專利名稱：：用于賦予對植物病害生物和植物病原體抗性的方法和材料的制作方法用于賦予對植物病害生物和植物病原體抗性的方法和材料本申請要求2004年10月21日提交的美國臨時申請第60/621,542號和2005年3月1日提交的美國臨時申請第60/657,821號的優(yōu)先權，兩份申請在本文中完整地引用作為參考。發(fā)明領域植物病害生物(例如真菌病原體、細菌、線蟲、昆蟲、病毒等)引起世界范圍、尤其在U中國家中食物和纖維的重要損失.損失包括直接產(chǎn)量損失或M前損失、收IL^損失和貯藏損失以^L食物品質和安全性降低(例如因為真菌毒素的產(chǎn)生).在因美學特性、芳香特性或生態(tài)特性而有^h值的植物中觀察到源自植物病害生物的其它損失。植物病害生物有時可以通迚拖用化學品(例如殺真菌劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、殺寄生蟲劑)、操縱或管理微觀環(huán)境或通過病原體抗性基因進行控制。發(fā)現(xiàn)并導入抗性"新"基因常導致能夠感染含有這種"新"基因的病原體新種族的發(fā)生和選擇。這已經(jīng)通過谷物作物的銹菌病和黑粉病得到最充分證實，但是它還可能隨土源疾病如分別由煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)和大豆疫霉(P.sojae)所致的煙草黑脛病和大豆根腐和莖腐病發(fā)生。存在至少兩個種的煙草疫霉以J5U^過70個種的大豆疫霉，所有這些均需要不同基因或基因的組合用于疾病抗性。疫霉屬真菌包含引起植物嚴重疾病的破壞力非常強的眾多病原體物種。這些嚴重疾病包括影響種類繁多的糧食作物、纖維作物和油料作物，包括鱘梨(avocado)、可可(cacao)、卡諾拉油菜(canola)、柑桔(citrus)、胡椒(pepper)、馬鈴薯、大豆、煙草、番茄、松(pine)、橡膠(rubber)、櫟樹(oaktree)等的枯萎病、猝倒病、潰瘍病、爛果病、根腐病、萎蔫和許多其它癥狀。基因沉默或RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象過去十年間已經(jīng)在眾多生物如植物、真菌、線蟲、水螅和人中描述和表征(Zamore和Haley，2005)。據(jù)認為該現(xiàn)象是一種古老的防御機制，其中宿主生物將雙鏈RNA分子識別為外來物并且使之水解。得到的水解產(chǎn)物是稱作小干擾RNA(siRNA)的長度21-30個核苷酸的小RNA片段，siRNA隨后擴散或被攜帶至宿主全身各處，在那里它們與特定基因的mRNA雜交并且引起mRNA水解以產(chǎn)生更多siRNA。該過程每次在siRNA與其同源的mRNA雜交時重復，有效地阻止mRNA翻譯，并且使特^Jl因的表達"沉默"。Fire等(2003)描逸法用RNA至宿主的方法，其中RNA由與宿主細胞的基因同源的有義序列和反義序列組成以沉默此宿主細胞的基因。US6,506,559。vanWest等(1999)得到的結果證實致病疫霉中的核間基因沉默。他們以處于有義方向和反義方向的infl激發(fā)素(elicitin)基因轉化致病疫霉。此^f"致轉基因以及內源基因的沉默。通過已沉默的轉基因菌抹和野生型菌林的體細胞融合，他們說明兩個重要論點；首先，轉基因自身的存在對維持受沉默的狀態(tài)不是必需的；其次，涉及的能夠在細胞核間轉運沉默信號的反式作用因子后來發(fā)現(xiàn)是siRNA。Waterhouse等(WO9953050Al)已經(jīng)描述通過用針對植物病毒基因的基因沉默構建體轉化植物而向植物賦予病毒抗性的方法。Wang等(US20030180945A1)描述通過提供真菌針對真菌基因的基因沉默構建體在真菌中沉默基因的方法.本
技術領域：
內所需的是可iSil適應于生物環(huán)境中的變化，如新發(fā)的嚴重植物疾病的植物抗性方法。例如，在美國直到2004年12月大豆中未出現(xiàn)亞洲銹菌病。預計亞洲銹菌病在2005-2006年引起預計10億至70億美元(USDA)損失，如果存在賦予植物對真菌、昆蟲、線蟲、細菌等抗性的通用遺傳方法，也將顯著推進^L術領域。發(fā)明概述本發(fā)明現(xiàn)在提供用于向植物賦予病害生物抗性的方法和構建體，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反5l^列，和(b)基本互補于所it^義序列的有義序列；其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由反義序列和有X^列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)；其中所述的有義序列和反義序列分別是長度至少大約19個核苷酸；并且其中反義序列與來自不同物種的至少兩種病害生物的致病性基因同」害生物是抗';的。、、'土$，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于向植物賦予病害生物抗性的方法和構建體，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對第一病害生物致病性基因同源性的第一反義序列；(b)具有對第二病害生物致病性基因同源性的第二反義序列；(c)基本互補于所述第一反義序列的第一有義序列；和(d)基本互補于所述第二反義序列的第二有義序列，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由第一反義序列和第一有義序列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由第二反義序列和第二有義序列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)，并且其中所述的第一和第二有義序列以及第一和第二反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸，因此，現(xiàn)在可以使植物對屬于選自昆蟲、細菌、真菌、植物和線蟲的相同或不同成員的多種病害生物抵抗。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于向植物賦予病害生物抗性的方法和構建體，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)有效地連接至反義序列的第一啟動子，其中所述反義序列與病害生物致病性基因同源并且有效地連接至終止子；(b)有效地連接至有義序列的第二啟動子，其中所i^義序列與所i^義序列基本互補并且有效地連接至終止子；其中所述的第二啟動子是相對于第一啟動子的強啟動子，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以在反義序列和有義序列所編碼的序列間形成雙鏈區(qū)，其中所述的有義序列和反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于向植物賦予病害生物抗性的方法和構建體，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反義序列，和(b)基本互補于所i^義序列的有義序列；其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由反義序列和有:JC^列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)；其中所述的有義序列和反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸，其中病害生物選自昆蟲、細菌、真菌和線蟲，并且其中病害生物致病性基因和病害生物選自本文中所教導的那些對象.發(fā)明簡述圖1植物轉化質粒pCAMBIA1201的遺傳圖，該質粒用作為^i:授內容通篇范圍的實例并且是pVZA100、pVZA200、pVZA300和pVZA400的骨架。圖2在中間質粒pVZAl內的插入片段草圖。圖3是克隆在質粒pVZA3中并且隨時用于轉移至pCAMBIA1201的pVZA100沉默盒。圖4M示從轉基因煙草和從轉基因煙草疫霉中分離的siRNA的放射自顯影圖。圖4A和4B顯示角質酶(cutinase)基因探針對分別來自野生型煙草植物和轉基因煙草植物以及野生型煙草疫霉和轉基因煙草疫霉的siRNA進行雜交的結果。圖5顯示溫室中對煙草霜霉造成的煙草青霉病天然流行的植物反應。圖6顯示自轉基因大豆胚產(chǎn)生的幼枝。