專(zhuān)利名稱：γ－內(nèi)酯的立體選擇性制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及立體選擇性合成γ-內(nèi)酯，特別是天然的γ-內(nèi)酯的方法。
“天然”產(chǎn)品日益受到普通大眾的喜愛(ài)，因此，使用芳香化合物或有氣味化合物的行業(yè)關(guān)注于開(kāi)發(fā)“天然”芳香物質(zhì)和制品。只有已在自然界中被鑒別的物質(zhì)能有望獲得該標(biāo)志；因此它們目前由植物或由微生物產(chǎn)生；后者日益得到廣泛應(yīng)用，目前生物技術(shù)方法使以合理的費(fèi)用合成天然分子成為可能。γ-內(nèi)酯正是上述這種情況。
γ-內(nèi)酯是芳香分子，其構(gòu)成了許多天然產(chǎn)品的香氣和香味。例如，γ-庚內(nèi)酯因其榛子或焦糖香氣和味道而眾所周知，γ-壬內(nèi)酯具有油脂、奶油或椰子香氣；γ-癸內(nèi)酯和γ-十一內(nèi)酯具有桃子或杏香氣和味道。
γ-內(nèi)酯以其兩種對(duì)映異構(gòu)體形式(R)和(S)天然存在，但是(R)對(duì)映異構(gòu)體占優(yōu)勢(shì)。
可通過(guò)合成產(chǎn)生或利用微生物通過(guò)生物合成產(chǎn)生γ-內(nèi)酯。于是，EP 371 568描述了利用微生物產(chǎn)生γ-內(nèi)酯的方法，該微生物對(duì)于制備食品是可接受的，例如，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、漢森德巴利酵母(Debaromyces hansenii)或波氏假絲酵母(Candidaboidinii)。
US 5,112,803表明γ-辛內(nèi)酯，特別是其(R)和(S)旋光異構(gòu)體可用于形成黃油香氣和香味，并描述了增加可被消費(fèi)物質(zhì)的香氣或香味的方法，其通過(guò)加入顯著量的具有光學(xué)活性的γ-辛內(nèi)酯和多種化合物的混合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，該多種化合物是所述專(zhuān)利中描述的用于獲得γ-辛內(nèi)酯的生物方法的副產(chǎn)物。US 5,112,803中描述的方法表明可采用辛酸利用Syncephalastratum sp.屬或被孢霉屬(Mortierella sp.)通過(guò)生物合成獲得γ-辛內(nèi)酯的兩種(R)和(S)異構(gòu)體；但是，該方法不具有對(duì)映選擇性。
γ-內(nèi)酯在食品調(diào)味品行業(yè)和香料行業(yè)中具有極大價(jià)值，以及實(shí)際的工業(yè)大投資關(guān)注于產(chǎn)生具有不同的感官細(xì)微差別的產(chǎn)品。
公知揮發(fā)性分子的手性可引起不同的嗅覺(jué)，以及γ-內(nèi)酯的旋光異構(gòu)體并不是都具有相同的感官香調(diào)因此產(chǎn)生γ-內(nèi)酯的特定旋光異構(gòu)體具有重要優(yōu)勢(shì)，特別是采用與現(xiàn)有技術(shù)相比至少同樣有效或甚至更有效的方法并以有競(jìng)爭(zhēng)性的成本實(shí)現(xiàn)該生產(chǎn)。
迄今為止，據(jù)申請(qǐng)人所知，還不存在用于直接得到天然的γ-內(nèi)酯的對(duì)映異構(gòu)體的立體選擇性方法。公知的方法產(chǎn)生對(duì)映異構(gòu)體的混合物，通常通過(guò)在取代的環(huán)糊精的毛細(xì)管柱上進(jìn)行氣相色譜或衍生化后來(lái)進(jìn)行所要的對(duì)映異構(gòu)體的分離。
因此，本發(fā)明的目的是提供有效的、經(jīng)濟(jì)的并具有立體選擇性的生物合成γ-內(nèi)酯的方法。
本發(fā)明涉及(R)-γ-內(nèi)酯和(S)-γ-內(nèi)酯的合成。出于本發(fā)明的目的，(R)和(S)表示在所述γ-內(nèi)酯的4位上的不對(duì)稱碳的位置。
根據(jù)本發(fā)明所述方法優(yōu)選合成的γ-內(nèi)酯是對(duì)應(yīng)于式(I)的本發(fā)明的C5-C20γ-內(nèi)酯 其中內(nèi)酯環(huán)可在2位碳和3位碳之間具有不飽和，且其中R1為C1-16烯基、C1-16炔基或C1-16烷基基團(tuán)，并除了5位碳以外任選地具有一個(gè)或多個(gè)取代的碳。措辭“取代的烯基或炔基或烷基”是指至少一個(gè)碳具有至少一個(gè)取代基基團(tuán)的烯基或炔基或烷基。術(shù)語(yǔ)“取代基基團(tuán)”特別是指羥基基團(tuán)、酮基基團(tuán)、硫醇基團(tuán)、烷基基團(tuán)或烯基基團(tuán)。
