專(zhuān)利名稱(chēng)：培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的分離和長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)的方法。哺乳動(dòng)物味細(xì)胞包括應(yīng)答味覺(jué)刺激物或呈味物質(zhì)(tastant)的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感受器表達(dá)細(xì)胞。本發(fā)明的方法使得對(duì)味覺(jué)感受器細(xì)胞的研究持續(xù)延長(zhǎng)的一段時(shí)間，例如長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。此外，本發(fā)明的方法與已知方法相比較降低了需要從其分離味細(xì)胞的動(dòng)物數(shù)量。由于本發(fā)明的方法允許味細(xì)胞在體外增殖和分化，使得包括增殖和分化的味細(xì)胞過(guò)程的體外研究，例如這些過(guò)程所需要的營(yíng)養(yǎng)因子的測(cè)定成為可能。將味細(xì)胞培養(yǎng)一段延長(zhǎng)的時(shí)間的能力使得能夠進(jìn)行需要較長(zhǎng)時(shí)間范圍的實(shí)驗(yàn)。
背景味蕾由大約50-100個(gè)味細(xì)胞組成，味細(xì)胞包括呈現(xiàn)神經(jīng)元和表皮特性的三種形態(tài)類(lèi)型。基于免疫細(xì)胞化學(xué)特征，可以將這些味細(xì)胞分類(lèi)為I型(暗)、II型(亮)和III型(居中)(Yee等，J Comp Neurol.2001年11月5日；440(1)97-108；Takeda等，J Comp Neurol.2004年11月1日；479(1)94-102)。
研究表明這些味細(xì)胞中的大約10％呈現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)的免疫反應(yīng)性。雖然NCAM-免疫反應(yīng)性細(xì)胞是III型細(xì)胞，但不是所有的III型味細(xì)胞對(duì)NCAM是免疫反應(yīng)性的(Nelson和Finger1993，J Comp Neurol 336(4)507-16)，且味細(xì)胞中的NCAM表達(dá)依賴(lài)于IX神經(jīng)的神經(jīng)支配(Smith等，1994，J Comp Neurol 347(2)187-96)。這些和其他數(shù)據(jù)表明了NCAM表達(dá)味細(xì)胞與神經(jīng)相聯(lián)系。
相反，對(duì)味覺(jué)刺激物的功能性應(yīng)答所需要的關(guān)鍵分子不在NCAM免疫反應(yīng)性細(xì)胞中表達(dá)。例如，味轉(zhuǎn)導(dǎo)素，是一種參與味覺(jué)傳導(dǎo)的關(guān)鍵性G-蛋白并且只存在于II型細(xì)胞中。然而，沒(méi)有在NCAM表達(dá)細(xì)胞中檢測(cè)到味轉(zhuǎn)導(dǎo)素(Takeda等，1992，J.Electron Microsc.41(5)375-80；Yang等，2000，J.Comp Neurol 425(1)139-51)。
認(rèn)為味細(xì)胞源自上皮細(xì)胞譜系，具有10天的有限平均壽命，其中垂死細(xì)胞由基細(xì)胞群替代。報(bào)道了大部分的味細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)物最多持續(xù)數(shù)天，例如，最多3至5天(比較，例如，對(duì)于小鼠味細(xì)胞，改良自哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)元分離的方法，Spielman等，1989，BrainResearch 503326-29；而對(duì)于大鼠味細(xì)胞，Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25，和Stone等，2002，Chem.Senses27779-87)。
為了能夠檢測(cè)給定的呈味物質(zhì)，味細(xì)胞通常需要呈味物質(zhì)(例如，苦味、甜味、鮮味(umami))的相關(guān)味覺(jué)感受器和味覺(jué)傳導(dǎo)所必需的分子二者。味覺(jué)感受器可以包括一種或多種T2R和/或一種或多種T1R。信號(hào)傳導(dǎo)分子可以包括味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和磷脂酶C。在此將表達(dá)至少一種味覺(jué)感受器并能夠應(yīng)答至少一種味覺(jué)刺激物/呈味物質(zhì)的細(xì)胞稱(chēng)為“味覺(jué)感受器細(xì)胞”。因此，味細(xì)胞在其他細(xì)胞類(lèi)型中包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。
迄今為止，不存在味覺(jué)感受器細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物模型，且任何體外研究都必須依賴(lài)于維持有限時(shí)間的味細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)物。
Ookura等(2002，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 38365-72)描述了從小鼠味覺(jué)上皮分離的特定類(lèi)型的細(xì)胞，這些細(xì)胞已經(jīng)基于它們的整聯(lián)蛋白β1標(biāo)記得到了分選并表達(dá)NCAM標(biāo)記。因此，這種整聯(lián)蛋白陽(yáng)性連續(xù)小鼠細(xì)胞培養(yǎng)沒(méi)有產(chǎn)生與那些負(fù)責(zé)味覺(jué)刺激物初級(jí)檢測(cè)的細(xì)胞相似的細(xì)胞。
Ruiz等(2001，Chem.Senses 26(7)861-73)報(bào)道了源自味蕾的原代細(xì)胞培養(yǎng)物維持了長(zhǎng)達(dá)14天，條件是將細(xì)胞保持于室溫，認(rèn)為這減緩了各種細(xì)胞過(guò)程。值得注意的是，保持于37℃的細(xì)胞只能維持幾天，和之前所報(bào)道的相同。報(bào)道了保持于室溫的細(xì)胞在第10天左右開(kāi)始死亡，這與預(yù)期的味細(xì)胞的平均壽命相符。Ruiz等1995年公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方案(“Tissue Culture of Rat Taste Buds”(大鼠味蕾的組織培養(yǎng))，編輯Spielman AI，Brand JG Experimental Cell Biologyof Taste and Olfaction(味覺(jué)和嗅覺(jué)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué))，CRC出版社，1995)公開(kāi)了相似的室溫下方法，該方法提及了長(zhǎng)達(dá)18天的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間。
概述本發(fā)明總地涉及分離、培養(yǎng)和/或測(cè)定哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞，以及涉及培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物味細(xì)胞。
本發(fā)明內(nèi)包括培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，該方法步驟為在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中和有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器上(其中在培養(yǎng)容器情況下的術(shù)語(yǔ)“上”包括其中)培養(yǎng)味細(xì)胞，并從第一次更換培養(yǎng)基開(kāi)始，以至少約5天的間隔更換培養(yǎng)基。一些實(shí)施方案中，味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，味細(xì)胞只包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰島素和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)容器的涂蓋物優(yōu)選包括膠原。
本發(fā)明還包括通過(guò)分離舌上皮來(lái)分離和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，其中將舌上皮中的味細(xì)胞暴露于存在或不存在蛋白水解酶的分離溶液的時(shí)間長(zhǎng)度最小化，在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中和在有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器上孵育分離的味細(xì)胞上皮碎片，并且，從第一次更換培養(yǎng)基開(kāi)始，以至少5天的間隔更換培養(yǎng)基。味細(xì)胞暴露于含有或不含蛋白水解酶的分離溶液的時(shí)間長(zhǎng)度為約30分鐘或更短時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞，一些實(shí)施方案中，味細(xì)胞只包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括含有MCDB 153、FBS、胰島素和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰島素和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)容器的涂蓋物優(yōu)選包括膠原。
本發(fā)明進(jìn)一步包括根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)或分離并培養(yǎng)的味細(xì)胞。優(yōu)選的實(shí)施方案中，味細(xì)胞是味覺(jué)感受器細(xì)胞。味覺(jué)感受器細(xì)胞優(yōu)選應(yīng)答至少一種味覺(jué)刺激物?？梢詫⒈景l(fā)明的培養(yǎng)的味細(xì)胞在約37℃培養(yǎng)至少約10天，在約18-37℃培養(yǎng)至少約20天。本發(fā)明還包括味細(xì)胞的培養(yǎng)物。一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中分裂超過(guò)48小時(shí)，優(yōu)選超過(guò)約5天，更優(yōu)選超過(guò)約2周的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感受器細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了具有約300-320毫滲摩的摩爾滲透壓濃度和約7.0至約7.3的pH的味細(xì)胞測(cè)定緩沖液，以及將味細(xì)胞維持于這樣的緩沖液中的方法。
進(jìn)一步關(guān)注轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物味細(xì)胞。本發(fā)明的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以用載體DNA，如質(zhì)?；虿《据d體DNA轉(zhuǎn)染。還提供了轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的味細(xì)胞的方法，該方法通過(guò)使培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物味細(xì)胞接觸核酸，諸如但不限于，載體DNA，例如，病毒載體DNA或質(zhì)粒載體DNA來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明還包括使用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的測(cè)定方法。一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定方法中所用的味細(xì)胞測(cè)定緩沖液具有300-320毫滲摩的摩爾滲透壓濃度和7.0至7.3的pH。
