專利名稱：通過經(jīng)遺傳修飾的非天然生產(chǎn)微生物來生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺的制作方法
通過經(jīng)遺傳修飾的非天然生產(chǎn)微生物來生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺 本發(fā)明涉及生產(chǎn)^-內(nèi)酰胺化合物的方法以及可用于此類生產(chǎn)方法的細(xì)胞。
|3-內(nèi)酰胺化合物目前作為內(nèi)源次級(jí)代謝產(chǎn)物通過絲狀微生物(例如
禾口爿cremow't/m c/j/^^ogewwm) 以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
微生物生產(chǎn)的3-內(nèi)酰胺的例子是青霉烷類(penam)化合物，例如青 霉素V、(異)青霉素N和青霉素G;頭孢菌素類(cephem)化合物，例 如，去乙酰氧基頭孢菌素和其它?；?7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸，去乙酰 頭孢烷酸和其它酰基-7-氨基去乙酰頭孢烷酸，頭孢菌素C和其它氨基-7-氨基-頭孢垸酸；棒烷類化合物，例如，棒酸；碳青霉烯類化合物，例如亞 胺培南(imipenem)和亞胺硫霉素(thienamycin);以及單環(huán)內(nèi)酰胺化合 物，例如，氨曲南(aztreonam)。
天然的^-內(nèi)酰胺生產(chǎn)生物的例子是A; wg"/船(A m'^/a"力、
尸ew/c/〃/wm (尸.c/z/7犯gewww 、 尸.wa/g7'ove似e 、 尸.gn、eq/^/vwm)禾口
商業(yè)應(yīng)用的生物中/3-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn)水平數(shù)年來已提高了很多。 例如，現(xiàn)代的尸em'"'〃/wm c力o^oge"wm生產(chǎn)菌株被報(bào)道能生產(chǎn)大約40-50 g/ 了，而原始菌株僅生產(chǎn)大約1 mg/1 (Elander, R.P. (2002) University of Wisconsin contributions to the early development of penicillin and cephalosporin antibiotics, Afevw 52， 270-278; Elander, R.P. (2003)
Industrial production of /3-lactam antibiotics, yl/ / / TVfz'croZn'o/ jS/otec/mo/ 61, 385-392)。
這種提高的生產(chǎn)水平是通過經(jīng)典的誘變技術(shù)實(shí)現(xiàn)的(Elander, R. (1983) Strain improvement and preservation of /3-lactam producing microorganisms. In A丄.Demain and N. Solomon (eds.) Antibiotics containing the /3-lactam structure I, Springer- Verlag, New York, N.Y.， 97-146)。
此外，重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使得能在天然僅能生產(chǎn)青霉核類/3-內(nèi)酰 胺的尸em'"7/^m菌株中生產(chǎn)頭孢烯類/3-內(nèi)酰胺。另一方面，通常生產(chǎn)頭孢 烯類化合物的Jc"mom'"m菌株己被遺傳修飾為能生產(chǎn)青霉核類化合物。
但是，使用天然能生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺的微生物的一個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)在于，這些 微生物通常在其生產(chǎn)階段為絲狀生物體。該絲狀屬性在發(fā)酵期間帶來了嚴(yán) 重的困難。實(shí)際的流變學(xué)(rheology)高度依賴于培養(yǎng)條件，并且可能從 沉淀生長變?yōu)檎吵砩L。前者導(dǎo)致營養(yǎng)運(yùn)送問題，后者導(dǎo)致了氧運(yùn)送的限 制。此外，菌絲的各個(gè)區(qū)室(compartment)在發(fā)酵期間有差異從生長頂 點(diǎn)或尖端細(xì)胞(具有所謂的"spitzenk6rper"作為新生長的端點(diǎn))，年輕 的、看上去健康的亞頂點(diǎn)細(xì)胞，以及老的并且高度液泡化的細(xì)胞。這些不 同的細(xì)胞可能生產(chǎn)水平有所不同，并且對(duì)培養(yǎng)條件應(yīng)答不同，這妨礙了工 藝控制。