圖7顯示以pVZA100轉化的大豆的結果。圖7A顯示轉化的大豆愈傷組織。圖7B顯示在轉化的大豆愈傷組織中檢測到的GUS和潮霉素磷酸轉移酶基因。圖8顯示在以pVZA100轉化的馬鈴薯細胞的培養(yǎng)亞中所產(chǎn)生的根和微塊莖，圖9顯示能夠在引起大豆嚴重疾病的三個真菌物種中沉默必需基因的多順反子基因沉默構建體。圖10顯示基于rDNA并且能夠沉HML疫霉、在層銹菌(Phakopsora)及在這兩種真菌中沉默那些必需基因的基因沉默構建體.圖11顯示野生型煙草植物(A)和pVZA100轉基因煙草植物(B)，分別對煙草疫霉易感和抵抗。圖12是從轉基因煙草植物(3)和從生長在受到沉默的轉基因煙草植物(4)上的煙草疫霉中分離的siRNA的放射自顯影圖.圖13顯示抗大豆疫霉的轉基因大豆植物.圖14顯示pVZA300和pVZA400對轉基因煙草疫霉和轉基因大豆疫霉生長和發(fā)育的影響。序列簡述SEQIDNO:1是如才艮據(jù)主艱良明所用的PCR引物VZA1F。SEQIDNO:2是如根據(jù)主艦明所用的PCR引物VZA2RSEQIDNO:3是如根據(jù)主狄明所用的PCR引物VZA3F。SEQIDNO:4是如才艮據(jù)主艱t明所用的PCR引物VZA4R。SEQIDNO:5《j艮據(jù)主艱良明所用的沉默構建體pVZAlOO,SEQIDNO:6;IJL據(jù)主艱良明所用的沉默構建體pVZA200。SEQIDNO:7是4Mt主艱良明所用的沉默構建體pVZA300。SEQIDNO:84_#據(jù)主現(xiàn)良明所用的沉默構建體pVZA400。SEQIDNO:9是如#據(jù)主^1明所用的正向PCR引物GUS。SEQIDNO:10是如根據(jù)主JiyC明所用的反向PCR引物GUS。SEQIDNO:11是如根據(jù)主艱良明所用的PCR引物pVZA100和潮霉SEQIDNO:12是如根據(jù)主題發(fā)明所用的PCR引物pVZA100和潮霉SEQIDNO.13是如絲主狄明所用的引物VZA165R。SEQIDNO.14是如才艮據(jù)主^JL明所用的引物VZA269F。SEQIDNO.15是如#據(jù)主^1明所用的引物VZA373F。SEQIDNO.16是如^^據(jù)主JH^明所用的引物VZA373F。SEQIDNO.17是如#^據(jù)主艱殳明所用的引物VZA165。SEQIDNO.18是如根據(jù)主^iC明所用的引物VZA670F。SEQIDNO.19是如才艮據(jù)主艱殳明所用的PCR引物VZA772F。SEQIDNO.20是如#>據(jù)主敗明所用的PCR引物VZA879F。SEQIDNO.21是如^^據(jù)主艱良明所用的PCRVZA984F引物。SEQIDNO.22是如才艮據(jù)主狄明所用的PCRVZA1087F引物。SEQIDNO.23是如根據(jù)主狄明所用的PCRVZA1189F引物。SEQIDNO.24是如^4t主現(xiàn)良明所用的PCRVZA1290F引物。SEQIDNO.25是如^^據(jù)主艱夂明所用的PCRVZA1391F引物。SEQIDNO.26是如才艮據(jù)主狄明所用的PCRVZA1481F引物。SEQIDNO.27是如根據(jù)主艱良明所用的PCRVZA1582F引物.SEQIDNO.28是如根據(jù)主^liL明所用的PCR引物VZA683F。SEQIDNO.29是如才艮據(jù)主題發(fā)明所用的PCR引物VZA1785F。SEQIDNO.30是如^4t主^C明所用的PCRVZA1886F引物。SEQIDNO.31是如才艮據(jù)主艱t明所用的PCRVZA1964R引物。SEQIDNO.32是如才艮據(jù)主^C明所用的PCRVZA2077F引物。SEQIDNO.33是如根據(jù)主艱t明所用的PCRVZA2163F引物。SEQIDNO.34是如才艮據(jù)主現(xiàn)良明所用的PCRVZA2266R引物。SEQIDNO.35是如才艮據(jù)主艱良明所用的PCRVZA2380F引物。SEQIDNO.36是如#>據(jù)主艱良明所用的PCRVZA2492F引物。SEQIDNO.37是如^^據(jù)主艱t明所用的PCR引物VZA2593F。SEQIDNO.38是如#>據(jù)主艱1明所用的PCR引物VZA2R.SEQIDNO.39是如#>據(jù)主^1明所用的PCR引物組織蛋白酶.SEQIDNO.40是如根據(jù)主*1明所用的PCR引物^JL素。SEQIDNO.41是如^^據(jù)主艱t明所用的PCR引物rDNAFP。SEQIDNO.42是如根椐主題發(fā)明所用的PCR引物rDNARP。SEQIDNO.43是如根據(jù)主題發(fā)明所用的標志-大豆莖褐腐病菌(Phialophoragregata)核糖體RNA基因(rDNA)。SEQIDNO.44是如根據(jù)主狄明所用的基因型BDNA標志-大豆莖褐腐病菌核糖體RNA基因(rDNA).SEQIDNO.45是如根據(jù)主題發(fā)明所用的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)RNA聚合酶II亞基的部分rpb2基因。SEQIDNO.46是如根據(jù)主題發(fā)明所用的大麥柄銹菌(Pucciniahordd)18S核糖體RNA基因。SEQIDNO.47是如根據(jù)主題發(fā)明所用的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)己糖轉運蛋白(hxt2)基因。SEQIDNO.48是如根據(jù)主題發(fā)明所用的豌豆茄腐鐮孢(FusariumsolanipisO角質酶mRNA。SEQIDNO.49是如根據(jù)主題發(fā)明所用的煙草疫霉的基因組或保守蛋白質基序。SEQIDNO.50是如根據(jù)主題發(fā)明所用的豆薯層銹菌基因組中存在的核糖體DNA序列。SEQIDNO.51是如根據(jù)主J^明所用的接骨木鐮孢翻譯延伸因子la。SEQIDNO.52是如根據(jù)主題發(fā)明所用的致病疫霉基因組中存在的激發(fā)素基因序列。SEQIDNO.53是如根據(jù)主題發(fā)明所用的核盤菌RNA聚合酶II亞基的部分rpb2基因。SEQIDNO.54是如根據(jù)主艱吏明所用的玉米狹殼柱孢(Stenocarpellamaydis)的rRNA。SEQIDNO.55是如根據(jù)主題發(fā)明所用的來自玉米尾胞菌(Cercosporazeaemaydis)II組的18S核糖體RNA。SEQIDNO.56是如根據(jù)主艱良明所用的來自桃奸(Myzuspersicae)的組織蛋白酶B蛋白酶.SEQIDNO.57是如根據(jù)主題發(fā)明所用的來自馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)的半胱氨酸蛋白酶。SEQIDNO.58是如根據(jù)主題發(fā)明所用的大麗輪枝菌(VerticiUiumdahliae)rDNA。SEQIDNO.59是如根據(jù)主題發(fā)明所用的Peronosporaberteroae基因組中存在的5.8S核糖體RNA的部分序列，SEQIDNO.60是如根據(jù)主題發(fā)明所用的奇特伍德根結線蟲(Meloidogynechitwoodi)細胞色素氧化酶的基因組亞基.SEQIDNO.61是如根據(jù)主題發(fā)明所用的斯克布納短體線蟲(P.scribneri)核糖體RNA。SEQIDNO.62是如才艮據(jù)主艱&明所用的大豆胞嚢線蟲(Heteroderaglycines)核糖體RNA'SEQIDNO.63是如根據(jù)主題發(fā)明所用的稻痘病菌(Magnaporthegrisea)RNA聚合酶II序列。SEQIDNO.64是如根據(jù)主題發(fā)明所用的大麥柄銹菌18S的rRNA。SEQIDNO.65是如根據(jù)主題發(fā)明所用的漳草假霜霉(Pseudoperonosporahumuli)的5.8S核糖體RNA的部分序列。SEQIDNO.66是如根據(jù)主題發(fā)明所用的灰葡萄孢(Botrytisdnerea)細胞色素P450單加氧酶。SEQIDNO.67是如根據(jù)主題發(fā)明所用的丁^H^單胞菌(Pseudomonassying狄)rRNA。SEQIDNO.68是如根據(jù)主題發(fā)明所用的密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibactermichiganensemichiganense)CeIA基因。SEQIDNO.69是如根據(jù)主JHj1明所用的密執(zhí)安棍狀桿菌的內切B-葡糖苷酶基因。