本發(fā)明因此涉及用于立體選擇性制備γ-內(nèi)酯的方法，其特征在于進(jìn)行γ-內(nèi)酯的微生物生物合成，尤其是以上通式(I)的γ-內(nèi)酯的微生物生物合成，其中所述內(nèi)酯環(huán)可在2位碳和3位碳之間具有不飽和，并優(yōu)選是飽和的，且其中R1為任選取代的C1-16烯基、C1-16炔基或C1-16烷基，所述生物合成采用菌株的生物培養(yǎng)物從至少一種底物、優(yōu)選為脂肪酸來(lái)進(jìn)行，該菌株選自能夠在C4位立體選擇性羥基化所述底物的菌株。
本發(fā)明涉及采用合適菌株的微生物培養(yǎng)物，從至少一種底物生物制備γ-內(nèi)酯，特別是立體選擇性合成γ-內(nèi)酯的每一(R)或(S)光學(xué)異構(gòu)體。
所述制備包括如下步驟a)選擇合適的菌株，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株，在進(jìn)行所述培養(yǎng)之前任選地存在預(yù)培養(yǎng)該菌株的步驟，c)加入可被轉(zhuǎn)化為γ-內(nèi)酯的底物，d)將該底物生物轉(zhuǎn)化為γ-內(nèi)酯，e)回收所產(chǎn)生的γ-內(nèi)酯。
旨在生物合成本發(fā)明的γ-內(nèi)酯的步驟a)中的合適的微生物菌株是那些能夠特異性羥基化所述底物的菌株。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，旨在生物合成本發(fā)明的γ-內(nèi)酯的步驟a)中的合適的微生物菌株是那些能夠在C4位進(jìn)行立體選擇性羥基化所述底物的菌株。因此，根據(jù)本發(fā)明，得到C4位的碳為(R)構(gòu)型或(S)構(gòu)型的γ-內(nèi)酯。
當(dāng)由生物合成產(chǎn)生的產(chǎn)物用于食品工業(yè)時(shí)，當(dāng)然優(yōu)選食品級(jí)的菌株。在能夠進(jìn)行立體選擇性羥基化的菌株中，可特別提及曲霉屬(Aspergillus sp.)、青霉屬(Penicillium sp.)、毛霉菌屬(Mucor sp.)、被孢霉屬(Mortierella sp.)的菌株。因?yàn)檫@些菌株均屬于1類(lèi)微生物，且由于部分菌株是食用菌株，因此它們的應(yīng)用不會(huì)對(duì)內(nèi)酯的工業(yè)生產(chǎn)或?qū)?nèi)酯在食品中的可能應(yīng)用造成任何特殊問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所用的菌株為曲霉屬，優(yōu)選米曲霉(Aspergillus oryzae)，其中可提及如下菌株的集合米曲霉DSMZ 1861、米曲霉DSMZ 1864、米曲霉DSMZ 1147、米曲霉DSMZ 63303、米曲霉CBS 570.65、米曲霉CBS 819.72、米曲霉CBS 110.27、米曲霉VMF 88093。
其中，優(yōu)選米曲霉DSMZ 1861和米曲霉CBS 110.27。
根據(jù)另一具體實(shí)施方案，所用的菌株為被孢霉屬，其中可提及如下種類(lèi)的集合深黃被孢霉(Mortierella isabellina)DSMZ 1414、深黃被孢霉CBS 100559、深黃被孢霉CBS 221.29、深黃被孢霉CBS 194.28、深黃被孢霉CBS 208.32、深黃被孢霉CBS 224.35、深黃被孢霉CBS560.63、深黃被孢霉CBS 167.80、深黃被孢霉CBS 493.83、深黃被孢霉CBS 309.93、深黃被孢霉CBS 250.95、深黃被孢霉CBS 109075、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)CBS 112.08、拉曼被孢霉CBS219.47、拉曼被孢霉CBS 243.58、拉曼被孢霉CBS 478.63、拉曼被孢霉CBS 852.72、拉曼被孢霉CBS 366.95、拉曼被孢霉CBS 101226。
事實(shí)上，發(fā)明人驚訝并出乎意料地發(fā)現(xiàn)使用曲霉屬的菌株導(dǎo)致選擇性產(chǎn)生(R)-γ-內(nèi)酯，使用被孢霉屬的菌株導(dǎo)致選擇性產(chǎn)生(S)-γ-內(nèi)酯。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，由于其不能在C4位引起羥基化，因此本發(fā)明將解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)菌株排除在外。有利的是，本發(fā)明將不能特異地及立體選擇性地在C4位產(chǎn)生羥基化的所有菌株排除在外。
不被任何理論所束縛，可預(yù)計(jì)培養(yǎng)所述菌株的條件在所觀察到的立體選擇性以及生物轉(zhuǎn)化的數(shù)量方面具有重要性。
本發(fā)明所述方法的步驟b)中進(jìn)行的培養(yǎng)包括在合適的培養(yǎng)基中，例如通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增制備所述菌株的培養(yǎng)物，優(yōu)選半濃縮培養(yǎng)物?？稍谶M(jìn)行該培養(yǎng)之前，使所述菌株在更適于進(jìn)行該菌株增殖的第一步驟的第一培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