提供了測(cè)定對(duì)候選味覺(jué)刺激物的味覺(jué)應(yīng)答的方法，該方法包括將培養(yǎng)的味細(xì)胞暴露于候選味覺(jué)刺激物，并將該味細(xì)胞對(duì)候選味覺(jué)刺激物的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答與培養(yǎng)的味細(xì)胞對(duì)標(biāo)準(zhǔn)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答相比較，其中培養(yǎng)的味細(xì)胞對(duì)候選味覺(jué)刺激物和對(duì)標(biāo)準(zhǔn)味覺(jué)刺激物相同的細(xì)胞應(yīng)答表明候選味覺(jué)刺激物在味細(xì)胞中引起和標(biāo)準(zhǔn)味覺(jué)刺激物相同的味覺(jué)應(yīng)答。還提供了測(cè)定候選味細(xì)胞的味覺(jué)應(yīng)答的方法，包括將候選的培養(yǎng)的味細(xì)胞暴露于已知的味覺(jué)刺激物，并將候選的培養(yǎng)的味細(xì)胞對(duì)已知味覺(jué)刺激物的細(xì)胞應(yīng)答與標(biāo)準(zhǔn)味細(xì)胞對(duì)已知味覺(jué)刺激物的細(xì)胞應(yīng)答相比較，其中候選味細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)味細(xì)胞對(duì)已知味覺(jué)刺激物相同的細(xì)胞應(yīng)答表明候選味細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)味細(xì)胞都具有對(duì)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答。
在此進(jìn)一步提供了鑒定味覺(jué)調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括在已知味覺(jué)刺激物的存在下，將培養(yǎng)的味細(xì)胞暴露于候選味覺(jué)調(diào)節(jié)劑，并將該味細(xì)胞對(duì)候選味覺(jué)調(diào)節(jié)劑的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答與候選調(diào)節(jié)劑不存在下的細(xì)胞應(yīng)答相比較，其中在候選味覺(jué)調(diào)節(jié)劑存在下對(duì)刺激物的細(xì)胞應(yīng)答的改變表示是味覺(jué)調(diào)節(jié)劑。
從以下的詳細(xì)描述和實(shí)施例將清楚本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
詳述在此提供了供給長(zhǎng)達(dá)1、2或3個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間的味細(xì)胞培養(yǎng)物的分離和培養(yǎng)方法，所述味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。本發(fā)明的方法可保持高百分比的存活細(xì)胞，甚至在37℃的溫度下，且結(jié)果沒(méi)有減緩所有的細(xì)胞過(guò)程。
本發(fā)明的味細(xì)胞分離和/或培養(yǎng)方法優(yōu)選包括以下步驟中的至少一個(gè)-在分離過(guò)程中，將味細(xì)胞暴露于含有和不含酶的分離溶液的時(shí)間最小化。例如，優(yōu)選味細(xì)胞暴露于分離溶液的時(shí)間不超過(guò)約30分鐘，優(yōu)選不超過(guò)約20分鐘，且最優(yōu)選不超過(guò)約15分鐘。例如，優(yōu)選將味細(xì)胞暴露于如下所述使用的含有鏈霉蛋白酶E和彈性蛋白酶的分離溶液不超過(guò)約30分鐘，優(yōu)選不超過(guò)約20分鐘，且最優(yōu)選不超過(guò)約15分鐘。
-用合適的涂蓋物涂蓋細(xì)胞培養(yǎng)容器。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)合適的涂蓋物是引起細(xì)胞粘附和增殖的涂蓋物。涂蓋物優(yōu)選包括膠原。涂蓋物優(yōu)選不包括聚-D-賴(lài)氨酸、CELL-TAKTM或MATRIGELTM。
-使用合適的培養(yǎng)基。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)合適的培養(yǎng)基是維持細(xì)胞存活、增殖和分化的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選培養(yǎng)基包括Iscove氏培養(yǎng)基、MCDB 153、FBS、胰島素和抗生素。合適培養(yǎng)基的實(shí)例是含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰島素和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)選不選自DMEM、F12或MCDB 153，單獨(dú)或含有胎牛血清(FBS)和抗生素補(bǔ)充物。
-在第一次更換培養(yǎng)基之后(例如，在24至48小時(shí)第一次更換培養(yǎng)基之后)，應(yīng)當(dāng)以不少于約5天，優(yōu)選不少于約7天，且最優(yōu)選不少于約8天的間隔更換培養(yǎng)基。
本發(fā)明的方法優(yōu)選包括這些步驟中的兩個(gè)或兩個(gè)以上，更優(yōu)選這些步驟中的三個(gè)或三個(gè)以上，且最優(yōu)選包括全部四個(gè)步驟。
包括這些步驟中一個(gè)或一個(gè)以上的味細(xì)胞培養(yǎng)方法將在約37℃至少約10天或在約18℃至約37℃至少約20天的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間后提供至少約40％，優(yōu)選至少約60％，最優(yōu)選至少約75％的味細(xì)胞存活力。味細(xì)胞培養(yǎng)方法優(yōu)選在高達(dá)約37℃的溫度約1至2個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間后提供至少約40％的存活力，優(yōu)選至少約60％，且最優(yōu)選至少約75％存活力。通過(guò)以下所述的錐蟲(chóng)藍(lán)測(cè)試來(lái)測(cè)試細(xì)胞存活力。
包括全部四個(gè)步驟的分離和培養(yǎng)方法在約37℃至少約10天或在約18℃至37℃至少約20天的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間后達(dá)到至少約80％至約90％或更高的味細(xì)胞存活力。包括全部四個(gè)步驟的培養(yǎng)方法在高達(dá)37℃的溫度至少約一個(gè)月的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間后優(yōu)選達(dá)到至少約80％，優(yōu)選約90％，更優(yōu)選約95％，和更優(yōu)選約98％或更高的存活力。
本發(fā)明的方法包括分離和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，包括i)分離舌上皮，其中將細(xì)胞暴露于含有或不含酶的分離溶液的時(shí)間最小化，ii)在用合適涂蓋物有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器中的合適細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育分離的舌上皮，和iii)在第一次更換培養(yǎng)基之后，例如在約24-48小時(shí)，以至少約5天的間隔更換培養(yǎng)基。
一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。優(yōu)選的實(shí)施方案中，味細(xì)胞只包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，味細(xì)胞暴露于含有或不含酶的分離溶液的時(shí)間為約30分鐘或更短，更優(yōu)選約20分鐘或更短，且最優(yōu)選約15分鐘或更短。一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，涂蓋物是膠原。一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基更換的時(shí)間間隔是至少約7天，且優(yōu)選至少約8天。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以將具有至少約40％存活力的細(xì)胞在高達(dá)約37℃的溫度維持至少約10天，或在約18℃至約37℃至少約20天。一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在高達(dá)37℃的溫度至少約10天或在約18至約37℃至少約20天達(dá)到至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選至少約95％的存活力。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)味細(xì)胞特別充分地粘附于有涂層的表面上。因此，本發(fā)明還提供了培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，包括i)在有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器中的合適細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)味細(xì)胞，和ii)在第一次更換培養(yǎng)基之后，例如在約24-48小時(shí)，以至少約5天的間隔更換培養(yǎng)基。
可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)分離根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞。優(yōu)選，根據(jù)在此提供的方法來(lái)分離味細(xì)胞。一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，涂蓋物是膠原。一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基更換的時(shí)間間隔是至少約7天，優(yōu)選是至少約8天。
本發(fā)明還提供了將味細(xì)胞維持于改良的測(cè)定緩沖液中至少約6小時(shí)，優(yōu)選至少約12小時(shí)，更優(yōu)選至少約24小時(shí)的方法。改良的測(cè)定緩沖液具有確定的約300-320毫滲摩，優(yōu)選300-310毫滲摩的摩爾滲透壓濃度。可以調(diào)節(jié)測(cè)定緩沖液的摩爾滲透壓濃度，例如，用5M NaCl調(diào)節(jié)。應(yīng)當(dāng)避免太高的摩爾滲透壓，例如，高于約320毫滲摩，因?yàn)榧?xì)胞開(kāi)始死亡且在測(cè)定細(xì)胞對(duì)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答時(shí)對(duì)于鈣成像測(cè)定不再接受測(cè)定試劑如fura-2AM(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例9)。測(cè)定緩沖液具有約7.0-7.3的pH。對(duì)于改良的測(cè)定緩沖液而言?xún)?yōu)選的pH是約7.15至約7.25。作為基礎(chǔ)緩沖液，可以使用任何合適的緩沖液。如果需要，可以調(diào)節(jié)基礎(chǔ)緩沖液的摩爾滲透壓濃度和/或pH。例如，合適的基礎(chǔ)緩沖液是改良的MHNK林格溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM丙酮酸鈉、20mM Hepes-Na，pH7.2)。當(dāng)欲維持細(xì)胞用于測(cè)定目的時(shí)，維持方法是有用的。現(xiàn)有技術(shù)方法中沒(méi)有一個(gè)能夠?qū)ㄎ队X(jué)感受器細(xì)胞的味細(xì)胞在緩沖液中維持相當(dāng)?shù)某掷m(xù)時(shí)間同時(shí)保持對(duì)味覺(jué)刺激物的反應(yīng)性。
對(duì)根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的味細(xì)胞的分析顯示了它們?cè)谡麄€(gè)培養(yǎng)持續(xù)過(guò)程中保持幾種功能和分子特性，培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間例如為長(zhǎng)達(dá)約一個(gè)月、兩個(gè)月或三個(gè)月，或更長(zhǎng)時(shí)間。特別地，細(xì)胞持續(xù)分裂(如通過(guò)BrdU標(biāo)記所示的)并持續(xù)分化成表達(dá)味覺(jué)感受器細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞，這些標(biāo)記包括味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、磷脂酶C-β-2(PLC-β2)、TRPM5、T1R3和T2R5。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的味細(xì)胞保持被味覺(jué)刺激物激活的能力。例如，如通過(guò)鈣成像所示的，通過(guò)一種或多種味覺(jué)刺激物激活根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的味細(xì)胞，所述味覺(jué)刺激物包括苦精(苯酸芐銨酰胺)、丁磺氨鉀(6-甲基-1，2，3-噻嗪-4(3H)-酮2，2-二氧化物鉀鹽)、MSG(谷氨酸一鉀)、放線(xiàn)菌酮(3-[2-(3，5-二甲基-2-氧環(huán)己基)-2-羥乙基]戊二酰亞胺)、甘氨酸和高鉀緩沖液(高鉀緩沖液富含鉀并含有改良的改良MHNK林格溶液，該溶液含有5mM NaCl、80mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM丙酮酸鈉和20mM Hepes-Na，pH7.2，用5M NaCl將其摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至300-310；所有其他刺激物均從Sigma，Saint Louis，MO，USA購(gòu)得)。鈣成像可檢測(cè)應(yīng)答味覺(jué)刺激物激活的胞內(nèi)鈣的升高，這是幾個(gè)對(duì)味覺(jué)刺激物的反應(yīng)機(jī)理之一(鈣從外部的進(jìn)入或從內(nèi)部鈣儲(chǔ)備中釋放)。