發(fā)明詳述定義如本文中所用，如下定義適用細胞(或宿主植物細胞)意指細胞或植物細胞的原生質體并且包括分離的細胞以M完整植物、植物器官或植物碎片內的細胞。細JlfeiE包括未分離的細胞。雙鏈區(qū)意指在其中核香酸能夠彼此形成氬鍵的多核苷酸區(qū)域，此類氫鍵可以是分子間或分子內的(例如形成具有所謂發(fā)夾的雙鏈區(qū)的單一轉錄單元或適宜地排列以便互補序列形成氫鍵的兩個轉錄單元)。為形成雙鏈區(qū)，根據(jù)本發(fā)明，不必要區(qū)域內100%核苷酸互補及形成氬鍵。只需要存在足夠的堿基配對以賦予RNA基本的雙鏈特征(例如所指出的解鏈溫度)，外源基因意指在給定宿主基因組中在現(xiàn)有形式下通常不存在的基因。就此而言，基因本身可以對宿主基因組是天然的，然而，此外源基因將包含因添加或缺失一種或多種不同調節(jié)元件或額外基因而受到改變的天然基因。基因意指這樣的核酸序列(包括RNA或DNA)，其編碼用于合成完整RNA、完整蛋白質或大到足以擁有所需特征的此完整RNA或完整蛋白質的任意功能性部分的遺傳信息。異源多核苷酸意指在任何非轉化宿主植物中不存在的任意多核苷酸。多核苷酸不因存在內源多核苷酸序列而不被認為是異源多核苷酸.同源性，M義序列與病害生物致病性基因(即結合RNA聚合酶并指導作為反義鏈的病害生物致病性基因mRNA轉錄的DNA鏈)間的關系而言，意指具有足以允許反義序列和病害生物致病性基因mRNA間在低嚴;NHt下進行體外、體內和/或離體雜交的序列相似性。宿主植物細胞抗性意指當與未經(jīng)所述構建體轉化的宿主植物細胞相比，植物對植物病害生物的有害影響易感性較低?；虮磉_的抑制意指來自耙基因的蛋白質和/或mRNA產(chǎn)物水平的降低。抑制的結果可以通過檢查細胞或生物的外在特性(如在實施例中呈現(xiàn))或通過生物化學技術如RNA溶液雜交、核酶保護、RNA印跡雜交、聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄(RT)逆轉錄PCR(RT/PCR)、以微陣列檢測基因表達、抗體結合、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質印跡、放射免疫測定(RIA)、其它免疫測定和熒光激活的細胞分析法(FACS)加以證實，標記基因意指這樣的基因，其賦予表達該標志基因的細胞明顯表型因而允許經(jīng)如此轉化的細胞與不含該基因的細船目區(qū)別。有效地連接意指連接作為同一核酸分子的部分，處于合適于從啟動子開始的轉錄的位置和方向，病害生物致病性基因意指在病害生物對宿主植物的有害影響中發(fā)揮作用的任何病害生物基因。有害影響意指例如對植物生長(植物的數(shù)量和/或大小)、發(fā)育、品質和/或繁殖不利的影響，僅在于舉例，病害生物致病性基因可以是在病害生物生長、發(fā)育和/或繁殖，或病害生物侵襲或感染宿主植物的任意過程中發(fā)揮作用的病害生物致病性基因。涉及病害生物時，致病意指病害生物在植物上造成有害影響的能力。致病性由任意的病害生物致病性基因引起。植物病害生物意指對植物生長(植物的數(shù)量和/或大小)、發(fā)育、品質、產(chǎn)量和/或繁殖有害的任何活生物。此病害生物的非P艮制實例是昆蟲、真菌、線蟲、細菌和病毒。品質意指可以視*作受歡迎的植物的任何方面。通過非限制性舉例，品質可以指植物的外觀、產(chǎn)量、風味、營養(yǎng)價值、香^^內容物，就有義序列和反義序列而言，基本互補意指足夠互補以允許形成雙鏈分子.轉化意指將外源DNA序列(例如載體、重組DNA分子)導入在其中該外源DNA以如此方式整合至染色體或能夠自主復制以至于轉錄異源RNA的細胞或原生質體的過程。轉錄物意指由DNA編碼的RNA。在本發(fā)明的有義轉錄物和反義轉錄物上下文中，此類有義轉錄物和反義轉錄物可以是同一多核苷酸的部分或是兩個獨立的多核苷酸(即各自具有自身5，端和3，端)。處理植物病害生物意指減少、消除、逆轉或阻止植物病害生物對植物的有害影響。載體意指能夠在宿主細胞中復制和/或向其中可有效地連接另一種DNA節(jié)段以至引起所連接節(jié)段發(fā)生復制的DNA分子.質粒是示例性的載體。本發(fā)明的多種實施方案的重點是通過以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞以賦予病害生物抗性而治療植物，所述異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反義序列，和(b)基本互補于所itJl義序列的有義序列；其中所述有義和反義序列能夠彼此雜交以形成雙鏈區(qū)并且其中所述有義序列和反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸。不被理論束縛，據(jù)信根據(jù)本發(fā)明轉化的植物轉錄如此RNA分子，其具有與病害生物致病性基因同源的區(qū)域和與之互補的區(qū)域，并且其中轉錄物形成雙鏈RNA(dsRNA)分子。植物將dsRNA識別有潛在的外來物質(例如病毒來源的物質)。植物的切丁酶將雙鏈RNA切割為長度大約23個核苷酸的單鏈RNA片段，其稱作小千擾RNA(siRNA)。這些siRNA由經(jīng)消化植物細胞(例如角質)而已i^植物的侵入性病害生物所攝入。一旦吸收，siRNA可以摻入至病害生物的RNA誘導性沉默復合體(RISC)。RISC復合體隨后消化病害生物同源基因的mRNA，P艮制病害生物損傷植物的能力。在一個實施方案中，向植物賦予病害生物抗性，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反義序列，和(b)基本互補于所i2L^義序列的有義序列，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由反義序列和有:JC^列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述的有義序列和反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸，其中所述的病害生物致病性基因選自角質酶、激酶、核糖體RNA、黏附素、激發(fā)素和G蛋白；并且其中所述的病害生物是真菌。在一個實施方案中，向植物賦予病害生物抗性，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反義序列；和(b)基本互補于所^A義序列的有義序列，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由反義序列和有:JC^列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述的有義序列和反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸，其中所述的病害生物致病性基因選自激餘、核糖體RNA、G蛋白、蛻皮因子、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和保幼激素酯酶；并且其中所述的病害生物是昆蟲.在一個實施方案中，向植物賦予病害生物抗性，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反義序列；和(b)基本互補于所述反義序列的有義序列，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由反義序列和有:^列編碼的核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述的有義序列和反義序列分別是長度至少大約19個核苷酸；其中所述的病害生物致病性基因選自激酶、核糖體RNA、G蛋白、角質層膠原蛋白和組織蛋白酶和其中所述的病害生物是線蟲。在一個實施方案中，向植物賦予病害生物抗性，包括以異源多核苷酸轉化宿主植物細胞的步驟，該異源多核苷酸包含(a)具有對病害生物致病性基因同源性的反:J^列；和(b)基本互補于所U義序列的有義序列，其中異源多核苷酸的轉錄物能夠雜交以形成包含由反義序列和有iC^列編碼的核苷酸的雙J鏈區(qū)，其中所述的有義序列和反義序列長度分別是至少大約19個核苷酸，其中所述的病害生物致病性基因選自角質酶、離析酶(masceratingenzyme)、激酶、核糖體RNA、黏附素和G蛋白；和其中所述的病害生物是細菌。在一個實施方案中，宿主植物是大豆并且病害生物選自茄腐鐮孢(Fusariumsolani)(例如猝死)、核盤菌(例如白霉病)、大豆莖褐腐病菌(例如褐色莖腐病)、豆薯層銹菌(例如亞洲銹病)和大豆疫霉(例如根腐和莖腐病)的成員之一。