專(zhuān)利名稱(chēng)：：生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物工業(yè)的技術(shù)，更明確地，涉及通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法。作為可通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)的堿性物質(zhì)，例如L-賴(lài)氨酸作為動(dòng)物詞料的添加劑是有用的，L-精氨酸和L-組氨酸對(duì)于藥物制劑例如輸注液(infiision)是有用的。
背景技術(shù)：
：在通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法中，培養(yǎng)具有產(chǎn)生堿性物質(zhì)的能力的微生物來(lái)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累堿性物質(zhì)，并從所述培養(yǎng)基收集所述堿性物質(zhì)。在這種方法中，作為分批培養(yǎng)、補(bǔ)料培養(yǎng)(feedingculture)或連續(xù)培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。在這樣的通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)中，一般地將硫酸根離子或氯離子添加到培養(yǎng)基中作為目標(biāo)物質(zhì)的反荷陰離子，所述目標(biāo)物質(zhì)在培養(yǎng)基中解離成陽(yáng)離子來(lái)將培養(yǎng)基的pH維持在中性水平(特開(kāi)平5-30985號(hào)公報(bào)和特開(kāi)平5-244969號(hào)公報(bào))。在需要進(jìn)行純化時(shí)，很多情況下通過(guò)離子交換從培養(yǎng)基中收集堿性物質(zhì)。例如，在L-賴(lài)氨酸的情況下，將發(fā)酵液調(diào)整為弱酸性之后，L-賴(lài)氨酸被吸附在離子交換樹(shù)脂上，然后用銨離子從樹(shù)脂上洗脫。洗脫的L-賴(lài)氨酸按原樣(asitis)作為賴(lài)氨酸堿(lysinebase)來(lái)直接使用，或可以與鹽酸結(jié)晶來(lái)形成L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽。當(dāng)在上述的L-賴(lài)氨酸純化中氯離子被用作培養(yǎng)基中的反荷陰離子時(shí)，可以通過(guò)濃縮培養(yǎng)基直接獲得L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽。然而，由于氯離子腐蝕金屬發(fā)酵罐等等，在實(shí)際生產(chǎn)中使它們以高濃度存在于培養(yǎng)基中不是優(yōu)選的。另一方面，當(dāng)不純化堿性物質(zhì)時(shí)，按照原樣濃縮發(fā)酵液，或用鹽酸或硫酸調(diào)為弱酸性，隨后噴霧造粒。在這種情況下，殘余成分含有添加到培養(yǎng)基的反荷陰離子，因而在得到的發(fā)酵產(chǎn)物中堿性物質(zhì)的含量被降低。特開(kāi)2002-65287(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2002025564)公開(kāi)了在石成性氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中利用碳酸根離子和碳酸氫根離子作為堿性氨基酸的反荷陰離子來(lái)代替一部分硫酸根離子或氯離子的方法。通過(guò)將培養(yǎng)基的pH值調(diào)為酸性，或濃縮培養(yǎng)基，或這兩種途徑，可以相對(duì)容易地從培養(yǎng)基中除去碳酸根離子和碳酸氬根離子。以上引用的出版物教導(dǎo)了控制發(fā)酵罐中的內(nèi)部壓力使它在發(fā)酵過(guò)程中為正值、或?qū)⒍趸細(xì)怏w或含有二氧化碳的混合氣體添加到培養(yǎng)基中的方法作為向培養(yǎng)基添加碳酸根離子和碳酸氬根離子的手段。然而，在典型培養(yǎng)基條件下，例如中性pH值，就算有的話，也僅有少量的二氧化碳?xì)怏w溶解。因此，為了維持培養(yǎng)基中碳酸氫根離子和碳酸根離子的存在從而降低維持硫酸根離子或氯離子濃度的影響，必須在堿性pH下進(jìn)行培養(yǎng)。然而，如果pH值變高，細(xì)菌生長(zhǎng)速率和目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)力通常被降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種方法，用于在通過(guò)使用具有生產(chǎn)目標(biāo)堿性物質(zhì).能力的微生物進(jìn)行發(fā)酵的堿性物質(zhì)生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)硫酸根離子和氯離子的降低和目標(biāo)物質(zhì)的有效生產(chǎn)，并利用碳酸根離子和碳酸氫根離子作為所述堿性物質(zhì)當(dāng)使用棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)時(shí)，如果pH變得過(guò)高，細(xì)菌生長(zhǎng)速率或目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)力通常被降低。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，引起這種現(xiàn)象的主要因素是氨，其被添加到培養(yǎng)基中作為用于堿性物質(zhì)生產(chǎn)、細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源，或作為堿性物質(zhì)的反荷離子的來(lái)源，通過(guò)將總氨濃度控制在適^^的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵可以顯著地抑制高pH值條件下微生物生長(zhǎng)速率或目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)力的降低。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供如下。(1)一種通過(guò)發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的能力的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述石咸性物質(zhì)，其中在培養(yǎng)過(guò)程的總時(shí)期的至少一部分期間通過(guò)將所述培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，來(lái)降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。(2)根據(jù)(1)的方法，其中所述總氨濃度的特定濃度范圍是滿足以下條件的范圍(A)所述培養(yǎng)基中銨離子的濃度是這樣的水平，使得溶于所述培養(yǎng)基中的碳酸氬根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和大于所述培養(yǎng)基中積累的所述堿性物質(zhì)中電離的所述堿性物質(zhì)的離子當(dāng)量，以及(B)所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度是不抑制所述微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的水平，其是如下預(yù)先確定的在具有不同pH值和不同總氨濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，測(cè)量每個(gè)pH值和每個(gè)總氨濃度下的所述^4性物質(zhì)的生產(chǎn)力，確定各個(gè)pH值條件下提供最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的50%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度。(3)根據(jù)(1)的方法，其中所述總氨濃度的特定范圍是如下預(yù)先測(cè)定的(A，)在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有其量足以在pH7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的反荷離子的來(lái)源，通過(guò)添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來(lái)將所述培養(yǎng)基的pH值維持在6.5到7.2之間的范圍內(nèi)，并測(cè)量所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，(B')在與步驟(A')中使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中開(kāi)始培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基成分的硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量，在一定時(shí)期內(nèi)用不同的總氨濃度繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在所述時(shí)期中由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累引起的作為堿性物質(zhì)反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的不足，維持所述培養(yǎng)基的pH值到7.2或更低變得不可能，以根據(jù)步驟(A')中測(cè)量的生產(chǎn)力來(lái)確定提供了50%或更高生產(chǎn)力的總氨濃度范圍。(4)根據(jù)(1)的方法，其中所述總時(shí)期的至少一部分包括下列中的至少一個(gè)由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累引起的反荷離子的不足而使所述培養(yǎng)基的pH值提高的時(shí)期，和由于向所述培養(yǎng)基添加陽(yáng)離子而使所述pH值提高的時(shí)期。(5)根據(jù)(1)的方法，其中當(dāng)根據(jù)如下指標(biāo)所測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過(guò)向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素來(lái)調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度，所述指標(biāo)是所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和觀察到的所述培養(yǎng)基中的pH值變化。(6)根據(jù)(1)的方法，其中將與含有其量足以在pH值7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述堿性物質(zhì)的反荷離子來(lái)源的培養(yǎng)基具有相同組分、只是將硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量的培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，以及所述總時(shí)期的至少一部分是一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于所述培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的引起的反荷離子不足，所述培養(yǎng)基的pH值不能被維持在7.2或更低。(7)根據(jù)(2)的方法，其中所述其他陰離子選自硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子和電離的有機(jī)酸。(8)根據(jù)(2)或(7)的方法，其中所述其他陰離子的總量是900meq/I或更低。(9)根據(jù)(1)的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述總氨濃度被調(diào)節(jié)到200mM或更低。(10)根據(jù)(1)的方法，其包括增殖所述微生物的步驟。(U)根據(jù)(10)的方法，其中在增殖所述微生物的所述步驟期間不調(diào)節(jié)所述總氨濃度。(12)根據(jù)(1)的方法，其中所述堿性物質(zhì)選自L-賴(lài)氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。(13)根據(jù)(12)的方法，其中所述堿性物質(zhì)是L-賴(lài)氨酸。(14)根據(jù)(12)的方法，其中所述堿性物質(zhì)是L-精氨酸。(15)根據(jù)(1)的方法，其中所迷培養(yǎng)基或其處理物在發(fā)酵之后被加熱以除去碳酸氫根離子和碳酸根離子。(16)根據(jù)(1)的方法，其中所述微生物是棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌。(n)含有堿性物質(zhì)的發(fā)酵液或發(fā)酵產(chǎn)物，其可以通過(guò)根據(jù)(i5)的方法獲付。圖1顯示通過(guò)使用常規(guī)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法進(jìn)行的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。圖2顯示在限制銨濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。圖3顯示通過(guò)僅控制總氨濃度而非控制pH值進(jìn)行的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。圖4顯示在常規(guī)培養(yǎng)基和沒(méi)有硫酸銨和氯化銨的培養(yǎng)基中總氨濃度和pH值隨時(shí)間的變化。圖5顯示在限制銨濃度的培養(yǎng)基中L-精氨酸發(fā)酵的生長(zhǎng)、總氨濃度、pH值和殘?zhí)橇侩S時(shí)間的變化。圖6顯示在限制銨濃度的培養(yǎng)基中L-精氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)結(jié)果。發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案以下，將詳細(xì)解釋本發(fā)明。的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性物質(zhì)。本發(fā)明的方法的特征在于，通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程的總時(shí)期的至少一部分期間將培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)來(lái)降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。也就是說(shuō)，本發(fā)明的方法是在培養(yǎng)基中生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，在所述培養(yǎng)基中通過(guò)使用這樣的總氨濃度以確保所述總氨作為氮源處在所述微生物的生長(zhǎng)或所述目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)所需的量，從而降低了硫酸根離子和氯離子，并且所述微生物的生長(zhǎng)或所述目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)不被抑制?？偘睗舛鹊奶囟ǚ秶膶?shí)例包括滿足以下條件的范圍(A)所述培養(yǎng)基中銨離子的濃度是這樣的水平，使得溶于所述培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和大于從所述培養(yǎng)基中積累的所述堿性物質(zhì)電離的所述堿性物質(zhì)的離子當(dāng)量，以及(B)所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度是不抑制所述微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的水平，其是如下預(yù)先確定的在具有不同的pH值和不同的總氨濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，測(cè)量每個(gè)pH值和每個(gè)總氨濃度下的所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，確定各個(gè)pH值條件下提供最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的50%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度。