專利名稱：一種玉米秸稈水解液生產(chǎn)燃料酒精的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米秸稈水解發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精的發(fā)酵工藝。它利用不同的工程菌在發(fā)酵的不同階段加入起到先糖化后發(fā)酵的結(jié)果，使得水解液中的木質(zhì)素、木糖、纖維素、葡萄糖等的水解率和同化率增加，對(duì)酒精轉(zhuǎn)化率增加，縮短發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)降低發(fā)酵成本。
背景技術(shù)：
目前世界面臨石油危機(jī)和環(huán)境危機(jī)，目前各國正在大力尋找可替代的能源。許多國家把眼光投向取之不盡的纖維素質(zhì)原料。玉米秸稈是我國資源豐富的纖維素質(zhì)材料，也是農(nóng)作物廢棄物，大量被農(nóng)民焚燒于田間，價(jià)格低廉。玉米秸稈含50％的纖維素，30％的半纖維素和20％的木質(zhì)素，經(jīng)過水解可釋放大量葡萄糖和木糖等。但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)能同時(shí)代謝木糖和葡萄糖的釀酒酵母，結(jié)果，利用玉米秸稈的發(fā)酵因?yàn)榉抢w維素和木質(zhì)素的廢棄以及酶制劑的成本問題而讓位于玉米發(fā)酵酒精技術(shù)，例如在美國。
但是，利用玉米秸稈發(fā)酵酒精技術(shù)畢竟是發(fā)展的方向，它不與人爭(zhēng)糧食，不與糧食爭(zhēng)地，產(chǎn)量巨大，分布廣泛?，F(xiàn)行我國纖維素酒精發(fā)酵技術(shù)只能利用葡萄糖，只應(yīng)用了傳統(tǒng)育種方法，使用的是非工程菌，具有總的糖酸轉(zhuǎn)化率低，時(shí)間長(zhǎng)，酒精水平低等缺陷。在這種情況下，再優(yōu)化發(fā)酵工藝也難以進(jìn)一步提高酒精的發(fā)酵能力，這些往往必須通過現(xiàn)代遺傳和代謝工程技術(shù)才能解決。
本發(fā)明就是通過使用借助現(xiàn)代基因工程技術(shù)開發(fā)的能夠代謝木糖的釀酒酵母，和能夠分泌高溫纖維素酶的釀酒酵母，從而大大改變了現(xiàn)行發(fā)酵工藝。
本發(fā)明根據(jù)上述原理而實(shí)施，旨在提高玉米秸稈水解液的酒精發(fā)酵產(chǎn)量和降低成本。

發(fā)明內(nèi)容1.種子的培養(yǎng)將攜帶編碼纖維素酶基因的釀酒酵母工程菌從低溫凍存管中取出在28-34℃富含氨基酸的豐富培養(yǎng)液中培養(yǎng)(例如酵母氮基)到OD600nm值2.0以上，全部接入下一個(gè)培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中(接種比10％)，28-32℃培養(yǎng)至OD600nm值2.0以上，可以作為上罐種子，如果上罐種子體積不足，可以參照上述方法繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.玉米秸稈水解液的制作將玉米秸稈洗凈切碎或則細(xì)粉然后進(jìn)行算法水解或者減法水解等，水解時(shí)間10-540min，酸堿中和到pH3.8-7.0，加入氮源、無機(jī)鹽以及必要的維生素等，在發(fā)酵罐內(nèi)滅菌，116-121℃，15-30min。降溫到27-34℃等待接種。
3.接種將上述種子和按照步驟1培養(yǎng)的能夠同化木糖的釀酒酵母工程菌培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種比1-10％，發(fā)酵罐溶液占用管內(nèi)空間在30-75％，接種溫度27-34℃，攪拌初始速度30-500rpm，以氨水或者NaOH等堿性溶液調(diào)節(jié)初始pH為3.8-7.0，在溶氧高于10％時(shí)發(fā)酵8-26h，維持溶氧低于5％直道培養(yǎng)液內(nèi)酒精濃度大于7％，放罐。
