專利名稱：中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因快速檢測方法及檢測試劑盒，尤其涉及中國荷斯坦牛紅毛基因的快速檢測方法及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
牛的毛色是品種的重要特征之一，其種類較多，且與乳、肉等生產(chǎn)性能有直接的關(guān)系。牛的毛色主要是由皮膚與毛發(fā)中的真黑色素(褐與黑)與偽黑色素(紅與黃)的相對數(shù)量與分布情況所決定的。現(xiàn)有研究表明牛黑素皮質(zhì)素受體1基因(melanocortin-1-receptor gene，MC1R)是奶牛黑白花和紅白花形成過程中的主效基因。牛MC1R基因在黑色素細(xì)胞中表達(dá)，與天然配體α-促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)相互作用，經(jīng)由G蛋白耦合的cAMP信號通路，調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞內(nèi)的一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終經(jīng)多巴或多巴胺合成各自的衍生物-褐黑素或真黑色素，使動物呈現(xiàn)不同的毛色或羽色。
牛MC1R基因定位在第18號染色體，長954bp，編碼317個(gè)氨基酸，主要存在3個(gè)等位基因(ED，E+，e)。ED在T296C的置換突變，在表型上主要表現(xiàn)黑色毛色；E+為野生型基因，表現(xiàn)各種毛色；e為隱性基因，表現(xiàn)或強(qiáng)或弱的紅毛表型。
中國荷斯坦牛是我國產(chǎn)奶量最高、數(shù)量最多，分布最廣的乳牛品種，毛色以黑白花為主，偶爾出現(xiàn)紅白花。因此，通常人們以毛色為黑白花的牛作為純種牛的特征，由于過度追求品種毛色的統(tǒng)一性，紅白花牛被當(dāng)作不受歡迎的個(gè)體，牛場主不希望出現(xiàn)紅白花牛，當(dāng)牛場中出現(xiàn)紅白花牛，牛場主就悄悄淘汰掉，以免買主對其牛群純度懷疑，影響其銷售和收入。鑒于此，有必要建立一種對中國荷斯坦牛紅毛基因的快速檢測方法，利用對奶牛紅毛基因進(jìn)行檢測，不僅有助于優(yōu)秀種公牛純度鑒別，避免由此引起的一些經(jīng)濟(jì)糾紛，而且對優(yōu)化我國奶牛育種技術(shù)體系具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決問題是利用PCR-RFLP技術(shù)和DNA測序技術(shù)建立一種中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測方法，并進(jìn)一步細(xì)化制備出應(yīng)用試劑盒，為優(yōu)質(zhì)種公牛純度鑒別及奶牛育種提供方便。
本發(fā)明所述中國荷斯坦牛紅毛基因的檢測方法，包括牛血樣品采集(ACD抗凝)，提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳之步驟；其特征在于所述特異性引物序列是15’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，25’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’；所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為15μL，其中含有基因組DNA 100ng，引物0.2mM，dNTPs 0.2mM，MgCl21.5mM，Taq酶1U；所述PCR擴(kuò)增的條件為95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，62℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；所述限制性內(nèi)切酶消化用等量的限制性內(nèi)切酶MspI和限制性內(nèi)切酶MspA1I。
本發(fā)明所述中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測試劑盒，其特征在于包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.0mM dNTPs；10mM上下游引物；15mM Mg2+；dd H2O；5U/μLTaq酶；保存溫度-20℃；
上述PCR體系為10×buffer 1.5μL；dNTPs 1.5μL；上下游引物MC1R2-F5’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，MC1R2-R5’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’各0.3μL；Mg2+1.5μL；dd H2O 8.4μL，Taq酶1U，DNA 100ng；RFLP試劑盒包括10U/μL限制性內(nèi)切酶MspI；10U/μ L限制性內(nèi)切酶MspA1I；dd H2O；Buffer，由330mM Tris-Ac pH7.9，100mM Mg-Ac，5mM Dithiothreitol，660mMK-Ac組成；0.1％BSA；保存溫度-20℃；上述RFLP體系為10U/μL限制性內(nèi)切酶MspI 1μL；10U/μL限制性內(nèi)切酶MspA1I1μL；dd H2O 6μL；Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；PCR產(chǎn)物8μL。
以往對動物毛色的研究多集中在色素的量上，方法繁瑣，定量困難，準(zhǔn)確度不高，且難以大范圍操作；本發(fā)明利用PCR-RFLP技術(shù)和DNA測序技術(shù)在基因水平上進(jìn)行操作，并且成功建立了適于對奶牛紅毛基因進(jìn)行快速檢測方法以及檢測試劑盒，不僅方法簡便、快速、價(jià)格低廉，而且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明方法對紅毛基因的檢出率可達(dá)100％，為優(yōu)質(zhì)種公牛純度鑒別及奶牛育種提供了有力的手段，對優(yōu)化我國奶牛育種技術(shù)體系，保證牛群種質(zhì)，保持奶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有重要意義。


圖1MC1R 3個(gè)等位基因的基因型。
其中PCR產(chǎn)物用MspA1I(左邊)和MspI(右邊)酶切后在2％的瓊脂糖凝膠上電泳。
圖2中國4品種牛典型序列以及NCBI上已發(fā)表的MC1R基因序列比對。
其中中國荷斯坦紅白花牛和魯西黃牛310位置缺失了G；渤海黑牛存在T296C的置換突變；所有所測序牛編碼區(qū)725位置都為C，而NCBI上序列都為A。
具體實(shí)施例方式
1.牛血樣品采集對牛進(jìn)行頸靜脈采血，加ACD抗凝(血液∶ACD＝6∶1)。共采集血樣420份，包括中國荷斯坦黑白花牛共160份采自山東冷水溝奶牛場120頭，山東農(nóng)科院奶牛中心40頭；中國荷斯坦紅白花牛共20份，采自山東冷水溝奶牛場8份，天津4份，北京8份；魯西黃牛共124份采自山東唐王牛場；渤海黑牛共116份采自濱州牛場。采樣方式為隨機(jī)抽樣。
2.血液DNA提取根據(jù)常規(guī)苯酚氯仿法提取牛血液基因組DNA。
