專利名稱：S－腺苷－l－甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法。
背景技術(shù)：
S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作為重要的中間代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各種生物體中，也是人體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，參與體內(nèi)許多代謝途徑和關(guān)鍵的生化反應(yīng)，如甲基化反應(yīng)，轉(zhuǎn)硫反應(yīng)及聚胺合成反應(yīng)等。SAM是體內(nèi)最重要的甲基供體，是甲硫氨酸在甲基化反應(yīng)中的活性形式。SAM參與的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)對(duì)體內(nèi)多種重要物質(zhì)的合成、活化和代謝有著重要的影響，如荷爾蒙、神經(jīng)傳遞介質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、磷脂等。體內(nèi)SAM濃度的微小變化都會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長、分化和功能產(chǎn)生重大影響。在臨床上主要用于肝病、關(guān)節(jié)炎和抑郁癥的治療。SAM還是重要的癌癥化學(xué)預(yù)防藥物，越來越多的引起人們的注意。另外，SAM對(duì)高血脂癥、動(dòng)脈硬化癥、纖維性肌痛、偏頭痛、老年性癡呆和老年前期癡呆有很好的治療效果。
但是SAM的穩(wěn)定性問題一直是限制其大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的重要因素。由于SAM分子結(jié)構(gòu)中高能硫離子的存在，使相連的C原子十分活潑，硫-碳鍵極易斷裂，使得SAM分子很不穩(wěn)定。即使在室溫和固體狀態(tài)下也會(huì)發(fā)生降解。當(dāng)溫度高于室溫，或在溶液狀態(tài)下，SAM均表現(xiàn)出極端的不穩(wěn)定性。SAM的不穩(wěn)定性可以通過與陰離子結(jié)合而受到抑制，而且其穩(wěn)定性與陰離子的尺寸有關(guān)，離子尺寸越大，空間位阻也就越大，所形成的SAM鹽就越穩(wěn)定。
國外有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)用苦酮酸選擇性沉淀，結(jié)合溶劑萃取的方法制備SAM對(duì)甲苯磺酸鹽(Fiecchi，Alberto.Process of preparing double salts ofS-adenosyl-L-methionine.U.S.Pat.4028183，1977)，但苦酮酸具有一定的毒性，受熱或受到撞擊就會(huì)爆炸，使用苦酮酸作為沉淀劑還會(huì)向體系中引入較深的顏色。而且有機(jī)溶劑用量大，種類多，對(duì)環(huán)境污染大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種性能穩(wěn)定、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法。
本發(fā)明的S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法，其步驟如下1)攪拌下，用乙酸乙酯水溶液從經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的釀酒酵母細(xì)胞中抽提S-腺苷-L-甲硫氨酸15～60分鐘，每公斤酵母細(xì)胞加入乙酸乙酯水溶液150ml～300ml，乙酸乙酯與水的體積比為1∶4～3∶2，然后向上述抽提體系中加入摩爾濃度0.15～0.2的硫酸溶液進(jìn)行酸化處理1～2小時(shí)，按每公斤酵母細(xì)胞加入硫酸溶液400ml～600ml，離心，去除細(xì)胞碎片，得到含有S-腺苷-L-甲硫氨酸的萃取液；2)調(diào)節(jié)S-腺苷-L-甲硫氨酸萃取液的pH值至4.5～6.0，以每小時(shí)1～4倍床層體積的流速通過裝填有弱酸性陽離子交換樹脂的柱子，樹脂與萃取液的體積比為1∶4～1∶6，上樣完成后，用摩爾濃度0.15～0.30的對(duì)甲苯磺酸進(jìn)行洗脫，得到S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液；3)將S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液用截留分子量200的交聯(lián)芳香族聚酰胺膜納濾濃縮；4)攪拌狀態(tài)下，將濃縮液以5～10毫升/分鐘的速度滴入無水甲醇中，無水甲醇與濃縮液的體積比為10∶1～5∶1，滴加完成后繼續(xù)攪拌0.5～1.0小時(shí)，然后靜置，沉降，過濾，收集晶體，用90％的甲醇溶液洗滌，真空干燥，得到S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽。
本發(fā)明中，所說的弱酸性陽離子交換樹脂可以是市售的JK110、HD2、D113、D115、D151或D152。