此外，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述總氨濃度的特定范圍如下預(yù)先測(cè)定。(A')(步驟l:在中性條件下評(píng)估發(fā)酵結(jié)果)在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含足以在pH7.2或更低的pH下進(jìn)行培養(yǎng)的量的硫酸根離子和/或氯離子作為所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的反荷離子的來(lái)源，通過(guò)添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來(lái)將所述培養(yǎng)基的pH值維持在6.5到7.2之間的范圍內(nèi)，并測(cè)量所述石威性物質(zhì)的生產(chǎn)力，(B，)(步驟2:降低^5危酸根離子和氯離子的量，改變銨離子濃度時(shí)的發(fā)酵結(jié)果的評(píng)價(jià))在與如上所述步驟l(步驟A，)中使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中開(kāi)始培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基成分的硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量，用不同的總氨濃度繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間，在所述期間由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累，導(dǎo)致作為堿性物質(zhì)反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子不足，從而維持所述培養(yǎng)基的pH值到7.2或更低變得不可能，根據(jù)步驟(A，)中測(cè)量的生產(chǎn)力來(lái)確定提供了50%或更高生產(chǎn)力的總氨濃度范圍。此外，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)沒(méi)有預(yù)先測(cè)定總氨濃度的特定范圍時(shí)，可以將總氨濃度調(diào)節(jié)到所述預(yù)定范圍之內(nèi)。具體地，當(dāng)根據(jù)所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和觀察到的所述培養(yǎng)基中的pH值變化作為指標(biāo)而測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過(guò)向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素來(lái)調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度。所述培養(yǎng)基具有與含有其量足以在pH值7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述堿性物質(zhì)的反荷離子來(lái)源的培養(yǎng)基相同的組分，只是將硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量。所述總時(shí)期的至少一部分的實(shí)例包括一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于所述培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)而使反荷離子不足，所述培養(yǎng)基的pH值不能被維持在7.2或更低。其他陰離子的實(shí)例包括氯離子、硫酸根離子、磷酸根離子、有機(jī)酸(乙酸、乳酸、琥珀酸等)的離子，等等。此外，溶于所述培養(yǎng)基的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子起到堿性物質(zhì)的反荷陰離子的作用。在本發(fā)明中，離子當(dāng)量是通過(guò)每種離子的摩爾濃度乘以該離子的化合價(jià)獲得的值，它以叫/l的單位來(lái)表示。也就是說(shuō)，1mM單價(jià)離子的離子當(dāng)量是lmeq/1，1mM二價(jià)離子的離子當(dāng)量是2meq/1。調(diào)節(jié)上述的總氨濃度來(lái)使培養(yǎng)基中存在的總氨處在微生物的生長(zhǎng)或堿性物質(zhì)的產(chǎn)生所需的量，并且處于不抑制微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的濃度，從而所述培養(yǎng)基被自動(dòng)地調(diào)節(jié)到適合于溶解作為堿性物質(zhì)的反荷陰離子所需的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的pH值。在本發(fā)明中，"總氨"是指未解離的氨(NH3)和銨離子(NH4+)的總和。當(dāng)調(diào)節(jié)所述總氨濃度時(shí)，可以測(cè)量未離解的氨或銨離子，或可以測(cè)量這兩者。一般地，向培養(yǎng)基添加硫酸銨和氯化銨作為堿性物質(zhì)的反荷陰離子的來(lái)源和氮源，一般而言。此外，由于氨和尿素一般用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，在培養(yǎng)基中存在高濃度的氨和銨離子。當(dāng)降低硫酸銨或氯化銨的量以降低添加到培養(yǎng)基的硫酸根離子或氯離子的量時(shí)，以相應(yīng)于被降低量的量來(lái)提供氮源例如氨。對(duì)于這種操作，必須的是開(kāi)發(fā)一種提供氨的方法，其考慮到陽(yáng)離子和陰離子之間的平衡，所述陽(yáng)離子包括由細(xì)菌產(chǎn)生的和隨培養(yǎng)的進(jìn)展而增加的那些陽(yáng)離子，例如目標(biāo)堿性物質(zhì)的陽(yáng)離子、從添加的氨電離的陽(yáng)離子、添加到培養(yǎng)基的陽(yáng)離子例如鈉離子和鉀離子等等，所述陰離子為由于細(xì)菌的呼吸作用或向培養(yǎng)基添加而產(chǎn)生的在培養(yǎng)基中增加的陰離子。如果不能維持這種平衡，發(fā)酵將不會(huì)發(fā)展，因?yàn)榘睗舛葧?huì)變得過(guò)高，或pH值會(huì)變得過(guò)高，或反之，氨會(huì)被耗盡。根據(jù)本發(fā)明，開(kāi)發(fā)添加氨來(lái)將總氨濃度調(diào)節(jié)到特定范圍之內(nèi)的方法可以有利地維持陽(yáng)離子和陰離子的上述平衡，因而甚至在培養(yǎng)基中存在的硫酸根離子和氯離子的量降低的條件下，也可以實(shí)現(xiàn)微生物的良好生長(zhǎng)和堿性物質(zhì)的順利產(chǎn)生。通過(guò)向培養(yǎng)基添加氨氣、氨溶液和尿素的至少一種來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度，使得培養(yǎng)基中的總氨濃度處在可接受的水平。此外，也可以添加銨鹽，例如氯化銨或硫酸銨，只要無(wú)損于本發(fā)明的效果。此外，也可以使用含有碳酸氫根離子或碳酸根離子作為反荷離子的銨鹽，其可以在完成培養(yǎng)之后作為氣體容易地除去。通過(guò)使用培養(yǎng)基或排氣(exhaustgas)中的銨離子或氨濃度的測(cè)量值作為指標(biāo)，可以調(diào)節(jié)總氨濃度。此外，還可能的是，通過(guò)預(yù)先測(cè)定提供了可接受的總氨濃度的pH值來(lái)調(diào)節(jié)總氨濃度，此時(shí)用氨或添加氨來(lái)調(diào)節(jié)pH值從而可以獲得這樣的pH值。在這種情況下，如果需要，在培養(yǎng)期間可以變化如上所述測(cè)定的pH值。此外，當(dāng)根據(jù)所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和觀察到的所述培養(yǎng)基中的pH值變化作為指標(biāo)所測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過(guò)向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素，也可以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度。也就是說(shuō)，如果培養(yǎng)基中的氮源變得不足或被耗盡，微生物的增殖或微生物的活性，例如目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)被降低或停止。微生物的活性通常表現(xiàn)為培養(yǎng)基中溶解氧和碳源的消耗、培養(yǎng)基混濁度的提高、目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)和由于通過(guò)呼吸作用的氨消耗或二氧化碳釋放引起的培養(yǎng)基的pH降低。因此，當(dāng)微生物的活性降低或停止時(shí)，在每單位時(shí)間的通氣量和攪拌速度恒定時(shí)培養(yǎng)基中溶解氧的濃度增加，二氧化碳分泌和氨消耗的下降，從而培養(yǎng)基的pH值提高。此外，碳源的消耗速度、培養(yǎng)基混濁度的增加速度和目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)速度降低。因此，生物活性的停滯(stagnation)時(shí)，氮源變得不足或被耗盡。如果這種情況發(fā)生，以微生物的生長(zhǎng)或目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)所需的量向培養(yǎng)基添加氨或尿素。通過(guò)重復(fù)這個(gè)步驟，作為結(jié)果，培養(yǎng)基中的總氨濃度被維持在特定范圍之內(nèi)。如果向培養(yǎng)基添加尿素來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，尿素被微生物利用，氨被釋放到培養(yǎng)基中。如果如上所述重復(fù)氨或尿素的添加，培養(yǎng)基的pH值逐漸地增加。每次添加的氨或尿素的量可以是，例如，300mM，優(yōu)選200mM，更優(yōu)選100mM,表示為培養(yǎng)基中總氨的終濃度。作為選擇，可以添加氨或尿素，從而在添加氨或尿素之后pH值增加0.3或更少，優(yōu)選0.15或更少，更優(yōu)選0.1或更少。例如，通過(guò)使用溶解氧電極，可以測(cè)量培養(yǎng)基中的溶解氧濃度。通過(guò)測(cè)量碳酸氬根離子、碳酸根離子和其他陰離子的濃度以及所述堿性物質(zhì)的濃度，可以確認(rèn)全部溶于培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和是否高于在培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的離子并在預(yù)先測(cè)定的pH值和/或添加預(yù)先測(cè)定量的氨進(jìn)行培養(yǎng)，也可以滿足以上條件。在本發(fā)明中，培養(yǎng)物的pH值可以是或可以不是恒定的。此外，當(dāng)控制培養(yǎng)基的pH值時(shí)，可以通過(guò)使用pH值本身作為指標(biāo)、或間接地通過(guò)控制總氨濃度而不直接控制pH值來(lái)進(jìn)行控制。此外，如果如上所述使用微生物的活性作為指標(biāo)來(lái)添加氨或尿素，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度使它處在合適的濃度范圍之內(nèi)，pH值隨著堿性物質(zhì)的積累逐漸地增加。此外，如果將總氨濃度控制到特定范圍之內(nèi)來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，pH值作為培養(yǎng)基中各種陽(yáng)離子和陰離子的積累平衡變化的結(jié)果而變化。無(wú)論選擇哪種方法，作為結(jié)果培養(yǎng)基中的總氨濃度被調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，因而可以降低用作堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。在本發(fā)明中，表述"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)"是指用于本發(fā)明的微生物良好地生長(zhǎng)，堿性物質(zhì)順利地產(chǎn)生。當(dāng)微生物的生長(zhǎng)不充分時(shí)，或當(dāng)盡管微生物生長(zhǎng)良好但不能有效產(chǎn)生堿性物質(zhì)時(shí)，認(rèn)為是堿性物質(zhì)的生產(chǎn)被抑制。具體地，用于本發(fā)明的微生物被培養(yǎng)在不同pH值水平和總氨濃度的培養(yǎng)基中，測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，與在最佳條件，例如通常使用的中性pH值的一般條件下可獲得的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力相比，導(dǎo)致在每種pH值下以?xún)?yōu)選50。/?；蚋摺⒏鼉?yōu)選70%或更高、特別優(yōu)選90%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度，被認(rèn)為是"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)"的濃度。在本發(fā)明中，"生產(chǎn)力"是指產(chǎn)率、生產(chǎn)速度或總生產(chǎn)量。"產(chǎn)率"是指基于能被同化的、培養(yǎng)基中存在的碳源，堿性物質(zhì)的生產(chǎn)量，"生產(chǎn)速度"是指每單位時(shí)間的生產(chǎn)量。此外，當(dāng)單獨(dú)地使用術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)量"或"生產(chǎn)的量"時(shí)，是指一旦完全消耗了碳源，在培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的量。作為選擇，在最佳條件下，例如通常使用的中性pH值的一般條件下，培養(yǎng)用于本發(fā)明的微生物，并測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力。然后，在具有相同組成只是硫酸根離子和/或氯離子的量降低了期望的量的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)量堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力。在這種情況下，存在一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于隨著目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累作為反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子不足，培養(yǎng)基的pH值將增加。對(duì)于這個(gè)時(shí)期，將總氨濃度維持到特定濃度范圍之內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于控制濃度的范圍，用1到500mM范圍內(nèi)的各種濃度進(jìn)行培養(yǎng)，將提供了在最佳條件下可獲得的生產(chǎn)力的優(yōu)選50%或更高、更優(yōu)選70%或更高、特別優(yōu)選90%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的范圍內(nèi)的濃度，確定為"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)"的濃度。用于上述"通常使用的中性pH值的一般條件，，的培養(yǎng)基的實(shí)例包括含有其量足以在pH7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子的培養(yǎng)基。硫酸根離子和/或氯離子降低的期望的量沒(méi)有具體的限制，只要可以獲得堿性物質(zhì)的目標(biāo)生產(chǎn)力。例如，被定義為"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)，，的總氨濃度也可以如下測(cè)定。