此外，使用這些絲狀的天然/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)生物，不能進(jìn)行對(duì)涉及和/或 影響j8-內(nèi)酰胺生產(chǎn)的因素的研究。首先，較之&cAen'c/^ c^等生物，難 于對(duì)它們應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。轉(zhuǎn)化是通過脆弱的原生質(zhì)體在聚乙二 醇中進(jìn)行的，不能獲得完整的保持為游離的質(zhì)粒，整合大部分是隨機(jī)并且 多拷貝的。在頂部，菌絲區(qū)室是多細(xì)胞核的，最重要的物種，尸. cAow ge做m沒有有性循環(huán)，并且，備選的擬有性(parasexual)循環(huán)也非 常低效。所有這些因素嚴(yán)重地妨礙了對(duì)重要基因的鑒定。
就這個(gè)原因來說，人們需要能更好地適合用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且沒有 絲狀微生物典型的不利性質(zhì)的/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)生物。此外，人們需要微生物 具有下述益處其中/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)所涉及的因素可被更為容易地研究。
迄今為止，由于多種因素，在非絲狀、微生物單個(gè)細(xì)胞中還不能建立 起對(duì)^內(nèi)酰胺的生產(chǎn)。
卩-內(nèi)酰胺合成的第一個(gè)明確認(rèn)定步驟是所謂的非核糖體肽合成酶組的
酶催化的，在這種情況下為，5-(L-a-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-纈氨酸合 成酶(ACVS)。這些模塊(modular)酶催化一系列復(fù)雜的氨基酸活化以 及隨后的肽鍵形成。面包酵母(S. cerev^M)等物種不具有此類酶，因此 不能被用來進(jìn)行此類反應(yīng)。此外，編碼ACVS的基因； cZ^S大約12 kb 長。加上啟動(dòng)子和終止子，需要將14 kb的表達(dá)盒穩(wěn)定整合進(jìn)酵母基因 組。
/3-內(nèi)酰胺合成的第二步是未知的、復(fù)雜的生物化學(xué)過程之一，是通過 異青霉素N合酶(IPNS)的非血紅素亞鐵氧化。該酶受細(xì)胞中很多標(biāo)準(zhǔn)化 合物的嚴(yán)重抑制(谷胱甘肽、Mn、 Zn、 pH改變等)。酵母在某些生長條 件下具有非常高的谷胱甘肽水平，這可能導(dǎo)致對(duì)IPNS酶的嚴(yán)重抑制。
^-內(nèi)酰胺合成的第三步由6-APA:AcylCoA酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)催化， 其由被三個(gè)真菌內(nèi)含子打斷的基因編碼。酵母僅有極少數(shù)具有內(nèi)含子的基 因，這些內(nèi)含子也與真菌內(nèi)含子不同，它們需要被除去，以獲得在酵母中 的正確表達(dá)。此外，AT僅在異源二聚體時(shí)有功能。兩種組分都通過自動(dòng) 加工從基因編碼的初始多肽獲得，產(chǎn)生10和29 kDa的肽。該自動(dòng)加工在 酵母細(xì)胞中是否能運(yùn)作是未知的。
/3-內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)定性的缺點(diǎn)廣為人知，用新的酶對(duì)絲狀真菌中的環(huán)境 進(jìn)行持續(xù)更新，以支持對(duì)/ -內(nèi)酰胺的連續(xù)生產(chǎn)。以前不知道酵母是否具有 該更新能力。
天然的/5-內(nèi)酰胺生產(chǎn)者已進(jìn)化出了特別適用于有效運(yùn)出(3-內(nèi)酰胺以保 持高生產(chǎn)水平的分泌系統(tǒng)。
最后但并非全部，/3-內(nèi)酰胺是毒性產(chǎn)品。非天然生產(chǎn)者可能不能在有 這些化合物的情況下存活。
根據(jù)本發(fā)明，我們吃驚地發(fā)現(xiàn)，^-內(nèi)酰胺生產(chǎn)可在不天然產(chǎn)生/3-內(nèi)酰 胺化合物的微生物中，即不具有導(dǎo)致/3-內(nèi)酰胺化合物形成的生物合成途徑 的微生物中建立。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種微生物，其不 天然產(chǎn)生^-內(nèi)酰胺化合物，并且經(jīng)/3-內(nèi)酰胺化合物生產(chǎn)所涉及的多核苷酸 轉(zhuǎn)化過。
優(yōu)選地，該不天然產(chǎn)生/3-內(nèi)酰胺化合物的微生物以單個(gè)細(xì)胞的形式生
長，更優(yōu)選地，是以單個(gè)細(xì)胞形式生長的真核微生物。最優(yōu)選地，不天然
產(chǎn)生/3-內(nèi)酰胺化合物的微生物是酵母。
用于本發(fā)明的合適的酵母是Sacc/mram少c^ (X cerev&ae 、 >S. 6a戸wtw 、 》S. ax7'gw— 、 CawA'(ia (C. g7a6rato 、 C. 、 C. ma/加a 、 C.