4.實(shí)施例1在發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到OD600nm值1.0以上，大約接種后16小時(shí)以后，將發(fā)酵液升溫到48-60℃糖化1～6h，然后降溫到27-34℃，接種按照步驟1準(zhǔn)備的木糖利用型釀酒酵母工程菌，接種比1-10％，調(diào)節(jié)溶氧10％以上，維持8-6小時(shí)，控制溶氧在5％以下，發(fā)酵到殘余葡萄糖濃度低于5g/L，木糖濃度低于10g/L。放罐。
5.實(shí)施例2在發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到OD600nm值1.0以上，大約接種后16小時(shí)以后，將發(fā)酵液升溫到48-60℃糖化1-6h，然后降溫到27-34℃，接種按照步驟1準(zhǔn)備的木糖利用型釀酒酵母工程菌，接種比1-10％，調(diào)節(jié)溶氧10％以上，維持8-6小時(shí)，控制溶氧在5％以下，發(fā)酵到殘余葡萄糖濃度低于5g/L，木糖濃度低于10g/L。放罐。
6.實(shí)施例3將上述種子和按照步驟1培養(yǎng)的能夠同化木糖的釀酒酵母工程菌培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種比1-10％，發(fā)酵罐溶液占用管內(nèi)空問在30-75％，接種溫度27-34℃，攪拌初始速度30-500rpm，以氨水或者NaOH等堿性溶液調(diào)節(jié)初始pH為3.8-7.0，在溶氧高于10％時(shí)發(fā)酵8-26h，維持溶氧低于5％直道培養(yǎng)液內(nèi)酒精濃度大于7％，放罐。
7.流加控制工藝4在發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到OD600nm值1.0以上，大約接種后10小時(shí)以后，流加總糖濃度大于300g/L的調(diào)節(jié)pH后的玉米秸稈水解液用以控制溶氧不高于50％。
8.流加控制工藝5在發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到OD600nm值1.0以上，大約接種后10小時(shí)以后，流加總糖濃度大于300g/L的調(diào)節(jié)pH后的玉米秸稈水解液用以控制pH不高于7.2。
結(jié)果，經(jīng)過本發(fā)明實(shí)施例，玉米秸稈的酒精發(fā)酵能力可達(dá)7.0％以上，總糖酸轉(zhuǎn)化率在80％以上，基本做到4噸秸稈制造一噸酒精。
權(quán)利要求
1在利用秸稈水解液制成的發(fā)酵液中加入產(chǎn)纖維素酶的大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精。
2在利用秸稈水解液制成的發(fā)酵液中加入能夠產(chǎn)木質(zhì)素酶的大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精。
3本發(fā)明利用工程菌直接分泌產(chǎn)生纖維素酶和木質(zhì)素酶，從而可以通過秸稈水解液的流加來控制發(fā)酵進(jìn)程。
4本法適用于來源于利用各種技術(shù)合成的各種DNA序列編碼的纖維素酶、木質(zhì)素酶的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用能夠生產(chǎn)纖維素酶和木質(zhì)素酶的大腸桿菌工程菌來發(fā)酵玉米秸稈(預(yù))水解液生產(chǎn)酒精。本發(fā)明可以利用溶氧值、pH值和單糖濃度來控制流加工藝，本發(fā)酵也可以利用在不同時(shí)刻接入不同的釀酒酵母工程菌以及決定是否升溫糖化來發(fā)酵生產(chǎn)酒精。本發(fā)明能明顯提高玉米秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)酒精的單位時(shí)間單位體積內(nèi)的生產(chǎn)力，縮短發(fā)酵和通話時(shí)間，簡(jiǎn)化控制操作，降低發(fā)酵成本。
文檔編號(hào)C12P7/10GK101033474SQ200610016639
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者李校堃, 袁輝, 王艷萍, 孟娟 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)