將用于本發(fā)明的微生物在培養(yǎng)基的不同pH值水平和總氨濃度下培養(yǎng)，并測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的量。將在各種條件下獲得的堿性物質(zhì)積累量與最佳條件下積累的量進(jìn)行比較。因而，可以確定不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)的總氨濃度。最佳條件被定義為如通常使用的中性pH值的一般條件中的、在中性pH值使用足夠反荷離子的培養(yǎng)條件。此外，例如，用于測(cè)定被定義為"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)"的總氨濃度的另一種方法如下。將用于本發(fā)明的微生物在最佳條件，例如通常使用的中性pH值的一般條件下培養(yǎng)，并測(cè)量培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力。然后，在具有相同組成只是將硫酸根離子和/或氯離子降低了期望的量的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，檢查生產(chǎn)力。在這種情況下，存在一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于隨著目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累作為反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子不足，培養(yǎng)基的pH值將增加。對(duì)于這個(gè)時(shí)期，將總氨濃度維持到特定濃度范圍之內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于控制濃度的范圍，用1到500mM范圍內(nèi)的各種濃度進(jìn)行培養(yǎng)，并將由此獲得的生產(chǎn)力與最佳條件下的進(jìn)行比較。被定義為"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)"的濃度包括，例如，與最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力相比，容許優(yōu)選50%或更高、更優(yōu)選70%或更高、特別優(yōu)選卯％或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的濃度。具體地，培養(yǎng)基中的總氨濃度是，例如，優(yōu)選300mM或更低、更優(yōu)選200mM或更j氐、特別優(yōu)選100mM或更低。隨著pH值增加，氨解離的程度降低。與銨離子相比，未解離的氨對(duì)于細(xì)菌是更有毒性的。因此，總氨濃度的上限還取決于培養(yǎng)基的pH值。也就是說(shuō)，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值增加時(shí)，可接受的總氨濃度變得更低。因此，對(duì)于上述被定義為"不抑制堿性物質(zhì)的生產(chǎn)"的總氨濃度，在培養(yǎng)期間對(duì)于最高pH值可接受的總氨濃度范圍可以被看作是整個(gè)培養(yǎng)的總氨濃度范圍。另一方面，微生物的生長(zhǎng)和堿性物質(zhì)的產(chǎn)生所需的作為氮源的氨總濃度源不足而降低，而且它可以適當(dāng)?shù)卮_定。例如，在培養(yǎng)期間隨時(shí)間測(cè)量氨濃度，當(dāng)培養(yǎng)基中的氨被耗盡時(shí)，可以將少量氨添加到培養(yǎng)基中。雖然添加氨之后的濃度沒(méi)有具體的限制，但就總氨濃度而言，它是，例如，優(yōu)選1mM或更高、更優(yōu)選5mM或更高、特別優(yōu)選10mM或更高。本發(fā)明的方法可以包括主要用于增殖具有產(chǎn)生堿性物質(zhì)能力的微生物的培養(yǎng)步驟，和主要用于容許微生物產(chǎn)生堿性物質(zhì)的培養(yǎng)步驟。此外，在本發(fā)明的方法中，微生物的增殖和堿性物質(zhì)的生產(chǎn)可以并行地進(jìn)行。此外，除了如上所述的這種培養(yǎng)，其也可被稱(chēng)為主發(fā)酵、主培養(yǎng)等之外，也可以獨(dú)立地進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在本發(fā)明中，除了如上所述調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度之外，也可以進(jìn)行促進(jìn)培養(yǎng)基中碳酸氫根離子和/或碳酸根離子溶解的操作。這種操作的實(shí)例包括在培養(yǎng)期間控制發(fā)酵罐中的壓力使得它是正的，向培養(yǎng)基提供二氧化碳?xì)怏w或含有二氧化碳?xì)怏w的混合氣體，限制向發(fā)酵罐中通氣使得碳酸氫根離子和/或碳酸根離子溶于培養(yǎng)基中，通過(guò)向培養(yǎng)基添加銨離子以外的陽(yáng)離子例如鈉離子和鉀離子來(lái)提高培養(yǎng)基的pH值，等等。為了使發(fā)酵罐中的壓力為正，例如，可以使供應(yīng)到發(fā)酵罐的空氣壓力比排氣的壓力更高。通過(guò)使發(fā)酵罐中的壓力更高，由發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w溶于培養(yǎng)基中并產(chǎn)生碳酸氫根離子或碳酸根離子。具體地，發(fā)酵罐中的壓力可以是0.13到0.3MPa,優(yōu)選0.15到0.25MPa。此外，通過(guò)向培養(yǎng)基提供二氧化碳?xì)怏w或含有二氧化碳?xì)怏w的混合氣體，可將二氧化碳?xì)怏w溶于培養(yǎng)基中。作為選擇，通過(guò)限制對(duì)發(fā)酵罐的通氣，由發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w也可以溶于培養(yǎng)基中。通過(guò)，例如，測(cè)量培養(yǎng)基中碳酸氫根離子或碳酸根離子的量、或測(cè)量培養(yǎng)基的pH值和氨濃度，可以確定適合的通氣速率。當(dāng)向培養(yǎng)基提供二氧化碳?xì)怏w時(shí)，例如，可將純二氧化碳?xì)怏w或含有5體積％或更多二氧化碳?xì)怏w的混合氣體鼓泡到培養(yǎng)基中。用于將碳酸氬根離子和/或碳酸根離子溶解到培養(yǎng)基中的上述方法可以獨(dú)立地、或作為兩種或多種的組合來(lái)使用。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中總氨濃度的操作，以及如果需要促進(jìn)培養(yǎng)基中碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的溶解的操作，可以在培養(yǎng)過(guò)程的總時(shí)期的至少一部分期間進(jìn)行。雖然"總時(shí)期的至少一部分"沒(méi)有具體的限制，只要獲得了期望的生產(chǎn)力，但具體地它可以是，例如，主培養(yǎng)的總培養(yǎng)過(guò)程的1/10或更多、優(yōu)選l/5或更多。更具體地，所述時(shí)期的實(shí)例包括，由于隨著所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累，反荷離子例如硫酸根離子和/或氯離子的不足引起所述培養(yǎng)基的pH值提高的時(shí)期，或由于添加陽(yáng)離子而使所述pH值提高的時(shí)期，或這兩個(gè)時(shí)期。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基沒(méi)有具體的限制，只要通過(guò)調(diào)節(jié)總氨濃度的操作至少總氨濃度可以被調(diào)節(jié)到上述范圍之內(nèi)，并且取決于使用的微生物，可以適當(dāng)?shù)厥褂煤杏袡C(jī)和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，例如碳源和氮源和其他痕量營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基?？梢允褂萌魏翁荚矗灰鼙凰鑫⑸锿?，而實(shí)例包括糖類(lèi)例如蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜和淀粉水解物，有機(jī)酸例如乙酸，醇類(lèi)例如乙醇，和烴類(lèi)例如曱烷。氮源的實(shí)例包括無(wú)機(jī)物例如氨，蛋白水解物，酵母提取物，等等。痕量營(yíng)養(yǎng)物的實(shí)例包括氨基酸，維生素和痕量金屬元素。存在于培養(yǎng)基中除碳酸氪根離子和/或碳酸根離子之外的陰離子的實(shí)例包括氯離子、硫酸根離子、磷酸根離子、離子化的有機(jī)酸、氫氧根離子，等等。這些其他離子的離子當(dāng)量的總和通常是900meq/l或更低，優(yōu)選700meq/1或更j氏，更優(yōu)選500meq/1或更j氏，還更優(yōu)選300meq/1或更低，特別優(yōu)選200meq/1或更低。本發(fā)明的目的之一是降低使用的硫酸根離子和/或氯離子的量，硫酸根離子或氯離子的離子當(dāng)量、或培養(yǎng)基中存在的這些離子的離子當(dāng)量的總和通常是700meq/l或更低，優(yōu)選500meq/1或更低，更優(yōu)選300meq/1或更低，還更優(yōu)選200meq/1或更低，特別優(yōu)選100m叫/1或更j氐。發(fā)酵方案沒(méi)有具體的限制，并可以是其中不添加培養(yǎng)基的分批培養(yǎng)，其中在加料的糖類(lèi)被消耗之后進(jìn)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料培養(yǎng)，其中當(dāng)培養(yǎng)基的體積超出發(fā)酵罐可接受的體積時(shí)抽取培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)，其中細(xì)菌細(xì)胞再回收的細(xì)胞再循環(huán)方法，等等。培養(yǎng)溫度可以取決于選擇的微生物適當(dāng)?shù)卮_定。其通常是25到45。C，優(yōu)選30到40。C。此外，優(yōu)選充分地?cái)嚢枋沟冒l(fā)酵期間存在充足的氧氣。例如，具體地如下進(jìn)行用于生產(chǎn)目標(biāo)堿性物質(zhì)的培養(yǎng)。制備含有典型培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)基，但是除去部分或者全部的銨鹽，例如硫酸銨和氯化銨。將已經(jīng)單獨(dú)地培養(yǎng)的微生物接種到此培養(yǎng)基中，并將總氨濃度控制到如上述確定的適合于選擇的微生物的范圍之內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)使用，例如，商業(yè)上可獲得的離子計(jì)等，可以測(cè)量發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基中或采樣的培養(yǎng)基中的氨濃度。通過(guò)使用測(cè)量的值作為指標(biāo)，可以控制總氨濃度。為了將總氨濃度維持在預(yù)定的濃度范圍之內(nèi)，可以向培養(yǎng)基添加氨氣、氨水或尿素。通過(guò)使用普通的氨電極測(cè)量來(lái)自發(fā)酵罐的排氣中的氨濃度，也可以間接地測(cè)量培養(yǎng)基中的總氨濃度。此外，在本發(fā)明中，如上所述，通過(guò)使用培養(yǎng)基的pH值作為指標(biāo)的如下方法，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的總氨濃度。在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基具有與含有其量足以在pH7.2或更低的條件下維持培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子的培養(yǎng)基相同的成分，只是將硫酸根離子和/或氯離子的量在各個(gè)pH值水平降低了期望的量，其中通過(guò)添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來(lái)改變pH值水平，以及繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)根據(jù)指標(biāo)，例如培養(yǎng)基中溶解氧濃度的變化、培養(yǎng)基中碳源消耗速度的變化、培養(yǎng)基混濁度的變化、培養(yǎng)基中pH值的變化等等，通過(guò)向培養(yǎng)基添加氨氣、氨水和尿素的任何一種，在一定時(shí)期內(nèi)以間接的方式維持培養(yǎng)基中的總氨濃度使它在優(yōu)選的濃度范圍之內(nèi)，在所述時(shí)期中由于對(duì)培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)的反荷離子的不足而不能將培養(yǎng)基的pH值維持在7.2或更低。賴(lài)氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。其中，L-賴(lài)氨酸是優(yōu)選的。能生產(chǎn)堿性物質(zhì)的微生物沒(méi)有具體的限制，可以選擇任何微生物只要它可以通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)堿性物質(zhì)。具體地，優(yōu)選即使在高培養(yǎng)基pH值下，也能在培養(yǎng)基的總氨濃度低的條件下良好地生產(chǎn)堿性物質(zhì)的微生物，。這種微生物的實(shí)例包括屬于棒狀桿菌型細(xì)菌、埃希氏菌屬(Esc/7en'c/n'fl)、沙雷氏菌屬(6"erra^(3)或芽孑包4干菌屬(5ac/〃w"。以下將說(shuō)明棒狀桿菌型細(xì)菌和埃希氏菌屬細(xì)菌，然而，用于本發(fā)明的方法的微生物不限于這些細(xì)菌。用于本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌包括棒桿菌屬(Cbo^e6acten'wm)細(xì)菌和早先已經(jīng)被分類(lèi)為短桿菌屬(BreWk7"m'wm)、但已經(jīng)重新分類(lèi)為棒桿菌屬(Int.J.Syst.Bacteriol.,41，255(1981))的那些細(xì)菌，并進(jìn)一步包括屬于短桿菌屬的細(xì)菌，其極其接近于棒桿菌屬。具體的實(shí)例包括以下p耆乙酉先乙酸寺奉才干菌(C07we6a"e7"'Mmacetoac/dop/H'/ww)醋谷譯奉4干菌(Co/^we6a"eWMmacefog/Mtom/cwm)火咒醇才奉才干菌(Co73^e6acfen-Mma/A;a"o/yricww)美棒桿菌(G9fywe6a"en.膽cc〃聰ae)谷氨酸才奉才干菌(Cor_yweZfl"er/wwg7wto附/cww)百合花才奉^干菌(Cor_ywe6cz"en.wm///z'w歷)才西4唐蜜才奉牙干菌(Cbrywe6"cfeWw附me/a^eco/a)p耆^^產(chǎn)氨才奉^干菌(Co^"e6(3"en^w^zermoaw/"ogewas)力士寺奉4干菌(Co7we6acten.wm/zercw//-)二il支少豆4干菌(i^eW6acten'Mmdz'van'ca似w)(谷氨酉交才奉4干菌)黃色短桿菌(BreWZfl"eWwm_/7avwm)(谷氨酸才奉桿菌)乳發(fā)酵短桿菌C6rev〖6a"en'wm/acto/erme"/wm)(谷氨酸棒桿菌)3史^鬼色4豆才干菌(5rev/6acten.w777解4唐4豆4干菌(5rev/6fl"en.ww5^cc/wra/3^/cwm)生石危4豆斗干菌(5rev/6"ceWww^z/ogem'to/^)產(chǎn)氨才奉4干菌(Co/^y"e6"c/e廠/wma/77mo"/age"as1)白色-豆才干菌(5rev/6acfer/tW7a/6wm)蟲(chóng)普^)犬^豆才干菌(5rev/6acten'wmp省氨孩吏4干菌(M"/cro6flcfen'wiT7awwow'a//n7MW)具體地，包括如下菌抹嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806烷醇棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032,ATCC13060百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC1W卯棲糖蜜棒桿菌ATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERMBP-1539)力士棒桿菌ATCC13868二歧短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826,ATCC140675rev/6ocen'w7w/mman'op/zZ/wwATCC14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13665,ATCCl3869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒桿菌)ATCC6871白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCCl5112嗜氨微桿菌ATCC15354埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括大腸桿菌(Eyc/zen'c/^co//)。