本發(fā)明還提供了在細(xì)胞培養(yǎng)物中持續(xù)分裂超過(guò)約48小時(shí)的味細(xì)胞，包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。根據(jù)培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間，味細(xì)胞可持續(xù)分裂超過(guò)約5天，優(yōu)選超過(guò)約2周，且更優(yōu)選超過(guò)約4周或更長(zhǎng)時(shí)間。值得注意的是，現(xiàn)有技術(shù)方法提供了味細(xì)胞培養(yǎng)物，其中細(xì)胞分裂在分離后不久只持續(xù)一段短的時(shí)間或減慢得非?？煲灾掠诩?xì)胞只能存活幾天。Ruiz等，2001，上文，報(bào)道了將BrdU加入到已經(jīng)培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)胞中導(dǎo)致基本上沒(méi)有被BrdU標(biāo)記。按照本領(lǐng)域公知的，使用BrdU標(biāo)記可以容易地測(cè)試細(xì)胞是否在培養(yǎng)物中持續(xù)分裂，例如在至少2天的培養(yǎng)后。根據(jù)本發(fā)明的味細(xì)胞顯示出高百分比的被BrdU標(biāo)記的細(xì)胞，例如，至少約30％的細(xì)胞。優(yōu)選，至少約40％的細(xì)胞，更優(yōu)選至少約50％的細(xì)胞，甚至更優(yōu)選約60％的細(xì)胞，且最優(yōu)選至少約70％的細(xì)胞是被BrdU標(biāo)記的。通常，至少約60-70％的細(xì)胞是被標(biāo)記的。
哺乳動(dòng)物味細(xì)胞實(shí)施例中所述的分離的味蕾源自大鼠的舌頭，但是根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用來(lái)自其他哺乳動(dòng)物的材料。所有哺乳動(dòng)物在味蕾中的味細(xì)胞的組構(gòu)及其細(xì)胞和分子組構(gòu)中都有高度的相似性。因此，也可以分離和/或長(zhǎng)期培養(yǎng)其他哺乳動(dòng)物的味細(xì)胞，而具有相似的存活力。例如，可以使用的常見(jiàn)研究動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，包括，例如，大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠?？梢允褂玫钠渌溉閯?dòng)物包括，例如?？苿?dòng)物、豬、狗、貓和靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，猿、猴子、人)。
味細(xì)胞分離的方法倘若使用酶和分離溶液的孵育時(shí)間較短的話(huà)，可以按照本領(lǐng)域公知的進(jìn)行用于分離舌上皮組織和味蕾的分離方法。最初的方法由Spielman等描述，1989，Brain Research 503326-29。對(duì)這種方法的各種改進(jìn)是已知的，例如Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25，Stone等，2002，Chem.Senses 27779-87，和Ruiz等，2001，Chem.Senses 26(7)861-73所述的。
根據(jù)本發(fā)明的分離過(guò)程涉及足夠短的在分離溶液中孵育和用蛋白水解酶孵育的孵育期，以便達(dá)到所需的培養(yǎng)和細(xì)胞存活力的持續(xù)時(shí)間，這可以如在此所述的容易地測(cè)試。優(yōu)選，使用分離溶液和蛋白水解酶的孵育持續(xù)時(shí)間是約30分鐘或更短，優(yōu)選約20分鐘或更短，且更優(yōu)選約15分鐘或更短。本發(fā)明使用沒(méi)有酶的單純分離溶液孵育約2至約15分鐘，優(yōu)選在冰上，向其中加入一種或多種蛋白水解酶并孵育約10至約15分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的分離方法中所用的優(yōu)選酶是水解蛋白質(zhì)的蛋白酶，足以在不超過(guò)約30分鐘的短時(shí)間段內(nèi)分離味細(xì)胞，使得可以分離細(xì)胞而不損害它們的粘附、生長(zhǎng)和分化的能力。合適的水解酶是，例如，鏈霉蛋白酶E和/或彈性蛋白酶。優(yōu)選，使用多于一種的酶。例如，鏈霉蛋白酶E和彈性蛋白酶的組合可以用于本發(fā)明的分離方法中。鏈霉蛋白酶E是來(lái)自灰色鏈霉菌(Streptomcyes griseus)的非特異性蛋白酶混合物且是可購(gòu)得的，例如，可得自Sigma，Saint Louis，MO，USA。彈性蛋白酶，例如I型豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌?同義詞胰腺肽酶E，豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌?、CAS編號(hào)39445-21-1；酶委員會(huì)(EC)編號(hào)3.4.21.36)，水解蛋白質(zhì)包括具有優(yōu)先切割位點(diǎn)Ala-Xaa的彈性蛋白，且從Sigma，Saint Louis，MO，USA可購(gòu)得(例如水性懸浮液中的1mg/ml彈性蛋白酶，4單位/mg蛋白，產(chǎn)品編號(hào)為E1250)。
另外，可以按照本領(lǐng)域公知的和例如Baumstark等(Baumstark等，1963，Biochim.Biophys.Acta 676；和Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory)所述的克隆并表達(dá)所述的酶。
優(yōu)選在分離后將舌上皮切碎。優(yōu)選，在將從味蕾區(qū)(輪廓狀、葉狀和菌狀乳頭中的一種或多種)分離的上皮轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中后，使用合適的工具例如外科手術(shù)刀片將分離的上皮切碎，來(lái)提供包含完整味蕾以及部分切開(kāi)的味蕾的混合物。源自這樣的混合物的原代細(xì)胞培養(yǎng)物易于及時(shí)提供可以保持較長(zhǎng)時(shí)間段的細(xì)胞培養(yǎng)物，這可能是由于更好的粘附和/或更長(zhǎng)時(shí)間段的存活和/或生長(zhǎng)所致。
味細(xì)胞的培養(yǎng)方法本發(fā)明方法中使用的合適培養(yǎng)基將維持味細(xì)胞的存活力、增殖和分化。用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基優(yōu)選包括Iscove氏培養(yǎng)基，優(yōu)選補(bǔ)充了MCDB 153培養(yǎng)基、FBS、胰島素和抗生素中的一種或多種。例如，用于細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)選培養(yǎng)基是Iscove氏培養(yǎng)基，優(yōu)選補(bǔ)充了15-20％MCDB 153培養(yǎng)基、5-20％ FBS、10ng/ml胰島素和抗生素中的一種或多種。合適的FBS濃度是10％。合適的抗生素組合是，例如，青霉素、鏈霉素、慶大霉素和兩性霉素B。合適的濃度是100U/ml/100μg/ml青霉素/鏈霉素，2.5μg/ml慶大霉素和0.5μg/ml兩性霉素B。
Iscove氏培養(yǎng)基是改良自Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)的高富集合成培養(yǎng)基，并含有亞硒酸鈉、附加的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉、HEPES緩沖液和替代硝酸鐵的硝酸鉀。Iscove氏培養(yǎng)基例如以“Iscove氏Modification of DMEM”從Cellgro，Mediatech Inc，Herndon，VA，USA可購(gòu)得(產(chǎn)品編號(hào)為10-016)。
MCDB 153培養(yǎng)基，例如含有L-谷氨酰胺和28mM HEPES，不含有碳酸氫鈉，是對(duì)Ham氏營(yíng)養(yǎng)混合物F-12的改良，并且是為無(wú)血清生長(zhǎng)設(shè)計(jì)的高富集培養(yǎng)基并使用激素、生長(zhǎng)因子、微量元素或低水平的滲析的胎牛血清蛋白。MCDB 153從Sigma，Saint Louis，MO，USA可購(gòu)得(產(chǎn)品編號(hào)為M7403)。
用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適溫度是允許細(xì)胞生長(zhǎng)和所需速率的細(xì)胞過(guò)程的任何溫度，例如，約18℃至約37℃，包括室溫(18-22℃)和約37℃，例如35至39℃。優(yōu)選的溫度是37℃，這是生理溫度并提供通常速率的細(xì)胞過(guò)程。例如在約37℃培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，溫度將隨著時(shí)間略有改變，在約37℃的平均值上下，例如±0.5或1℃波動(dòng)，這將取決于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的。
在含有合適CO2濃度和合適濕度的合適環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的。例如，根據(jù)選定培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)，約5％的CO2濃度是合適的。通常在高濕度，例如約95％的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)容器，例如培養(yǎng)皿或蓋玻片，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用膠原，更優(yōu)選I型膠原，且最優(yōu)選鼠尾1型膠原涂蓋。
在例如接種后約24-48小時(shí)可以進(jìn)行第一次培養(yǎng)基更換，此后，以不短于至少約5天，優(yōu)選至少約7天，最優(yōu)選至少約8天的間隔來(lái)進(jìn)行隨后的培養(yǎng)基更換。根據(jù)培養(yǎng)條件、選定的培養(yǎng)基、抗生素的濃度和生長(zhǎng)速率，通常應(yīng)當(dāng)在大約10天后更換培養(yǎng)基。
本領(lǐng)域中已知的任何方法都可以用于測(cè)定細(xì)胞存活力。例如，可以使用錐蟲(chóng)藍(lán)染色(Sigma，Saint Louis，MO，USA)?？梢匀缦聹y(cè)試存活力將錐蟲(chóng)藍(lán)(Sigma，Saint Louis，MO，USA)直接加入到培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)基中來(lái)獲得0.2％(w/v)錐蟲(chóng)藍(lán)的濃度。錐蟲(chóng)藍(lán)將死細(xì)胞的細(xì)胞核染成藍(lán)色。5至10分鐘后，在相差顯微鏡下以10x放大倍數(shù)使用目鏡網(wǎng)格來(lái)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。以百分比來(lái)確定存活力(計(jì)數(shù)的活細(xì)胞除以計(jì)數(shù)的總細(xì)胞，乘以100)。用2-3個(gè)蓋玻片重復(fù)該程序并確定平均值。不同蓋玻片之間的差異通常很低。細(xì)胞培養(yǎng)物至少約80％是活的，更優(yōu)選至少約80％是活的，更優(yōu)選至少約90％是活的，更優(yōu)選至少約95％，甚至更優(yōu)選至少約98％，且甚至更優(yōu)選至少約99％是活的。
味細(xì)胞測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的方法和味細(xì)胞可以用于本領(lǐng)域已知的測(cè)定方法中來(lái)鑒定引發(fā)味細(xì)胞中應(yīng)答的候選刺激物或化合物，包括呈味物質(zhì)、味覺(jué)調(diào)節(jié)劑(包括提高、遏抑、刺激或抑制味覺(jué)的刺激物，或影響特定味質(zhì)的刺激物)，和引發(fā)味細(xì)胞中特定應(yīng)答或效應(yīng)的其他候選刺激物或化合物。例如，這些測(cè)定可以用于鑒定和評(píng)價(jià)候選物的味覺(jué)、味質(zhì)、味覺(jué)調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)促進(jìn)、抑制或毒性作用。此外，它們可以用于鑒定治療味覺(jué)喪失的候選物、用于藥物研發(fā)的靶和維持健康味細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)因子。通常，這樣的測(cè)定包括將目標(biāo)候選物或候選物混合物的至少一種類(lèi)型的細(xì)胞應(yīng)答(例如，與鈣濃度相關(guān)的熒光信號(hào))與標(biāo)準(zhǔn)相比較。
