專利名稱：L－蛋氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富含對(duì)映異構(gòu)體的L-蛋氨酸的制備方法。特別是，本發(fā)明包括制備L-蛋氨酸的循環(huán)酶法，其包括a)乙?；疍，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；b)酶裂解所述混合物；c)結(jié)晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；d)任選地，乙?；玫慕Y(jié)晶母液；e)離子交換純化所得的乙?；哪敢?；f)外消旋在步驟e)中的所述純化的N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸；g)循環(huán)步驟f)的外消旋混合物至步驟b)中。
背景技術(shù)：
L-蛋氨酸主要用于營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域，例如，在滲析溶液中的腸外注入液或作為飼料添加劑和食物添加劑。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，已知有多種方法制備L-蛋氨酸。然而，僅極少的一些方法已在工業(yè)上應(yīng)用。
制備L-蛋氨酸的當(dāng)代化學(xué)方法包括至少一個(gè)酶法步驟。在此，已有兩種方式有利地為公眾所知，即酶拆分外消旋的N-乙?；?D，L-蛋氨酸和酶裂解外消旋的D，L-甲基硫乙基乙內(nèi)酰脲(US 6114163和US 6524837)。
在這些方法中，所謂的?；D(zhuǎn)移酶路線已被實(shí)現(xiàn)，從而在工業(yè)水平上獲得幾乎完全純的對(duì)映異構(gòu)體L-蛋氨酸(WO 97/21667)。在WO97/21663中，公開(kāi)了制備L-氨基酸和L-蛋氨酸的優(yōu)化方法，其中有利地將制得的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸通過(guò)外消旋步驟循環(huán)至乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶裂解中，從而利用了所有的原料。
但是，基于上述的現(xiàn)有技術(shù)，仍需要進(jìn)一步優(yōu)化L-氨基酸，尤其是L-蛋氨酸的制備過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是對(duì)于L-蛋氨酸的制備，與現(xiàn)有技術(shù)相比，獲得可實(shí)現(xiàn)的改進(jìn)方法。特別是，重點(diǎn)在于所述方法能有利地在工業(yè)水平上實(shí)施，并且從經(jīng)濟(jì)以及生態(tài)的角度上，也優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的方法。
通過(guò)權(quán)利要求中的方法實(shí)現(xiàn)了該目的。
L-蛋氨酸的制備方法，其包括a)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；b)酶裂解所述混合物；c)結(jié)晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；d)任選地，乙?；玫慕Y(jié)晶母液；e)離子交換純化所得的乙?；哪敢海籪)外消旋在步驟e)中的所述純化的N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸；g)循環(huán)步驟f)的外消旋混合物至步驟b)中；出人意料地，所述目的非常有利地被實(shí)現(xiàn)了。通過(guò)結(jié)合上述的步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以以工業(yè)水平實(shí)施L-蛋氨酸的制備方法，且不損失原料，獲得原料的高產(chǎn)率以及更少的廢物流，因此與現(xiàn)有技術(shù)中的方法相比更有優(yōu)勢(shì)。
a)乙?；疍，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物
L-氨基酸的乙酰化是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。許多文獻(xiàn)涉及從游離氨基酸通過(guò)Schotten-Baumann-或Einhorn-方法獲得N-乙?；被?Organikum，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，16.Auflage，Berlin 1986，S.407)。同樣，蛋氨酸可以被乙酰化(US 6,114,163；WO97/21667)。以優(yōu)選的方式，以固體或以30-50％的堿溶液的形式供應(yīng)D，L-蛋氨酸，優(yōu)選以鈉鹽溶液。另外，也可以使用含有D，(L)-，(D)，L-或D，L-蛋氨酸的母液。