當(dāng)使用遺傳工程技術(shù)培育大腸桿菌時(shí)，可以選擇大腸桿菌K12菌抹和其衍生物，即大腸桿菌MG1655菌抹(ATCCNo.47076)、W3110菌抹(ATCCNo.27325)等等。大腸桿菌K12菌抹是1922年在斯坦福大學(xué)分離的，并且是X噬菌體的溶原細(xì)菌。另外，它是具有F因子的多用途菌抹，通過(guò)接合等等可以構(gòu)建它的遺傳重組體。此外，已經(jīng)確定了大腸桿菌K12菌抹的基因組序列，該遺傳信息是公眾可獲得的。大腸桿菌K12菌抹和其衍生物可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,地址P.O.Box1549，Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica)獲得。能夠生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括S-(2-氨基乙基)半胱氨酸(以下縮寫(xiě)為"AEC")抗性突變菌抹、需要氨基酸例如L-高絲氨酸用于生長(zhǎng)的突變菌抹(特公昭48-28078號(hào)和特公昭56-6499號(hào))、具有對(duì)AEC的抗性并且進(jìn)一步需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變菌抹(美國(guó)專(zhuān)利Nos.3,708,395和3,825,472)、具有對(duì)DL-a-氨基-s-己內(nèi)酰胺、a-氨基-月桂基內(nèi)酰胺(a-amino-lauryllactam)、天冬氨酸類(lèi)似、物、石黃胺藥(sulfadmg)、類(lèi)S昆(quinoid)和N-月桂?；涟彼?N-lauroylleucine)的抗性的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌抹、具有對(duì)草酰乙酸脫羧酶或呼吸道酶抑制物的抗性的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌抹(特開(kāi)昭50-53588,特開(kāi)昭50-31093，特開(kāi)昭52-102498，特開(kāi)昭53-9394，特開(kāi)昭53-86089，特開(kāi)昭55-9783，特開(kāi)昭55-9759，特開(kāi)昭56-32995，特開(kāi)昭56-39778,特公昭53-43591和特公昭53-1833)、需要環(huán)己六醇(inositol)或乙酸的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌抹(特開(kāi)昭55-9784和特開(kāi)昭56-8692)、對(duì)氟丙酮酸(fluoropymvicacid)或34。C或更高的溫度敏感的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌抹(特開(kāi)昭55-9783和特開(kāi)昭53-86090)、具有對(duì)乙二醇的抗性的短桿菌屬或棒桿菌屬細(xì)菌的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌株，等等。具體實(shí)例包括，例如，乳發(fā)酵短桿菌ATCC31269、黃色短桿菌ATCC21475和醋谷棒桿菌ATCC21491菌抹。此外，在實(shí)施例中描述的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869/pVK-C*，plysE菌抹也是優(yōu)選的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌。通過(guò)將含有編碼天冬氨酸激酶的基因的質(zhì)粒pVK-O和含有/_y^E基因的質(zhì)粒plysE(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2003113899)摻入到ATCC13869菌抹中來(lái)獲得這個(gè)菌抹，所述天冬氨酸激酶是對(duì)L-賴(lài)氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制脫敏感的(lysC",所述基因與已知促進(jìn)棒桿菌屬細(xì)菌的L-賴(lài)氨酸分泌的基因是同源的(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)9723597A2)，所述ATCC13869菌抹是乳發(fā)酵短桿菌的野生型菌抹。/"C^基因可以從例如生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌抹AJ3463(FERMP-1987)(參見(jiàn)特公昭51-34477號(hào)公報(bào))分離，所述菌林是通過(guò)誘變ATCC13869菌抹產(chǎn)生的。AJ3463菌抹于1973年3月22日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(以前為工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)(i也i止TsukubaCentral6,1-1，Higashil-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)，分配的登記號(hào)是FERMP-1987。此外，lysC^基因片段也可以從含有質(zhì)粒p399AK9B的乳發(fā)酵短桿菌AJ12691菌抹分離，所述質(zhì)粒含有該基因。AJ12691菌抹于1992年4月10日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，分配的登記號(hào)是FERMP-12918。之后，于1995年2月10日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERMBP-4999。通過(guò)將允許質(zhì)粒在棒桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的DNA片段插入質(zhì)粒p399AK9來(lái)獲得質(zhì)粒p399AK9B(美國(guó)專(zhuān)利No.5,766,925)，質(zhì)粒p399AK9是通過(guò)將來(lái)自AJ3463菌抹的lysC插入克隆載體pHSG399來(lái)獲得的(參見(jiàn)，Takeshita,S等，Gene(1987),61,63-74)。在上述脫敏感的天冬氨酸激酶中，野生型天冬氨酸激酶的a-亞基的位置279處的丙氨酸殘基和(3-亞基的位置30處的丙氨酸殘基各自被替換為蘇氨酸殘基。a-亞基和P-亞基都在lysC基因的相同閱讀框內(nèi)編碼。lysC^基因的核苷酸序列和脫^:感的天冬氨酸激酶的a-亞基的氨基酸序列在序列表中示出，分別為SEQIDNO:5和6，同一個(gè)基因的核苷酸序列和脫敏感的天冬氨酸激酶的(3-亞基的氨基酸序列分別顯示為SEQIDNO:7和8。使用根據(jù)報(bào)道的核苷酸序列(GenBank登記號(hào)X96471)的引物，例如SEQIDNO:3和4所示的引物和棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體DNA作為模板，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參見(jiàn)White,T丄等，TrendsGenet.,5,185(1989))可以獲得棒狀桿菌型細(xì)菌的lysE基因。含有谷氨酸棒桿菌/"G和/，E基因(GenBank登記號(hào)X96471)的DNA片段的核苷酸序列在SEQIDNO:9中示出，由這個(gè)基因編碼的LysE蛋白的氨基酸序列在SEQIDNO:10中示出。LysG由相應(yīng)于SEQIDNO:8中核苷酸編號(hào)1723到2352的互補(bǔ)序列編碼。編碼天冬氨酸激酶的a-亞基、P-亞基和LysE蛋白的DNA包括編碼蛋白的DNA，所述蛋白可以在每個(gè)蛋白中一個(gè)或幾個(gè)位置包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的缺失、取代、插入或添加，只要不喪失所述蛋白的活性。雖然術(shù)語(yǔ)"幾個(gè)，，意指的氨基酸殘基數(shù)目可以取決于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置和種類(lèi)而變化，對(duì)于每個(gè)蛋白它優(yōu)選為2到30個(gè)、更優(yōu)選2到20個(gè)、特別優(yōu)選2到10個(gè)。這基于以下理由。也就是，由于某些氨基酸相互間是高度同源的，這些氨基酸之中的差異不會(huì)很大地影響蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和活性。因此，每個(gè)蛋白可以是與SEQIDNO:6、8或10的氨基酸殘基具有50%或更高、優(yōu)選70%或更高、更優(yōu)選90%或更高、特別優(yōu)選95%或更高的同源性，并具有天冬氨酸激酶或LysE蛋白的活性的蛋白質(zhì)。如上所述的這種蛋白質(zhì)修飾是維持每個(gè)蛋白活性的保守突變。取代是一種改變，其中氨基酸序列中至少一個(gè)殘基被除去，并在此插入另一個(gè)殘基。被認(rèn)為是保守性取代的氨基酸殘基對(duì)原始氨基酸殘基的取代的實(shí)例包括ser或thr對(duì)ala的耳又i^，gln、his或lys對(duì)arg的耳又4戈，glu、gln、lys、his或asp只十a(chǎn)sn的耳又4氣，asn、glu或gln對(duì)asp的耳又代，ser或ala對(duì)cys的耳又4戈，asn、glu、lys、his、asp或arg對(duì)gin的耳又i^，asn、gln、lys或asp只十glu的耳又4弋，pro乂于gly的耳又"f弋，asn、lys、gln、arg或tyr只于his的耳又4氣，leu、met、val或phe對(duì)ile的耳又4&，ile、met、val或phe對(duì)leu的耳又，asn、glu、gln、his或arg對(duì)lys的耳又代，ile、leu、val或phe對(duì)met的耳又代，trp、tyr、met、ile或leu對(duì)phe的耳又4弋，thr或ala對(duì)ser的耳又4弋，ser或ala7寸于thr的耳又4弋，phe或tyr對(duì)trp的耳又4弋，his、phe或trp對(duì)tyr的耳又4戈和met、ile或leu對(duì)val的耳又代。編碼與具有SEQIDN0:6、S或10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA,可以通過(guò)使用例如位點(diǎn)特異性誘變，從而發(fā)生一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，修飾編碼SEQIDNO:6、8或10所示氨基酸序列的核苷酸序列來(lái)獲得。這種修飾的DNA可以通過(guò)用試劑處理或在引起突變的條件下處理以常規(guī)方式來(lái)獲得。這種處理的實(shí)例包括用羥胺處理編碼本發(fā)明的蛋白的DNA、紫外線照射含有所述DNA的微生物、用試劑例如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理。編碼如上所述這種修飾的蛋白的DNA也可以通過(guò)分離DNA來(lái)獲得，被分離的DNA能在嚴(yán)格條件下與lysC基因、lysE基因或這些基因的一部分雜交并仍編碼具有天冬氨酸激酶活性或LysE蛋白的活性的蛋白。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"包括這樣的條件，在這些條件下形成所謂的特異性雜合體(specifichybrid),而不形成非特異性雜合體。嚴(yán)格條件包括，例如，這樣的條件，在這些條件下相互具有高同源性的DNA，例如具有不低于70%、優(yōu)選不低于80%、更優(yōu)選不低于90%、特別優(yōu)選不低于95%的同源性的DNA能夠雜交。嚴(yán)格條件還包括Southern雜交的典型的洗滌條件，例如，在60。C,1xSSC,0.1%SDS，優(yōu)選0.1xSSC，0.1%SDS。屬于埃希氏菌屬的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌的實(shí)例包括具有對(duì)L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物的抗性的突變體。L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物抑制埃希氏菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，但當(dāng)L-賴(lài)氨酸同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)這種抑制完全地或部分地消除了。L-賴(lài)氨酸類(lèi)似物的實(shí)例包括氧代賴(lài)氨酸(oxalysine)、賴(lài)氨酉交氧將酸(lysinehydroxamate)、(S)-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、y-曱基賴(lài)氨酸、a-氯己內(nèi)酰胺(a-chlorocaprolactam),等等。具有對(duì)這些賴(lài)氨酸類(lèi)似物的抗性的突變體可以通過(guò)使埃希氏菌屬微生物經(jīng)受常規(guī)的人工突變處理來(lái)獲得。用于生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌菌抹的具體實(shí)例包括大腸桿菌AJ11442(FERMBP-1543，NRRLB-12185;參見(jiàn)特開(kāi)昭56-18596和美國(guó)專(zhuān)利No.4,346,170)和大腸桿菌VL611菌抹。AJ11442菌抹于1981年5月1日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(以前為工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)(地址TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566:曰本)，分配的登記號(hào)是FERMP-5084。之后，這個(gè)保藏物于1987年10月29曰根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERMBP-1543。在這些微生物中，L-賴(lài)氨酸的天冬氨酸激酶反饋抑制被脫敏了。此外，例如，除了脫每t的天冬氨酸激酶之外，具有編碼涉及L-賴(lài)氨酸生物合成的酶的基因的增強(qiáng)表達(dá)的細(xì)菌也可用作優(yōu)選的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌。這種酶的實(shí)例包括二氨基庚二酸(diaminopimelate)途徑中涉及的酶，例如二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶(對(duì)于所有上述的酶，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(特開(kāi)昭60-87788)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(特公平6-102028)、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶(特開(kāi)2003-135066)和天冬氨酸半醛脫氫酶(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO00/61723),氨基己二酸途徑中涉及的酶，例如高烏頭酸水合酶(homoaconitatehydratase)(特開(kāi)2000-157276),等等。具有生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的能力的大腸桿菌菌抹的具體實(shí)例包括大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2菌抹(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO95/16042)等等。