"仿z.c"似、C. 6oWw" 、 C. ,ra/n.cafo) 、 A7w_yverom_yces (K /acto 、 X". 附anaVmtw、 iC Aermoto/eraws)、 7a6at/a2^附a oZ mer/、尸z'c/n'a (尸.awg"5^a (= /7a/weww/a / o/j7wor/ Aa)、尸.5or6"o/ /n7a) 、TarrovWa /z) o/z'rtca 、
本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語"單個(gè)細(xì)胞"指絕大部分或僅以單個(gè)細(xì) 胞的形式生長的微生物，S卩，并非絕大部分或僅以菌絲、沉淀和/或作為絲 狀生物的形式生長的微生物。這有利地允許將微生物培養(yǎng)至比用絲狀生物 所可能達(dá)到的細(xì)胞密度要高得多的細(xì)胞密度。
一些時(shí)候，天然作為單個(gè)細(xì)胞生長的微生物的生長行為可能由于，例 如，遺傳修飾而發(fā)生變化。例如，己知能導(dǎo)致酵母發(fā)芽問題的修飾。技術(shù) 人員將理解，此類可能不一定完全以單個(gè)細(xì)胞形式生長的、經(jīng)修飾的生物
仍然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液粘度降低，例如，較低的攪拌速度 就足以確保發(fā)酵培養(yǎng)液的適當(dāng)混合，獲得發(fā)酵罐中更高的氧運(yùn)送速率的可 能性，由此允許碳源以增加的補(bǔ)料速率向發(fā)酵罐中補(bǔ)料，獲得更高的經(jīng)/3-內(nèi)酰胺途徑的碳通量的可能性，細(xì)胞間的無差別使得所有細(xì)胞都是生產(chǎn)細(xì) 胞。
/3-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn)所涉及的多核苷酸包含編碼^-內(nèi)酰胺生物合成
途徑的酶的多核苷酸序列。作為0-內(nèi)酰胺生物合成途徑的一部分的酶的例 子是
(三)肽合成酶，諸如5-(L-o;-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-纈氨酸合 成酶(ACVS )例如，由尸em'cz7/z'wm c/ o^oge肌w的； cZ^3基因編碼，
"非含亞鐵加雙氧酶，諸如異青霉素N合酶(IPNS)，例如由 尸ewz'c/〃/wm c/z/3^ogewwm的/ c6C基因編石馬
.差向異構(gòu)酶，諸如IPN差向異構(gòu)酶，例如由S&eptomyces c/avi^gen^
的cefD基因編碼，
*?；D(zhuǎn)移酶，諸如6-APA:AcylCoA acyl轉(zhuǎn)移酶(AT)，例如由 尸em'cz7/Zw附c/z^^oge"wm白勺； e"D^"基因編石馬，
擴(kuò)環(huán)酶(expandase )，例如去乙酰氧基頭孢菌素C合酶 (DAOCS )， 其包含 Jcremom'wm cA^yogewwm 的 ce/EF 基因或 ^re/7tow少(:M c/avw/z'gen^的ce/E基因所編碼的酶，
*羥化酶，諸如去乙酰頭孢菌素C合酶，其包含Aremom'Mm cA，ogew應(yīng)的c^/EF基因或5V"tom_yc&y c/aWz.gen 的ce/E基因所編碼 的酶，
*轉(zhuǎn)移酶，諸如O-氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，例如由&^^om>Y^ c/avw/z'gerM51的c附ci7基因編石馬。
優(yōu)選地，對(duì)/3-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn)所涉及的多核苷酸還包含編碼下述 蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)在不天然產(chǎn)生/3-內(nèi)酰胺化合物的微生 物對(duì)i3-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn)中起支持性作用。具有支持性作用表示，該蛋 白質(zhì)并非3-內(nèi)酰胺化合物生物合成途徑的一部分，但是該蛋白質(zhì)對(duì)于有效 的/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)來說是必要的。"對(duì)有效的^-內(nèi)酰胺生產(chǎn)來說是必要的" 表示該蛋白質(zhì)對(duì)于^-內(nèi)酰胺生產(chǎn)來說可能是必須的，即，當(dāng)其不存在時(shí)， 在微生物中沒有可測(cè)量到的/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)，甚至當(dāng)存在所有相關(guān)生物合成 酶時(shí)，和/或其可能對(duì)于獲得合適的/5-內(nèi)酰胺生產(chǎn)水平來說是必要的，艮口， 當(dāng)其不存在時(shí)微生物中僅可檢測(cè)到非常低的/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)。具有支持性功
能的蛋白質(zhì)的例子是
*&內(nèi)酰胺生物合成途徑的調(diào)控蛋白，例如cpcW (Schmitt, EK. and Kuck, U (2000) The fUngal CPCRl protein, which binds specifically to beta-lactam biosynthesis genes, is related to human regulatory factor X transcription factors, J Biol Chem. 275:9348-9357); c/<xR (Perez-Redondo R, Rodriguez-Garcia A, Martin JF, Liras P. (1998) The claR gene of Streptomyces clavuligerus, encoding a LysR-type regulatory protein controlling clavulanic acid biosynthesis, is linked to the clavulanate-9-aldehyde reductase (car) gene, Mol. Microbiol. 27:831-843); ccai (Perez-Llarena FJ, Liras P, Rodriguez-