通過(guò)向D，L-蛋氨酸的水溶液中加入乙酸酐或乙酰氯，和堿(例如氫氧化鈉/鉀)在20-40℃下進(jìn)行乙?；?。對(duì)于接下來(lái)的酶拆分，可以直接使用來(lái)自于乙?；襟E的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的堿性鹽溶液。在此情況中，不需要分離N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。
b)酶裂解該乙?；旌衔?該步驟對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且可以根據(jù)US6,114,163進(jìn)行。本步驟的一個(gè)優(yōu)選方法是通過(guò)將大約0.4-2.0mol/l的N-乙?；?D，L-蛋氨酸的堿性水溶液，優(yōu)選pH值在6.0和7.5之間的鈉鹽，與?；D(zhuǎn)移酶接觸而進(jìn)行。在此，N-乙?；?L-蛋氨酸選擇性地被分裂成乙酸鹽和L-蛋氨酸，而N-乙?；?D-蛋氨酸不受影響。優(yōu)選地，在酶拆分之前，可以將pH值被調(diào)節(jié)為7.0-7.5的來(lái)自于外消旋步驟f)的N-乙?；?D，L-蛋氨酸鹽溶液循環(huán)至?；D(zhuǎn)移酶裂解混合物中，并且所述混合物可以經(jīng)活性炭和過(guò)濾處理。然后將懸浮液在壓濾機(jī)上過(guò)濾，并將澄清濾液收集于罐中?？梢约尤牒哿康穆然\或氯化鈷作為酶促反應(yīng)的催化劑。用水將所述溶液稀釋至N-乙?；?D，L-蛋氨酸堿性鹽的濃度為約0.5-1.0mol/l，優(yōu)選0.6-0.9mol/l，并供應(yīng)至用于酶裂解反應(yīng)的反應(yīng)器中。
所述反應(yīng)器有利地包括具有膜的超濾單元，所述膜具有5,000-20,000道爾頓，優(yōu)選7,500-12,000道爾頓的截留值(cut-off)。用泵將所述N-乙?；?D，L-蛋氨酸鹽溶液供入所謂的酶膜反應(yīng)器(Enzyme Membrane Reactor)(EP 1170277及其引用的文獻(xiàn))中，并混合入其中含有?；D(zhuǎn)移酶，優(yōu)選Amano酰基轉(zhuǎn)移酶或其等價(jià)物的濃縮流(concentrate stream)(意指其中存在酶的那部分混合物)中。所述酶選擇性地裂解N-乙酰基-L-蛋氨酸堿金屬鹽，優(yōu)選鈉鹽，以形成L-蛋氨酸和堿金屬乙酸鹽。裂解速率約為75-85％。具有分子量為約80,000道爾頓的酰基轉(zhuǎn)移酶不能透過(guò)超濾膜，因此而留在濃縮流中。所有其它的具有分子量為200道爾頓或更小的化合物可以透過(guò)所述膜而進(jìn)入透過(guò)流中。該酶促反應(yīng)有利地在溫度為20-40℃和pH值范圍為7.0-7.5下進(jìn)行。
c)結(jié)晶并分離由此制備的L-蛋氨酸本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有多種方法從N-未保護(hù)的氨基酸純化N-保護(hù)的氨基酸的混合物，如通過(guò)離子交換色譜(EP 276392；Preparation ofL-methionine and N-acetyl-D-methionine from the solution of enzymaticdeacylation hydrolyzed of N-acetyl-D，L-methionine by ion-exchange，Yan，Xiaomin；Zhao，Lin；Song，Zhengxiao；Jia Xiaobo，School ofChemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin，Peop.Rep.China，Lizi Jiaohuan Yu Xifu(2004)，20(4)，308-315.PublisherLizi Jiaohuan Yu Xifu Bianjibu，CODENLJYXE5 ISSN1001-5493)。優(yōu)選地，L-蛋氨酸的結(jié)晶在此情形中是用于從反應(yīng)混合物中分離L-蛋氨酸(US 6,114,163)。而且更優(yōu)選地，來(lái)自于酶裂解反應(yīng)的反應(yīng)混合物在結(jié)晶之前被濃縮。根據(jù)US 6,114,163，可以只進(jìn)行結(jié)晶本身。為此目的，收集來(lái)自EMR的反應(yīng)溶液并泵送入在減壓下操作的蒸發(fā)裝置。該裝置可以是普通的薄膜蒸發(fā)器或降膜蒸發(fā)器等。優(yōu)選地，在低于會(huì)發(fā)生外消旋的溫度下進(jìn)行濃縮，尤其是低于90℃。再一次，可以通過(guò)活性炭和壓濾機(jī)的過(guò)濾純化剩下的溶液以在優(yōu)選70-90℃之間除去帶色的雜質(zhì)。額外地或替代地，出于生物學(xué)過(guò)濾的目的，可以進(jìn)行通過(guò)微纖維過(guò)濾器的過(guò)濾，所述過(guò)濾器具有至少0.2微米的截留值。用于此目的優(yōu)選的膜由聚醚砜或聚丙烯或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它材料制成。