候選刺激物或化合物可以是，例如，候選呈味物質(zhì)或呈味物質(zhì)存在下的候選味覺(jué)調(diào)節(jié)劑。標(biāo)準(zhǔn)的刺激物或化合物可以是已知的味覺(jué)刺激物或已知味質(zhì)的呈味物質(zhì)，或能夠引發(fā)對(duì)味細(xì)胞的特定作用的刺激物/化合物。這樣的作用可以是生長(zhǎng)促進(jìn)、抑制或毒性作用，或喪失對(duì)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答，維持細(xì)胞生長(zhǎng)或味細(xì)胞的健康。如果要比較不同味細(xì)胞，例如，不同來(lái)源(物種、個(gè)體、年齡等)的味細(xì)胞的應(yīng)答差異，候選物和標(biāo)準(zhǔn)可以是相同的(例如，已知的呈味物質(zhì))。
將根據(jù)本發(fā)明的包括味覺(jué)感受器細(xì)胞的味細(xì)胞暴露于候選物和標(biāo)準(zhǔn)，并比較產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)的細(xì)胞應(yīng)答。可以按照本領(lǐng)域公知的連續(xù)地或平行地進(jìn)行暴露?？梢砸黄饻y(cè)試幾種刺激物或化合物。
不同的細(xì)胞應(yīng)答是本領(lǐng)域公知的并包括鈣濃度、pH和電壓的改變。應(yīng)答的改變可以包括大小、反應(yīng)時(shí)間(定義為介于刺激物暴露與應(yīng)答之間的時(shí)間)或持續(xù)時(shí)間的改變。通過(guò)本領(lǐng)域公知的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)這些改變，包括對(duì)鈣或pH敏感的熒光化合物，電壓敏感染料(例如，Hayashi等，1996，Biophys J.，71(2)1057-70所述的)和電生理學(xué)記錄(例如，如Ogura等，J Neurosci.1997年5月15日；17(10)3580-7，和Zviman MM等，J Membr Biol.1996年1月；149(2)81-8所述的)。
存在多種特定的測(cè)定類(lèi)型，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚怎樣詳細(xì)地建立它們。例如，可以按照Frank ME所述的，“Taste nerve recordingin rodents”(嚙齒動(dòng)物中的味覺(jué)神經(jīng)記錄)來(lái)進(jìn)行測(cè)定，在“Experimental cell biology of taste and olfaction”(味覺(jué)和嗅覺(jué)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué))，A.Spielman和J.Brand編輯，CRC出版社，1995；Bryant，BP.“Trigeminal nerve recording in rodents”(嚙齒動(dòng)物中的三叉神經(jīng)記錄)，A.Spielman和J.Brand編輯，CRC出版社，1995；Gilbertson TA，“Patch-clamping of taste cellsin hamster and rat”(倉(cāng)鼠和大鼠中味細(xì)胞的膜片鉗術(shù)”)，A.Spielman和J.Brand編輯，CRC出版社，1995。
在此提供了一些功能測(cè)定的概述。
呈味物質(zhì)鑒定/表征測(cè)定將味細(xì)胞對(duì)未知味質(zhì)的候選物的應(yīng)答與對(duì)已知呈味物質(zhì)的應(yīng)答相比較來(lái)鑒定細(xì)胞應(yīng)答的差異或相似。通過(guò)它們對(duì)已知呈味物質(zhì)的應(yīng)答來(lái)鑒定味細(xì)胞，例如，如實(shí)施例8中所述的或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可比較的細(xì)胞應(yīng)答測(cè)定。監(jiān)控對(duì)候選物的細(xì)胞應(yīng)答并與相同細(xì)胞對(duì)呈味物質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答相比較。
調(diào)節(jié)劑(味覺(jué)調(diào)節(jié)劑)測(cè)定比較在候選調(diào)節(jié)劑(例如，味覺(jué)調(diào)節(jié)劑)存在或不存在下對(duì)已知刺激物(例如，已知呈味物質(zhì))的味細(xì)胞應(yīng)答。檢測(cè)并比較細(xì)胞應(yīng)答。比較可以顯示出應(yīng)答得到了提高、降低、延遲、延長(zhǎng)或未受到影響。引起對(duì)刺激物的細(xì)胞應(yīng)答大小的增大或?qū)Υ碳の锏募?xì)胞應(yīng)答頻率的增加的候選調(diào)節(jié)劑表明該候選調(diào)節(jié)劑可用于增強(qiáng)刺激物(例如，呈味物質(zhì))的強(qiáng)度，和可以用于加入到某些產(chǎn)品如食品中，來(lái)增強(qiáng)給定的刺激物(例如，味覺(jué)刺激物/食用香料)。引起較短反應(yīng)時(shí)間或較長(zhǎng)應(yīng)答持續(xù)時(shí)間應(yīng)答的刺激物或化合物表明提高的強(qiáng)度或改變的品質(zhì)。
提高的味覺(jué)強(qiáng)度或較快或更長(zhǎng)時(shí)間的味知覺(jué)的發(fā)現(xiàn)將刺激物或化合物鑒定為味覺(jué)增強(qiáng)劑，可以將其加入到食品中來(lái)增強(qiáng)食品的口味。將導(dǎo)致對(duì)靶刺激物減小的應(yīng)答大小、較慢的反應(yīng)時(shí)間或較短的應(yīng)答持續(xù)時(shí)間的候選調(diào)節(jié)劑鑒定為用作靶刺激物的遮掩、封閉或抑制劑。如果結(jié)果顯示在候選調(diào)節(jié)劑存在與不存在下對(duì)靶刺激物的應(yīng)答沒(méi)有差異，該化合物就不是靶刺激物的調(diào)節(jié)劑。
不同測(cè)試對(duì)象中味細(xì)胞應(yīng)答差異的測(cè)定比較源自不同來(lái)源的味細(xì)胞對(duì)給定刺激物(例如，已知呈味物質(zhì)，已知呈味物質(zhì)和味覺(jué)調(diào)節(jié)劑)的應(yīng)答。通過(guò)使用這些測(cè)定，可以確定根據(jù)不同培養(yǎng)物、個(gè)體、物種或與年齡、遺傳組成、代謝或營(yíng)養(yǎng)狀況、疾病狀態(tài)、藥物使用和治療性處理的不同聯(lián)系起來(lái)選擇的不同來(lái)源的味細(xì)胞之間對(duì)刺激物或呈味物質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答是否不同。
鑒定的差異使得可以開(kāi)發(fā)改良的以食用香料和食用香味為目標(biāo)的味覺(jué)系統(tǒng)，例如，用于食品，使所述系統(tǒng)適應(yīng)特定物種、群體或個(gè)體的需要。例如，在源自老年相對(duì)年輕受試者的細(xì)胞中對(duì)特定刺激物降低的反應(yīng)性可鑒定出必要的刺激物濃度的提高/降低來(lái)改善消費(fèi)者的食欲品質(zhì)，這將取決于打算供其食用該產(chǎn)品的消費(fèi)者群的年齡。可以在不同物種中鑒定在一個(gè)物種中已知其活性的味覺(jué)調(diào)節(jié)劑的功效來(lái)鑒定在目標(biāo)物種中有效的味覺(jué)刺激物。
涉及不同細(xì)胞參數(shù)的基于味細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答的測(cè)定測(cè)量的參數(shù)包括如上詳述的應(yīng)答差異、對(duì)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答頻率或如實(shí)施例中所述的特定的細(xì)胞參數(shù)，包括細(xì)胞的增殖速率、與味覺(jué)或味細(xì)胞再生(增殖、分化、存活)相關(guān)的蛋白標(biāo)記的表達(dá)等等。
可以通過(guò)比較在候選化合物存在和不存在下的味細(xì)胞應(yīng)答來(lái)鑒定影響味細(xì)胞再生、修復(fù)、增殖、分化、存活和置換的可以用作治療藥物的候選化合物?？梢栽隗w內(nèi)或體外使細(xì)胞暴露于候選化合物。
可以通過(guò)以下本領(lǐng)域公知的一種或多種方法來(lái)進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)上述測(cè)定鑒定的候選刺激物或化合物。這些方法包括對(duì)測(cè)試對(duì)象的行為測(cè)試、感官測(cè)試、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)試、生理學(xué)方法(例如，神經(jīng)記錄)，如例如Spielman A.I.，和Brand，J.G.(編輯)，“Experimental cellBiology of Taste and Olfaction”(味覺(jué)和嗅覺(jué)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué))，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，pp.437，1995和Doty，R.L.(編輯)Handbook of Olfaction and Gustation(嗅覺(jué)和味覺(jué)手冊(cè))，第2版，N.Y.Marcel Dekker，2003，1150pp所述。
通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的味細(xì)胞的測(cè)定法鑒定的刺激物或化合物可以加入到食品中?！笆称贰币馑际前ㄖ糜诳谇恢械乃挟a(chǎn)品，包括藥物、漱口水和其他口腔健康和衛(wèi)生產(chǎn)品。它進(jìn)一步包括寵物食品。
轉(zhuǎn)染方法本發(fā)明第一次提供了轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的味細(xì)胞。在另一方面中，本發(fā)明因此涉及例如通過(guò)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的味細(xì)胞，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的味細(xì)胞，和涉及產(chǎn)生這樣的細(xì)胞的方法，例如通過(guò)轉(zhuǎn)染，例如，通過(guò)使用質(zhì)粒載體。
可以使用用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)轉(zhuǎn)染根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的味細(xì)胞，包括味細(xì)胞和味覺(jué)感受器細(xì)胞，例如以下所述的方法，Murray，EJ，編輯(1990)，Gene Transfer and Expression ProtocolsMethods in Moplecular Biology(基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方案分子生物學(xué)方法)，Vol.7，Humana Press，Clifton，New Jersey；Perkus ME等，(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1572)；Felgner，J.等(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1563)?；蛘撸梢允褂肍uGene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)來(lái)轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，如實(shí)施例10中對(duì)于含有報(bào)道基因的表達(dá)載體所示的。還可以按照本領(lǐng)域公知的使用已知的病毒轉(zhuǎn)染方法來(lái)通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染根據(jù)本發(fā)明的味細(xì)胞。使用病毒將遺傳物質(zhì)引入味細(xì)胞的方法是已知的(Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25；Stone等，2002，Chem.Senses27779-87)。
質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染方案具有避免復(fù)雜的病毒處理的優(yōu)點(diǎn)。使用質(zhì)粒載體可以成功地轉(zhuǎn)染根據(jù)本發(fā)明的味細(xì)胞，而具有良好的轉(zhuǎn)染效率，從轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)(如綠色熒光蛋白)產(chǎn)生容易目視的熒光信號(hào)。使用根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)的細(xì)胞，良好的轉(zhuǎn)染效率可以是至少約10％，優(yōu)選至少約20％，更優(yōu)選至少約50％。優(yōu)選，使用培養(yǎng)了至少約5天或更長(zhǎng)時(shí)間(例如，至少約7天，至少約2周，至少約3周，至少約4周，和至少約2個(gè)月)的細(xì)胞。