Garcia A， Martin JF. (1997) A regulatory gene (ccaR) required for cephamycin and clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus: amplification results in overproduction of both /3-lactam compounds, J. Bacteriol. 179: 2053-2059)，
*將/5-內(nèi)酰胺生物合成途徑的前體運(yùn)送至細(xì)胞中合適位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白，諸如ATP型結(jié)合盒(ABC)蛋白，例如，aal、 aa5、 aa7、 aalO、 dd2 (WO 01/32904)以及諸如易化擴(kuò)散載體超家族(Multi-Facilitator Superfamiliy, MFS)蛋白，例如cefT (Ullan， R. V" Liu， G., Casqueiro, J" Gutierrez, S., BaAuelos， O. & Martin, J. F. (2002) The cefT gene of Acremonium chrysogenum encodes a putative multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production. Mol Genet Genomics 267, 673-683)，
，初級(jí)代謝中涉及的酶，尤其地，作為半胱氨酸前體的初級(jí)代謝產(chǎn)物 形成中涉及的酶，例如om51，其編碼O-乙酰-L-絲氨酸硫化氫解酶(WO 99/01561);以及作為氨基己二酸前體的初級(jí)代謝產(chǎn)物形成中涉及的酶，例 如賴氨酸的(Casqueiro J, Gutierrez S, BaAuelos O, Hijarrubia MJ， Martin JF. (1999) Gene targeting in Penicillium chrysogenum: disruption of the Iys2 gene leads to penicillin overproduction, J Bacteriol. 181:1181-1188》
側(cè)鏈活化所必需的酶，例如pc/編碼的苯基乙?；o酶A連接酶 (WO 97/02349)，
ACVS對(duì)氨基酸活化中涉及的酶，例如編碼的A^wgWM5 mV/w/aws磷酸》乏酰巰基乙胺(phosphopantenoyl )轉(zhuǎn)移酶(Keszenman-Pereyra D, Lawrence S, Twfieg ME, Price J， Turner G. (2003) The npgA7 cfwA gene encodes a putative 4'-phosphopantetheinyl transferase which is essential for penicillin biosynthesis in Aspergillus nidulans, Curr Genet. 43:186- 190》
*過氧化物酶體增殖涉及的酶，例如pexll編碼的PexllP (WO 00/71579)。
除編碼/3-內(nèi)酰胺生物合成酶的天然存在的基因或編碼具有支持性功能 作用的蛋白質(zhì)的天然存在的多核苷酸之外，還可使用編碼這些酶或支持性
蛋白質(zhì)的人工突變體的多核苷酸序列。此類突變體較之天然的酶或蛋白質(zhì) 可能顯示出更高的穩(wěn)定性、增強(qiáng)的性能(例如增強(qiáng)的活性或不同的定位) 或不同的特異性。
不天然產(chǎn)生/5-內(nèi)酰胺化合物但其中將根據(jù)本發(fā)明建立/5-內(nèi)酰胺的微生 物可以按照本領(lǐng)域熟知的方法方便地制備。
簡言之，/5-內(nèi)酰胺生產(chǎn)涉及的多核苷酸可被包括進(jìn)合適的載體。此類
載體可以是環(huán)狀或線性的載體。此外，載體可提供游離復(fù)制，即載體在細(xì)
胞基因組DNA之外的復(fù)制，或者載體需要多核苷酸向基因組中的整合。 優(yōu)選地，載體是表達(dá)載體，其提供/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)涉及的多核苷酸在其中將 建立^-內(nèi)酰胺的微生物中的表達(dá)。^-內(nèi)酰胺生產(chǎn)所涉及的多核苷酸的編碼 序列與調(diào)控序列一起提供，以確保被編碼多肽的表達(dá)。調(diào)控序列可以是天 然與所討論的編碼序列相關(guān)聯(lián)的那些，或者可以是針對(duì)其確保在選用的微 生物中合適的表達(dá)的能力選出來的序列。/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)涉及的多核苷酸可 被包括進(jìn)一種載體，或者可針對(duì)每種不同的多核苷酸包括進(jìn)單獨(dú)的載體。 如果/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)所涉及的兩種或多種多核苷酸被組合，那么可以向每種 多核苷酸提供各自的調(diào)控區(qū)域(多順反子組織)，或者可以使用一種調(diào)控 區(qū)域用于兩種或多種多核苷酸(根據(jù)所謂的單順反子或操縱子結(jié)構(gòu))。還 可以將某些多核苷酸組合于一種載體中，以及對(duì)于其它多核苷酸使用單獨(dú) 的載體。