冷卻時(shí)L-蛋氨酸可以被結(jié)晶(US 6,114,163)。隨后，它可以通過(guò)離心而過(guò)濾，經(jīng)清洗并干燥。優(yōu)選地，清洗溶液由甲醇在水中的混合物(65-90重量％)構(gòu)成。清洗溶液可以被回收并且可以通過(guò)蒸餾回收甲醇。最優(yōu)選的是，將獲得的晶體懸浮于甲醇溶液中以除去最后的雜質(zhì)并保證微生物的質(zhì)量。優(yōu)選在低于40℃的溫度下進(jìn)行懸浮步驟。懸浮的晶體再一次通過(guò)離心而過(guò)濾，并用上述的甲醇溶液清洗?？梢酝ㄟ^(guò)蒸餾再一次循環(huán)甲醇清洗溶液。在最后的步驟中，在減壓和升溫下干燥濕的晶體，直到達(dá)到不高于125℃的最終溫度。
d)任選地，乙?；玫慕Y(jié)晶母液結(jié)晶過(guò)程步驟c)的母液包括少量的D-蛋氨酸，基于生態(tài)學(xué)的原因，其有時(shí)需要被乙?；⒅匦陆Y(jié)合進(jìn)入所述過(guò)程。為此目的，需要將母液的pH值調(diào)節(jié)至8.0-12.0，并向此混合物加入相應(yīng)量的乙酰氯或乙酸酐(已述的Schotten-Baumann-方法)。完成后，濃縮所得的混合物，任選地，對(duì)其進(jìn)行外消旋，并將其并入步驟a)的產(chǎn)物流以循環(huán)。
e)離子交換純化乙?；哪敢好噶呀夥磻?yīng)的母液包括未反應(yīng)的N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸，乙酸鹽和少量的L-蛋氨酸。為了不浪費(fèi)后者(非常昂貴)，必須對(duì)該材料進(jìn)行進(jìn)一步純化。有利地，通過(guò)陽(yáng)離子交換方法進(jìn)行該純化。為了獲得純化的副產(chǎn)物，在分離L-蛋氨酸以后對(duì)酶裂解反應(yīng)的母液進(jìn)行離子交換處理是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(EP 276392；WO 97/21667)。通過(guò)將所述母液經(jīng)受陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，未保護(hù)的L-蛋氨酸和堿金屬離子則被吸附至靜態(tài)相，而剩余的產(chǎn)物如N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸和乙酸鹽被洗脫。在一優(yōu)選的方式中，所述溶液被加熱到45-80℃并泵送至填充有陽(yáng)離子樹(shù)脂的柱上。L-蛋氨酸和堿金屬(優(yōu)選鈉)離子被吸附，而N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸和乙酸的酸性部分通過(guò)該柱。有利地，該過(guò)程可以通過(guò)三個(gè)獨(dú)立的離子交換柱進(jìn)行。在第一柱中，來(lái)自晶體分離的母液如上述處理以分離L-蛋氨酸和對(duì)溶液去礦化。隨后，在陰離子樹(shù)脂和陽(yáng)離子樹(shù)脂上成功處理N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸和乙酸部分。陰離子樹(shù)脂旨在從混合物中除去所有的陰離子，典型的，尤其是在外消旋步驟f)中會(huì)損壞不銹鋼設(shè)備的氯化物。陽(yáng)離子樹(shù)脂用來(lái)除去會(huì)導(dǎo)致步驟f)中不完全外消旋的最后痕量的堿金屬離子和L，(D)-蛋氨酸。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，離子交換樹(shù)脂可以重新載有H+或OH-。含有L-蛋氨酸的部分仍然存在于第一根陽(yáng)離子柱中，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)被洗脫(優(yōu)選參見(jiàn)下文)、收集，L-蛋氨酸任選地可以被例如通過(guò)結(jié)晶分離。這有助于收集多數(shù)制得的和理想的材料，以實(shí)現(xiàn)本方法相對(duì)于100％的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸，藥品級(jí)別的L-蛋氨酸大于75％的總收率。
f)外消旋步驟e)的純化的N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸
為了相比于外消旋的初始原料，使制得的L-蛋氨酸的比例最大化，必須將分離的N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸循環(huán)至過(guò)程中。然而，為了完成此目的，所述重新結(jié)合僅可通過(guò)其中在循環(huán)的混合物中增加N-乙?；?L-蛋氨酸的量的步驟而進(jìn)行，也即必須進(jìn)行外消旋。