大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2菌抹是通過(guò)向W3110(tyrA)中導(dǎo)入含有編碼L-賴(lài)氨酸生物合成系統(tǒng)酶的基因的質(zhì)粒pCABD2來(lái)獲得的，W3110(tyrA)是大腸桿菌的tyrA缺陷菌抹(它被稱(chēng)為AJ12604,于1991年1月28日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(以前為工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)(地址TsukubaCentral6,1-1,Higashil-Chome，Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566，日本)，分配登記號(hào)FERMP-11975,然后該保藏物根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在1991年9月26日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配登記號(hào)FERMBP-3579)。質(zhì)粒pCABD2含有編碼突變二氫吡啶二羧酸合酶的基因，其中位置118的組氨酸殘基被突變?yōu)槔野彼釟埢?，L-賴(lài)氨酸的反饋抑制被脫敏，編碼突變天冬氨酸激酵III的基因，其中位置352的蘇氨酸殘基被突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，L-賴(lài)氨酸的反饋抑制被脫敏，和編碼二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶的基因。此外，可以如下所述獲得大腸桿菌W3110(tyrA)菌抹。也就是說(shuō)，通過(guò)將質(zhì)粒導(dǎo)入W3110(tyrA)菌抹獲得的許多菌株在歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.488424/1992中公開(kāi)。例如，通過(guò)導(dǎo)入質(zhì)粒pHATerm獲得的菌林被稱(chēng)為大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm菌抹，并保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，分配登記號(hào)FERMBP-3653。通過(guò)，例如，從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm菌抹消除質(zhì)粒pHATerm可以獲得W3110(tyrA)菌抹。質(zhì)粒的消除可以按常規(guī)方式進(jìn)4亍。此外，WC196菌抹(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO96/17930)也可以被用作大腸桿菌的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌株。WC196菌株是通過(guò)給源自大腸桿菌K-12的W3110菌抹賦予AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而培育的。這個(gè)菌抹被稱(chēng)為大腸桿菌AJ13069,并于1994年12月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(TsukubaCentral6,1-1，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566,日本))，分配的登記號(hào)是FERMP-14690。之后，該保藏物于1995年9月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERMBP-5252。本發(fā)明可以使用的微生物可以具有降低的酶活性，所述酶經(jīng)由作為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸生物合成途徑的分支的途徑，催化產(chǎn)生除L-賴(lài)氨酸外的化合物的反應(yīng)，或是下調(diào)L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)，或可以在這種酶中有缺陷。在L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)中，這樣的酶的說(shuō)明性實(shí)例包括高絲氨酸脫氫酶、賴(lài)氨酸脫羧酶(ca^4，WcC)和蘋(píng)果酸酶。其中這些酶的活性被降低或有缺陷的菌抹在國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)W095/23864、WO96/17930、WO2005/010175,等等中描述。為了降低或消除酶的活性，可以通過(guò)常規(guī)的誘變方法來(lái)突變?nèi)旧w上編碼酶的基因，使得酶的細(xì)胞內(nèi)活性被降低或消除。例如，這可以通過(guò)使用遺傳重組消除染色體上編碼酶的這些基因，或修飾表達(dá)控制序列，例如啟動(dòng)子或Shine-Dalgamo(SD)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。這也可以通過(guò)導(dǎo)入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、導(dǎo)入終止密碼子(無(wú)義突變)、添加或缺失染色體上酶的編碼區(qū)中一個(gè)或兩個(gè)核苷酸導(dǎo)入移碼突變，或缺失一部分基因來(lái)實(shí)現(xiàn)(JournalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997))。也可以通過(guò)構(gòu)建編碼突變的酶的基因，其中編碼區(qū)被缺失，并通過(guò)同源重組等等用突變的基因取代染色體上的野生型基因，或向基因?qū)朕D(zhuǎn)座子或IS因子，來(lái)降低或消除酶的活性。例如，可以采用以下方法來(lái)導(dǎo)入突變，所述突變引起上述酶的活性的下降，或通過(guò)遺傳重組消除活性。通過(guò)修飾目標(biāo)基因的部分序列來(lái)制備突變基因，并用含有突變基因的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌來(lái)引起突變基因和染色體上基因之間的重組，染色體上的目標(biāo)基因可以被取代為不產(chǎn)生正常起作用的酶的突變基因。已經(jīng)建立了使用同源重組基于基因置換(genesubstitution)的這種位點(diǎn)特異性誘變，并且已知使用線性DNA的方法、使用含有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97，No.12,pp.6640-6645;U.S,專(zhuān)利No.6,303,383;特開(kāi)平05-007491)等等。此外，如上所述使用同源重組基于基因置換的這種位點(diǎn)特異性誘變也可以用不能在宿主中復(fù)制的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行。此外，已經(jīng)被修飾使得L-賴(lài)氨酸和L-精氨酸分泌基因_>^/￡的表達(dá)量提高的微生物也可用于本發(fā)明(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO2005/073390)。屬于沙雷氏菌屬的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌的實(shí)例包括用編碼二氫吡啶二羧酸合酶的DNA轉(zhuǎn)化的沙雷氏菌屬細(xì)菌，所述二氫吡啶二羧酸合酶具有脫敏化L-賴(lài)氨酸反饋抑制的突變，和含有天冬氨酸激酶的沙雷氏菌屬細(xì)菌，所述天冬氨酸激酶是對(duì)L-賴(lài)氨酸的反饋抑制脫敏的(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)W096/41871)。生產(chǎn)L-精氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括棒狀桿菌型細(xì)菌的野生型菌株；對(duì)某些試劑包括磺胺藥類(lèi)、2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)、ot-氨基-(3-羥基戊酸(a-amino-卩-hydroxyvalericacid)等等有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌；除了對(duì)2-p塞唑丙氨酸有抗性之外顯示對(duì)L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-曱硫氨酸或L-色氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開(kāi)昭54-44096);只于酮基丙二酉臾(ketomalonicacid)、氟丙二酉臾(fluoromalonicacid)或單氟乙酸(monofluoroaceticacid)有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開(kāi)昭57-1898外對(duì)argininol有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開(kāi)昭W-MO75);對(duì)X-胍有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(X代表脂肪酸或脂肪族鏈的衍生物，特開(kāi)平2-186995)等等。此外，在L-精氨酸抑制物方面有缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.20020045233)，和具有提高的谷氨酸脫氫酶活性的棒狀桿菌型細(xì)菌(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)1057893)也是用于L-精氨酸生產(chǎn)的合適的菌抹。具體地，實(shí)例包括黃色短桿菌AJ11169(FERMBP-6892)、谷氨酸棒桿菌AJ12092(FERMBP-6906)、黃色短桿菌AJ11336(FERMBP-6893)、黃色短桿菌AJ11345(FERMBP-6894)和乳發(fā)酵短桿菌AJ12430(FERMBP-2228)菌抹。AJ11169和AJ12092菌抹對(duì)2-噻唑丙氨酸有抗性(特開(kāi)昭54-44096)。AJ11336菌抹對(duì)argininol和磺胺嘧啶(sulfadiazine)有抗性(日本專(zhuān)利公開(kāi)No.62-24075)。AJ11345菌抹對(duì)ai'ginino、2-噻唑丙氨酸和磺胺胍有抗性，且對(duì)組氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的(特公昭62-24075)。AJ12430菌抹對(duì)辛基胍(octylguanidine)和2-。塞唑丙氨酸有抗性(特開(kāi)平2-186995)。谷氨酸棒桿菌AJ12092于1994年12月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(TsukubaCentral6,l-l，Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566，日本)，分配的登記號(hào)是FERMP-12092。之后，該保藏物于1999年10月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，分配的登記號(hào)是FERMBP-6906。能生產(chǎn)L-精氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括用基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(參見(jiàn)特開(kāi)昭57-569"和大腸桿菌菌抹237(俄國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000117677)，其是能夠同化乙酸的突變菌抹的生產(chǎn)L-精氨酸的衍生物。237菌抹于2000年4月10日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，GNIIGenetika(地址Russia,117545,Moscow,1Dorozhnyproezd,1),分配編號(hào)VKPMB-7925。該保藏物于2001年5月18日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。大腸桿菌菌抹382是對(duì)L-精氨酸的反饋抑制有抗性的突變體(特開(kāi)2002-017342號(hào)公報(bào))，其是237菌抹的衍生物，而且也可以采用。大腸桿菌菌4朱382于2000年4月10日以編號(hào)VKPMB-7926保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),于2001年5月18日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。能生產(chǎn)L-精氨酸的沙雷氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括粘質(zhì)沙雷氏菌(&rra"amwr^cera)，其不能分解L-精氨酸并對(duì)精氨酸拮抗劑和刀豆氨酸(canavanine)有抗性，并且對(duì)賴(lài)氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的(參見(jiàn)日本專(zhuān)利Laid-openNo.52-8729)。能生產(chǎn)L-組氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括屬于短桿菌屬對(duì)硫胺素拮抗劑有抗性的微生物，具體地，乳發(fā)酵短桿菌FERMP-2170、FERMP-2316、FERMP-6478、FERMP-6479、FERMP-6480和FERMP-6481菌抹(特開(kāi)昭59-63194)。此外，實(shí)例包括屬于短桿菌屬或棒桿菌屬的突變菌抹，其對(duì)聚酮化合物(polyketides)有抗性和L-組氨酸生產(chǎn)能力，具體地，F(xiàn)ERMP-4161、FERMP-7273、FERMP-8371、FERMP-8372和ATCC14067菌抹。能生產(chǎn)L-組氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括屬于埃希氏菌屬對(duì)組氨酸類(lèi)似物有抗性的突變菌抹，例如，大腸桿菌R-344菌抹，和用分離自菌抹R-344的L-組氨酸合成系統(tǒng)酶基因轉(zhuǎn)化的埃希氏菌屬細(xì)菌。具體地，實(shí)例包括大腸桿菌KRRL-12116、NRRL-12118、NRRL-12119、NRRL-12120和NRRL-12121菌材、(特開(kāi)昭56-5099)。能生產(chǎn)L-組氨酸的芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括屬于芽孢桿菌屬對(duì)組氨酸類(lèi)似物有抗性的突變菌抹，和用從這些突變菌抹獲得的基因轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬細(xì)菌，所述基因涉及對(duì)組氨酸拮抗劑的抗性。具體地，實(shí)例包括FERMBP-218、FERMBP-224和FERMBP-219菌4朱(特開(kāi)昭58-107192)?；蛱妓釟涓x子作為離解的堿性物質(zhì)的反荷陰離子。當(dāng)培養(yǎng)基被加熱或濃縮時(shí)，或如果培養(yǎng)基的pH值通過(guò)添加強(qiáng)酸例如鹽酸^f皮降低時(shí)，這些碳酸根離子或碳酸氫根離子作為二氧化碳?xì)怏w逸出。在發(fā)酵液或發(fā)酵產(chǎn)物中的固體成分之中堿性物質(zhì)的相對(duì)量因而被提高。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使用碳酸氫根離子、碳酸根離子等來(lái)代替氯離子和硫酸根離子，氯離子的量可以甚至降低到不引起設(shè)備腐蝕的水平，或可以減少硫酸根離子。此外，在發(fā)酵之后，僅通過(guò)向培養(yǎng)基添加鹽酸，碳酸氫根離子和碳酸根離子可以被氯離子取代，僅通過(guò)進(jìn)一步濃縮培養(yǎng)基而不使用離子交換可以獲得賴(lài)氨酸鹽酸鹽，并進(jìn)一步，可以直接分離賴(lài)氨酸鹽酸鹽的晶體。在本發(fā)明中，"發(fā)酵產(chǎn)物"包括從發(fā)酵液獲得的濃縮物和干燥產(chǎn)物，和通過(guò)加工發(fā)酵液或其干燥產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。