用于將多核苷酸引入選用的微生物的轉(zhuǎn)化方法對(duì)于多種類型的微生物 來說是常用的。
具體地，可以通過下述方法來轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞首先提供每種都用想要 的多核苷酸之一轉(zhuǎn)化過的不同的酵母細(xì)胞群體，隨后使各種經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母 細(xì)胞群體雜交，由此獲得含有所有想要的多核苷酸的酵母細(xì)胞群體。或 者， 一旦經(jīng)過轉(zhuǎn)化，可使用不同的選擇標(biāo)記，或者，在通過可獲得的系統(tǒng) 除去選擇標(biāo)記的情況下使用同樣的選擇標(biāo)記來轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞(例如，cre-lox, FLP-FRT,綜述見Gilbertson L. (2003) Cre-lox recombination: Creative tools for plant biotechnology, Trends Biotechnol. 21:550-555; Luo H, Kausch AP (2002) Application of FLP/FRT site-specific DNA recombination system inplants, Genet Eng (NY). 24:1 -16)。
在一種實(shí)施方式中，應(yīng)當(dāng)將尸.cAow ge麗m的； d^8、 pc6C、 和pe/基因(分別編碼ACVS、 IPNS、 AT禾QPCL)置于X ce^v^^特異 性啟動(dòng)子(例如M五725-啟動(dòng)子)和& cwev&ae特異性終止子(例如 M五"5-終止子)的控制下；并且將各個(gè)表達(dá)盒整合進(jìn)酵母基因組。對(duì)這四 種不同的酶的酶活進(jìn)行的測(cè)定按照本領(lǐng)域己知的方法來進(jìn)行抗體可用于
探測(cè)蛋白質(zhì)的存在，特異性試驗(yàn)用于測(cè)定酶的比活性。此類試驗(yàn)的例子可 在Theilgaard H， van Den Berg M, Mulder C, Bovenberg R, Nielsen J. (2001) Quantitative analysis of PeniciUium chrysogenum Wis54-1255 transformants over expressing the penicillin biosynthetic genes, Biotechnol Bioeng 72:379-388. (對(duì)ACVS而言)；Theilgaard et al (2001)(對(duì)IPNS而言)；Tobin MB, Fleming MD， Skatrud PL, Miller JR. (1990) Molecular characterization of the acyl-coenzyme A:isopenicillin N acyltransferase gene (penDE) from PeniciUium chrysogenum and Aspergillus nidulans and activity of recombinant enzyme in Escherichia coli. J Bacteriol. 172:5908-5914 (對(duì)AT而言)和Minambres B， Martinez- Bianco H, Olivera ER, Garcia B, Diez B, Barredo JL, Moreno MA, Schleissner C， Salto F, Luengo JM. (1998) Molecular cloning and expression in different microbes of the DNA encoding Pseudomonas putida U phenyl acetyl-CoA ligase. Use of this gene to improve the rate of benzyl penicillin biosynthesis in PeniciUium chrysogenum. J Biol Chem. 271:33531- 33538 (對(duì) PCL而言)中找到。
根據(jù)本發(fā)明對(duì)/5-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn)或?qū)-內(nèi)酰胺中間產(chǎn)物例如 ACV或IPN的生產(chǎn)可以通過例如基于LC-MS的試驗(yàn)方便地測(cè)定。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及一種方法，用于使用第一個(gè)方面的微生物來 生產(chǎn)P-內(nèi)酰胺化合物。所述方法包括將第一個(gè)方面的微生物在有益于所述 j8-內(nèi)酰胺化合物生產(chǎn)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件對(duì)本發(fā)明來說并不重 要，只要能產(chǎn)生^-內(nèi)酰胺化合物。通常已知的培養(yǎng)基和條件可以使用，技 術(shù)人員將容易地理解，生產(chǎn)的/3-內(nèi)酰胺的類型將取決于在第一個(gè)方面的微 生物中表達(dá)的生物合成基因。/3-內(nèi)酰胺化合物優(yōu)選是青霉素G、青霉素V、己二酰-7-氨基去乙酰氧