以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明實(shí)施方案的幾個(gè)方面。提供這些實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制在此所述的本發(fā)明的各方面。
實(shí)施例實(shí)施例1從大鼠味蕾(輪廓狀、葉狀)分離包括味覺(jué)感受器細(xì)胞的味細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)所用的大鼠是1-2個(gè)月大的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。通過(guò)CO2吸入接著頸部脫位來(lái)處死大鼠。解剖接近于輪廓乳頭的舌頭并立即放入冰上的冷分離溶液(26mM NaHCO3、2.5mM NaH2PO4、20mM葡萄糖、65mM NaCl、20mM KCl和1mM EDTA)中，持續(xù)5至10分鐘。
從冰中取出標(biāo)本并將約1ml的分離溶液與1.5mg/ml鏈霉蛋白酶E(來(lái)自灰色鏈霉菌的蛋白酶，從Sigma，St.Louis，MO，USA可購(gòu)得，產(chǎn)品編號(hào)為P6911，具有5.5單位/mg固體的活性。單位定義1單位在pH7.5，37℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1.0微摩爾(181微克)酪氨酸的顏色)和1mg/ml彈性蛋白酶(也稱(chēng)為I型豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌?，CAS編號(hào)39445-21-1，從Sigma，St.Louis，MO，USA可購(gòu)得，產(chǎn)品編號(hào)為E1250，含有4單位/mg蛋白的水性懸浮液)混合。
用25號(hào)的NORM-JECT注射器將所得的含有酶的溶液均勻地注射至解剖的舌頭的輪廓狀和葉狀乳頭的舌上皮下面或周?chē)蛊湓龃蟮秸４笮〉募s兩倍。將含有酶溶液的解剖的舌頭放入冷的分離溶液中并在室溫孵育15分鐘。
在酶孵育后，在解剖顯微鏡(Stereomaster，F(xiàn)ischer Scientific，Pittsburgh，PA)下將上皮輕輕地從下面的肌肉層上剝離并浸泡在分離溶液中。從輪廓狀和葉狀乳頭區(qū)分離上皮并將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中。
使用以下的培養(yǎng)基-Iscove氏培養(yǎng)基(來(lái)自Mediatech Inc，Herndon，VA，USA的CELLGRO“Iscove氏Modification of DMEM”，產(chǎn)品編號(hào)為10-016)，含有10％胎牛血清(BTI，MA，USA)、15-20％ MCDB 153培養(yǎng)基(Sigma，St.Louis，MO，USA)、10ng/ml胰島素和抗生素(100U/ml/100μg/ml青霉素/鏈霉素，2.5μg/ml慶大霉素和0.5μg/ml兩性霉素B)。
-含或不含10％FBS的Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco BRL，NY，USA；Cellgro，USA)-MCDB153(Sigma，St.Louis，MO，USA)在培養(yǎng)基中，用外科手術(shù)剪刀將從輪廓狀和葉狀乳頭區(qū)分離的上皮剪成小片，使得存在完整的味蕾和部分切開(kāi)的味蕾。將上皮的碎片接種于選定的培養(yǎng)皿或蓋玻片上。所用的不同培養(yǎng)皿或蓋玻片是-鼠尾1型膠原涂蓋的(1∶4稀釋于水中的3.96mg/ml，BDSciences，San Diego，CA)18mm圓形玻璃蓋玻片(Fisher，USA)；-沒(méi)有涂層的聚苯乙烯培養(yǎng)皿；
-沒(méi)有涂層的玻璃蓋玻片；-涂蓋了基質(zhì)凝膠(2ml/l，ATCC，USA)的玻璃蓋玻片。從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(ATCC，USA，產(chǎn)品編號(hào)為CRL-2108)制得基質(zhì)溶液。如下以三種變化形式來(lái)使用基質(zhì)凝膠在接種之前將細(xì)胞包埋于基質(zhì)凝膠內(nèi)并輕輕地施加于蓋玻片上；用基質(zhì)凝膠涂蓋蓋玻片并將細(xì)胞接種于聚合的基質(zhì)凝膠上；將細(xì)胞接種于基質(zhì)凝膠上，同時(shí)凝膠聚合；-涂蓋了聚-D-賴(lài)氨酸(Sigma，St.Louis，MO，USA，產(chǎn)品編號(hào)為P-6407，最終工作濃度為0.1mg/ml)的玻璃蓋玻片。
在涂蓋或使用之前，如下處理蓋玻片在2M NaOH中孵育1小時(shí)并在70％硝酸(HNO3)中孵育過(guò)夜，接著在HCl酸洗液中孵育1小時(shí)。然后將蓋玻片在水中高壓滅菌，用70％乙醇和100％乙醇沖洗，并進(jìn)行空氣干燥。
將培養(yǎng)皿或蓋玻片在37℃在含有5％CO2的濕潤(rùn)環(huán)境(95％濕度)中孵育。在24-48小時(shí)后更換培養(yǎng)基，此后每5-10天更換一次。
在過(guò)夜培養(yǎng)后使用顯微鏡(10x)監(jiān)控細(xì)胞的粘著。
通過(guò)用錐蟲(chóng)藍(lán)(Sigma，St.Louis，MO，USA)染色來(lái)測(cè)定細(xì)胞的存活力。以0.2％(w/v)的濃度將錐蟲(chóng)藍(lán)加入到培養(yǎng)皿中。5至10分鐘后，在相差顯微鏡下以10x放大倍數(shù)使用目鏡網(wǎng)格來(lái)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。通過(guò)在相差顯微鏡下觀察染上藍(lán)色的核來(lái)識(shí)別死細(xì)胞。拍照細(xì)胞培養(yǎng)皿或蓋玻片的某一個(gè)區(qū)域并通過(guò)計(jì)數(shù)每2-3個(gè)蓋玻片的100個(gè)細(xì)胞來(lái)確定細(xì)胞的存活力(用計(jì)數(shù)的存活細(xì)胞除以計(jì)數(shù)的總細(xì)胞，乘以100)。
結(jié)果在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)控細(xì)胞并在使用根據(jù)本發(fā)明的分離方法、膠原涂蓋的培養(yǎng)表面和Iscove氏培養(yǎng)基保持時(shí)顯示出以下的特征單個(gè)細(xì)胞和味蕾類(lèi)型的細(xì)胞在平板培養(yǎng)后24-48小時(shí)是活的。細(xì)胞以貼壁細(xì)胞和細(xì)胞簇的形式生長(zhǎng)達(dá)長(zhǎng)7-8天。第5-7天后，產(chǎn)生子細(xì)胞的細(xì)胞簇開(kāi)始分離。細(xì)胞維持它們的原始形狀長(zhǎng)達(dá)15-20天。第15-20天后，部分細(xì)胞群開(kāi)始改變形態(tài)，不過(guò)細(xì)胞仍保持它們的緊密的外觀，保持圓形細(xì)胞體，具有或不具有一個(gè)或多個(gè)過(guò)程。20天后，大部分長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞獲得較扁平的外觀。細(xì)胞維持高存活力長(zhǎng)達(dá)3周，具有至少95％存活力，在大部分培養(yǎng)皿中，為至少98％至99％存活力。
當(dāng)使用另一種分離方案或沒(méi)有膠原的不同細(xì)胞培養(yǎng)表面時(shí)，細(xì)胞沒(méi)有附著，或如果培養(yǎng)它們，則最遲在2周時(shí)死細(xì)胞的數(shù)量快速增加。
在過(guò)夜培養(yǎng)后測(cè)定細(xì)胞附著的百分比。當(dāng)如上所述分離細(xì)胞，將其接種于膠原涂蓋的蓋玻片上，并在Iscove氏培養(yǎng)基+20％ MCDB153+10％FBS+10ng/ml胰島素+抗生素(青霉素/鏈霉素+慶大霉素+兩性霉素B)中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞顯示出過(guò)夜孵育(12-16小時(shí))后15-20％的細(xì)胞附著率。7天后，發(fā)現(xiàn)至少90％細(xì)胞是活的。2個(gè)月后，細(xì)胞仍然是至少90％活的。
表1培養(yǎng)皿/蓋玻片表面(用根據(jù)本發(fā)明的改良方案分離并在Iscove氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞)
表2組織培養(yǎng)基(用根據(jù)本發(fā)明的改良方案分離并接種于膠原涂蓋的蓋玻片上的細(xì)胞)
使用所示的酶，在最佳化的表面上分離并且使用最佳化的培養(yǎng)基，將味細(xì)胞維持至少長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月，長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，且可能更長(zhǎng)時(shí)間。頭3至4周，味細(xì)胞維持接近約98至99％的存活力，如如上所述使用錐蟲(chóng)藍(lán)所測(cè)試的。在2個(gè)月后和3個(gè)月時(shí)，味細(xì)胞仍然維持約95％的存活力和部分細(xì)胞增殖。
實(shí)施例2通過(guò)BrdU標(biāo)記所示的包括味覺(jué)感受器細(xì)胞的味細(xì)胞的增殖為了確定原代細(xì)胞培養(yǎng)物是否含有增殖性細(xì)胞，如下所述對(duì)長(zhǎng)達(dá)11天的培養(yǎng)物進(jìn)行5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)摻入。
發(fā)現(xiàn)用BrdU標(biāo)記了60-70％的味細(xì)胞，這顯示出通過(guò)實(shí)施例1的方案分離并按照以下詳述的培養(yǎng)時(shí)，味細(xì)胞在至少長(zhǎng)達(dá)11天的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間后持續(xù)增殖。
按照實(shí)施例1中所述的從大鼠分離味細(xì)胞并接種于膠原涂蓋的蓋玻片中。將細(xì)胞培養(yǎng)5-6天，然后用50μM溶解于10mM DMSO中的BrdU(Sigma，Saint Louis，MO，USA)處理24-48小時(shí)，此后用Iscove氏培養(yǎng)基+20％ MCDB 153+10％FBS+10ng/ml胰島素+抗生素(青霉素/鏈霉素+慶大霉素+兩性霉素B)替換培養(yǎng)基來(lái)除去BrdU。將細(xì)胞在蓋玻片上的培養(yǎng)物中再維持3天，然后用0.1M PB(pH7.2)中的4％低聚甲醛在室溫固定10分鐘。固定后，通過(guò)免疫組織化學(xué)分析細(xì)胞中的BrdU摻入。固定后，將蓋玻片在0.1M PBS(pH7.2)中洗滌三次(每次5分鐘)，并用H2O2溶液(4mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)+0.5mL 100％甲醇+0.5mL 30％ H2O2)在室溫處理20分鐘來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。然后，用PBS漂洗蓋玻片，然后用2N HCl在37℃變性30分鐘。變性后，用PBS洗滌蓋玻片，并用PBS中的封閉緩沖液(SuperBlock，Pierce Chemical Company，Rockford，IL)在室溫孵育1小時(shí)來(lái)降低非特異性結(jié)合。然后在4℃將蓋玻片與稀釋于含有0.05％吐溫20的10％ SuperBlock中的小鼠抗-BrdU(1∶100稀釋的，Sigma，Saint Louis，MO，USA B-2531)一起孵育過(guò)夜。在PBS中洗滌三次后，在室溫將蓋玻片與稀釋于含有0.05％吐溫20的10％ SuperBlock中的FITC綴合的抗小鼠IgG(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)一起孵育1小時(shí)。然后，將蓋玻片在PBS中洗滌三次，每次5分鐘，并在水中洗滌三次，每次10分鐘。最后，用封固劑(Vectashield，或含有DAPI的Vectashield，Vector Labs，USA)封固蓋玻片。
作為陰性對(duì)照，使用小鼠IgG對(duì)照血清代替初次抗體來(lái)排除抗-BrdU抗體的BrdU非特異性染色。作為進(jìn)一步的證實(shí)，用抗-BrdU抗體將未標(biāo)記的細(xì)胞染色。這些對(duì)照中沒(méi)有一個(gè)顯示出任何與BrdU相關(guān)的特異性染色，且發(fā)現(xiàn)味細(xì)胞的BrdU染色是特異性的。
實(shí)施例3通過(guò)RT-PCR分析味細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達(dá)對(duì)如實(shí)施例1中所述的分離并培養(yǎng)的味細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析，如實(shí)施例1中所述的根據(jù)快速分離方法分離并在膠原涂蓋的培養(yǎng)皿上和在改良的Iscove氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述味細(xì)胞。