在一個實施方案中，宿主植物是十字花科植物并且病害生物是Alvcbgo(例如白銹病).在一個實施方案中，宿主植物是煙草并且病害生物是疫霉(例如莖腐病、根腐病).在一個實施方案中，宿主植物是馬鈴薯并且病害生物是疫霉(例如晚疫)。在一個實施方案中，宿主植物是青花菜(broccoli)并且病害生物U霉(Pythium)(例如猝倒病)。在一個實施方案中，宿主植物是豌豆(pea)和/或甜菜(sugarbeet)并且病害生物是絲嚢霉(Aphanomyces)(例如才艮腐病)。在一個實施方案中，宿主植物是煙草并且病害生物是霜霉(Peronospora)(例如青霉病)。已經(jīng)進一步發(fā)現(xiàn)可以將根據(jù)本發(fā)明在病害生物中的基因沉默作用賦予病害生物子代，這種子代從未與轉化的宿主植物直揍接觸過。在一個實施方案中，本發(fā)明還包含將病害生物與轉化的宿主植物細胞一起培養(yǎng)的步驟。在一個實施方案中，本發(fā)明轉化的宿主植物細胞與病害生物共培養(yǎng).任選地，病害生物子代對除轉化的宿主植物細胞以外的植物細胞致病性較低。在一個實施方案中，從根據(jù)本發(fā)明轉化的宿主植物細胞中再生的植物在受病害生物污染的土壤中栽培.在另一個實施方案中，從根據(jù)本發(fā)明轉化的宿主植物細胞中再生的植物在具有受病害生物污染的風險的土壤中栽培..在另一個實施方案中，病害生物與從根據(jù)本發(fā)明轉化的宿主植物細胞中再生并隨后在受病害生物污染的土壤中栽培的植物共培養(yǎng)。在另一個實施方案中，病害生物與這樣的植物共培養(yǎng)，該植物從根據(jù)本發(fā)明轉化的宿主植物細胞中再生并隨后在具有受病害生物污染的風險的土壤中栽培。在一個實施方案中，病害生物與受到轉化并隨后在具有受病害生物污染的風險的土壤中栽培的植物共培養(yǎng)。病害生物的致病性基因同源性已經(jīng)還發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的基因沉默作用可以賦予對種類多得令人驚訝的病害生物的抗性并且對于本發(fā)明的效果來說，不需要有義序列的區(qū)域和病害生物感染性基因間的完全同一性。在本發(fā)明的一個實施方案中，病害生物致病性基因是提供交叉抗性的基因。此類病害生物基因在病害生物門(phylum)內保守以至當與;^發(fā)明一起使用時，使植物抵抗該病害生物門內的多種成員(即交叉抗性)。此外，病害生物致病性基因可以根據(jù)本發(fā)曰/息同源性分析加以選擇以提供跨物種、跨屬、跨科或跨目抗性的交叉抗性。例如將從本文實例中顯而易見，將角質酶基因在植物中對賦予多個真菌物種抗性是有用的。rDNA的基因在本發(fā)明的病害生物(即昆蟲、細菌、真菌和線蟲)中是有用的.此類保守基因的非限制實例是激酶、黏附素、G蛋白、激發(fā)素、離析酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶、延伸因子、蛻皮因子、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、保幼激素酯酶、角質層J^^、蛋白和組織蛋白酶和如下所述的其它保守基因。在另一個實施方案中，選擇了與植物基因缺少足夠同源性以在宿主植物上引起異源多核苷酸的有害影響的病害生物致病性基因(例如防止對植物基因的沉默)。例如，在一個實施方案中，良義序列和病害生物致病性基因之間的同源性低于大約70%.在一個實施方案中，反義序列與病害生物致病性基因同源性為至少大約70%。任選地，同源性是至少大約75%,任選地，同源性是至少大約80%.任選地，同源性是至少大約85%,任選地，同源性是至少大約90%。任選地，同源性是至少大約95%。在一個實施方案中，有義序列的轉錄物與病害生物致病性基因的轉錄物(例如病害生物致病性基因mRNA)同源性為至少大約70%,任選地，同源性是至少大約75%.任選地，同源性是至少大約80%。任選地，同源性是至少大約85%.任選地，同源性是至少大約卯％。任選地，同源性是至少大約95%。如上所述的同源性可以任選地^/f申覆蓋至少大約20個核苷酸，或至少大約25個核苷酸，或至少大約50個核苷酸或至少大約100個核苷酸的片段。任選地，反義序列與病害生物致病性基因(結合RNA聚合酶并指導病害生物致病性基因mRNA轉錄的DNA鏈)的同源性可以以至少三種方式中的寸壬一方式加以證實。(1)反義序列與病害生物基因有義鏈的對應區(qū)域間雜交。(2)反義轉錄物與病害生物致病性基因的對應區(qū)域間雜交。(3)互補于反義序列的DNA(即反義cDNA)的轉錄物與病害生物致病性基因mRNA的對應區(qū)域間雜交。如以上所述，雜交可以在低嚴4NHf下開展。任選地，此4Hf是通過本領域眾所周知的技術所定義的中等嚴格性條件至高嚴格性條件中的一個糾，如在Keller,G.H.，M.M.Manak(1987)DNAProbs，StocktonPress,NewYork,NY，第169-170頁中所述技術。在本文中提供中等嚴4MHf至高嚴4NHf的實例。具體地，使用標準方法(M肌iatis等)以32P標記基因特異性探針在RNA印跡上開展固定化DNA的雜交。通常，雜交及隨后的洗滌在允許檢測具有與本文中所例舉序列的同源性的把序列的中等嚴格至高嚴旨fr下開展。對于雙鏈DNA基因探針，雜交在低于DNA雜交體解鏈溫度(Tm)20-25。C上在6xSSPE、5xDenhardt溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml變性DNA過夜實施。寡核苷酸探針的解鏈溫度由如下來自Bdtz等(1983)的公式描述Tm=81.5。C+16.6LoglNa++0.41(%G+C)-0.61(%甲酰胺)-600/堿基配對的雙鏈體的長度。洗滌通常如下開展(1)在室溫在lxSSPE、0.1%SDS中兩次持續(xù)15^(低嚴格洗滌).(2)在Tm-20。C在0.2xSSPE、0.1%SDS中一次持續(xù)15分鐘(中等嚴格洗滌)。對于寡核苷酸探針，雜交在低于雜交體解鏈溫度(Tm)的10-20°C上在6xSSPE、5xDenhardt溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml變性DNA過夜實施。解鏈溫度由如下來自Suggs等(1981)的公式描述Tm(。C)=2(T/A>5^JJit數(shù))+4(G/C4^JJt數(shù))。洗滌通常如下開展(1)在室溫在lxSSPE、0.1%SDS中兩次持續(xù)15分鐘(低嚴格性洗滌)。(2)在雜交溫度在lxSSPE、0.1%SDS中一次持續(xù)15分鐘(中等嚴格性洗滌)，通常，可以改變鹽和/或溫度以改變嚴格性。涉及長JL^過大約70個左右的4的標記DNA片段，可以使用如下M:低l或2xSSPE、室溫低l或2xSSPE、42°C中等0.2x或lxSSPE、65。C高O.lxSSPE、65。C。雙^^體的形成和穩(wěn)定性取決于雜交體的兩條鏈間大量的互補性，并且如上所述，一定程度的錯配可以容忍。因此在主艱發(fā)明中有用的多核苷酸序列包含在所述序列中的(單個或多個)突變、缺失和插入，以及其組合，其中所述突變、插入和缺失允許與目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜交體。突變、插入和缺失可以使用本領域已知的標準方法在給定多核苷酸序列中產(chǎn)生.其它方法可能在將來為人所知。本發(fā)明多核苷酸序列的突變性、插入性和缺失性變體可以以如所例舉的多核苷酸相同的方式加以使用，只要該變體具有與原始序列大量的序列相似性。如本文中所用，大量的序列相似性指足以使變異的多核苷^ic揮如與原始序列相同的功能的核苷酸相似性程度。優(yōu)選地，該相似性超過75%;更優(yōu)選地，該相似性超過90%;并且最優(yōu)選地，該相似性超過95%。途。產(chǎn)生設計旨在改善序列功能或提供方法學優(yōu)勢的突變性、插入性和缺失性突變完全在本領域技術人員的技術范圍內，載體本領域技^A員完全能夠構建本發(fā)明的載體(包括基于棵DNA的那些栽體)并設計用于重組基因表達的方案。細節(jié)見例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:第二版，Sambrook等，1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress。操作核酸的此類可應用技術和方案，例如在制備核酸構建體、誘變、測序、導入DNA至細胞并表達基因以及分析蛋白質方面的技術和方案，在ProtocolsinMolecularBiology,第二版，Ausubel等編輯，JohnWiley&Sons,1992中詳細描述，先前成功地廣泛用于植物的具體方法和栽體由Bevan，Nucl.AcidsRes.(1984)12，8711-8721)以及在PlantMolecularBiologyLabfax(CroyRRD編輯).Oxford,BIOSScientificPublishers，第121-148頁中Guerineau和Mullineaux，(1993).Planttransformationandexpressionvectors描述?？梢蕴峁?即自其天然環(huán)境)分離和/或純化的、處于基本純的或均一形式或者不含或基本不含其它核酸的本發(fā)明栽體。本發(fā)明的核酸可以完全是合成的或部分;l合成的，宿主植物本發(fā)明可用于轉化眾多植物，包括但不限于玉米(Zeamays)、卡諾拉油菜(歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪青(Brassicarapassp))、苜蓿(Medicagosativa)、稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高粱(雙色高粱(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghumvulgare))、向日葵(Helianthusan肌us)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(SoIanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖叫》(Cofeassp.)、椰子(Cocosnudfera)、鳳梨(Ananascomosus)、柑桔樹(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(CamelHasinensis)、香蕉(Musaspp.)、跨梨(Perseaamericana)、無花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、^t^(Oleaeuropaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidental)、澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia)、扁杉fe(Primusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、燕麥(oat)、大麥、蔬菜、園藝植物和針葉樹。任選地，本發(fā)明的植物是作物植物(例如、谷物和豆類、玉米、小麥、馬鈴薯、木薯(tapioca)、稻、高粱、粟、木薯、大麥、豌豆和其它塊根作物、塊莖作物或種子作物(seedcrop)。對本發(fā)明重要的種子作物是油菜(oil-seedrape)、甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。可應用本發(fā)明的園藝植物包括萵夢(lettuce)、苦苣(endive)和蕓荅類蔬菜包括巻心菜(cabbage)、青花菜和花椰菜(cauliflower)以;5L^:乃舉(carnations)、天竺葵(geraniums)、矮牽牛(petunia)和秋海裳(begonias)。本發(fā)明可以適用于煙草、黃瓜(cucurbits)、胡蘿卜(carrot)、草莓(strawberry)、向曰葵(sunflower)、番癡、辣椒(pepper)、菊花(chrysanthemum)、楊(poplar)、桉樹(eucalyptu)和松(pine)。任選地，本發(fā)明的植物包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、稻、高粱、黑麥等。任選地，本發(fā)明的植物包括油料植物，油料植物包括卡諾拉油菜、棉花、大豆、紅花(safflower)、向日葵、蕓莒屬(Brassica)、玉米、苜蓿、棕櫚(palm)、椰子等。任選地，本發(fā)明的植物包括豆科植物.豆科植物包括豆類和豌豆.豆類包括瓜爾豆(guar)、槐豆(locustbean)、香豆子(fenugreek)、大豆、四季豆(gardenbean)、H豆(cowpea)、綠豆(mungbean)、利馬豆(limabean)、蠶豆(favabean)、小扁豆(lentil)、鷹嘴豆(chickpea)等。在本發(fā)明中有用的宿主植物是作栽作用和撒:掩ft物(broadcastcrop),有用的非限制性作栽作用實例是玉米、大豆、棉花、莧(amaranth)、蔬菜、稻、高粱、小麥、高粱(milo)、大麥、向日葵、硬粒小麥(durum)和燕麥。有用的撒播作物的非限制的實例是向日葵、黍(millet)、稻、高粱、小麥、高粱、大麥、硬粒小麥和燕麥.在本發(fā)明中有用的宿主植物是單子葉植物和雙子葉植物。有用的單子葉植物的非限制實例是稻、玉米、小麥、棕櫚樹、草坪草(turfgrasse)、大麥和燕麥。有用的雙子葉植物的非限制實例是大豆、棉花、苜蓿、卡諾拉油菜、亞麻(flax)、番茄、甜菜、向日葵、馬鈴薯、煙草、玉米、小麥、稻、萵夢、芽菜(celery)、黃瓜(cucumber)、胡蘿卜、花椰菜、葡萄(grape)和草坪草。在本發(fā)明中有用的宿主植物包括栽培用于審美或欣賞香味的植物。非限制性實例包括觀花的植物、樹、草、耐陰植物以及開花和不開花的園藝植物。在本發(fā)明中有用的宿主植物包括栽培用于營養(yǎng)價值的植物。宿主細胞類型本領域技術人員認識到可以與根據(jù)本發(fā)明的異源多核苷酸接觸的多種類型的宿主細胞。此類細胞的非限制性實例是在胚性組織、I、II和III型愈傷組織、下胚軸、分生組織、根組織、用于在韌皮部內表達的組織等中的那些細胞。宿主植物細胞可以任選地富集以得到具有更高轉化潛力和/或更高再生成熟植物的潛力的細胞。手工選擇宿主植物細胞，例如通it^n型愈傷組織的表面篩選胚性細胞，是可以用于培養(yǎng)前(無論是在固M養(yǎng)基上或在懸浮液中培養(yǎng))富集宿主植物細胞的一種手段，任選地，細胞可以從位于細胞團表面的那些細胞中選擇，并且細胞可以還因它們缺少分化、它們的尺寸和致密胞漿是可鑒定的。在一個實施方案中，宿主植物細胞分化度較低或仍然未i^A分化。因此，在一個實施方案中，細lfe^Jt樣的細胞中鑒定和選擇，所述細胞胞漿致密、相對無液泡，細胞核與細胞漿比率(例如通過細胞學觀察)高、尺寸小(例如10-20nm)并且能夠持續(xù)分裂并形成體細胞性原胚。任選地，宿主植物細胞通過使用由具有相對非通透性膜的細胞如胚性所攝取的染料加以鑒定，如伊文思藍。任選地，宿主植物細胞通過使用可以由細胞化學染色得以檢測的胚性細胞同工酶標志加以鑒定，如谷氨酸脫氫酶(Fransz等，1989).本領域技術人員將認識到同工酶標志如谷氨酸脫氫酶可以從仍具有相對高的代謝活性的非胚性細胞如根細胞中產(chǎn)生某種程度的假陽性結果。幾乎所有植物組織可以使用本文中所述的適宜技術在去分化期間加以轉化。受體靶細胞包括，但不限于分生組織細胞、i、n型和ra型愈傷組織、未成熟胚以及配子細胞如小孢子、花粉、精子和卵細胞。預計從中可以再生能育植物的任何細胞作為受體細胞是有用的。i、n型和in型愈傷組織可以從包括但不限于未成熟胚、未成熟花序、幼苗頂端分生組織、小孢子等的組織來源中產(chǎn)生。能夠作為愈傷組織增殖的那些細胞也是用于遺傳轉化的受體細胞。本發(fā)明提供用于轉化未成熟胚并且隨后再生能育的轉基因植物的技術。直接轉化未成熟胚免除長時間發(fā)育受體細胞培養(yǎng)物的需要.花粉以及其前體細胞小孢子可能能夠發(fā)揮作用，作為受體細胞用于遺傳轉化，或作為栽體以攜帶用于在受精期間導入的外來DNA。直接轉化花粉免除細胞培養(yǎng)的需要，分生組織細胞(及能夠持續(xù)進行細胞分裂并且以未分化的細胞學外觀為特征的植物細胞，通常在植物的生長點或生長組織內存在，如根尖、莖端、側芽等)可以代表另一類型的受g物細胞。由于它們未分化的生長性和器官分化潛能以及全能性，轉化的單個分生組織細胞能夠以完整的轉化植物回收.實際上，人們建議胚性懸浮培養(yǎng)物可以是一種體外分生組織細胞系統(tǒng)，其保留在未分化狀態(tài)下持續(xù)進行細胞分裂的能力，受培養(yǎng)基環(huán)境控制。