專利名稱：：呈現(xiàn)出增加表達(dá)的修飾型木聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及增加表達(dá)的木聚糖酶，更具體是涉及自宿主中增加表達(dá)和分泌木聚糖酶。
背景技術(shù)：
：通過(guò)許多種絲狀真菌(filamentousfungi)和細(xì)菌生產(chǎn)的木聚糖酶，是具有廣泛商業(yè)用途的一組酶。木聚糖酶主要的用途是在生產(chǎn)紙張中用于生物漂白紙漿。另外，木聚糖酶已經(jīng)用作果汁和果酒中的澄清劑、用作精密裝置和半導(dǎo)體洗滌劑中的酶促試劑，以及它們也用于改進(jìn)禽類和豬飼料的可消化性。工業(yè)應(yīng)用上使用最多的木聚糖酶是在生物化學(xué)和生物物理學(xué)性質(zhì)上顯示多樣性的家族11木聚糖酶。例如，已經(jīng)從細(xì)菌(US6,667,170)、真菌(US6,635,464)或其它極端嗜熱生物中分離了耐熱的木聚糖酶(Luthi等，1990；Winterhalter等，1995；Simpson等，1991)?；蛘?，通過(guò)蛋白質(zhì)工程已經(jīng)確定木聚糖酶用于各種工業(yè)應(yīng)用的最佳性能(如U.S.5,759,840；U.S.5,866,408；U.S.5,405,769；以及Turunen等，2001)。木聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用中的有效實(shí)施，需要從能在深層發(fā)酵期間將木聚糖酶分泌到培養(yǎng)肉湯中的宿主微生物進(jìn)行經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。這尤其是從嗜熱生物或極端嗜熱生物中大規(guī)模生產(chǎn)木聚糖酶所必需的，其中所述的生物難以進(jìn)行培養(yǎng)或不能充分分泌高水平的蛋白質(zhì)。通常，用于生產(chǎn)工業(yè)酶的宿主微生物是絲狀真菌，例如木霉菌(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)或鐮孢菌(Fusarium)，放線菌(actinomycete)例如鏈霉菌(Streptomyces)或桿菌屬(Bacillusbacteria)。這表示編碼目標(biāo)木聚糖酶的基因，無(wú)論是從不同生物體分離的或是從宿主生物體的木聚糖酶基因經(jīng)蛋白質(zhì)工程構(gòu)建的，都必須以基因可操縱地連接于能促進(jìn)其從宿主表達(dá)和分泌的DNA序列的方式克隆入生產(chǎn)宿主。通過(guò)遺傳修飾工業(yè)菌株里氏木霉(T.reesei)來(lái)表達(dá)和分泌外源蛋白質(zhì)已經(jīng)持續(xù)多年的顯著爭(zhēng)議(Conesa等，2001)。在里氏木霉中異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，可引起在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中由未折疊的或錯(cuò)誤折疊的新生多肽的累積而引起的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR；Saloheimo等，1999)。由于來(lái)自里氏木霉的家族11木聚糖酶的折疊和分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制的現(xiàn)有信息是有限的，已經(jīng)實(shí)施一些策略來(lái)促進(jìn)相關(guān)的外源木聚糖酶在里氏木霉宿主菌株中的高水平表達(dá)。這些策略包括使用高度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如里氏木霉纖維素酶基因的啟動(dòng)子，以及用包含高度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的木聚糖酶表達(dá)構(gòu)建體來(lái)替換天然纖維素酶基因。從里氏木霉表達(dá)細(xì)菌木聚糖酶，需要用完整的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(例如里氏木霉甘露聚糖酶I或CBHII蛋白的催化核心或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)將木聚糖酶融合到載體里氏木霉多肽(Paloheimo等，2003)。在US6,635,464和US6,667,170中公開(kāi)了這一策略，或者其與缺失一個(gè)或多個(gè)來(lái)自宿主里氏木霉菌株的纖維素酶基因(組)組合，由此來(lái)指導(dǎo)從細(xì)菌(A.flexuosa)和真菌(C.thermophilus)來(lái)源表達(dá)耐熱的家族11木聚糖酶。盡管載體多肽的確增加了US6,635,464和US6,667,170中所公開(kāi)的異源木聚糖酶從里氏木霉宿主菌株的生產(chǎn)和分泌，但載體多肽附著于木聚糖酶以用于工業(yè)用途并不總是理想的。這樣的話，需要在融合蛋白分泌到培養(yǎng)肉湯之后并在其用于應(yīng)用之前通過(guò)蛋白水解作用來(lái)除去載體多肽。然而，由于蛋白水解步驟所需要的成本和溫育時(shí)間以及在水解除去載體多肽期間目的木聚糖酶的可能產(chǎn)量損失，蛋白水解增加了目的木聚糖酶總產(chǎn)量的時(shí)間和成本。這些使用了將目的蛋白融合到宿主細(xì)胞天然的載體蛋白的策略也已經(jīng)得以成功應(yīng)用，來(lái)提供哺乳動(dòng)物凝乳酶從曲霉的生產(chǎn)和分泌(VandenBrink等，WO02/36752和WO03/106484)。WO03/106484公開(kāi)了通過(guò)將N-糖基化基序引入到凝乳酶和葡糖淀粉酶融合配偶體之間的人工接頭多肽內(nèi)部或凝乳酶肽序列內(nèi)部，來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)從曲霉生產(chǎn)和分泌葡糖淀粉酶-凝乳酶融合蛋白。然而，很難證實(shí)通過(guò)將糖基化基序引入未包含融合配偶體的構(gòu)建體而從曲霉生產(chǎn)凝乳酶的效益。Sagt等人(2000)報(bào)導(dǎo)通過(guò)將N-糖基化基序引入目的蛋白內(nèi)部可改進(jìn)從異源真核宿主分泌目的蛋白。在這些報(bào)導(dǎo)中，將N-糖基化位點(diǎn)引入狂犬病突變型序列或真菌角質(zhì)酶(cutinase)序列或當(dāng)?shù)伛橊効贵w片段序列中，導(dǎo)致增加目的蛋白從畢赤酵母(Pichiayeast)宿主的分泌。