外消旋N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的(Study on racemization of N-acetyl-D-methionine，Zhang，Qing-yu；Tan，Xin；Zhao，Lin；Song，Zheng-xiao；Jia，Xiao-bo；Zhang，Xin-fa，School ofChemical Engineering，Tianjin university，Tianjin，Peop.Rep.China，Huaxue Gongye Yu Gongcheng(Tianjin，China)(2004)，21(2)，91-95，PublisherHuaxue Gongye Yu Gongcheng Bianjibu，CODENHGGOERISSN1004-9533；WO 97/21650；EP 175840；US 6,114,163)。在一個(gè)有利的方式中，用離子交換過(guò)程的各自濃縮和去礦化的部分進(jìn)行N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸的外消旋。在非常有利的步驟中，通過(guò)加入少量的乙酸酐外消旋所得到的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸的熔融物以形成N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。該混合物被加熱至約120-150℃，并隨后在稀釋的堿金屬(優(yōu)選鈉)氫氧化物的溶液中驟冷。或者，來(lái)自于外消旋步驟的混合物可以通過(guò)在去礦化水中驟冷外消旋的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸而被清洗。冷卻后，N-乙?；?D，L-蛋氨酸晶體和雜質(zhì)殘留在母液中。
g)循環(huán)步驟f)的外消旋混合物至步驟b)中在酶裂解反應(yīng)之前，或者將在堿金屬氫氧化物中的稀釋的N-乙?；?D，L-蛋氨酸溶液，或者將通過(guò)在去礦化水中清洗N-乙酰基-D，L-蛋氨酸而獲得的晶體循環(huán)至步驟b)中。在使用堿金屬氫氧化物的情況中，用于酶拆分的溶液的pH值可以僅通過(guò)加入N-乙酰基-D，L-蛋氨酸堿金屬氫氧化物溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。
歸因于上述提及的本方法步驟的創(chuàng)造性的結(jié)合，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從N-乙?；?D，L-蛋氨酸的外消旋混合物開(kāi)始，以極其有利的方式獲得高質(zhì)量的純的對(duì)映異構(gòu)體的L-蛋氨酸，也即，具有最小量的浪費(fèi)和極高的產(chǎn)率。因此本發(fā)明的方法無(wú)論是從生態(tài)學(xué)還是從經(jīng)濟(jì)的角度，都是優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的。
然而，除此之外，本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式可以比原來(lái)更好地制備L-蛋氨酸。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式涉及如下的本發(fā)明的方法，其中將來(lái)自于步驟b)的混合物的一部分供入至離子交換步驟e)，其它的部分經(jīng)受步驟c)的結(jié)晶。在該方式中，來(lái)自于步驟b)的產(chǎn)物流被分成兩部分。一部分如上所述經(jīng)受步驟c)的進(jìn)一步處理。然而酶裂解反應(yīng)的第二部分在當(dāng)酶裂解的其它副產(chǎn)物如N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸和乙酸通過(guò)柱時(shí)，被用來(lái)從陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫L-蛋氨酸。這兩部分的比例可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)。目標(biāo)是使L-蛋氨酸的產(chǎn)率盡可能得高，并同時(shí)生產(chǎn)高質(zhì)量的產(chǎn)品。來(lái)自步驟b)的產(chǎn)物流的提及兩部分之間的優(yōu)選比例是20-50％∶80-50％，更優(yōu)選的是30-50％∶70-50％，最優(yōu)選的是40-50％∶60-50％。酶裂解反應(yīng)的混合物包括堿金屬離子。通過(guò)將所述混合物供應(yīng)至吸附L-蛋氨酸的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上，堿金屬離子會(huì)逐漸代替L-蛋氨酸，從而純的L-蛋氨酸從柱上被洗脫。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，將步驟e)中制備的純化的和去礦化的L-蛋氨酸溶液加入至步驟c)的結(jié)晶溶液。在結(jié)晶前，優(yōu)選在活性炭處理前，步驟e)的任選被濃縮的L-蛋氨酸溶液被加入至步驟c)的溶液是有利的。更優(yōu)選的是，在濃縮來(lái)自酶裂解反應(yīng)的溶液前，在不濃縮下將該溶液加入至步驟c)。