基頭孢烷酸(己二酰-7-ADCA)或己二酰-7-氨基-3-氨甲酰氧甲基-3-頭孢 烯-4-羧酸(己二酰-7-ACCA)?？蛇x地，所述方法還包含如果/5-內(nèi)酰胺 化合物是青霉核類，在第6位去?；蝗绻?3-內(nèi)酰胺是頭孢烯類，在7 位去?；允沟梅謩e能生產(chǎn)例如6-氨基-青霉烷酸(6-APA) 、 7-ADCA或7-ACCA。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及第一個(gè)方面的微生物用于鑒定影響^-內(nèi)酰胺
生產(chǎn)的基因和/或因素的用途。這可以通過一系列實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，例如
在生產(chǎn)和非生產(chǎn)條件下培養(yǎng)野生型S. ce"v&^和生產(chǎn)/5-內(nèi)酰胺的X
ce^Ww'^，用可獲得的"生物組學(xué)(omics)"技術(shù)(例如，轉(zhuǎn)錄本組
學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)等)比較它們各自的應(yīng)答，
用一定范圍內(nèi)不同的/3-內(nèi)酰胺對(duì)在相關(guān)條件下生長的野生型X
cw，&^和生產(chǎn)^-內(nèi)酰胺的61. cwevz'ie加以挑戰(zhàn)，用可獲得的"生物組
學(xué)"技術(shù)(例如，轉(zhuǎn)錄本組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)等)比較它們各
自的應(yīng)答，
修飾生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺的& cwev^'^中每種基因的表達(dá)(剔除，表達(dá) 以及過量表達(dá))，用可獲得的"生物組學(xué)"技術(shù)(例如，轉(zhuǎn)錄本組學(xué)、蛋 白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)等)分析它們各自的應(yīng)答，
在生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺的S. cern^^中表達(dá)任何可獲得的基因和/或調(diào)控 因子(例如非編碼RNA、 tRNA、上游調(diào)控RNA等)，用可獲得的"生物 組學(xué)"技術(shù)(例如，轉(zhuǎn)錄本組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)等)分析它們 各自的應(yīng)答，
修改用于野生型& ce^v^^和生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺的& ce"v&ae的培養(yǎng) 條件(例如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)容器形狀和/或補(bǔ)料系統(tǒng))，用可獲得的"生 物組學(xué)"技術(shù)(例如，轉(zhuǎn)錄本組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)等)比較它 們各自的應(yīng)答。
這些分析的結(jié)果可被有利地整合，并用于產(chǎn)生對(duì)/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)物種 (包括天然生產(chǎn)者，例如尸.cA^ysogewwm 、 A cA^sogewwm禾口 X c/avw/^en^)中的/5-內(nèi)酰胺生產(chǎn)進(jìn)一步提高的引導(dǎo)。
實(shí)施例 實(shí)施例1構(gòu)建表達(dá)載體
基于酵母質(zhì)粒pRS406 (Sikorski, R.S. and Hieter, P (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae， Genetics 122:19-27)來制造表達(dá)載體。從 pRS416Met25 (Mumberg D, Muller R， Funk M. (1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156:119-122)分離Met25啟動(dòng)子和終止子區(qū)域(Johnston, M. et al (1997) The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII, Nature 387 (6632 Suppl.), 87-90)。
構(gòu)建pRS403Met25和pRS405Met25:用Sstl和Nael對(duì)pRS416Met25 進(jìn)行限制性處理，得到Met25啟動(dòng)子和終止子片段。隨后將該片段連接進(jìn) 用Sst薩el消化過的pRS403和pRS405 (Sikorski, R.S. and Hieter, P， 1989)，得到想要的質(zhì)粒。
構(gòu)建pRS404Met25和pRS406Met25:用Sstl和Kpnl對(duì)pRS416Met25 進(jìn)行限制性處理，得到Met25啟動(dòng)子和終止子片段。隨后將該片段連接進(jìn) 用Sstl/Kpnl消化過的pRS404禾卩pRS406 (Sikorski, R.S. and Hieter, P, 1989)，得到想要的質(zhì)粒。
通過對(duì)P. chrysogenum的pcbC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增來制備用于將IPNS 基因整合進(jìn)酵母染色體的質(zhì)粒pRS406Met25pcbC (IPNS基因)(Carr, L.G., Skatrud, P丄.，Scheetz， M.E. II， Queener, S.W. and Ingolia， T.D. (1986) Cloning and expression of the isopenicillin N synthetase gene from Penicillium chrysogenum, Gene 48:257-266)，其中使用如下引物