實(shí)施例以下，將參考如下實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1:生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌的構(gòu)建將編碼脫敏的天冬氨酸激酶的基因和編碼賴(lài)氨酸分泌因子的基因?qū)胍吧魻顥U菌型細(xì)菌來(lái)制備生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌。(l)獲取編碼脫敏的天冬氨酸激酶的基因通過(guò)PCR從生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌抹AJ3463(FERMP-1987,參見(jiàn)特公昭51-34477)來(lái)分離編碼對(duì)L-賴(lài)氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶(Ask"的基因(lysC",所述生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變菌株AJ3463通過(guò)誘變?cè)醋怨劝彼岚魲U菌(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC13869。在CM-Dex培養(yǎng)基中培養(yǎng)AJ3463菌抹，通過(guò)一般方法從獲得的細(xì)胞i是取染色體DNA(Biochem.Biophys.Acta"72,619-629(1963))。通過(guò)使用這個(gè)染色體DNA作為模板，用在目標(biāo)DNA片段的5'末端導(dǎo)入限制性酶BamHI位點(diǎn)的寡核苷酸ASK-F(SEQIDNO:l)和在目標(biāo)DNA片l殳的3'末端導(dǎo)入限制性酶Kpnl位點(diǎn)的寡核苷酸ASK-R(SEQIDNO:2)作為PCR的引物，擴(kuò)增含有作為目標(biāo)基因的^C^基因的DNA片段。為了擴(kuò)增，將由98°CIO秒的變性步驟、55°C30秒的退火步驟、72°C2分鐘的延伸步驟組成的循環(huán)重復(fù)25次。根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)使用酶，PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzo)。通過(guò)苯酚/氯仿處理和乙醇沉淀來(lái)純化擴(kuò)增的DNA片段，然后用限制性酶5amHI和消化。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳展開(kāi)(develop)獲得的反應(yīng)混合物，切下含有/，(^*基因的條帶，通過(guò)常規(guī)方法純化基因片段。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體pVK7(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.6,004,773)按類(lèi)似的方式單獨(dú)地用限制性酶BamHI和《;"I處理，并連接到上述/，e片段。根據(jù)廠家的規(guī)程用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌抹(TakaraShuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，選擇幾個(gè)卡那霉素抗性菌落。通過(guò)將乳發(fā)酵短桿菌的隱蔽性質(zhì)粒(crypticplasmid)pAM330連接到大腸桿菌的載體pHSG299(m"",參見(jiàn)Takeshita，S.等，Gene,61,63-74，(1987))來(lái)構(gòu)建pVK7如下(參見(jiàn)特開(kāi)平11-266881，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)W099/07853)。從乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌4朱制備pAM330。用ztvall(TakaraShuzo)消化pHSG299,其已經(jīng)用T4DNA聚合酶平端化(blunt-ended),然后用///"dn(TakaraShuzo)消化，并連接到用T4DNA聚合酶平端化的pAM330。因而，獲得pVK7。pVK7可在大腸桿菌和乳發(fā)酵短桿菌的細(xì)胞中自主復(fù)制，并含有來(lái)自pHSG299的多克隆位點(diǎn)、/acZ，和卡那霉素抗性基因作為標(biāo)記物。按常規(guī)方式從如上所述獲得的卡那霉素抗性菌落提取質(zhì)粒DNA,將含有目標(biāo)/"(^*基因的質(zhì)粒稱(chēng)為pVK-C*。C2)獲取編碼賴(lài)氨酸分泌因子的基因通過(guò)使用來(lái)自乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA作為模板，通過(guò)PCR分離/"五基因(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.20(B113899)。已知/，￡基因在棒桿菌屬細(xì)菌中起作用來(lái)促進(jìn)L-賴(lài)氨酸的分泌(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)9723597A2)。按與上述相同的方式制備菌抹的染色體DNA。將LysE-F(SEQIDNO:3)和LysE-R(SEQIDNO:4)用作引物。使用Pyrobest(TakaraShuzo)用94。C的熱處理90秒并將以下循環(huán)重復(fù)30次來(lái)進(jìn)行PCR:94。C變性20秒，55。C退火30秒和72。C延伸反應(yīng)60秒。然后在72°C溫育反應(yīng)10分鐘。通過(guò)這個(gè)反應(yīng)獲得了預(yù)計(jì)大小的DNA片段。純化這個(gè)DNA片段，然后根據(jù)廠家的規(guī)程克隆到克隆載體pCR2.1(Invitrogene)中。根據(jù)廠家的規(guī)程用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌抹(TakaraShuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，并選擇幾個(gè)氨千青霉素抗性菌落。從這些菌落提取質(zhì)粒DNA，并將具有期望結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒稱(chēng)為pCRlysE。然后，用限制性酶SamHI和lal消化pCRlysE，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)獲得含有/，￡基因的片段。將大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體pKC(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2003113S99)按類(lèi)似的方式單獨(dú)用限制性酶S"wHI和屈"I處理，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)獲得含有氯霉素抗性基因的基因片段。純化這個(gè)基因，然后連接到上述(V5五片段。通過(guò)使用這個(gè)連接反應(yīng)混合物，根據(jù)廠家的規(guī)程轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌抹(TakaraShuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，并選擇幾個(gè)氯霉素抗性菌落。從如上所述獲得的菌落制備質(zhì)粒以獲得LysE表達(dá)質(zhì)粒plysE。如下制備pKC4。具有源自已經(jīng)獲得的質(zhì)粒pHM1519的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pHK4(參見(jiàn)特開(kāi)平5-7491),該復(fù)制起點(diǎn)可在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984)),用限制性酶S"wHI和AT/"I消化來(lái)獲得含有復(fù)制起點(diǎn)的基因片段。用DNABlunting試劑盒(TakaraShuzo)將獲得的片段平端化，通過(guò)使用接頭(TakaraShuzo)的連接來(lái)插入pHSG399(TakaraShuzo)的^QwI位點(diǎn)。根據(jù)廠家的規(guī)程用這個(gè)連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌抹(TakaraShuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，選擇幾個(gè)氯霉素抗性菌落。從如上所述獲得的菌落制備質(zhì)粒來(lái)獲得pKC4。(3)構(gòu)建生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌以上描述的兩個(gè)質(zhì)粒pVK-C+和plysE通過(guò)電穿孔導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌抹。通過(guò)使用GenePulser(BIO-RAD)進(jìn)行電穿孔。電轉(zhuǎn)杯中電極之間的距離是0.1cm,電脈沖施加條件是25pF、200D和1.8kV。在含有5嗎/1氯霉素和25嗎/l卡那霉素的CM-Dex瓊脂平板(培養(yǎng)基的組成參見(jiàn)下文)上選擇含有質(zhì)粒的菌抹。將含有質(zhì)粒的菌抹在含有5嗎/1氯霉素和25嗎/1卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中在31.5。C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。在3ml培養(yǎng)基中在試管中搖動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)。如下制備CM-Dex培養(yǎng)基。混合表1中列出的所有成分，用KOH調(diào)節(jié)到pH7.5,然后通過(guò)高壓蒸鍋在12CTC滅菌20分鐘。在瓊脂培養(yǎng)基中，瓊脂添加到20g/L的終濃度。表1:CM-Dex培養(yǎng)基的成分(每1L)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>生物素_I10|Llg(用滅菌的水添加到1L)如上所述，獲得生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀桿菌型細(xì)菌ATCC13869/pVK-C*，plysE。實(shí)施例2:生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌在堿性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，以及總氨濃度對(duì)L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的影響通過(guò)使用實(shí)施例1中構(gòu)建的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌，研究了在堿性培養(yǎng)基中不抑制L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)力的總氨濃度。首先，使用了常規(guī)的培養(yǎng)方法。也就是說(shuō)，使用通過(guò)向培養(yǎng)基A(成分如表2所示)中相對(duì)葡萄糖加入55%(w/w)的硫酸銨而獲得的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基B)。在培養(yǎng)期間用氨氣將培養(yǎng)基的pH值維持恒定，來(lái)進(jìn)行L-賴(lài)氨酸發(fā)酵。pH值控制到7.0或8.0。表2:培養(yǎng)基A成分(每1L)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>具體地，如下進(jìn)行培養(yǎng)。將上述菌抹接種到3mlCM-Dex液體培養(yǎng)基，在31.5。C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，并將200^培養(yǎng)基均勻地涂布在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上。在31.5。C靜置培養(yǎng)過(guò)夜來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。然后，將在一個(gè)平板上的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌細(xì)胞的三分之一接種到釜式發(fā)酵器(jarfermenter)中300ml培養(yǎng)基B中，并進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，用300ml每分鐘的過(guò)濾滅菌空氣對(duì)培養(yǎng)基通氣，將攪拌速度維持在700rpm,培養(yǎng)基的溫度維持在31.5。C。結(jié)果在圖1中示出。結(jié)果，在pH7.0,積累了17.4g/L的L-賴(lài)氨酸，生產(chǎn)率是0.725g/Lhr。另一方面，在pH8.0，細(xì)胞幾乎不存在生長(zhǎng)，發(fā)酵不進(jìn)行(圖1)。然后，使用上述生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌在沒(méi)有硫酸銨的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。將上述菌抹接種到3mlCM-Dex液體培養(yǎng)基中，在31.5。C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，200^培養(yǎng)基均勻地涂布在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上并在31.5。C放置過(guò)夜。將300ml培養(yǎng)基A(沒(méi)有硫酸銨)置于釜式發(fā)酵器中，通過(guò)將氨氣鼓泡通過(guò)培養(yǎng)基來(lái)調(diào)節(jié)pH值到7.8、8.2或8.9。將在一個(gè)平板上的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌細(xì)胞的三分之一接種到培養(yǎng)基中，并進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，用300ml每分鐘的過(guò)濾滅菌空氣對(duì)培養(yǎng)基通氣，攪拌速度維持在700rpm,培養(yǎng)基的溫度在31.5。C維持恒定。在培養(yǎng)期間，通過(guò)將氨氣鼓泡通過(guò)培養(yǎng)基來(lái)維持恒定的pH值。結(jié)果，證實(shí)的是，在pH8.9,在培養(yǎng)基中總氨濃度超過(guò)100mM之后，特別地，生長(zhǎng)和L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)被強(qiáng)烈抑制。在上述培養(yǎng)方法中，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，由生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w溶于培養(yǎng)基中作為碳酸根離子或碳酸氫根離子，導(dǎo)致pH值下降。因此，將pH值控制在預(yù)定水平所必須添加的氨的量提高。此外，調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基pH值水平越高，溶解的碳酸根離子和碳酸氫根離子的濃度越高，因此添加以將pH值調(diào)節(jié)到預(yù)定值的氨濃度越高。未離解的氨容易地滲透細(xì)胞，引起細(xì)胞的細(xì)胞損傷。由于pH值越高氨的解離度越低，隨pH值提高細(xì)菌的生長(zhǎng)更加被抑制，即使總氨濃度被維持在恒定的水平。因此，可以斷定，在pH8.9或更低時(shí)，如果控制總氨濃度很低，例如，100mM或更低，細(xì)菌生長(zhǎng)和L-賴(lài)氨酸積累的抑制作用不顯著。然后，在將培養(yǎng)基中的總氨濃度控制在100mM或更低，在pH7.8、8.2和8.9時(shí)，進(jìn)行生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的培養(yǎng)。將上述菌抹接種到3mlCM-Dex液體培養(yǎng)基中，在31.5。C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，將200(il培養(yǎng)基均勻地涂布在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上并在31.5。