否抑制15-脂肪氧化酶活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括在證明該化合物對骨形成的作用的功能性試驗中檢測該化合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述功能性試驗包括使化合物接觸人間充質(zhì)干細胞并確定細胞分化為骨形成細胞。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述功能性試驗包括將該化合物給予非人類動物并測定骨形成的指數(shù)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述測定的指數(shù)是骨礦物質(zhì)密度。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述指數(shù)是骨的生物力學(xué)參數(shù)。
7.權(quán)利要求3的方法，其中確定細胞分化包括進行堿性磷酸酶試驗、鈣試驗、總DNA制備試驗，或其組合。
8.一種鑒定增加骨礦物質(zhì)密度的化合物的方法，該方法包括使15-脂肪氧化酶抑制劑接觸人間充質(zhì)干細胞并確定細胞分化為骨形成細胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中確定細胞分化包括進行堿性磷酸酶試驗、鈣試驗、總DNA制備試驗，或其組合。
10.由權(quán)利要求1至9中任何一項的方法鑒定的化合物。
全文摘要
公開了治療和預(yù)防骨損失和/或增加骨形成的方法。該方法利用15－脂肪氧化酶抑制劑。這些分子可以單獨或與抑制骨再吸收的試劑或調(diào)節(jié)從骨再吸收鈣或增加骨累積的另外的試劑結(jié)合傳遞。本發(fā)明另外提供了診斷骨損失的易感性的方法。
文檔編號C12Q1/42GK1896270SQ20061010006
公開日2007年1月17日 申請日期2003年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日
發(fā)明者J·D·阿拉德, R·F·克萊因, G·A·佩爾茨 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司, 美國政府, 俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)