在本發(fā)明的立體選擇性方法中使用的培養(yǎng)條件應(yīng)是導(dǎo)致菌絲體產(chǎn)生的條件，該菌絲體顯示有充滿內(nèi)含物的膨脹(特別是有過(guò)氧化物酶體)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所制備的細(xì)胞培養(yǎng)物具有“腫脹的(compoteux)”的菌絲體，該菌絲體由不帶有分生孢子的區(qū)室化的菌絲組成，并顯示出凸起結(jié)構(gòu)，充滿這些內(nèi)容物(過(guò)氧化物酶體)。該培養(yǎng)條件實(shí)際上特別適于防止該菌絲體的孢子形成。此外，發(fā)明人能夠注意到所述菌絲體的生理狀態(tài)，特別是由于使用本申請(qǐng)所述的培養(yǎng)條件而得到的菌絲體(區(qū)室化的菌絲體含有充滿內(nèi)含物、特別是充滿過(guò)氧化物酶體的膨脹和凸起)的生理狀態(tài)對(duì)反應(yīng)收率具有相當(dāng)大的影響，并使得能獲得比現(xiàn)有技術(shù)更高的收率。菌絲體的生理狀態(tài)還對(duì)反應(yīng)的立體選擇性有影響。
因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明方法中的步驟b)是在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，以便得到含有充滿內(nèi)含物、特別是充滿過(guò)氧化物酶體的膨脹和凸起的區(qū)室化的菌絲體的步驟。有利地，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基不含有蛋白胨，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基包含麥芽和/或酵母提取物。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，用于步驟c)的菌絲體是濃縮的。優(yōu)選地，用于步驟c)的菌絲體的濃度為5-15g/l，優(yōu)選6-12g/l，非常優(yōu)選7-10g/l。
尤其注意到通過(guò)使用上述的充滿內(nèi)含物的膨脹菌絲體，在立體選擇性和收率方面特別促進(jìn)了由被孢菌霉菌株產(chǎn)生(S)-γ-內(nèi)酯；實(shí)際上，使用這種菌絲體可以得到具有以絕對(duì)值表示的比現(xiàn)有技術(shù)更大的旋光性的反應(yīng)產(chǎn)物；此外，通過(guò)本發(fā)明所述方法得到的收率，特別是通過(guò)使用上述的充滿內(nèi)含物的膨脹菌絲體得到的收率能夠比通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)得到的收率更高。
所述方法的步驟c)為向所述細(xì)胞培養(yǎng)物中加入所述底物。根據(jù)本發(fā)明，γ-內(nèi)酯的生物合成涉及合適的底物。
出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“合適的底物”是指含有至少5個(gè)碳的飽和或不飽和的直鏈脂肪酸，且優(yōu)選5至20個(gè)碳，除5位碳以外任選地分支或被取代，以及所述脂肪酸的酯；優(yōu)選甲酯或乙酯。
在優(yōu)選的底物中，可提及戊酸，其為產(chǎn)生γ-戊內(nèi)酯的C5酸；己酸，其為產(chǎn)生γ-己內(nèi)酯的C6酸；庚酸，其為產(chǎn)生γ-庚內(nèi)酯的C7酸；辛酸，其為產(chǎn)生γ-辛內(nèi)酯的C8酸；壬酸，其為產(chǎn)生γ-壬內(nèi)酯的C9酸；癸酸，其為產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的C10酸；十一烷酸，其為產(chǎn)生γ-十一內(nèi)酯的C11酸；十一烯酸，其為產(chǎn)生γ-十一烯內(nèi)酯的C11酸；月桂酸，其為產(chǎn)生γ-十二內(nèi)酯的C12酸；肉豆蔻酸，其為產(chǎn)生γ-十四內(nèi)酯的C14酸；棕櫚酸，其為產(chǎn)生γ-十六內(nèi)酯的C16酸；棕櫚油酸，其為產(chǎn)生γ-十六烯內(nèi)酯的不飽和C16酸；硬脂酸，其為產(chǎn)生γ-十八內(nèi)酯的C18酸；油酸，其為產(chǎn)生γ-十八烯內(nèi)酯的C18酸；亞油酸，其為產(chǎn)生γ-十八碳二烯內(nèi)酯的C18酸；亞麻酸，其為產(chǎn)生γ-十八碳三烯酸內(nèi)酯的C18酸；以及花生酸，其為產(chǎn)生γ-二十內(nèi)酯的C20酸，以及上述酸的酯，優(yōu)選其乙酯或甲酯。
盡管它們是罕有的，但還可將C13、C15、C17和C19脂肪酸及其乙酯或甲酯氧化并分別產(chǎn)生C13、C15、C17和C19γ-內(nèi)酯。