通過(guò)RT-PCR分析以下的味細(xì)胞特異性標(biāo)記味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β-2(PLC-β2)、TRPM5、T1R3和T2R5。將β-肌動(dòng)蛋白(管家基因)用作陽(yáng)性對(duì)照。
從培養(yǎng)7-10天的味細(xì)胞、培養(yǎng)2個(gè)月的味細(xì)胞和作為陽(yáng)性對(duì)照從大鼠舌上皮分離總RNA。如下所述將RNA分離、逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)PCR擴(kuò)增。在所有樣品(培養(yǎng)7-10天、2個(gè)月的味細(xì)胞和大鼠舌上皮)中，檢測(cè)預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。這顯示出即使在培養(yǎng)2個(gè)月后，培養(yǎng)的味細(xì)胞仍持續(xù)表達(dá)味細(xì)胞特異性標(biāo)記的mRNA。
用于RNA-分離、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的方案按照本領(lǐng)域公知的，例如根據(jù)制造商的說(shuō)明，用TRIZOL試劑(Invitrogen Corp，USA)提取每種樣品?；蛘?，可以按照Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory所述的分離、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA。
在42℃使用用于RT-PCR的SUPERSCRIPT第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen Corp.，USA)將總共20μl體積的4μg RNA逆轉(zhuǎn)錄90分鐘。作為檢查基因組DNA污染的陰性對(duì)照，在逆轉(zhuǎn)錄酶存在和不存在下平行處理RNA樣品并用于PCR。之后通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)基因組DNA污染的測(cè)試顯示出不存在基因組DNA污染。以下列出了用來(lái)顯示味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2、β-肌動(dòng)蛋白、T2R3、T1R5和TRPM5表達(dá)的已知特定引物。
選擇跨越一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的引物以排除與來(lái)自基因組DNA的擴(kuò)增片段的混淆并確保靶特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。之前公開(kāi)了味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2和β-肌動(dòng)蛋白的引物，例如在Rossler等，2000，ChemicalSenses 25413-421。之前Heiner等，2003，Biochem.J.3711045-1053公開(kāi)了TRPM5。所示的第一個(gè)引物是正向引物，第二個(gè)是反向引物。
味轉(zhuǎn)導(dǎo)素5’-gat gct agc caa tcc gag aag tag aga gg-3’(SEQ ID NO1)5’-cgg aga tct gct gtt gaa gag gtg aag ac-3’(SEQID NO2)PLC-β25’-ctg gag gct gaa gta aag gag-3’(SEQ ID NO3)5’-gcc cct gca tgt atg tta gg-3’(SEQ ID NO4)β-肌動(dòng)蛋白5’-tca tgt ttg aga cct tca a-3’(SEQ ID NO5)5’-gtc tt gcg gat gtc cac g-3’(SEQ ID NO；6)T2R55’-tgg caa atc cac atg aag aa-3’(SEQ ID NO7)5’-gca ggg ata gag gaa tgc aa-3’(SEQ ID NO8)T1R35’-gat cag tgg tcc cca gaa aa-3’(SEQ ID NO9)5’-taa gct agc atg gcg aag gt-3’(SEQ ID NO10)TRPM55’-caa gat cat cgt ggt aga gc-3’(SEQ ID NO11)5’-tcc aga aca tgt ctg cgt tg-3’(SEQ ID NO12)在含有2μl RT反應(yīng)物、1×Ampli Taq Gold PCR緩沖液、2.5mM MgCl2、1mM脫氧核苷三磷酸、0.4μM每種引物和0.25U/μl Ampli TagGold聚合酶(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)的50μl終體積中進(jìn)行每個(gè)RT反應(yīng)的cDNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增包括最初95℃5分鐘的變性，接著是94℃變性30秒、55℃退火45秒和72℃延伸30秒的循環(huán)。40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后，在72℃最后延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物在1.4％瓊脂糖凝膠上分離并用0.2μg/ml溴化乙錠染色來(lái)證實(shí)它們預(yù)期的大小。
實(shí)施例4味覺(jué)感受器細(xì)胞特異性生物標(biāo)記味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2和BrdU的免疫組織化學(xué)定位α-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和PLC-β2是分化的應(yīng)答味覺(jué)刺激物的味覺(jué)感受器細(xì)胞的已知生物標(biāo)記。BrdU是細(xì)胞增殖的一般標(biāo)記。對(duì)如實(shí)施例1中所述的分離并培養(yǎng)的味細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)，按照實(shí)施例1中所述的根據(jù)快速分離方法分離并在膠原涂蓋的培養(yǎng)皿上和在改良的Iscove氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述味細(xì)胞。將分析的味細(xì)胞培養(yǎng)7-10天，或2個(gè)月，并按照以下方案中所述的測(cè)試它們對(duì)α-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2和BrdU的免疫反應(yīng)性。通過(guò)使用檢測(cè)非特異性結(jié)合的抗體特異性免疫球蛋白來(lái)證實(shí)抗體特異性。用抗體特異性免疫球蛋白的免疫染色證明了不存在非特異性免疫染色。
在7-10天和2個(gè)月的培養(yǎng)物中都觀察到了α-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和PLC-β2的免疫反應(yīng)性，具有相似的表達(dá)模式，即，它們?cè)谙嗨菩螒B(tài)的細(xì)胞中表達(dá)。
免疫反應(yīng)性的方案使用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.2，PB)中的4％低聚甲醛在室溫固定接種于膠原涂蓋的蓋玻片上的細(xì)胞10分鐘。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中三次洗滌步驟(每次持續(xù)10分鐘)后，用0.1M PBS中的0.3％曲通X-100、2％正常山羊血清和1％牛血清白蛋白封閉蓋玻片1小時(shí)，接著在PBS中再洗三次。將稀釋于封閉溶液中的初次抗體添加至蓋玻片上并在+4℃孵育過(guò)夜。所用的初次抗體是多克隆兔子抗-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素(稀釋度1∶500-1∶1000)和多克隆兔子抗-PLC-β2(稀釋度1∶1000，Santa Cruz Biotechnology)。然后將蓋玻片在PBS中洗滌并在黑暗中與稀釋于封閉緩沖液中的ALEXA FLUOR 488抗小鼠(1∶500，Molecular Probes Inc.)或ALEXA FLUOR 633抗兔子(1∶500，Molecular Probes Inc.)在室溫反應(yīng)1小時(shí)。最終PBS和水洗滌后，用VECTORSHIELD封固蓋玻片。
以相似的方式進(jìn)行全部雙免疫標(biāo)記研究，所不同的是在完成第一個(gè)初次抗體抗-BrdU的檢測(cè)后引入第二個(gè)初次抗體、抗-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素或抗-PLC-β2。免疫熒光顯微鏡的對(duì)照包括省略初次抗血清，且在這些條件下沒(méi)有看到免疫反應(yīng)性。
實(shí)施例5味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2和BrdU平行的免疫組織化學(xué)定位通過(guò)用味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2和BrdU的雙標(biāo)記來(lái)平行分析已經(jīng)在體外增殖的細(xì)胞和味細(xì)胞特異性生物標(biāo)記表達(dá)之間的相關(guān)性。按照實(shí)施例4中所述的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行使用三個(gè)生物標(biāo)記中的兩個(gè)。
培養(yǎng)7-10天和2個(gè)月的味細(xì)胞呈現(xiàn)出分化的味細(xì)胞(味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、PLC-β2)以及增殖(后者通過(guò)BrdU染色來(lái)顯示)特異性標(biāo)記的表達(dá)。通過(guò)使用味轉(zhuǎn)導(dǎo)素或PLC-β2，各自結(jié)合BrdU的雙標(biāo)記來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。盡管一些細(xì)胞顯示出只有一種標(biāo)記(BrdU、味轉(zhuǎn)導(dǎo)素或PLC-β2)的信號(hào)，但是大部分細(xì)胞平行顯示出兩種標(biāo)記(味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和BrdU，PLC-β2和BrdU)的信號(hào)。這顯示出細(xì)胞已經(jīng)在體外增殖并分化成味細(xì)胞。
實(shí)施例6共焦成像用Leica TCS SP2光譜共焦顯微鏡(LEICA Microsystems Inc.，Mannheim，Germany)，使用UV、铔和氦氖(HeNe)激光器捕獲熒光圖像。在HC PL APO CS 20.0x(0.070NA)物鏡下觀察蓋玻片。所用的激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)DAPI為405nm，而對(duì)ALEXA FLUOR 488為488nm，對(duì)ALEXA FLUOR 633為633nm，在合適的波長(zhǎng)下檢測(cè)發(fā)射。對(duì)于所用的物鏡，將針孔直徑設(shè)定在愛(ài)里斑(Airy disc)的第一個(gè)最小直徑處，獲得對(duì)于熒光焦平面可接受的z-軸分辨率。調(diào)節(jié)激光束的功率和光電倍增管的增益來(lái)優(yōu)化信噪比。對(duì)于一些雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，使用每個(gè)波長(zhǎng)的順序獲取，并且當(dāng)與同時(shí)掃描相比較時(shí)未顯示出超越該波長(zhǎng)的信號(hào)滲漏或差異。使用LEICA Scanware軟件來(lái)獲取以1024×1024像素格式單向掃描的共焦圖像，具有2行加3幀平均值。在20x物鏡下使用計(jì)算機(jī)控制的數(shù)碼連續(xù)變焦系統(tǒng)來(lái)增大放大倍數(shù)至最大的2.5X。使用LCS軟件(LEICA Microsystems Inc.)來(lái)整理數(shù)字圖像并調(diào)節(jié)對(duì)比度和亮度。
實(shí)施例7通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析的味覺(jué)感受器細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達(dá)對(duì)于培養(yǎng)的味細(xì)胞的味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和PLC-β2表達(dá)，根據(jù)以下所述的方案使用蛋白質(zhì)印跡。