病害生物在本發(fā)明中有用的植物病害生物(即根據(jù)本發(fā)明可以變成非致病的)包括真菌、線蟲、昆蟲、細菌和寄生性植物如糙伏毛(striga)、菟絲子(dodder)和槲寄生(mistletoe)。有用真菌的非限制實例包括在表4中所述的那些真菌。此類有用線蟲的非P艮制實例包括在表3中所述的那些線蟲。此類有用昆蟲的非限制實例包括蚜蟲、葉蟬(leafli叩per)、飛虱(planthopper)、粉介殼蟲(mealybug)和鱗翅目(Lepidoptera)幼蟲'<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>甘蔗霜霉病甘蔑指霜霉(Peronosclerosporasacchari)=甘蔑指梗霉(Sclerosporasacchari)玉米穗干腐病(玉米芯、玉米籽和玉米莖腐病)稻黑孢霉(Nigrosporaoryzae)(有性世代Khuskiaoryzae)輕度玉米穗腐病灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)，黑曲霉(A.niger)，曲霉(Aspergillusspp.)，小克銀漢霉(Cunninghamellasp.)，蒼白彎孢(Curvulariapallescens)，具柄矛束孢(Doratomycesstemonitis)=Cephalotrichumstemonitis，大刀鐮孢(Fusariumculmorum)，Gonatobotryssimplex,Pithomycesmaydicus，小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)，葡枝根霉(R.stolonifer)=黑^L^(R.nigricans)，Scopulariopsisbrumptii麥角病(horse，stooth,dientedelcaballo)大禿馬勃(Clavk印sgigantea)(無性世代麥角菌(Sphacdiasp.)眼斑病玉米出芽短梗霉菌(Aureobasidiumzeae)=玉米眼斑病菌(Kabatiellazeae)鐮孢穗莖腐病W^鐮孢(Fusariumsubglutinans)=串珠鐮"lfc^孢變種(F.moniliformevar.subglutinans)鐮孢籽、根腐和莖腐病，爛種病和立枯病串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)(有性世代藤倉赤霉(Gibberellafujikuroi))鐮孢莖腐病，幼苗根腐病燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)(有性世代燕麥赤霉(Gibberellaavenacea))赤霉玉米穗腐莖腐病玉米赤霉(Gibberellazeae)(無性世代禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum))灰霉玉米穗腐病Botryosphaeriazeae=Physalosporazeae(無性世代Macrophonmzc狄)灰霉葉腐病(尾孢(Cercospora)葉斑病)高粱尾孢(Cercosporasorghi)-高粱尾孢玉米變種(C.sorghivar.Maydis、C.zeae國maydis)長蠕孢(Helminthosporium)根腐病Exserohilumpedicellatum=Helminthosporiumpedicellatum沐性世代毛球腔菌(Setosphaeria)長蠕孢(Hormodendrum)玉米穩(wěn)腐病芽枝狀枝孢(Cladosporiumcladosporioides)=Hormodendrumcladosporioides，腐病)，草^^孢(C.herbarum(有性世代塔森球腔菌(Mycosphaerellatassiana))Hyalothyridium葉斑病Hyalothyridiummaydis晚萎病(Latewilt)玉米晚萎病菌(Cephalosporiummaydis)輕度葉斑病鏈^&(Alternariaalternate)，Ascochytamaydis、A.tritic、A.zeicola、維多利亞平臍蠕孢(股polarisvictoriae)=維多利亞長蠕孢(Helminthosporiumvictoriae)(有性世代維多利亞4t孢腔菌(Cochliobolusvictoriae))、麥根腐a腔菌(C.sativus)(無性世代'.麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)=H.sorokinianum=H,sativum)，黑附球菌(Epicoccumnigrum)，Exserohilumprolatum=Drechsleraprolata(有性世代Setosphaeriaprolata)，Graphiumpenidllioides、Leptosphaeriamaydis、Leptothyriumzeae，匍毛蛇孢球菌(Ophiosphaerellaherpotricha)(無性世代Scolecosporiellasp.)、Paraphaeosphaeriamichotii、莖點霉(Phomasp)、Septoriazeae、S.zeicola、S.zeina北方型玉米葉枯病大斑病突臍蠕孢(Exserohilumturcicum)=Helminthosporiumturcicum,Setosphaeriaturcica北方型玉米葉斑病炭色旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)長蠕孢玉米穗腐病(品種l)玉米生平臍蠕孢(股polariszeicola)-炭色長蠕抱(Helminthosporiumcarbonum)青霉菌(PenicilHum)玉米穗腐病(藍眼病、青霉病)青霉(Penicilliumspp.)、產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)、擴展青霉(P,expansum)、草酸青霉(P.oxalicum)暗色座腔孢(Phaeocytostroma)莖腐和根腐病Phaeocytostromaambiguum，PhaeocytosporellazeaePhaeosphaeria葉斑病Phaeosphaeriamaydis，Sphaerulinamaydis嚢殼孢(Physalospora)玉米穗腐病Botryosphaeriafestucae=玉米囊孢殼(Physalosporazeicola)(無性世代干腐色二孢(Diplodiafrumenti))Purpleleafsheath半寄生性細菌和真菌棘殼孢(Pyrenochaeta)莖腐和根腐病Phomaterrestris，土棘殼孢(Pyrenochaetaterrestris)腐審根腐病腐霉(Pythium)若干種、強雄腐霉(P.arrhe加manes)、禾生腐霉(P.graminicola)腐審實腐病瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)-巴特勒腐霉(P.butleriL.)紅籽病(玉米穗霉病、葉腐和種腐病)黑附球菌絲核菌(Rhizoctonia)玉米穗腐病玉米絲核菌(Rhizoctoniazeae)(有性世代Waiteacircinata)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表4病害生物-真菌性<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>病害生物致病性基因技術人員可以i^鑒定本發(fā)明中待把向的病害生物基因，此基因可以是在此病害生物對宿主植物的有害影響中起直接或間接作用的任意病害生物基因。僅作為例子，此基因可以是在病害生物生長、發(fā)育、增殖和繁殖、^A或感染中起作用的基因。在一個實施方案中，宿主植物不包含與病害生物致病性基因超過大約70%同源性的基因。任選地，同源性不大于大約60%。任選地，同源性不大于大約50%。在一個實施方案中，宿主植物不包含如此基因，該基因包含與病害生物致病性基因超過大約70%同源性的25個核苷酸的片段。在一個實施方案中，宿主植物不包^此基因，該基因包含與病害生物致病性基因超過大約60%同源性的25個核苷酸的片段。在一個實施方案中，宿主植物不包^此基因，該基因包含與病害生物致病性基因超過大約50%同源性的25個核苷酸的片段。在一個實施方案中，宿主植物不包含多于一個的如此基因，該基因包含與病害生物致病性基因超過大約70%同源性的25個核苷酸的片段。在一個實施方案中，宿主植物不包含多于一個的如此基因，該基因包含與病害生物致病性基因超過大約60%同源性的25個核苷酸的片段。