3.引物設(shè)計(jì)引物序列為MC1R2-F5’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’MC1R2-R5’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’4.利用本發(fā)明所述中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為15μL，其中含有基因組DNA約100ng，引物0.2mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，MgCl21.5mmol/L，Taq酶1U。
PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5min；然后35個(gè)循環(huán)94℃變性30s，62℃復(fù)性30s，72℃延伸30s。最后72℃延伸7min。
(2)限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系為20μL，其中限制性內(nèi)切酶MspI 1μL，限制性內(nèi)切酶MspA1I 1μL，dd H2O 6μL，Buffer2μL，0.1％BSA 2μL，PCR產(chǎn)物8μL。
(3)凝膠電泳檢測用2％瓊脂糖凝膠電泳，80V，1.5h，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析圖形(見圖1)。
(4)PCR-RFLP檢測結(jié)果MspI酶切E/E得到328bp、249bp、192bp的片段；E/e到519bp、328bp、249bp、192bp的片段；e/e到519bp、249bp的片段(圖1右面)。
當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳圖出現(xiàn)Marker右一條帶情況者即為紅毛表型；出現(xiàn)Marker右二情況者為紅毛基因攜帶者(不表現(xiàn)紅毛表型)。
MspA1I酶切ED/ED得到593bp、229bp的片段；ED/E+得到593bp、229bp、181bp的片段；E+/E+得到593bp、181bp的片段(圖1左面)。
上述RFLP體系為10U/μL限制性內(nèi)切酶MspI 1μL；10U/μL限制性內(nèi)切酶MspA1I1μL；dd H2O 6μL；Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；PCR產(chǎn)物8μL。
5.DNA序列分析用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物用SmaI酶切后與同時(shí)用SmaI酶切的pUC18載體連接，藍(lán)白斑篩選出重組子，取陽性克隆送上海生工測序。分別檢測4頭中國荷斯坦黑白花牛、中國荷斯坦紅白花牛、魯西黃牛、渤海黑牛MC1R基因序列。
6.測序結(jié)果所得序列比對分析發(fā)現(xiàn)MC1R基因存在2個(gè)突變位點(diǎn)，ED基因存在T296C的置換突變，導(dǎo)致99位亮氨酸到脯氨酸的突變，在表型上主要表現(xiàn)黑色毛色。隱性的e基因在310處缺失一個(gè)堿基G，造成移碼突變，在468處提前終止翻譯，翻譯出一個(gè)縮短了的失去功能的MC1R蛋白表現(xiàn)或強(qiáng)或弱的紅色毛色。
值得一提的是MC1R編碼區(qū)725位置在所測序牛中都為C，而GenBank上發(fā)表序列為A(如圖2)。
權(quán)利要求
1.一種中國荷斯坦牛紅毛基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳之步驟；其特征在于所述特異性引物序列是15’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，25’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’；所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為15μL，其中含有基因組DNA 100ng，引物0.2mM，dNTPs 0.2mM，MgCl21.5mM，Taq酶1U；所述PCR擴(kuò)增的條件為95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，62℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；所述限制性內(nèi)切酶消化用等量的限制性內(nèi)切酶MspI和限制性內(nèi)切酶MspAlI。
2.一種中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測試劑盒，其特征在于包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.0mM dNTPs；10mM上下游引物；15mM Mg2+；dd H2O；5U/μL Taq酶；保存溫度-20℃；上述PCR體系為10×buffer 1.5μL；dNTPs 1.5μL；上下游引物MC1R2-F5’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，MC1R2-R5’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’各0.3μL；Mg2+1.5μL；dd H2O 8.4μL，Taq酶1U，DNA 100ng；RFLP試劑盒包括10U/μL限制性內(nèi)切酶MspI；10U/μL限制性內(nèi)切酶MspAlI；dd H2O；Buffer，由330mM Tris-Ac pH7.9，100mM Mg-Ac，5mM Dithiothreitol，660mMK-Ac組成；0.1％BSA；保存溫度-20℃；上述RFLP體系為10U/μL限制性內(nèi)切酶MspI 1μL；10U/μL限制性內(nèi)切酶MspAlI1μL；dd H2O 6μL；Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；PCR產(chǎn)物8μL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中國荷斯坦牛紅毛基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳之步驟；其中所述引物是15’－CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC－3’，25’－AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC－3’；所述PCR擴(kuò)增的條件為95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，62℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；所述限制性內(nèi)切酶消化用等量的限制性內(nèi)切酶MspI和限制性內(nèi)切酶MspAlI。本發(fā)明還同時(shí)公開了紅毛基因快速檢測試劑盒，包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分。本發(fā)明方法簡便、快速，而且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為優(yōu)質(zhì)種公牛純度鑒別及奶牛育種提供了有力的手段，對優(yōu)化我國奶牛育種技術(shù)體系，保證牛群種質(zhì)，保持奶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK101016563SQ200610070569
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月4日
發(fā)明者李秋玲, 李建斌, 王洪梅 申請人:山東奧克斯生物技術(shù)有限公司