無(wú)需聲明所述底物可以是任何合適的底物，或多種合適底物的混合物，特別是特定的酸與其一種或多種酯的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的有有益實(shí)施方案，采用分批發(fā)酵法或分批進(jìn)料法將所述底物加入到所述菌絲體中。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，在將所述底物與所述菌絲體接觸前，以與輔助材料的混合物形式加入該底物，該輔助材料例如為油，特別是任何常規(guī)的食用油，如大豆油、玉米油、葵花子油等，或諸如miglyol的合成的短鏈脂肪酸甘油三酯，優(yōu)選被氫化的或富含油酸的葵花子油。輔助材料的存在可以尤其極大地減少所述底物的腐蝕性或毒性作用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，使用深黃被孢霉菌株的本發(fā)明所述的合成在不含礦物油的培養(yǎng)基中進(jìn)行。有利地，以0.3-2.5g/l/h的濃度加入所述底物。有利地，與所述底物混合物的油(優(yōu)選植物油)的量為100-500g/l，優(yōu)選150-300g/l。
在加入所述底物的同時(shí)，還向所述培養(yǎng)基中加入糖源，優(yōu)選葡萄糖，以確保提供所述細(xì)胞需要的能量。有利地，加入的葡萄糖的濃度為0.3-0.4g/l/h。
如果需要，在加入所述底物期間以及隨后進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化期間，通過(guò)加入任何合適的堿來(lái)調(diào)節(jié)pH。有利地，pH應(yīng)為4.5-8.5，優(yōu)選5.5-8，且優(yōu)選6-7.5。
在生物轉(zhuǎn)化期間，溫度優(yōu)選保持在27℃-30℃。生物轉(zhuǎn)化的持續(xù)期為30-120小時(shí)，優(yōu)選48-72小時(shí)。
在本發(fā)明所述方法的步驟d)中涉及的所述底物向γ-內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化是由所述菌株進(jìn)行所述底物在C4位的羥基化反應(yīng)，隨后進(jìn)行內(nèi)酯化所構(gòu)成。為了可以進(jìn)行該羥基化，需要氧源。該氧源優(yōu)選含氧的氣體，非常優(yōu)選空氣或氧氣。將該氣體以相對(duì)大的量溶解于所述反應(yīng)培養(yǎng)基中。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案且是本領(lǐng)域公知的，消泡劑，特別是硅油或用脂肪酸酯化的聚乙二醇的聚合物用于控制在生物轉(zhuǎn)化期間可能形成的泡沫。
一旦完成生物轉(zhuǎn)化，即完成在C4位完成特異性和立體選擇性羥基化，之后的內(nèi)酯化后，所述方法的步驟e)為通過(guò)提取回收所述γ-內(nèi)酯，通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行所述γ-內(nèi)酯的提取。有利地，通過(guò)水蒸氣蒸餾(hydrodistillation)進(jìn)行γ-內(nèi)酯的提取，任選地然后進(jìn)行酯化，旨在隨后去除未反應(yīng)的所述底物。
或者，在將所述培養(yǎng)基酸化后，通過(guò)溶劑(環(huán)己烷，乙酸乙酯)提取進(jìn)行γ-內(nèi)酯的提取。
根據(jù)本發(fā)明方法的變體，不實(shí)施所述方法的的步驟e)，改為實(shí)施步驟e’)，該步驟為在步驟d)結(jié)束時(shí)，在提取前，通過(guò)將所得到的γ-內(nèi)酯在原位還原來(lái)繼續(xù)所述方法。步驟e’)可以獲得更飽和的(R)-或(S)-γ-內(nèi)酯，這取決于在步驟d)中得到γ-內(nèi)酯的立體化學(xué)。
根據(jù)第一實(shí)施方案，可進(jìn)行還原直到獲得飽和的內(nèi)酯為止。根據(jù)第二實(shí)施方案，可停止還原，以便得到γ-內(nèi)酯，該γ-內(nèi)酯的側(cè)鏈與來(lái)源于步驟d)的生物轉(zhuǎn)化的γ-內(nèi)酯的側(cè)鏈相比具有較少的不飽和。根據(jù)此其它實(shí)施方案，在步驟d)結(jié)束時(shí)，在停止發(fā)酵罐的pH調(diào)節(jié)時(shí)，向所述反應(yīng)器中加入活性干酵母和糖源來(lái)繼續(xù)本發(fā)明所述方法，該干酵母可以為面包酵母、制酒酵母或啤酒酵母，該糖源尤其為葡萄糖。當(dāng)pH值達(dá)到5.5時(shí)，用諸如氫氧化鈉NaOH的合適的堿將pH調(diào)節(jié)在5.5。將所述混合物孵育，優(yōu)選孵育12-24小時(shí)，然后提取γ-內(nèi)酯。根據(jù)另一變體，可使用還原性微生物的新鮮培養(yǎng)物，或使用至少在還原條件下放置的微生物來(lái)將來(lái)源于步驟d)的γ-內(nèi)酯還原，所述微生物例如為釀酒酵母或Pichia etchelsii、甲醇酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。