C放置過(guò)夜。將300ml培養(yǎng)基A(沒(méi)有硫酸銨)置于釜式發(fā)酵器中，通過(guò)將氨氣鼓泡通過(guò)培養(yǎng)基來(lái)調(diào)節(jié)pH值到7.5、7.8或8.2。將在一個(gè)平板上的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌細(xì)胞的三分之一接種到培養(yǎng)基中，并進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，用300ml每分鐘的過(guò)濾滅菌空氣對(duì)培養(yǎng)基通氣，攪拌速度維持在700rpm，培養(yǎng)基的溫度維持在31.5°C。在培養(yǎng)期間，用6N氫氧化鉀代替氨將pH值維持在各個(gè)預(yù)定水平。對(duì)培養(yǎng)基周期性地取樣，通過(guò)使用氨電極和離子計(jì)(Orion)來(lái)測(cè)量培養(yǎng)基中的總氨濃度。根據(jù)需要通過(guò)添加10%氨水溶液將總氨濃度控制到0到100mM之內(nèi)。此外，通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的溶解氧濃度，當(dāng)氨被耗盡時(shí)檢測(cè)到溶解氧濃度的急劇增加。當(dāng)這發(fā)生時(shí)，添加10%氨水溶液以防止培養(yǎng)基中氨的繼續(xù)耗盡。結(jié)果在圖2中示出。結(jié)果，在從7.8到8.9的所有pH值水平觀察到了良好的生長(zhǎng)和L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)。與使用常規(guī)培養(yǎng)方法在pH7.0進(jìn)行的發(fā)酵相比，觀察到115%或更高的生產(chǎn)率。實(shí)施例3:L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)在這個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)僅控制總氨濃度，而不是控制pH值來(lái)進(jìn)行L-賴(lài)氨酸發(fā)酵?？偘睗舛鹊姆秶痪S持在100mM或更低。根據(jù)實(shí)施例2中結(jié)果選擇這個(gè)范圍。將上述菌抹接種到3mlCM-Dex液體培養(yǎng)基中，在31.5。C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，將200(il培養(yǎng)基均勻地涂布在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上并在3L5。C放置過(guò)夜。將300ml培養(yǎng)基A(沒(méi)有硫酸銨)置于釜式發(fā)酵器中，通過(guò)將氨氣鼓泡通過(guò)培養(yǎng)基來(lái)將培養(yǎng)基的總氨濃度調(diào)節(jié)到23.8mM。將在一個(gè)平板上的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的細(xì)菌細(xì)胞的三分之一接種到培養(yǎng)基中，并進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，用300ml每分鐘的過(guò)濾滅菌空氣對(duì)培養(yǎng)基通氣，攪拌速度維持在700rpm，培養(yǎng)基的溫度維持在31.5°C。周期性地對(duì)培養(yǎng)基取樣并測(cè)量總氨濃度，根據(jù)需要將合適量的10%氨水添加給培養(yǎng)基從而使總氨濃度維持在0到100mM之間。結(jié)果，積累了15.9g/L的賴(lài)氨酸，L-賴(lài)氨酸發(fā)酵得以進(jìn)行(圖3)。實(shí)施例4:生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的大腸桿菌細(xì)菌的構(gòu)建<1>構(gòu)建在其中編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的cadJ和WcC基因被破壞的菌抹首先構(gòu)建賴(lài)氨酸脫羧酶缺陷菌抹。賴(lài)氨酸脫羧酶由ca^4基因(Genbank登錄號(hào)NP—418555，SEQIDNO:15)和WcC基因(Genbank登錄號(hào)NP—414728，SEQIDNO:17)編碼(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO96/17930)。在這個(gè)實(shí)施例中，WC196菌抹用作親本菌抹。通過(guò)使用由Datsenko和Wanner首先開(kāi)發(fā)的稱(chēng)為"Red-驅(qū)動(dòng)整合"的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，vol.97,No.12,pp.6640-6645)和源自X噬菌體的切除系統(tǒng)(J.Bacteriol"2002Sep.,184(18):5200-3,Interactionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephagelambdaexcisivenucleoproteincomplex,ChoEH，GumportRJ，GardnerJF)，來(lái)缺失編碼賴(lài)氨酸脫羧酶的caW和WcC基因。根據(jù)"Red驅(qū)動(dòng)整合"方法，使用合成的寡核苦酸引物獲得的PCR產(chǎn)物，所述引物中目標(biāo)基因的部分被設(shè)計(jì)在5'端，而抗生素抗性基因的部分被設(shè)計(jì)在3，端，可以用于一步獲得破壞基因的菌抹。此外，通過(guò)組合使用來(lái)自人噬菌體的切除系統(tǒng)，可以消除已經(jīng)整合到破壞基因的菌抹中的抗生素抗性基因(特開(kāi)2005-058227)。(l)破壞cadA基因?qū)①|(zhì)粒pMWl18-attL-Cm-attR(特開(kāi)2005-058827)用作PCR中的才莫板。通過(guò)在pMW118(TakaraBio)中插入和基因以及caf基因來(lái)獲得pMWl18-attL-Cm-attR,膽￡和a"/基因是X噬菌體的附著位點(diǎn)，caf基因是抗生素抗性基因。插入的順序是""丄-cW-WW。用如SEQIDNO:11和12所示的合成寡核苦酸引物進(jìn)行PCR，它們?cè)谝锏?'端具有相應(yīng)于和的兩端的序列，并在5'端具有相應(yīng)于目標(biāo)ca^i基因的一部分的序列。在瓊脂糖凝膠上純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌WC196菌抹中，上述大腸桿菌WC196菌株含有溫度敏感性可復(fù)制的質(zhì)粒pKD46。質(zhì)粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.，2000,vol.97，No.12，pp.6640-6645含有X噬菌體的2154核普酸的DNA片段，其中含有阿拉伯糖-可誘導(dǎo)的ParaB啟動(dòng)子(GenBankEMBL登錄號(hào)J02459,位置31088到33241的核苷酸)控制下的編碼XRed同源重組系統(tǒng)的Red重組酶的基因(X、(3、exo基因)。質(zhì)粒pKD46是將PCR產(chǎn)物整合到WC196菌抹的染色體中所需的。用于電穿孔的感受態(tài)細(xì)胞如下制備。也就是說(shuō)，將在含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中3CTC培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌WC196菌抹用含氨芐青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(lmM)的5mLSOB培養(yǎng)基(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrook,J.等,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))稀釋100倍。使稀釋的培養(yǎng)物中的細(xì)胞在30。C通氣生長(zhǎng)直到OD600達(dá)到約0.6，然后將培養(yǎng)物濃縮100倍，并用10%甘油洗滌三次，<吏得細(xì)胞可以用于電穿孔。通過(guò)使用70)il的感受態(tài)細(xì)胞和約100ngPCR產(chǎn)物進(jìn)行電穿孔。在電穿孔之后，將細(xì)胞添加到1mLSOC培養(yǎng)基(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrook,丄等，ColdSpringHarborLaboratoryPress(l989))，在37。C培養(yǎng)2.5小時(shí)，然后在37。C在含有25mg/LCm(氯霉素)的L瓊脂培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，選擇Cm抗性重組體。然后，為了除去pKD46質(zhì)粒，細(xì)胞在含有Cm的L瓊脂培養(yǎng)基上在42。C傳代培養(yǎng)兩次，檢查菌落的氨千青霉素抗性來(lái)獲得沒(méi)有pKD46的氨千青霉素敏感菌抹。通過(guò)PCR確認(rèn)在氯霉素抗性基因的基礎(chǔ)上鑒定的突變體中caW基因的缺失。獲得的缺陷菌抹被稱(chēng)為WC196AcadA::att-cat菌抹。然后，為了除去已經(jīng)被導(dǎo)入cflW基因的a"-c^基因，使用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts(特開(kāi)2005-058827)。pMW-intxis-ts攜帶編碼整合酶(Int)的基因和編碼九噬菌體的切除酶(excisionase)(Xis)的基因，并且是溫度敏感性可復(fù)制的。按常規(guī)方式制備以上獲得的WC196AcadA::att-cat菌抹的感受態(tài)細(xì)胞，用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts轉(zhuǎn)化，在含有50mg/L氨千青霉素的L-瓊脂培養(yǎng)基上在30。C作為平板培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，并選擇氨千青霉素抗性菌抹。然后，為了除去pMW-intxis-ts質(zhì)粒，選擇的菌抹在42。C在L-瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)兩次，并檢查獲得的菌落的氨千青霉素抗性和氯霉素抗性來(lái)獲得沒(méi)有att-cat和pMW-intxis-ts的氯霉素和氨芐青霉素敏感性的破壞cadA的菌抹。這個(gè)菌抹被稱(chēng)為WC196AcadA。(2)從WC196AcadA菌株缺失WcC基因根據(jù)上述方法使用SEQIDNO:13和14的引物作為用于破壞WcC的引物來(lái)從WC196AcadA菌抹缺失WcC基因。從而獲得破壞ca^4和WcC的菌抹WC196AcadAAldcC。用攜帶dap丄dapS和/j^C基因以用于生產(chǎn)Lys的質(zhì)粒pCABD2(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO01/53459)按常規(guī)方式轉(zhuǎn)化WC196AcadAAldcC菌抹來(lái)獲得WC196AcadAAldcC/pCABD2菌抹(WC196LC/pCABD2)。實(shí)施例5:使用大腸桿菌生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸這個(gè)實(shí)施例顯示了應(yīng)用來(lái)通過(guò)大腸桿菌生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的本發(fā)明的實(shí)施例。在這個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸而不添加硫酸銨和氯化銨，它們一般被添加到培養(yǎng)基目的是在L-賴(lài)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中提供氮和L-賴(lài)氨酸的反荷離子。具體地，進(jìn)行培養(yǎng)，不控制pH值，但控制培養(yǎng)基中的氨濃度。預(yù)先檢查培養(yǎng)基中氨濃度應(yīng)當(dāng)控制的范圍。結(jié)果，確認(rèn)了總氨濃度優(yōu)選在50到100mM的范圍內(nèi)。因此，在實(shí)際的主培養(yǎng)(mainculture)中，通過(guò)氨氣鼓泡將總氨濃度控制為100mM或更低。此外，當(dāng)總氨濃度降低到50mM時(shí)，用氨氣控制來(lái)維持該濃度。將WC196AcadAAldcC/pCABD2用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)。使用置于釜式發(fā)酵器中的表3中所示用于大腸桿菌的300ml的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基。通過(guò)氨氣鼓泡將總氨濃度調(diào)節(jié)到95mM。通過(guò)在含有20昭/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基的完整表面上涂布生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌抹，并將它在37。C培養(yǎng)24小時(shí)獲得的細(xì)胞，接種到這個(gè)培養(yǎng)基中。接種的細(xì)胞的量相應(yīng)于在三個(gè)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)基的溫度維持在37°C、過(guò)濾滅菌的空氣每分鐘50ml的通氣、700rpm的攪拌速度，進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中溶解氧濃度降低到20%飽和度時(shí)，通氣速度變?yōu)?00mL每分鐘。表4中所示的大腸桿菌的補(bǔ)料溶液適當(dāng)?shù)刂鸬翁砑拥脚囵B(yǎng)基中，使得葡萄糖不被耗盡，而且在培養(yǎng)基中其濃度不變?yōu)?0g/L或更高。最后，當(dāng)消耗了36g葡萄糖時(shí)，終止培養(yǎng)。結(jié)果，可以順利地進(jìn)行培養(yǎng)，從而在33小時(shí)后所有添加的葡萄糖被消耗，積累了13.4g的L-賴(lài)氨酸，L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)速率(productionrate)是1.2g/L/hr。這種生產(chǎn)的得率(yield)是37。/。。作為對(duì)照，顯示了用相同菌抹通過(guò)添加硫酸銨而不是控制總氨濃度，但控制pH值，類(lèi)似于堿性氨基酸的常見(jiàn)生產(chǎn)方法而進(jìn)行的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的結(jié)果。按類(lèi)似方式將相同菌抹接種到培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基由添加了13g/L硫酸銨的表3中所示用于大腸桿菌的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基組成，通過(guò)適當(dāng)?shù)陌睔夤呐輰H值控制恒定在6.7的同時(shí)來(lái)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度、通氣速度和攪拌速度與上述的那些情況相同。在這種情況下，加入添加有112.5g/L硫酸銨的用于大腸桿菌的補(bǔ)料溶液(含有硫酸銨，表5)代替表4所示用于大腸桿菌的補(bǔ)料溶液，使得葡萄糖不被耗盡，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度不應(yīng)變?yōu)?0g/L或更高，最后消耗了36g葡萄糖。結(jié)果，在33小時(shí)后所有添加的葡萄糖被消耗，積累了14.7g的L-賴(lài)氨酸，L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)率是1.3g/L/hr。這種生產(chǎn)的得率是40%。所有如上所述的賴(lài)氨酸濃度按照賴(lài)氨酸鹽酸鹽來(lái)顯示。此外，培養(yǎng)期間總氨濃度和pH值隨時(shí)間的變化在圖4中示出。