本發(fā)明應(yīng)用離子交換法從酵母細(xì)胞中提純S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和利用反向鹽析結(jié)晶法制備SAM對(duì)甲苯磺酸鹽。該發(fā)明的特點(diǎn)是1.利用離子交換法代替已有的有機(jī)溶劑沉淀法，降低了生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，將SAM的分離純化和穩(wěn)定鹽生成集成在一步完成，減少了工藝步驟，大大提高了產(chǎn)品回收率；2.利用反向鹽析結(jié)晶法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的正向結(jié)晶法，所得S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽產(chǎn)品的純度高，顆粒粒度分布均一；穩(wěn)定性很好，45℃，60天內(nèi)SAM對(duì)甲苯磺酸鹽含量幾乎不變；4.工藝路線簡單，有機(jī)溶劑用量小，產(chǎn)品回收率高，生產(chǎn)成本低，具有很好的工業(yè)化前景。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例11)釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，4℃，5000轉(zhuǎn)離心，收獲40公斤濕菌體。加入9.6升體積濃度為50％乙酸乙酯水溶液，劇烈攪拌處理30分鐘，然后用20升0.175mol/lH2SO4繼續(xù)處理1.5小時(shí)。5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去除細(xì)胞碎片，得到含有SAM的萃取液40升，其中SAM的含量為8.6g/l。
2)40升含有SAM的萃取液，用5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至pH5.0，以每小時(shí)2倍樹脂床層體積的流速通過6.7升JK110離子交換樹脂柱。上樣結(jié)束后，先用30升的去離子水沖洗柱子，然后用0.15mol/l的對(duì)甲苯磺酸溶液進(jìn)行洗脫，得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液25L，其濃度為13.2g/l，SAM回收率為96％。
3)由于SAM對(duì)溫度的敏感性，使用截留分子量200的交聯(lián)芳香族聚酰胺膜，將25升SAM對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液納濾濃縮至120g/l，得濃縮液2.70L，SAM回收率為98％。
4)攪拌狀態(tài)下，將濃縮液以8毫升/分鐘的速度緩慢滴入20升無水甲醇中，攪拌轉(zhuǎn)速為45轉(zhuǎn)/分鐘。滴加完成后繼續(xù)攪拌1.0小時(shí)，然后靜置，沉降。過濾后收集晶體，用90％的甲醇溶液洗滌晶體兩次，50℃真空干燥得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽產(chǎn)品610克，純度97.4％。
實(shí)施例21)釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，4℃，5000轉(zhuǎn)離心，收獲40公斤濕菌體。加入12升體積濃度為20％乙酸乙酯水溶液，劇烈攪拌處理60分鐘，然后用16升0.15mol/lH2SO4繼續(xù)處理2小時(shí)。5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去除細(xì)胞碎片，得到含有SAM的萃取液38升，其中SAM的含量為8.7g/l。
2)38升含有SAM的萃取液，用5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至pH4.5，以每小時(shí)1倍樹脂床層體積的流速通過9.5升D113離子交換樹脂柱。上樣結(jié)束后，先用30升的去離子水沖洗柱子，然后用0.3mol/l的對(duì)甲苯磺酸溶液進(jìn)行洗脫，得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液22.5升，其SAM濃度為14.1g/l，SAM回收率為96％。
3)由于SAM對(duì)溫度的敏感性，使用截留分子量200的交聯(lián)芳香族聚酰胺膜，將22.5升SAM對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液納濾濃縮至125g/l，得濃縮液2.50L，SAM回收率為98％。
4)攪拌狀態(tài)下，將濃縮液以5毫升/分鐘的速度緩慢滴入12.5升無水甲醇中，攪拌轉(zhuǎn)速為45轉(zhuǎn)/分鐘。滴加完成后繼續(xù)攪拌1.0小時(shí)，然后靜置，沉降。過濾后收集晶體，用90％的甲醇溶液洗滌晶體兩次，50℃真空干燥得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽產(chǎn)品603克，純度98.2％。
實(shí)施例31)釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，4℃，5000轉(zhuǎn)離心，收獲40公斤濕菌體。加入6升體積濃度為60％乙酸乙酯水溶液，劇烈攪拌處理15分鐘，然后用30升0.15mol/lH2SO4繼續(xù)處理1.0小時(shí)。5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去除細(xì)胞碎片，得到含有SAM的萃取液46升，其中SAM的含量為7.1g/l。