步驟e’)中的還原導(dǎo)致產(chǎn)生比來(lái)源于步驟d)的γ-內(nèi)酯更飽和的γ-內(nèi)酯。根據(jù)此特定實(shí)施方案得到的這些更飽和的γ-內(nèi)酯在4位具有不對(duì)稱碳，具有與衍生其的較少飽和的γ-內(nèi)酯相同的構(gòu)型，因?yàn)樗鲞€原反應(yīng)不改變所述分子的立體異構(gòu)現(xiàn)象。
根據(jù)本發(fā)明所述方法得到的γ-內(nèi)酯具有氣味和味覺(jué)特性，因此它們可用于所有的香料和食品調(diào)味料應(yīng)用，特別用于產(chǎn)生香料、或有氣味物質(zhì)、或化妝品組合物或食品組合物，或用作食品添加劑。
出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“香料”不僅表示該術(shù)語(yǔ)通常意義上的香料，而且表示其它領(lǐng)域，在該領(lǐng)域中產(chǎn)品的氣味是重要的。這可以是該術(shù)語(yǔ)通常意義上的香料組合物，如芳香基質(zhì)和濃縮物、古龍水、香水、香精和類(lèi)似的產(chǎn)品；局部用組合物-特別是化妝用組合物，如面霜和體霜、滑石粉、發(fā)油、香波、發(fā)乳、浴鹽和沐浴油、淋浴膠和沐浴膠、香皂、止汗劑和身體除臭劑、剃須液和剃須霜、肥皂、霜、牙膏、漱口劑、膏和類(lèi)似的產(chǎn)品；以及保養(yǎng)產(chǎn)品，如軟化劑、去污劑、洗衣粉、空氣清新劑和類(lèi)似的產(chǎn)品。
術(shù)語(yǔ)“有氣味的”表示散發(fā)氣味的化合物。
術(shù)語(yǔ)“食品調(diào)味料”是指本發(fā)明所述化合物在任何人用食品或獸用食品、液體食品或固體食品中的調(diào)味料中的任何應(yīng)用，特別是在飲料、乳制品、冰淇淋中的應(yīng)用。
(R)或(S)γ-內(nèi)酯、或(R)和(S)γ-內(nèi)酯的混合物可用于芳香組合物中，以便提供外來(lái)的、花的或水果香調(diào)。根據(jù)本申請(qǐng)，可使用所述(S)對(duì)映異構(gòu)體或所述(R)對(duì)映異構(gòu)體或由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定比例的兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明所述方法得到的本發(fā)明的γ-內(nèi)酯以相對(duì)于其所存在的組合物總重量的0.0025％-10％重量比的量使用。它們可用于構(gòu)成固體或液體組合物，尤其是凝膠組合物、霜組合物、膏組合物和/或噴霧組合物。
通過(guò)本發(fā)明所述方法得到γ-內(nèi)酯還可用于本身具有氣味的組合物中，或用于其中添味劑是用于掩蓋或中和某些氣味的組合物中。
閱讀下文所述的實(shí)施例之后，將清楚地了解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，所述實(shí)施例是示例性說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1，步驟a-選擇菌株將收集的所有菌株首先接種在MGY瓊脂培養(yǎng)基上，并在27℃下孵育72小時(shí)；隨后將這些菌株接種在含有100ml 1x麥芽培養(yǎng)基的1升錐形瓶?jī)?nèi)，并在27℃下孵育24小時(shí)。然后將底物，十一烯酸，加入到該培養(yǎng)基(5g/l，分10份)中，并將該培養(yǎng)物在27℃下再保持48小時(shí)至120小時(shí)。
在嗅氣味和分析所述培養(yǎng)基中的γ-十一烯內(nèi)酯濃度后，選擇最有利的菌株；該最有利的菌株為深黃被孢霉CBS 100559、深黃被孢霉CBS 221.29、米曲霉DSMZ 1861和米曲霉CBS 110.27菌株，隨后這些菌株用于發(fā)酵罐優(yōu)化試驗(yàn)。
實(shí)施例1，步驟b-制備細(xì)胞培養(yǎng)物將深黃被孢霉CBS 100559、深黃被孢霉CBS 221.29、米曲霉DSMZ 1861和米曲霉CBS 110.27菌株(起源＝在-80℃下冷凍的試管)接種在MGY瓊脂上并在27℃下孵育30小時(shí)。
將上述預(yù)培養(yǎng)物接種在6l發(fā)酵罐內(nèi)的5l的1x麥芽培養(yǎng)基中麥芽提取物 165g酵母提取物 25gH2Oqs 5lpH 6.5深黃被孢霉在27℃下，500rpm，3.5l/l/h的空氣，pH自由(pH libre)的條件下孵育30小時(shí)。
米曲霉在20℃，500rpm，0.05vvm的空氣，pH自由的條件下孵育30小時(shí)，然后在25℃，500rpm，0.05vvm的空氣，pH自由的條件下孵育24小時(shí)。在兩種情況下，應(yīng)得到含有許多大的充滿內(nèi)含物(包括過(guò)氧化物酶體)的凸起的菌絲體。