根據(jù)這些結(jié)果的比較，確認(rèn)的是，當(dāng)使用本發(fā)明的方法時(shí)，與添加硫酸銨的常見(jiàn)發(fā)酵生產(chǎn)中獲得的情況相比，可以以約92%的生產(chǎn)速率、約93%的得率和約91%的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)量進(jìn)行L-賴(lài)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)而不添加硫酸銨或氯化銨。表3:用于大腸桿菌的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基的成分(每1L)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>將葡萄糖和FeSCV7H20稱(chēng)重作為部分A，將其他成分稱(chēng)重作為部分B，并將部分A按照原樣，將部分B調(diào)節(jié)到pH5.0,通過(guò)高壓蒸鍋在115。C單獨(dú)滅菌10分鐘，然后混合。將20pg/L的鏈霉素在使用前添加到培養(yǎng)基中。表4:用于大腸桿菌的補(bǔ)料溶液的成分(每1L)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>成分通過(guò)高壓蒸鍋在12(TC滅菌20分鐘。將20pg/L鏈霉素在使用前添加到培養(yǎng)基中。表5:含有硫酸銨的用于大腸桿菌的補(bǔ)料溶液的成分(每1L)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>成分通過(guò)高壓蒸鍋在12(TC滅菌20分鐘。將20(ig/L鏈霉素在使用前添加到培養(yǎng)基中。實(shí)施例6:L-精氨酸的生產(chǎn)這個(gè)實(shí)施例顯示了應(yīng)用來(lái)通過(guò)棒狀桿菌型細(xì)菌生產(chǎn)L-精氨酸的本發(fā)明的實(shí)施例。將谷氨酸棒桿菌AJ12092(FERMBP-6906)用作生產(chǎn)L-精氨酸的菌株。首先，作為對(duì)照，顯示了用相同菌抹通過(guò)添加硫酸銨不控制總氨濃度，但控制pH值，類(lèi)似于堿性氨基酸的常見(jiàn)生產(chǎn)方法而進(jìn)行的L-精氨酸生產(chǎn)的結(jié)果。具有表6所示成分的用于L-精氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基，添加了65g/L硫酸銨，并且，葡萄糖濃度變?yōu)?0g/L。將300ml這種培養(yǎng)基置于釜式發(fā)酵器中，并通過(guò)氨氣鼓泡將pH值控制為7.0。通過(guò)在CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基的全表面上涂布谷氨酸棒桿菌AJ12092菌林，31.5。C培養(yǎng)24小時(shí)獲得的兩個(gè)平板的細(xì)胞接種到這個(gè)培養(yǎng)基中。在維持31.5。C的培養(yǎng)基溫度，以過(guò)濾滅菌空氣的150ml每分鐘通氣和700rpm速度的攪拌進(jìn)行培養(yǎng)。此外，在培養(yǎng)期間，通過(guò)添加已經(jīng)單獨(dú)滅菌的6NK0H溶液將pH值控制為6.9。隨著培養(yǎng)的進(jìn)展，葡萄糖濃度降低。為了維持葡萄糖濃度在30到40g/L，適當(dāng)?shù)靥砑訂为?dú)滅菌的692g/L葡萄糖溶液。培養(yǎng)進(jìn)行54小時(shí)。結(jié)果，積累了23.4g/L的L-精氨酸，L-精氨酸的產(chǎn)物得率是消耗的葡萄糖的26.7%,生產(chǎn)速率是0.43g/L/hr。在培養(yǎng)期間消耗的葡萄糖數(shù)量是每個(gè)分批29.1g。然后不向培養(yǎng)基添加硫酸銨，同時(shí)僅控制總氨濃度但不控制pH值，進(jìn)行L-精氨酸的生產(chǎn)。以下顯示了結(jié)果。將300ml具有表6所示成分但不含有硫酸銨的L-精氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基置于釜式發(fā)酵器中，通過(guò)氨氣鼓泡將總氨濃度調(diào)節(jié)到12.6mM。將以與對(duì)照相同的方式培養(yǎng)的生產(chǎn)L-精氨酸的菌抹的兩個(gè)平板的細(xì)胞接種到這個(gè)培養(yǎng)基中。按照與對(duì)照相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)，并維持溫度在31.5。C、150ml每分鐘過(guò)濾滅菌空氣的通氣，及維持?jǐn)嚢杷俣仍?00rpm。通過(guò)周期性地對(duì)培養(yǎng)基采樣并測(cè)量培養(yǎng)基的總氨濃度或使用氨濃度控制裝置，控制培養(yǎng)基中的總氨，從而在培養(yǎng)期間它處在各種水平。結(jié)果，證實(shí)了根據(jù)需要通過(guò)添加氨氣控制培養(yǎng)基中總氨濃度為約20mM提供了有利的結(jié)果?；谏鲜鼋Y(jié)果控制培養(yǎng)基中總氨濃度為約20mM進(jìn)行的培養(yǎng)順利地進(jìn)行，在51小時(shí)后積累了24.2g/L的L-精氨酸，因而完成了L-精氨酸發(fā)酵。培養(yǎng)期間消耗的葡萄糖是每個(gè)分批35.1g，L-精氨酸的產(chǎn)物得率是消耗的葡萄糖的20.6%,生產(chǎn)速率是0.47g/L/hr。此外，培養(yǎng)基的pH值從開(kāi)始時(shí)的7.92提高到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的8.02。根據(jù)這些結(jié)果與對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的比較，證實(shí)了與添加硫酸銨的常見(jiàn)發(fā)酵生產(chǎn)中獲得的情況相比，不添加硫酸銨或氯化銨可以以約77%的收率和高出約9。/。的生產(chǎn)速率進(jìn)行L-精氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。表6:L-精氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基的成分(每1L)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>用氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基到pH7.0,直至1L，通過(guò)高壓蒸鍋在115。C滅菌10分鐘。序列表的說(shuō)明SEQIDNO:l:用于克隆基因的引物序列SEQIDNO:2:用于克隆/，C基因的引物序列SEQIDNO:3:用于克隆基因的引物序列SEQIDNO:4:用于克隆/，￡基因的引物序列SEQIDNO:5:(ycC^基因的核香酸序列和抑制作用脫敏的天冬氨酸激酶的a-亞基的氨基酸序列SEQIDNO:6:抑制作用脫敏的天冬氨酸激酶的a-亞基的氨基酸序列SEQIDNO:7:(ycC^基因的核苦酸序列和抑制作用脫敏的天冬氨酸激酶的(3-亞基的氨基酸序列SEQIDNO8:抑制作用脫敏的天冬氨酸激酶的p-亞基的氨基酸序列SEQIDNO9:lysE基因的核苦酸序列和LysE蛋白的氨基酸序列SEGIDNO10:LysE蛋白的氨基酸序列SEQIDNO11:用于破壞caW基因的引物SEQIDNO12:用于破壞caW基因的引物SEQIDNO13:用于破壞Wc基因的引物SEQIDNO14:用于破壞Wc基因的引物SEQIDNO15:基因的核苦酸序列和賴(lài)氨酸脫羧酶的氨基酸序列SEQIDNO16:賴(lài)氨酸脫羧酶(cadA)的氨基酸序列SEGIDNO17:基因的核苷酸序列和賴(lài)氨酸脫羧酶的氨基酸序列SEQIDNO16:賴(lài)氨酸脫羧酶(ldc)的氨基酸序列工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)甚至在高pH值下發(fā)酵可以產(chǎn)生堿性物質(zhì)，其允許降低工業(yè)原料例如硫酸銨的量，而不明顯地降低常規(guī)的普通培養(yǎng)方法原本的性能，例如生產(chǎn)力。雖然通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的發(fā)酵液含有碳酸根離子和/或碳酸氫根離子，這些通過(guò)加熱容易地逸出到空氣中，因而可以獲得具有作為固體出現(xiàn)的大量堿性物質(zhì)的發(fā)酵液或發(fā)酵產(chǎn)物。此外，當(dāng)需要純化時(shí)，如果將比碳酸更強(qiáng)的酸添加到發(fā)酵液，可以容易地用更強(qiáng)的酸取代碳酸鹽而不用進(jìn)行常規(guī)生產(chǎn)方法中通常進(jìn)行的離子交換。此外，賴(lài)氨酸鹽酸鹽的晶體可以通過(guò)濃縮發(fā)酵液直接獲得。權(quán)利要求1.一種通過(guò)發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的能力的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性物質(zhì)，其中在培養(yǎng)過(guò)程的總時(shí)期的至少一部分期間通過(guò)將所述培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，來(lái)降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述總氨濃度的特定濃度范圍是滿足以下條件的范圍(A)所述培養(yǎng)基中銨離子的濃度是這樣的水平，使得溶于所述培養(yǎng)基中的碳酸氬根離子和/或碳酸根離子以及其他陰離子的離子當(dāng)量的總和大于所述培養(yǎng)基中積累的所述堿性物質(zhì)中電離的所述堿性物質(zhì)的離子當(dāng)量，以及(B)所述培養(yǎng)基中所述總氨濃度是不抑制所述微生物的堿性物質(zhì)生產(chǎn)的水平，其是如下預(yù)先確定的在具有不同pH值和不同總氨濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，測(cè)量每個(gè)pH值和每個(gè)總氨濃度下的所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，確定各個(gè)pH值條件下提供最佳條件下的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的50%或更高的堿性物質(zhì)生產(chǎn)力的總氨濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述總氨濃度的特定范圍是如下預(yù)先測(cè)定的(A，)在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有其量足以在pH7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的反荷離子的來(lái)源，通過(guò)添加氨氣、氨水和尿素的至少一種來(lái)將所述培養(yǎng)基的pH值維持在6.5到7.2之間的范圍內(nèi)，并測(cè)量所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力，(B，)在與步驟(A，)中使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中開(kāi)始培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基成分的硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量，在一定時(shí)期內(nèi)用不同的總氨濃度繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在所述時(shí)期內(nèi)由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累引起的作為堿性物質(zhì)反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的不足，維持所述培養(yǎng)基的pH值到7.2或更低變得不可能，以根據(jù)步驟(A，)中測(cè)量的生產(chǎn)力來(lái)確定提供了50%或更高生產(chǎn)力的總氨濃度范圍。4.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述總時(shí)期的至少一部分包括下列中的至少一個(gè)由于所述目標(biāo)堿性物質(zhì)的積累51起的反荷離子的不足而使所述培養(yǎng)基的pH值提高的時(shí)期，和由于向所述培養(yǎng)基添加陽(yáng)離子而使所述pH值提高的時(shí)期。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)根據(jù)如下指標(biāo)所測(cè)定的所述微生物的活性降低或停止時(shí)，通過(guò)向所述培養(yǎng)基添加氨或尿素來(lái)調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的總氨濃度，所述指標(biāo)是所述培養(yǎng)基中溶解的氧濃度、所述培養(yǎng)基中碳源的消耗率、所述培養(yǎng)基的混濁度、所述堿性物質(zhì)的生產(chǎn)力、和所述培養(yǎng)基中的pH值變化。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將與含有其量足以在pH值7.2或更低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的硫酸根離子和/或氯離子作為所述堿性物質(zhì)的反荷離子來(lái)源的培養(yǎng)基具有相同組分、只是將硫酸根離子和/或氯離子降低期望的量的培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，以及所述總時(shí)期的至少一部分是一個(gè)時(shí)期，在所述時(shí)期中由于所述培養(yǎng)基中積累的堿性物質(zhì)引起的反荷離子不足，所述培養(yǎng)基的pH值不能被維持在7.2或更低。7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述其他陰離子選自硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子和電離的有機(jī)酸。8.根據(jù)權(quán)利要求2或7的方法，其中所述其他陰離子的總量是卯0m叫/1或更低。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述總氨濃度被調(diào)節(jié)到200mM或更4氐。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括增殖所述微生物的步驟。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中在增殖所述微生物的所述步驟期間不調(diào)節(jié)所述總氨濃度。—12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述堿性物質(zhì)選自L-賴(lài)氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述堿性物質(zhì)是L-賴(lài)氨酸。14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述堿性物質(zhì)是L-精氨酸。15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基或其處理物在發(fā)酵之后被加熱以除去碳酸氫根離子和碳酸根離子。16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌。17.含有堿性物質(zhì)的發(fā)酵液或發(fā)酵產(chǎn)物，其可以通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求l5的方法獲得。全文摘要本發(fā)明提供一種通過(guò)發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)堿性物質(zhì)的方法，包括在發(fā)酵罐中含有的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述堿性物質(zhì)的能力的微生物，從而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累所述堿性物質(zhì)，其中在培養(yǎng)過(guò)程的總時(shí)期的至少一部分期間通過(guò)將所述培養(yǎng)基中總氨濃度調(diào)節(jié)到特定濃度范圍之內(nèi)，來(lái)降低用作所述堿性物質(zhì)的反荷離子的硫酸根離子和/或氯離子的量。文檔編號(hào)C12N1/00GK101111602SQ20058003439公開(kāi)日2008年1月23日申請(qǐng)日期2005年10月7日優(yōu)先權(quán)日2004年10月7日發(fā)明者杉本慎一,竹下亮申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社