5' CAAGTTTTCACCGCGGTTTTTCTAGTTAACATGATATCGAT TCCC-3'(SEQIDNO: 1)
和
5'- GAGTCCGGGATTTCTAGATCCCGGTCGAC陽3' (SEQ ID NO: 2)， 隨后克隆進(jìn)pCRTOP02.1載體(Invitrogen，按照廠商提供的說明書進(jìn)
行)，接著用Xhol和Spel進(jìn)行限制性酶消化，隨后在XhoI/Spel限制性 處理過的pRS406Met25載體中連接pcbC片段。
構(gòu)建PCL整合質(zhì)粒pRS403Met25pcl : 用 Xbal/BamHl對(duì) pRS403Met25進(jìn)行限制性處理，與Xbal/BamHl消化過的PCR擴(kuò)增PCL 基因連接(WO 97/02349)，其中使用如下引物
5'-CCATTATTTTTCTAGACACCCATATGGTTTTTTTACCTCC-3' (SEQ ID NO: 3)禾口 5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 4)。
構(gòu)建AT (penDE)整合質(zhì)粒pRS405Met25penDE:用下述引物對(duì)penDE 基因(Tobin et al, 1990)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 5) 和5'- CCATTATTTTTCTAGACCATATGCTTCACATCC畫3' (SEQ ID NO: 6) 隨后用Xbal、 BamHI進(jìn)行限制性處理，將得到的penDE片段連接進(jìn)用 Xbal、 BamHI限制性處理過的pRS405Met25中。
按照下文所述構(gòu)建ACVS (pcbAB)整合質(zhì)粒pRS404DestACVS。通過 下述方法構(gòu)建質(zhì)粒pRS404Dest，首先擴(kuò)增pDEST15 (Invitrogen)的 CapccJB選擇盒，其中使用下述引物
5'-GGGGGCGGCCGCACAACTTTGTATAGAAAAGTTGAG AAACGTAAAATGATATAAAT-3' (SEQ ID NO: 7)和
5'-GGGGCGCCGGCGACAACTTTTTTGTACAAAGTTGAGAAACG TAAAATGATATAAAT-3' (SEQ ID NO: 8),
接著連接進(jìn)pCR2.1 TOPO，產(chǎn)生質(zhì)粒pCR2.1/catccdB。然后用Muni消化 質(zhì)粒pCR2.1/catccdB ，將catccdB片段連接進(jìn)EcoRI消化過的 pRS404Met25，產(chǎn)生pRS404Dest。通過擴(kuò)增獲得pcbAB基因(Diez, B., Gutierrez, S.， Barredo, J丄.，van Solingen, P.， van der Voort, LH. and Martin, J. F. (1990) The cluster of penicillin biosynthetic genes. Identification and characterization of the pcbAB gene encoding the alpha曙aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase and linkage to the pcbC and penDE genes, J. Biol. Chem. 265: 16358-16365)，其中使用下述引物 5'畫CACCATGACTCAACTGAAGCCAC-3' (SEQ ID NO: 9)禾口 5'-ATAGCGAGCGAGGTGTTC-3' (SEQ ID NO: 10)。
按照廠商說明書，將平末端PCR片段克隆進(jìn)pENTR/SD/D-Topo載體 (Invitrogen)，產(chǎn)生pENTR/SD/ACVS 。
按照Invitrogen的Gateway說明書，用pRS404Dest對(duì)pENTR-SD-ACVS進(jìn)行Gateway LR-反應(yīng)，獲得最終的整合質(zhì)粒pRS404DestACVS。
實(shí)施例2 轉(zhuǎn)化S. cerevisiae 將得到的、攜帶有編碼ACVS、 IPNS、 PCL和AT的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 進(jìn)酵母 iSacc/^ra附y(tǒng)cas CEN-Pk2-lc (Wieczorke R， Krampe S，
Weierstall T， Freidel K， Hollenberg CP, Boles E， (1999) Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae, FEBS Lett. 464:123-128)。使用Gietz RD, Woods RA (2002， Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier D N A/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 350:87-96)所述的基于鋰-離子的高效酵母轉(zhuǎn)化程序和鯡魚精運(yùn)載體DNA處理作為方案。使用營養(yǎng) 缺陷型標(biāo)記HIS、 LEU、 TRP和URA進(jìn)行整合子選擇，這按照本領(lǐng)域已 知的那樣來進(jìn)行。通過PCR和Southern雜交印記分析，得到的菌株攜帶 有編碼ACVS、 IPNS、 AT和PCL的青霉素生物合成基因。