然后在300l發(fā)酵罐中制備125l的1.5x麥芽培養(yǎng)基麥芽提取物 6.188kg酵母提取物 0.938kgH2Oqs 125l將該培養(yǎng)基在121℃下滅菌40分鐘。發(fā)酵罐及其零件是無(wú)菌和加壓的。溫度是穩(wěn)定的并調(diào)節(jié)在27℃。釋放壓力并保持3.5l/l/h，即約0.6m3/h的空氣流速。將堿(10N NaOH)、酸(85％H3PO4)、消泡劑和用作接種物的6l發(fā)酵罐無(wú)菌地集合在一起。將攪拌速度調(diào)整至325rpm，開(kāi)始加入該消泡劑，然后接種該接種物(5l)，pH自由。將攪拌速度保持在325rpm，并將通氣增加到2.2m3/h(0.3vvm)。讓其繼續(xù)生長(zhǎng)24小時(shí)，以便基于干重有約10g/l的菌絲體該菌絲體應(yīng)是“腫脹的”并由包含多個(gè)凸起和膨脹的沒(méi)有孢子的菌絲組成。
實(shí)施例2，步驟c和d用被孢霉菌株進(jìn)行月桂酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將底物(月桂酸)在mygliol中給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持續(xù)給料55小時(shí)。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH在7。將速度增加到900rpm并以1vvm，即12m3/h的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行55小時(shí)。得到收率為12g/l的(S)-γ-十二內(nèi)酯。為了進(jìn)行比較，根據(jù)第5,457,036號(hào)美國(guó)專(zhuān)利(Han)所教導(dǎo)的，采用第5,457,036號(hào)美國(guó)專(zhuān)利中描述的被孢霉菌株制備γ-十二內(nèi)酯。
當(dāng)使用Han方法時(shí)，得到的收率為4-6.5g/l的等級(jí)；作為比較，當(dāng)使用本發(fā)明所述的方法，使用具有內(nèi)含物的凸起的“腫脹的”菌絲體時(shí)，收率為12-15g/l。
實(shí)施例3步驟c和d用被孢霉菌株進(jìn)行辛酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將底物以0.75g/l/h的流速給料6小時(shí)。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持續(xù)給料。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH在6.5。將速度增加到600rpm并以3.5l/min的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行48-74小時(shí)。得到收率為15-25g/l，通常約9g/l的(S)-辛內(nèi)酯。
為了進(jìn)行比較，根據(jù)第519481號(hào)歐洲專(zhuān)利(Farbood)所教導(dǎo)的，采用第519481號(hào)歐洲專(zhuān)利中描述的被孢霉菌株制備γ-辛內(nèi)酯；根據(jù)Farbood方法得到的產(chǎn)物的旋光度為-28°，這表明該產(chǎn)物是(R)和(S)的混合物，且(S)非常輕微地占優(yōu)勢(shì)；根據(jù)本發(fā)明所述方法得到的產(chǎn)物的旋光度為-42°，這顯示了產(chǎn)生(S)-γ-內(nèi)酯的所述反應(yīng)的選擇性。
當(dāng)使用Farbood方法，得到的收率為7.5-10g/l；作為比較，當(dāng)使用本發(fā)明所述方法，使用具有內(nèi)含物的凸起的“腫脹的”菌絲體時(shí)，收率為15-25g/l。
實(shí)施例4步驟c和d用被孢霉菌株進(jìn)行己酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將底物以0.3g/l/h的流速給料6小時(shí)。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持續(xù)給料。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH調(diào)節(jié)在6.5。將速度增加到600rpm并以3.5l/min的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行48-74小時(shí)。得到收率為6g/l的(S)-己內(nèi)酯。