將測(cè)試的培養(yǎng)的味細(xì)胞按照實(shí)施例1中所述培養(yǎng)1周和2個(gè)月，按照實(shí)施例1中所述的在根據(jù)本發(fā)明改良的含有Iscove氏培養(yǎng)基的膠原涂蓋的培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)。
測(cè)試這些細(xì)胞中的分化味細(xì)胞特異性生物標(biāo)記味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和PLC-β2的表達(dá)。作為陽(yáng)性對(duì)照，使用從新鮮分離的大鼠舌葉狀和輪廓狀組織裂解物的樣品。在所有樣品中均顯示出味轉(zhuǎn)導(dǎo)素和PCL-β2表達(dá)。對(duì)于PLC-β2，使用抗PLC-β2抗體，顯示出之前已經(jīng)報(bào)道過(guò)的兩個(gè)不同的條帶(Wei和Neer 2001，J.Biological Chemistry 276，pp.2503-2508)。對(duì)于兩種生物標(biāo)記，陽(yáng)性對(duì)照與培養(yǎng)的細(xì)胞相比較具有較強(qiáng)的信號(hào)和表達(dá)水平。在培養(yǎng)1周或2個(gè)月的細(xì)胞之間，不存在信號(hào)水平的差異。按照實(shí)施例1中所述的分離和培養(yǎng)的味細(xì)胞維持它們的特異性生物標(biāo)記至少2個(gè)月。
使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫印跡技術(shù)，例如，Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A laboratory Manual”(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory所述的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
將培養(yǎng)的大鼠初級(jí)味細(xì)胞(培養(yǎng)7-10天和1-2個(gè)月的)裂解，并將來(lái)自大鼠輪廓和葉狀乳頭的組織樣品在含有蛋白酶抑制劑(104mMAEBSF，80μM抑肽酶，2mM亮抑肽酶、4mM抑氨肽酶素b和1.5mM抑肽素A)的RIPA緩沖液(150mM NaCl、10mM Tris pH7.2、0.1％ SDS、1％曲通X-100、1％脫氧膽酸鹽、5mM EDTA)中均質(zhì)化。按照本領(lǐng)域公知的，例如，根據(jù)制造商的方案，使用Bio-Rad Dc蛋白質(zhì)估算試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)估算每種樣品的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品與含有β-巰基乙醇的SDS加樣緩沖液混合，煮沸5分鐘，然后置于冰上5分鐘。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺(5-15％)梯度凝膠(Bio-Rad Labs)電泳分離細(xì)胞勻漿并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Bio-RadLabs)上，用1％脫脂奶粉在4℃孵育過(guò)夜。使用多克隆兔子抗-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素(抗體味轉(zhuǎn)導(dǎo)素I-20，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，產(chǎn)品編號(hào)為sc-395)(稀釋度1∶1000)和多克隆兔子抗-PLC-β2(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(稀釋度1∶1000)來(lái)鑒定味細(xì)胞。用這些初次抗體在室溫孵育1.5小時(shí)后，將膜洗滌和漂洗3次，每次在含有0.05％吐溫20的0.1M磷酸鹽緩沖液(“PBS/T”)中孵育15分鐘，在室溫下與HRP綴合的二次抗兔子抗體(稀釋度1∶5000，NA 934，Amersham)反應(yīng)1小時(shí)。將膜洗滌和漂洗3次，每次在大量的PBS/T中孵育15分鐘。按照本領(lǐng)域公知的，例如，根據(jù)制造商的說(shuō)明，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)來(lái)檢測(cè)信號(hào)。之后用掃描儀掃描X-射線(xiàn)膜，用于分析。
實(shí)施例8通過(guò)Ca-成像測(cè)定的味細(xì)胞對(duì)不同味覺(jué)刺激物的應(yīng)答將使用的味細(xì)胞按照實(shí)施例1中所述的分離并在1型鼠尾膠原涂蓋的蓋玻片上培養(yǎng)1周或2個(gè)月。
如下進(jìn)行Ca-成像。在補(bǔ)充了1mM Fura-2AM(Molecular ProbesInc.，Eugene，OR)和20mg/ml PLURONIC F127(Molecular ProbesInc.)的改良MHNK林格溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mMCaCl2、1mM丙酮酸鈉和20mM Hepes-Na，pH7.2，用5M NaCl將摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至300-310)中將蓋玻片與鈣敏感性染料一起孵育15-30分鐘。鈣敏感性染料fura-2AM分裂成fura-2，其是熒光的并且可以得到檢測(cè)。
孵育后，將蓋玻片置于記錄室中并用用作表面灌流液的改良MHNK林格溶液連續(xù)浸泡。
將刺激物(苯酸芐銨酰胺2mM和0.5mM，丁磺氨鉀250ppm，谷氨酸一鈉(MSG)3mM，放線(xiàn)菌酮25μM，甘氨酸125mM，和高鉀緩沖液(改良的改良MHNK林格溶液，含有5mM NaCl、80mM KCl、1mM MgCl2、lmM CaCl2、1mM丙酮酸鈉和20mM Hepes-Na，pH7.2，用5M NaCl將摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至300-310)施加至蓋玻片，通過(guò)將表面灌流液改換成刺激物溶液來(lái)進(jìn)行，這使得在10秒鐘內(nèi)將記錄室內(nèi)的浸泡溶液完全更換。
使用Restrepo D.，M.Zviman和N.E.Rawson所述的標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)(“The measurement of intracellular calcium in chemosensorycells”(化學(xué)感受細(xì)胞中胞內(nèi)鈣的測(cè)量)，在Methods in ChemosensoryResearch(化學(xué)感受研究中的方法)，A.Spielman和J.Brand編輯，CRC出版社，1995)來(lái)進(jìn)行鈣成像記錄。通過(guò)連接顯微鏡的LSRSPECTRAMASTER單色儀提供照明。將200x放大倍數(shù)下細(xì)胞中fura-2發(fā)射的光在510nm處過(guò)濾并用冷卻的CCD相機(jī)(Olympix，Perkin ElmerLife Sciences，Bethesda MD)記錄。使用寬帶濾波器，激發(fā)波長(zhǎng)是340-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)是510nm。使用Merlin成像工作站(PerkinElmer Life Sciences，Bethesda MD)將圖像數(shù)字化，該工作站控制照明器、相機(jī)和獲取，并進(jìn)行圖像壓縮和偽彩色圖像的展示。引入記錄設(shè)置后，細(xì)胞保持存活超過(guò)2天并每次可以連續(xù)成像2小時(shí)而沒(méi)有染料褪色的顯著效應(yīng)。
將刺激物稀釋于改良MHNK林格溶液中并通過(guò)自流式表面灌注裝置施加約10-60秒，這取決于刺激物。如通過(guò)對(duì)所選的至少一個(gè)細(xì)胞的Fura-2AM陽(yáng)性信號(hào)所示的，可以用所有測(cè)試的刺激物來(lái)刺激細(xì)胞。通常測(cè)試幾個(gè)細(xì)胞。
實(shí)施例9用于測(cè)定的改良緩沖液中味細(xì)胞的維持使用的培養(yǎng)的味細(xì)胞和實(shí)施例8中所述的一樣。將蓋玻片上培養(yǎng)的味細(xì)胞在室溫(22-25℃)在培養(yǎng)箱外在改良的測(cè)定緩沖液中孵育過(guò)夜。改良的測(cè)定緩沖液是改良MHNK林格溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM丙酮酸鈉和20mM Hepes-Na，pH7.2)，用5M NaCl將摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至300-310。
在該測(cè)定緩沖液中和在以上孵育條件下，將細(xì)胞維持長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)并且仍然應(yīng)答刺激物(比較實(shí)施例10中所用的刺激物)，如通過(guò)陽(yáng)性Fura-2AM信號(hào)所測(cè)定的(按照實(shí)施例8中所述的進(jìn)行)。與檢查前24小時(shí)相比較，細(xì)胞顯示出相同的結(jié)果。當(dāng)暴露于320或更高的較高摩爾滲透壓濃度時(shí)，細(xì)胞死亡且沒(méi)有被fura-2AM染色。這種測(cè)定緩沖液中原代味細(xì)胞培養(yǎng)物的維持對(duì)于測(cè)定來(lái)說(shuō)是有用的。
實(shí)施例10培養(yǎng)的味細(xì)胞的轉(zhuǎn)染在分離后第5-7天用5-8μg pGFP2-MCS-Rluc(h)表達(dá)載體(BioSignal Packard，Montreal，Canada，產(chǎn)品編號(hào)為6310051)和FuGene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)根據(jù)Roche Diaguostics“FuGene 6轉(zhuǎn)染試劑”說(shuō)明手冊(cè)，版本5，2000年9月，來(lái)轉(zhuǎn)染按照實(shí)施例1所述分離的在膠原涂蓋的蓋玻片上培養(yǎng)的味細(xì)胞。將15-24微升Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑加入到50微升無(wú)血清培養(yǎng)基中。所用的培養(yǎng)基是如實(shí)施例1中所述的補(bǔ)加Iscove氏培養(yǎng)基，但它是無(wú)血清的。用手輕輕地混合混合物。加入5-8微克DNA(pGFP2-MCS-Rluc(h)表達(dá)載體)，用手輕輕地混合混合物。將混合物在室溫孵育15-30分鐘，然后逐滴加入到細(xì)胞上。將平板輕輕地旋轉(zhuǎn)，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育2天。
另外，可以使用用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如本領(lǐng)域公知的，例如如Murray，EJ，編輯(1990)，Gene Transfer andExpression ProtocolsMethods in Molecular Biology(基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方案分子生物學(xué)方法)，Vol.7，Humana出版社，Clifton，New Jersey；Perkus ME等(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1572)；Felgner，J.等(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1563)所述的。
24-48小時(shí)后，將細(xì)胞在PBS中的4％低聚甲醛(PFA)中固定10分鐘并通過(guò)共焦顯微鏡來(lái)檢測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)的熒光信號(hào)。易于觀察GFP的表達(dá)。
這表明了根據(jù)本發(fā)明的味細(xì)胞提供了可行的表達(dá)系統(tǒng)，與通常所用的細(xì)胞系相比在該系統(tǒng)中更相似于在體內(nèi)。與所用的測(cè)試-DNA(pGFP2-MCS-Rluc(h)表達(dá)載體)相似，味覺(jué)感受器的DNA可以被超表達(dá)。
實(shí)施例11用mT2R5和hT2R16轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的味細(xì)胞和鈣成像按照實(shí)施例10中所述的進(jìn)行實(shí)施例11中的轉(zhuǎn)染，改變之處如下-所用的蓋玻片是大鼠尾膠原-1-涂蓋的蓋玻片；-在分離后第3-7天進(jìn)行轉(zhuǎn)染；和-轉(zhuǎn)染的DNA是帶有GFP的實(shí)施例10的表達(dá)載體或攜帶DNA插入片段的表達(dá)載體，以小鼠T2R5 DNA(sstmT2R5HSV/pcDNA3.1-zeo，6053bp)或者人T2R16 DNA作為插入片段(在這兩種情況中，可以按照Bufe等，Nat Genet.2002年10月；32(3)397-401所述的人TAS2R基因的克隆來(lái)形成構(gòu)建體)。