在一個實施方案中，宿主植物不包含多于一個的如此基因，該基因包含與病害生物致病性基因超過大約50%同源性的25個核普酸的片段。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>例如，角質酶基因是根據(jù)本發(fā)明有用的基因。當真菌菌絲侵入植物細胞并吸收營養(yǎng)時，其從植物中吸收siRNA并使真菌必需且組成型的角質酶基因沉默。僅作為例子，此基因可以是在病害生物生長、發(fā)育、增殖和繁殖、侵入或感染中起作用的基因。其它非限制性實例包括表6中的那些實例。有義(和反義)序列根據(jù)本發(fā)明的有義序列和反義序列可以(分別)是具有與病害生物致病性基因的有義鏈和反義鏈的同源性的任何序列。有W列和反:^列可以在相同的DNA鏈上或在不同的DNA鏈上。當有義序列和反義序列在相同的DNA鏈上時，這些序列的轉錄可以由相同啟動子驅動或由不同啟動子驅動(例如相同啟動子或不同啟動子的不同拷貝)。當有義序列和反i(^列在不同的DNA鏈上時，這些序列的轉錄可以由不同啟動子驅動。有義序列和反義序列可以在DNA中排列作為互補的、雙鏈體DNA或是有義序列和反:5U^列可以位于DNA的不同區(qū)域內(即彼此不形成雙鏈體DNA)。有義序列和反義序列的每一序列包含至少大約19個核苷酸。任選地，每一序列包含至少大約50個核苷酸、任選地至少大約100個核苷酸、任選地至少大約150個核苷酸、任選地至少大約250個多核苷酸、任選地至少大約500個核苷酸、任選地至少大約600個多核苷酸。在一個實施方案中，來自病害生物致病性基因中的序列受到修飾以產(chǎn)生或增加對多于一種病害生物的致病性基因的同源性。在另一個實施方案中，來自病害生物致病性基因中的序列受到修飾以縮短可讀才匡。在另一個實施方案中，來自病害生物致病性基因中的序列受到修"飾以導致對植物、動物或人基因的較低同源性。在另一個實施方案中，有義序列和反義序列包含病害生物致病性基因的重復區(qū)域。此類區(qū)域的選擇根據(jù)本文中本發(fā)明的教授內容進行(例如高度保守的區(qū)域)。在其它實施方案中，可以重復病害生物致病性基因的區(qū)域或甚至病害列和反義序列所形成雙鏈區(qū)的長度.不被理論束綽，據(jù)信在本發(fā)明的某些實施方案中，siRNA的閾值水平必須達到以在病害生物中^Jt有用的基因沉默并且向植物賦予病害生物抗性?；蛐蛄械闹豒增加雙鏈區(qū)長度和增加siRNA數(shù)目的一種有用的方式。這種(基因重復)方法使用包含致病疫霉激發(fā)素INFl(GenBank基因座AY766228〗的異源多核苷酸pVZA300(SEQID7)在本文實施例中闡明。選擇該序列是因為它與由疫霉屬所表達的眾多其它激發(fā)素基因的高度同源性，從而提示該序列可能使眾多其它激發(fā)素基因沉默，并且因此提供對眾多疫霉物種的抗性。所選序列長282nt,因此該序列在有義方向和反義方向上重復(-564nt)以接近于已經(jīng)非常成功的pVZA100(SEQID5)、pVZA200(SEQID6)和pVZA400(SEQID8)的有義部分和反義部分的長度。該方法的成功通過與經(jīng)pCAMBIA1201、pVZA100或pVZA200轉化的效果相比，pVZA300在減少轉化的煙草疫霉和大豆疫霉(圖14D、F)的菌絲生長并引起其畸形方面的明顯效果加以證實.質粒pVZA200和pVZA300因兩者均含有組織蛋白酶基因而部分相同，但pVZA300還含有重復的激發(fā)素基因。因此pVZA300對真菌的有害影響應當歸因于激發(fā)素基因。這對于開發(fā)抗疫霉植物以及將此方法應用于經(jīng)疫霉污染的土壤的脫致病性具有積極意義。轉化方法可獲得多種方法用于導入本發(fā)明的異源多核苷酸l處于允許該多核苷酸穩(wěn)定維持和表達條件下的把宿主。特定轉化技術的選擇由該技術對轉化某些植物種的效率以及用選擇的特定方法學實施本發(fā)明的人的經(jīng)驗和偏愛決定。對于技術人員顯而易見，選擇特定轉化系統(tǒng)以導入核酸^M1物細胞不是本發(fā)明的必需或限制因素，同樣，選擇用于植物再生的技術也是如此。盡管多種轉化方法在本文中作為獨立的方法教導，技術人員將容易認識到可以組合地使用某些方法以增強轉化方法效率.此類方法的非限制實例包括以包被孩吏粒的土壤桿菌轟擊(EP-A-486234)或微粒轟擊以誘導傷口，隨后通過與土壤桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)。直接送遞可以用于轉化本發(fā)明的植物宿主，通過非限制性地舉例，此類直接送遞方法包括聚乙二醇處理、電穿孔、脂質體介導的DNA攝取(例如Freeman等PlantCellPhysiol.29:1353(1984))或渦旋混合方法(例如Kindle,PNASU.S.A.87:1228(19卯d)。直接送遞DNA的一種形式是直接基因轉移進入例如來自胚性細胞懸浮培養(yǎng)的原生質體(Lazzeri和Lorz(l988)AdvancesinCellCulture,第6巻，Academicpress,第291頁；OziasAkins和Lorz(1984)TrendsinBiotechnology2:119)。授粉途徑技術人員知道基因型依賴性轉化的某些難度，其來源于谷物的低再生活力.因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，轉化通過基于授粉途徑的基因型非依賴性轉化方法(01^￥.，1986)而實現(xiàn)。在玉米中，高效率的遺傳轉化可以通過花粉與外源DNA的混合物實現(xiàn)(LuoZ.X.等WuR.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:715-719)。玉米可以通過自花授粉或異花4^l^技術進行育種。玉米在同一植林上具有獨立的雄花和雌花，分別位于*穗和耳穗中。當風將花粉vWMt穗吹至從耳穗頂部突出的穗絲時，在玉米中發(fā)生天然;^粉。本發(fā)明稻的轉化也可以通^粉管途徑完成(PlantMolecularBiologyReporter6:165-174),花粉管途徑的主要潛在優(yōu)勢包括(a)基因型非依賴性；(b)無鑲嵌現(xiàn)象；(c)不需要復雜的細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)汰術。用本發(fā)明的異源多核苷酸對番茄和瓜的轉化可以通過授粉途徑實現(xiàn)進入完整植物(Chesnokov，Yu.V"等，1992，USSR專利號1708849;USSR專利^^"，第4號；ChesnokovYu.V.&KorolA.B.1993;GenetikaUSSR,29:1345-1355).基于授粉-受精途徑的遺傳轉化的方法包括(i)使用花粉與起轉化作用的DNA的混合物(漿)；(ii)授粉后，遞送外來DNA至花粉管；和(iii)微粒轟擊小孢子或花粉粒。土壤桿菌技術在本發(fā)明的一個實施方案中，宿主植物使用土壤桿菌技術轉化。土壤桿菌介導的轉移是導入基因至植物細胞的廣泛應用的系統(tǒng)，因為DNA可以導入完整植物組織，因而不再需要從原生質體中再生完整植物。在本領域是眾所周知利用土壤桿菌介導的植物整合栽體以將DNA導入植物細胞。見例如由Fraley等，(1985)，Rogers等，(1987)和美國專利號5，563，055所述的方法，所述文獻特別在本文中完整引用作為參考。土壤桿菌介導的轉化可以有效地用于本發(fā)明的雙子葉宿主植物，通過非限制性舉例包括擬南芥(Arabid叩sis)、玉米、大豆、棉花、卡諾拉油菜、煙草、番茄和馬鈴薯。土壤桿菌介導的轉化還可用于幾乎所有本發(fā)明的單子葉植物。通過非限制性舉例，此類單子葉植物技術適用于稻(Hiei等，1997;Zhang等，1997;(Ishida等，1996);美國專利號5,591,616，所iUL獻特別在本文中完整地引用作為參考)、小麥(McCormac等，1998)和大麥(Tingay等，1997;McCormac等，1998)。根據(jù)本發(fā)明，土壤桿菌介導的轉化可以用已分離培養(yǎng)的原生質體并通過轉化完整細胞或組織而完成。在雙子葉植物中土壤桿菌介導的轉化與其它轉化方法如粒子轟擊、電穿孔、聚乙二醇介導的轉化方法等相比促進送遞異源核酸的較大片段。此外，土壤桿菌介導的轉化似乎引起相對較少的基因重排并且更典型地導致低數(shù)量的基因拷貝R至植物染色體。現(xiàn)代的土壤桿菌轉化栽體能夠在大腸桿菌(E.coli)以及土壤桿菌內復制，這如所述允許方便地操作(Klee等，1985)。