實(shí)施例5步驟c和d用曲霉菌株進(jìn)行十一烯酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將十一烯酸以0.3g/l/h的流速給料6小時(shí)，然后以0.53g/l/h的流速給料72小時(shí)即總共為40g/l。該十一烯酸作為與氫化的葵花子油(1/4酸-3/4油)的混合物形式給料；因此該油以0.9g/l/h的流速，然后以1.53g/l/h的流速進(jìn)行給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速連續(xù)給料72小時(shí)。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH調(diào)節(jié)在7.5。將速度增加到505rpm并以1vvm，即12m3/h的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行72小時(shí)。
得到6.5g/l(S)立體異構(gòu)的γ-十一烯內(nèi)酯。
實(shí)施例6步驟c和d用被孢霉菌株進(jìn)行十一烷酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將十一烷酸以0.3g/l/h的流速給料6小時(shí)，隨后以0.53g/l/h的流速給料3.5小時(shí)，然后以0.75g/l/h給料3.5小時(shí)，以1g/l/h給料18小時(shí)。將該十一烷酸作為與氫化的葵花子油的混合物(1/4酸-3/4油)形式給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持續(xù)給料24小時(shí)。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH調(diào)節(jié)在7.5。將速度增加到505rpm并以1vvm，即12m3/h的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行48小時(shí)。
得到19g/l(S)立體異構(gòu)的γ-十一內(nèi)酯。
實(shí)施例7步驟c和d用曲霉菌株進(jìn)行十一烯酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將十一烯酸以0.3g/l/h的流速給料6小時(shí)，然后以0.53g/l/h的流速給料72小時(shí)即總共為40g/l。該十一烯酸作為與氫化的葵花子油(1/4酸-3/4油)的混合物形式給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速連續(xù)給料72小時(shí)。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH調(diào)節(jié)在6.5。以0.5vvm，即6m3/h的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行80小時(shí)。得到0.5g/l(R)立體異構(gòu)的γ-十一烯內(nèi)酯。
實(shí)施例8步驟c和d用曲霉菌株進(jìn)行己酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將己酸以1.64g/l/h的流速給料24小時(shí)，然后以2g/l/h的流速給料72小時(shí)即總共為183g/l。將該己酸作為與氫化的葵花子油的混合物(1/2酸-1/2油)形式給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速持續(xù)地給料。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5NNaOH將pH調(diào)節(jié)在6.5。以0.5vvm，即6m3/h的流速進(jìn)行通氣。在72小時(shí)-96小時(shí)后，得到15g/l(R)立體異構(gòu)的γ-己內(nèi)酯。
實(shí)施例9步驟e提取-純化用3l的85％磷酸完成在pH 1.5的酸化。在大于100℃下加熱30分鐘以便使內(nèi)酯基本上為其環(huán)狀形式，而不為其開(kāi)鏈的羥基酸形式。定量測(cè)定所述內(nèi)酯，加入提取溶劑(優(yōu)選環(huán)己烷)，并在環(huán)境溫度下攪拌混合物1小時(shí)。進(jìn)行離心分離并回收有機(jī)相。定量地測(cè)定所述內(nèi)酯。將溶劑濃縮，因此得到油狀的“粗品”。進(jìn)行真空蒸餾。得到“脫膠脂的”內(nèi)酯和廢油(exhausted oil)。隨后通過(guò)真空分餾該內(nèi)酯來(lái)進(jìn)行純化。得到純度＞99％的產(chǎn)物，如果使用被孢霉菌株，則產(chǎn)物為γ-十一烯內(nèi)酯(＞99％S)，如果使用曲霉菌株，則產(chǎn)物為γ-十一烯內(nèi)酯(＞99％R)。
(R)或(S)γ-十一烯內(nèi)酯、或(R)和(S)γ-十一烯內(nèi)酯的混合物，以及(R)或(S)γ-十一內(nèi)酯、或(R)和(S)γ-十一內(nèi)酯的混合物可用于芳香組合物中，以便提供外來(lái)的、花的或水果香調(diào)，這使申請(qǐng)人已將γ-十一烯內(nèi)酯注冊(cè)為商標(biāo)“Tropicalone”。根據(jù)本申請(qǐng)，可使用所述(S)對(duì)映異構(gòu)體或所述(R)對(duì)映異構(gòu)體或由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定比例的兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