使用抗標(biāo)記蛋白(單純皰疹病毒糖蛋白D(Herpes Simplex VirusGlycoprotein D)，HSV-D)的抗體檢測(cè)在培養(yǎng)的味細(xì)胞中的表達(dá)。用抗味轉(zhuǎn)導(dǎo)素抗體(兔子多克隆抗味轉(zhuǎn)導(dǎo)素，(Santa Cruz，1∶1000)將轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在4℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌(3次，每次15分鐘)，然后用山羊抗兔子ALEXA-633(Molecular Probe，1∶500)在室溫孵育30分鐘，用PBS洗滌(3次，每次15分鐘)，然后用小鼠抗-HSV-標(biāo)記單克隆抗體(Novagen # 69171-1，1∶1000)在4℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌(3次，每次15分鐘)，然后用山羊抗小鼠ALEXA488(Molecular Probe，1∶500)在室溫孵育30分鐘。然后將蓋玻片在PBS中洗滌三次，每次10分鐘，在水中洗滌三次，每次10分鐘，用封固劑(Vectashield，或含有DAPI的Vectasheld，VectorLabs，USA)封固并在共焦或落射熒光裝備的顯微鏡上觀察。非特異性免疫反應(yīng)性的對(duì)照包括省略初次抗體并用兔子和小鼠IgG替代初次抗體，在這種情況中沒(méi)有檢測(cè)到免疫染色。
GFP和HSV-D標(biāo)記探針都顯示出表示超表達(dá)的強(qiáng)烈熒光信號(hào)。HSV-D標(biāo)記免疫熒光的信號(hào)分別與T2R5或T2R16蛋白的表達(dá)相關(guān)。這些結(jié)果證明了根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的味細(xì)胞提供了可行的表達(dá)系統(tǒng)。
另外，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于如實(shí)施例8中所述的鈣成像測(cè)定。如所述的，用T2R5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈現(xiàn)出應(yīng)答1μM放線(xiàn)菌酮有效濃度的放線(xiàn)菌酮的胞內(nèi)鈣的增加，所述濃度與用該受體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中觀察到的濃度相當(dāng)，Ueda等，J.Neurosci.，2003.23(19)7376-7380。
如所述的，用T2R16轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈現(xiàn)出應(yīng)答1mM有效濃度的苯基-β-D-吡喃葡糖苷的胞內(nèi)鈣的增加，所述濃度與用該受體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中觀察到的濃度相當(dāng)，Bufe等，Nat Genet.2002年11月；32(3)397-401。
此外，這些結(jié)果證明了根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的味細(xì)胞提供了可行的表達(dá)系統(tǒng)。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明不限于上述的具體實(shí)施方案，而是包括后面的實(shí)施方案所限定的變化、改良和等價(jià)的實(shí)施方案。此外，所公開(kāi)的所有實(shí)施方案不一定是必?fù)衿湟坏?，因?yàn)榭梢越M合本發(fā)明的各種實(shí)施方案來(lái)提供所需的特征。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，包括a.在合適的培養(yǎng)基中和有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器上培養(yǎng)味細(xì)胞，和b.從第一次更換培養(yǎng)基開(kāi)始，以至少約5天的間隔更換培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括含有15-20％MCDB 153、10％FBS、10ng/ml胰島素和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)容器涂蓋了膠原。
5.分離并培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，包括a.分離舌上皮，其中將舌上皮中的味細(xì)胞暴露于水解蛋白酶的時(shí)間長(zhǎng)度最小化，b.在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中和有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器上孵育分離的味細(xì)胞上皮片，和c.從第一次更換培養(yǎng)基開(kāi)始，以至少5天的間隔更換培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求5的方法，其中味細(xì)胞暴露于蛋白水解酶的時(shí)間長(zhǎng)度約為30分鐘或更短。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括含有15-20％MCDB153、10％FBS、10ng/ml胰島素和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)容器涂蓋了膠原。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法培養(yǎng)的味細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是味覺(jué)感受器細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞應(yīng)答味覺(jué)刺激物。
13.權(quán)利要求10的細(xì)胞，將其在約37℃培養(yǎng)超過(guò)10天。
14.權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中將所述細(xì)胞在約18-37℃培養(yǎng)超過(guò)20天。
15.權(quán)利要求10的味細(xì)胞的培養(yǎng)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求5的方法分離并培養(yǎng)的味細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是味覺(jué)感受器細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞應(yīng)答味覺(jué)刺激物。
19.權(quán)利要求16的細(xì)胞，將其在約37℃培養(yǎng)超過(guò)10天。
20.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中將所述細(xì)胞在約18-37℃培養(yǎng)超過(guò)20天。
21.權(quán)利要求16的味細(xì)胞的培養(yǎng)物。
22.維持味細(xì)胞的方法，包括在含有約300-320毫滲摩的摩爾滲透壓濃度和約7.0至約7.3pH的緩沖液中維持味細(xì)胞。
23.在細(xì)胞培養(yǎng)物中分裂超過(guò)48小時(shí)的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感受器細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中分裂超過(guò)約5天。
25.權(quán)利要求23的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中分裂超過(guò)約2周。
26.轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物味細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中用載體DNA轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中所述載體DNA包括病毒載體DNA或質(zhì)粒載體DNA。
29.轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的味細(xì)胞的方法，包括使培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物味細(xì)胞接觸核酸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述核酸包括載體DNA。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述載體DNA包括病毒載體DNA或質(zhì)粒載體DNA。
32.測(cè)定對(duì)候選味覺(jué)刺激物的味覺(jué)應(yīng)答的方法，包括a.將培養(yǎng)的味細(xì)胞暴露于候選味覺(jué)刺激物，和b.將所述味細(xì)胞對(duì)候選味覺(jué)刺激物的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答與培養(yǎng)的味細(xì)胞對(duì)標(biāo)準(zhǔn)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答相比較，其中培養(yǎng)的味細(xì)胞對(duì)候選味覺(jué)刺激物與對(duì)標(biāo)準(zhǔn)味覺(jué)刺激物相同的細(xì)胞應(yīng)答表示候選味覺(jué)刺激物引起與標(biāo)準(zhǔn)味覺(jué)刺激物相同的在味細(xì)胞中的味覺(jué)應(yīng)答。
33.測(cè)定候選味細(xì)胞的味覺(jué)應(yīng)答的方法，包括a.將候選的培養(yǎng)的味細(xì)胞暴露于已知味覺(jué)刺激物，和b.將候選的培養(yǎng)的味細(xì)胞對(duì)已知味覺(jué)刺激物的細(xì)胞應(yīng)答與標(biāo)準(zhǔn)味細(xì)胞對(duì)已知味覺(jué)刺激物的細(xì)胞應(yīng)答相比較，其中候選味細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)味細(xì)胞對(duì)已知味覺(jué)刺激物的相同細(xì)胞應(yīng)答表示候選味細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)味細(xì)胞都具有對(duì)味覺(jué)刺激物的應(yīng)答。
34.鑒定味覺(jué)調(diào)節(jié)劑的方法，包括a.在已知味覺(jué)刺激物存在下，將培養(yǎng)的味細(xì)胞暴露于候選味覺(jué)調(diào)節(jié)劑，和b.將所述味細(xì)胞對(duì)候選味覺(jué)調(diào)節(jié)劑的一種或多種細(xì)胞應(yīng)答與候選調(diào)節(jié)劑不存在下的細(xì)胞應(yīng)答相比較，其中在候選調(diào)節(jié)劑存在下對(duì)刺激物的所述細(xì)胞應(yīng)答的改變表示是味覺(jué)調(diào)節(jié)劑。
35.含有300-320毫滲摩的摩爾滲透壓濃度和7.0至7.3pH的味細(xì)胞測(cè)定緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了培養(yǎng)哺乳動(dòng)物味細(xì)胞的方法，味細(xì)胞包括味覺(jué)感受器細(xì)胞。將細(xì)胞維持長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月和更長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)維持成熟味細(xì)胞的分子和功能特征。將細(xì)胞在有涂層的培養(yǎng)容器上培養(yǎng)，從第一次更換培養(yǎng)基開(kāi)始，以至少5天的間隔更換培養(yǎng)基。本發(fā)明進(jìn)一步提供了味細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其中將使細(xì)胞暴露于分離溶液和蛋白水解酶的時(shí)間最小化并將細(xì)胞在有涂層的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，從第一次更換開(kāi)始以至少5天的間隔更換培養(yǎng)基。本發(fā)明進(jìn)一步提供了培養(yǎng)的味細(xì)胞、轉(zhuǎn)染和測(cè)定方法，以及具有約300－320的摩爾滲透壓濃度和約7.0－7.3pH的味細(xì)胞測(cè)定緩沖液。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101065479SQ200580040235
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者N·E·羅森, M·H·厄茲代內(nèi)爾 申請(qǐng)人:蒙奈爾化學(xué)感覺(jué)中心