2)46升含有SAM的萃取液，用5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至pH6.0，以每小時(shí)4倍樹脂床層體積的流速通過10升D115離子交換樹脂柱。上樣結(jié)束后，先用30升的去離子水沖洗柱子，然后用0.125mol/l的硫酸溶液進(jìn)行洗脫，得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液24L，其SAM濃度為13g/l，SAM回收率為95％。
3)由于SAM對(duì)溫度的敏感性，使用截留分子量200的交聯(lián)芳香族聚酰胺膜，將24升SAM對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液納濾濃縮至120g/l，得濃縮液2.5L，SAM回收率為96％。
4)攪拌狀態(tài)下，將濃縮液以10毫升/分鐘的速度緩慢滴入25升無水甲醇中，攪拌轉(zhuǎn)速為45轉(zhuǎn)/分鐘。滴加完成后繼續(xù)攪拌1.0小時(shí)，然后靜置，沉降。過濾后收集晶體，用90％的甲醇溶液洗滌晶體兩次，50℃真空干燥得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽產(chǎn)品598克，純度98.5％。
按照《中華人民共和國藥典》2000年版附錄XIXC藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則中關(guān)于熱穩(wěn)定性試驗(yàn)的要求，對(duì)SAM對(duì)甲苯磺酸原料藥進(jìn)行溫度穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表1。由表1中結(jié)果可知，在30℃、45℃條件下，SAM對(duì)甲苯磺酸鹽外觀和含量均無變化，而且60天內(nèi)含量幾乎不變，穩(wěn)定性非常好。表中含量指純SAM的含量，不包括對(duì)甲苯磺酸根和水分。
表1SAM對(duì)甲苯磺酸鹽穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果

權(quán)利要求
1.S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法，其步驟如下1)攪拌下，用乙酸乙酯水溶液從經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的釀酒酵母細(xì)胞中抽提S-腺苷-L-甲硫氨酸15～60分鐘，每公斤酵母細(xì)胞加入乙酸乙酯水溶液150ml～300ml，乙酸乙酯與水的體積比為1∶4～3∶2，然后向上述抽提體系中加入摩爾濃度0.15～0.2的硫酸溶液進(jìn)行酸化處理1～2小時(shí)，按每公斤酵母細(xì)胞加入硫酸溶液400ml～600ml，離心，去除細(xì)胞碎片，得到含有S-腺苷-L-甲硫氨酸的萃取液；2)調(diào)節(jié)S-腺苷-L-甲硫氨酸萃取液的pH值至4.5～6.0，以每小時(shí)1～4倍床層體積的流速通過裝填有弱酸性陽離子交換樹脂的柱子，樹脂與萃取液的體積比為1∶4～1∶6，上樣完成后，用摩爾濃度0.15～0.30的對(duì)甲苯磺酸進(jìn)行洗脫，得到S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液；3)將S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽洗脫液用截留分子量200的交聯(lián)芳香族聚酰胺膜納濾濃縮；4)攪拌狀態(tài)下，將濃縮液以5～10毫升/分鐘的速度滴入無水甲醇中，無水甲醇與濃縮液的體積比為10∶1～5∶1，滴加完成后繼續(xù)攪拌0.5～1.0小時(shí)，然后靜置，沉降，過濾，收集晶體，用90％的甲醇溶液洗滌，真空干燥，得到S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-腺苷-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法，其特征是所說的弱酸性陽離子交換樹脂為JK110、HD2、D113、D115、D151或D152。
全文摘要
本發(fā)明公開的S－腺苷－L－甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽的制備方法，其步驟如下1)用乙酸乙酯水溶液從經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的釀酒酵母細(xì)胞中抽提S－腺苷－L－甲硫氨酸(SAM)；2)利用離子交換法分離純化SAM，同時(shí)將其轉(zhuǎn)化為SAM的對(duì)甲苯磺酸鹽溶液；3)用納濾膜濃縮SAM的對(duì)甲苯磺酸鹽溶液；4)以甲醇為溶劑，利用反向鹽析法得到SAM對(duì)甲苯磺酸鹽結(jié)晶，50℃真空干燥得到產(chǎn)品。本發(fā)明工藝路線簡單，有機(jī)溶劑用量小，產(chǎn)品回收率高，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低，具有很好的工業(yè)化前景。
文檔編號(hào)C12R1/865GK1935826SQ20061005383
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者徐志南, 陳勇, 沈文和, 林建平, 岑沛霖 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)