此外在用于土壤桿菌介導基因轉移的栽體方面的最新技術i^H已經(jīng)改進栽體中的基因和限制性位點排列，以便促進構建能夠表達編碼多種多肽的基因的栽體.所述栽體(Rogers等，1987)具有方便的多接頭區(qū)域并且因此適合于本發(fā)明目的，其和M苷^化位點。此外，含有裝甲和卸甲Ti基因的土壤桿i可以用于轉化。在土壤桿菌介導的轉化是有效的那些植物林系內，因為基因轉移容易而確定的性質，土壤桿菌介導的轉化是所選擇的方法。當土壤桿菌(例如根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)用于轉化本發(fā)明的植物細胞時，待插入的DNA可以克隆至特定質粒，即克隆至中間載體或至雙元栽體。中間載體可以通過因與T-DNA的序列同源的序列發(fā)生同源重組而整合至Ti質粒或Ri質粒。Ti質粒或Ri質粒還包含為T-DNA轉移所需的vir區(qū)域。中間載體自身不能在土壤桿菌中復制。中間載體可以借助輔助質粒(接合)轉移至根瘤土壤桿菌。雙元栽體自身可以在大腸桿菌和土壤桿菌中中復制。此類載體可以包M擇標記基因以及由T-DNA左邊界區(qū)和右邊界區(qū)所界定的接頭或多接頭。雙元載體可以直接轉化至土壤桿菌(Holsters等1978Mol.Gen.Genet.163:181-187)。作為宿主細胞使用的土壤桿菌將包含攜帶vir區(qū)域的質粒。vir區(qū)域為轉移T-DNA至植物細胞所必需。額外的T-DNA可以納入。如此轉化的細菌用于植物細胞的轉化.植物外植體可以有利地與根瘤土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌一^^培養(yǎng)用于轉移DNA至植物細胞。隨后，完整植林可以從合適培養(yǎng)基中的已感染植物材料(例如葉子的小條、根、莖的節(jié)段、以及原生質體或懸浮培養(yǎng)的細胞)再生，其中該培養(yǎng)基可以含有用于選擇的抗生素或殺生物劑。如此得到的植抹可以隨后測試所插入異源多核苷酸的存在。在注射法和電穿孔法時，對質粒沒有特別要求。有可能使用常用質粒，如pUC衍生物。其它轉化技術化包括whiskers技術，見Zeneca的美國專利5j302，523和5，464，765，,轟擊任選地，宿主植物細胞根據(jù)本發(fā)明通過微粒轟擊(美國專利號5,550,318;美國專利號5，538，880;美國專利號5，610，042和美國專利號5，5卯，3卯；每一文lt^本文中特別引用作為參考)轉化。在該實施方案中，粒子以核酸包被并且通過推動力送遞至細胞。示例性的粒子包括由鵠、鉑和優(yōu)選地由金組成的粒子。預期在某些情況下，對于使用微粒轟擊送遞DNA至細胞，不必需使DNA沉淀至金屬粒子表面。然而預期粒子可以含有DNA而非以DNA包被。因此，提出DNA包被的粒子可以通it^立子轟擊增加DNA送遞水平，但就其本身而言不是必需的。為了轟擊，將懸浮液里的細胞在濾器或固體培養(yǎng)基上濃縮。備選地，將未成熟胚或其它靶細胞排列在固體培養(yǎng)基上。將待轟擊的細胞放置在微粒終止板下的合適距離。用于送遞主題載體至植物細胞的轉化方法的示例性實施方案是使用BiolisticsParticlesDeliverySystem(BioRad，Hercules,Calif.)加速，該系統(tǒng)用于推動包被DNA或細胞的粒子穿過屏障如不銹鋼或尼龍屏障，抵達以懸浮方式培養(yǎng)的植物細胞所覆蓋的濾器表面。屏障使粒子^t以至于將粒子不以巨大團集物的形式送遞至受體細胞。不被理論束繂，據(jù)信屏障在微粒裝置和待轟擊的細胞間的介入降低了微粒團聚體的尺寸并且可能通過降低因過大體積的微粒在受體細胞上所產(chǎn)生的傷害而有助于較高的轉化率。為了轟擊，將懸浮液里的細胞在濾器或固體培養(yǎng)基上濃縮。備選地，將未成熟胚或其它靶細胞排列在固>^養(yǎng)基上.將待轟擊的細胞安置在微粒終止平臺下的合適距離.根據(jù)需要，可以將一個或多個屏障置于加速設備和待轟擊細胞之間。通過使用本文中所述的技術，可以獲得瞬時表達標記基因的高達1000個或更多的細胞轉化灶.轉化灶中轟擊后48小時表達外源基因產(chǎn)物的細胞數(shù)常常是1至10個并且平均是1至3個.本領域技^A員可以優(yōu)化轟擊前的培養(yǎng)條件和轟擊參數(shù)以產(chǎn)生最大數(shù)量的穩(wěn)定轉化體.用于轟擊的物理M和生物參數(shù)均在該技術中是重要的.物理因素是涉^L^作DNA/微粒沉淀或影響巨大微?；蛭⒘５娘w行和速度的那些因素.生物因素包括在轟擊前或緊隨其后所涉及的操作細胞的4^步驟、為有助于減輕與轟擊有關的創(chuàng)傷而對耙細胞的滲透調節(jié)作用并且還包括轉化用DNA的性質，如線性化DNA或完整的超螺旋質粒.據(jù)信轟擊前的操作對成功轉化未成熟胚尤其重要。因此，預計技術人員可以在小M^研究中調整轟擊參數(shù)以充分優(yōu)化條件。技術人員可能尤其希望調整物理M，如間隙距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓力.技術人員還可以通過調整影響受體細胞生理狀況以及可能因此影響轉化和整合效率的條件而使創(chuàng)傷減少因素(TRF)降到最少。例如，可以調節(jié)滲透壓狀態(tài)、組織水合和傳代培養(yǎng)階段或者受體細胞的細胞周期用于最佳的轉化。來自此類小規(guī)^^優(yōu)化研究的結果在本文中公開并且實施其它常規(guī)調節(jié)在本公開的啟示下對本領域技術人員而言是已知的，微粒轟擊轉化應用廣泛，并且可以用于轉化幾乎任何植物物種。單子葉植物任選地根據(jù)本發(fā)明通過轟擊加以轉化，例如玉米(美國專利號5,5卯，3卯)、大麥(Ritala等，1994;Hensgens等，1993)、小麥(美國專利號5，563，055，特別在本文中完整引用作為參考)、稻(Hensgens等，1993)、燕麥(Torbet等，1995;Torbet等，1998)、黑麥(Hensgens等，1993)、甘蔗(Bower等，1992)和高粱(Casa等，1993;Hagio等，1991)。雙子葉植物任選地根據(jù)本發(fā)明通過轟擊加以轉化，例如煙草(Tomes等，19卯；Buising和Benbow，1994)、大豆(美國專利號5,322,783，特別在本文中完整引用作為參考)、向日葵(Knittel等1994)、花生(Singsit等，1997)、棉花(McCabe和Martinell，1993)、番薪(VanEck等1995)和常見豆科植物(美國專利號5,563,055，特別在本文中完整引用作為參考)。電穿孔在一個實施方案中，植物細胞使用電穿孔方法轉化.參見例如屬于BoyceThompson研究所的WO87/06614;美國專利號5，472，869和5,384,253，兩者均屬于Dekalb;和WO92/09696和WO93/21335,兩者均屬于PlantGeneticSystem.Krzyzek等的方法(美國專利號5，384，253，在本文中完整引用作為參考)充分適用于本發(fā)明.在該方法中.采用某些降解細胞壁的酶例如果膠降解酶以使乾受體細胞與未處理的細J^目比對電穿孔轉化更易感。備選地，通過M致傷使受體細胞變得更易轉化.爾j如Tada，Y.等的方'法(Efficientgeneintroductiontoricebyelectroporationandanalysisoftransgenicplants:Useofelectroporationbufferlackingchlorideions，TheorApplGenet,Vol.80:475-480，1990)適用于轉化稻。在一個實施方案中，為通過電穿孔法有效地轉化，使用易碎組織如細胞或胚性愈傷組織的懸浮培養(yǎng)物。任選地，直接轉化未成熟胚或其它組織化的組織。在此技術中，通過使細胞壁接觸果膠降解酶(果膠酶)或以可控方式;Wfe致傷部分地降解細胞壁。限制性實例是小麥(根據(jù)例如Zhou等，1993)、番茄(根據(jù)例如Hou和Lin，1996)、大豆(根據(jù)例如Christou等，1987)以及煙草(Lee等，1989)。還參見美國專利號5,384,253;Rhodes等，1995;和D，Halhiin等，1992.在一個實施方案中，將植物轉化用于原生質體的電穿孔法(根據(jù)例如Bates,1994;Lazzeri，1995)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明通過原生質體的電穿孔加以轉在PCT發(fā)明者C·L·尼布勒特申請人:文甘扎公司