本發(fā)明的另一優(yōu)選的變體涉及如下，在酶裂解前，將鋅離子和/或鈷離子加入至混合物。這種方法明顯地增加了酶裂解能力。有利的是，利用每升反應(yīng)混合物10-3-10-5M的鋅離子。在此情形中，使用的鈷離子的量可以是每單位酶10-3-10-5的鈷離子。為了進(jìn)一步最小化來(lái)自反應(yīng)過(guò)程的廢物流，在純化L-蛋氨酸晶體的過(guò)程中，收集使用的甲醇清洗溶液和蒸餾可以再利用的甲醇是有利的。剩余的重相包括大量的L-蛋氨酸和N-乙?；?D，L-蛋氨酸。該重相可以任選地被循環(huán)至步驟d)的乙酰化過(guò)程中。結(jié)果是該材料被重新結(jié)合至總的L-蛋氨酸的制備過(guò)程中。
從上述描述的方法可以看出，L-蛋氨酸的制備方法由于其產(chǎn)生最小的廢物量和得到極高產(chǎn)率的高質(zhì)量的產(chǎn)品，可以在技術(shù)上高度多樣化地運(yùn)作。方法步驟的結(jié)合使獲得L-蛋氨酸較高的總收率，這明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，并有助于獲得上述有利的結(jié)果。
術(shù)語(yǔ)D，(L)-，(D)，L-或D，L-是指具有不同量的D-和L-異構(gòu)體的對(duì)映異構(gòu)體的混合物。在D，(L)-混合物中，D-對(duì)映異構(gòu)體是相對(duì)于L-形式主要存在的。同樣，在(D)，L-混合物中，L-對(duì)于D-異構(gòu)體的比例大于1。D，L-混合物是外消旋或幾乎外消旋的混合物(例如＜80％ee，優(yōu)選＜75％ee，更優(yōu)選＜65％ee)。
術(shù)語(yǔ)富含對(duì)映異構(gòu)體的或?qū)τ钞悩?gòu)體過(guò)量的(簡(jiǎn)稱ee)在本發(fā)明的上下文中被理解為混合物中對(duì)映異構(gòu)體與其光學(xué)對(duì)映體的比例＞50％且＜100％。ee值如下計(jì)算([對(duì)映異構(gòu)體1]-[對(duì)映異構(gòu)體2])/([對(duì)映異構(gòu)體1]+[對(duì)映異構(gòu)體2])＝ee值。
權(quán)利要求
1.L-蛋氨酸的制備方法，其包括a)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；b)酶裂解所述混合物；c)結(jié)晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；d)任選地，乙?；玫慕Y(jié)晶母液；e)離子交換純化所述乙?；哪敢海籪)外消旋在步驟e)中的所述純化的N-乙?；?D，(L)-蛋氨酸；g)循環(huán)步驟f)的外消旋混合物至步驟b)中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，將步驟b)的一部分混合物供應(yīng)至離子交換步驟e)中，和將剩下的部分經(jīng)受步驟c)的結(jié)晶。
3.如權(quán)利要求1和/或2所述的方法，其中，將在步驟e)中制備的純化的和去礦化的L-蛋氨酸溶液加入至步驟c)的結(jié)晶溶液中。
4.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中，在酶裂解之前，將鋅離子和/或鈷離子加入至所述混合物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及富含對(duì)映異構(gòu)體的L－蛋氨酸的制備方法。特別是，本發(fā)明包括制備L－蛋氨酸的循環(huán)酶法，其包括a)乙?；疍，L－蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；b)酶裂解所述混合物；c)結(jié)晶并分離由此制得的L－蛋氨酸；d)任選地，乙?；玫慕Y(jié)晶母液；e)離子交換純化所述乙?；哪敢海籪)外消旋在步驟e)中的所述純化的N－乙?；璂，(L)－蛋氨酸；g)循環(huán)步驟f)的外消旋混合物至步驟b)中。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101082054SQ20061008426
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者熱拉爾·里歇, 京特·克瑙普 申請(qǐng)人:德古薩股份公司, 德古薩集團(tuán)瑞克希姆公司