權(quán)利要求
1.立體選擇性制備γ-內(nèi)酯的方法，其特征在于進(jìn)行γ-內(nèi)酯的微生物生物合成，特別是進(jìn)行通式(I)的γ-內(nèi)酯的微生物生物合成 其中內(nèi)酯環(huán)可在2位碳和3位碳之間具有不飽和，優(yōu)選為飽和的，且其中R1為任選取代的C1-16烯基、C1-16炔基或C1-16烷基基團(tuán)，所述生物合成采用菌株的微生物培養(yǎng)物從至少一種底物進(jìn)行，所述底物優(yōu)選為脂肪酸，所述菌株選自那些能夠在C4位上特異性羥基化所述底物的菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其包括如下步驟a)選擇合適的菌株，所述菌株選自那些能夠在C4位羥基化所述底物的菌株，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株，在進(jìn)行所述培養(yǎng)之前任選地存在預(yù)培養(yǎng)所述菌株的步驟，c)加入可被轉(zhuǎn)化為γ-內(nèi)酯，特別是可轉(zhuǎn)化為權(quán)利要求1所定義的式(I)的γ-內(nèi)酯的底物，d)將所述底物生物轉(zhuǎn)化為γ-內(nèi)酯，特別是轉(zhuǎn)化為式(I)的γ-內(nèi)酯，e)回收所產(chǎn)生的γ-內(nèi)酯。
3.制備權(quán)利要求2所述的(R)-γ-內(nèi)酯的立體選擇性方法，其特征在于步驟a)中的所述微生物菌株選自曲霉屬菌株，且優(yōu)選米曲霉菌株。
4.制備權(quán)利要求2所述的(S)-γ-內(nèi)酯的立體選擇性方法，其特征在于步驟a)中的所述微生物菌株選自被孢霉屬菌株，且優(yōu)選深黃被孢霉菌株。
5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述底物選自含有至少5個(gè)碳的任選取代的、飽和或不飽和的直鏈脂肪酸，且優(yōu)選5至20個(gè)碳，以及所述脂肪酸的酯，優(yōu)選甲酯或乙酯。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述底物選自戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十一烯酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生酸，及上述酸的酯，優(yōu)選其乙酯或甲酯，或其混合物。
7.如權(quán)利要求2-6中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述底物是作為與至少一種生產(chǎn)輔助材料的混合物的形式加入到步驟c)中，所述生產(chǎn)輔助材料優(yōu)選選自油類(lèi)，特別是被氫化的或富含油酸的葵花子油、mygliol或葡萄糖，或這些成分的混合物。
8.如權(quán)利要求2-7中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于步驟e)是通過(guò)水蒸氣蒸餾來(lái)提取所述γ-內(nèi)酯，任選地隨后進(jìn)行酯化并除去未反應(yīng)的所述底物。
9.如權(quán)利要求2-8中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于步驟e)是對(duì)步驟d)結(jié)束時(shí)得到的所述γ-內(nèi)酯進(jìn)行溶劑提取。
10.如權(quán)利要求2-9中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于用步驟e’)替換步驟e)，所述步驟e’)為將步驟d)結(jié)束時(shí)得到的所述內(nèi)酯在原位進(jìn)行還原。
11.米曲霉培養(yǎng)物在(R)-γ-內(nèi)酯的立體專(zhuān)一性生物合成中的用途。
12.深黃被孢霉培養(yǎng)物在(S)-γ-內(nèi)酯的立體專(zhuān)一性生物合成中的用途。
全文摘要
用于立體選擇性制備(R)或(S)γ－內(nèi)酯的本發(fā)明方法為微生物生物合成γ－內(nèi)酯，其中所述生物合成在菌株的作用下從選自C5－C20脂肪酸的底物進(jìn)行，所述菌株選自那些能在C4位立體選擇性羥基化所述底物的菌株，特別為曲霉或被孢霉。還公開(kāi)了所述γ－內(nèi)酯的生物合成及其在香料中的用途，以及用于食品調(diào)味劑的用途。
文檔編號(hào)C12P17/04GK101056544SQ200580038132
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者約瑟夫·盧卡, 雅內(nèi)·瑪奈 申請(qǐng)人:瑪奈·菲爾薩公司