實(shí)施例3探測(cè)生物合成酶和酶活性 通過在酵母最小限度培養(yǎng)基(1XYNB， 20mM磷酸鹽，pH 6.8， 2% 葡萄糖)上進(jìn)行培養(yǎng)，針對(duì)酶活性對(duì)可能的青霉素生產(chǎn)酵母菌株加以篩 選。在這些條件下，由于不存在甲硫氨酸，Met25啟動(dòng)子完全被遏制。酵 母生長過夜，直到達(dá)到4-5的OD600。隨后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沉淀，使用超聲 波處理或玻璃珠，獲得不含細(xì)胞的提取物。針對(duì)青霉素生物合成酶的產(chǎn)生 對(duì)裂解物部分和可溶上清液加以篩選。在庫馬西(Coomassie)染色的 SDS-PAGE凝膠上，通過Western雜交印記進(jìn)行分析，分析顯示了生物合 成酶的產(chǎn)生。LC-MS被用于展示青霉素生物合成中間產(chǎn)物ACV、 IPN和
PenG的形成。
實(shí)施例4探測(cè)抗生素活性 將經(jīng)過菌落純化的酵母菌株轉(zhuǎn)移至激發(fā)/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)的瓊脂平板，在 25°C培養(yǎng)24-168小時(shí)。在2xTY中將/3-內(nèi)酰胺敏感型E. coli ESS菌株 (Hsu JS, Yang YB， Deng CH, Wei CL， Liaw SH， Tsai YC (2004) Family shuffling of expandase genes to enhance substrate specificity for penicillin G. Appl Environ Microbiol.70:6257-6263)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，在預(yù)熱過的0.8% 2xTY瓊脂中稀釋，小心地分布到酵母菌落上。在37。C培養(yǎng)過夜后，通過 菌落周圍的澄清區(qū)域(所謂的暈輪)，可以觀察到生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺的菌株。
權(quán)利要求
1.一種微生物，其不天然產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺化合物，但通過對(duì)所述微生物進(jìn)行遺傳修飾后能生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺化合物。
2. 如權(quán)利要求1的微生物，其經(jīng)過了在所述/5-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn)中 所涉及的多核苷酸的轉(zhuǎn)化，從而提供了能生產(chǎn)所述/3-內(nèi)酰胺化合物的微生 物。
3. 如權(quán)利要求2的微生物，其中所述^-內(nèi)酰胺的生產(chǎn)中所涉及的所述 多核苷酸是編碼所述/3-內(nèi)酰胺化合物生物合成途徑的酶的多核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求3的微生物，其中，所述/3-內(nèi)酰胺化合物的生物合成途 徑的酶選自由ACVS、 IPNS和AT構(gòu)成的組。
5. 如權(quán)利要求2-4中任何一項(xiàng)所述的微生物，其還經(jīng)過了編碼下述蛋 白質(zhì)的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)化，所述蛋白質(zhì)在對(duì)所述/3-內(nèi)酰胺化合物的生產(chǎn) 中具有支持性作用。
6. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的微生物，其是酵母。
7. 如權(quán)利要求6所述的酵母，其中所述酵母屬于&zcdraramF"、
8. —種方法，用于生產(chǎn)/3-內(nèi)酰胺化合物，所述方法包括在有益于生產(chǎn) 所述卩-內(nèi)酰胺化合物的條件下培養(yǎng)根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的微生物，所述方法可選地包含如果所述P-內(nèi)酰胺化合物是青霉核類，則在第6位去酰基化；如果所述/3-內(nèi)酰胺是頭孢烯類，則在7位去?；?br> 9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述/3-內(nèi)酰胺化合物是青霉素G、 青霉素V、 6-APA、己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACCA、 7-ADCA、 7-ACCA、 7-ACA。
10. 如權(quán)利要求1-7的微生物用于鑒定影響/3-內(nèi)酰胺生產(chǎn)的因素的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了用beta-內(nèi)酰胺生物合成所涉及的多核苷酸對(duì)不天然產(chǎn)生beta-內(nèi)酰胺化合物的微生物的轉(zhuǎn)化，以及此類經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物在生產(chǎn)beta-內(nèi)酰胺化合物或者在鑒定beta-內(nèi)酰胺化合物合成所涉及基因或因素中的用途。例如，編碼來自P.chrysogenum的ACV、IPNS、AT和PCL的基因通過遺傳工程被插入S.cerevisiae。
文檔編號(hào)C12P37/00GK101098963SQ200580042491
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者巴斯特安·羅米恩, 翰德里克·簡·諾爾曼, 馬可·亞歷山大·伯格·范德, 魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司