然而，將糖基化位點(diǎn)引入天然真菌角質(zhì)酶并不導(dǎo)致異源酵母宿主的任何表達(dá)增加。WO02/02597報(bào)導(dǎo)包含糖基化位點(diǎn)的FSH-α亞基和葡糖腦苷脂酶多肽的生成。這些研究目的在于改進(jìn)這些多肽的穩(wěn)定性和表達(dá)。然而，使用添加編碼N-糖基化基序的短核苷酸序列而不是通過(guò)指導(dǎo)一級(jí)肽序列的修飾，來(lái)僅僅證明該方法的實(shí)用性。本發(fā)明目的是提供增加表達(dá)的修飾型木聚糖酶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及增加表達(dá)的木聚糖酶，更具體是涉及從宿主增加表達(dá)和分泌木聚糖酶。本發(fā)明提供一種修飾型家族11木聚糖酶，其包含引入功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)(functionalconsensusN-glycosylationsite)的序列，其中所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。修飾型家族11木聚糖酶包含將選自位置34(X34N)、位置131(X131N)、位置180(X180N)、位置182(X182N)及其組合的位置替換成天冬酰胺的氨基酸取代，所述位置通過(guò)將家族11木聚糖酶與如SEQIDNO1中所示的里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶II的氨基酸序列進(jìn)行序列對(duì)比而確定。本發(fā)明也涉及如上所述的修飾型家族11木聚糖酶，其還包含將選自位置36(X34N-S36T)、位置182(X180N-S182T)、位置184(X182N-S184T)及其組合的位置替換成蘇氨酸的氨基酸取代。優(yōu)選地，修飾型家族11木聚糖酶包含X131N突變體。還提供了選自下列的修飾型家族11木聚糖酶ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITXS′、Xln1-131N以及變鉛青鏈霉菌(S.lividans)xlnC-131N。本發(fā)明公開(kāi)了如上所述的修飾型家族11木聚糖酶，其中當(dāng)在里氏木霉宿主菌株中表達(dá)時(shí)，與自其衍生出所述修飾型木聚糖酶的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。本發(fā)明還提供了一種修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其包含可操縱地連接于分泌信號(hào)的啟動(dòng)子，分泌信號(hào)可操縱地連接于包含功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)的編碼區(qū)，所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中；當(dāng)與自其衍生出所編碼的修飾型木聚糖酶的所編碼的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所述修飾型木聚糖酶遺傳構(gòu)建體使得所編碼的修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加。此外，本發(fā)明提供包含所述的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體的遺傳修飾的微生物。優(yōu)選地，遺傳修飾的微生物包含木霉屬或肉座菌屬(Hypocrea)的菌株。此外，遺傳修飾的微生物包含屬于木霉屬分泌信號(hào)的分泌信號(hào)，例如木霉屬木聚糖酶分泌信號(hào)。該本發(fā)明還涉及包含編碼區(qū)的遺傳修飾型微生物，其中編碼區(qū)編碼選自下列的修飾型木聚糖酶ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITX5′、Xln1-131N以及變鉛青鏈霉菌(S.lividans)xlnC-131N。本發(fā)明提供加工食物或飼料的方法，包括用包含修飾型家族11木聚糖酶的添加劑來(lái)處理食物或飼料，其中所述的木聚糖酶包含引入了功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)的序列，并且所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。例如，食物或飼料添加劑選自禽類飼料添加劑、豬飼料添加劑、用于烘焙的食品添加劑或用于釀酒的食品添加劑。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)紙漿的方法，包括用修飾型家族11木聚糖酶來(lái)處理紙漿，其中所述的木聚糖酶包含引入功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)的序列，并且所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。本發(fā)明還涉及修飾型木聚糖酶在工業(yè)或食品或飼料加工中的用途，其中所述的木聚糖酶包含引入功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)的序列，并且所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。工業(yè)生產(chǎn)方法可以是生產(chǎn)紙漿。本發(fā)明提供自木霉屬宿主增加表達(dá)和分泌的修飾型家族11木聚糖酶，該酶在生物化學(xué)性質(zhì)上沒(méi)有任何明顯變化。該菌株在特異性木聚糖酶產(chǎn)量和總蛋白生產(chǎn)率的增加結(jié)果，促進(jìn)用于工業(yè)應(yīng)用的家族11木聚糖酶產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。此外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可將N-糖基化位點(diǎn)引入位于家族11肽序列的起點(diǎn)、中間或末端的具有保守序列同源性的區(qū)域?？稍谀揪厶敲傅墓倌軋F(tuán)上實(shí)現(xiàn)這種引入，并且沒(méi)有任何副作用。發(fā)明概述并不必描述本發(fā)明的所有特征。附圖簡(jiǎn)述通過(guò)后面的描述并參照下列附圖，可更加清楚本發(fā)明的這些和其它特征，附圖中圖1顯示從N末端編序的家族11木聚糖酶的氨基酸序列的比對(duì)，其中Bp-短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)(SEQIDNO31)；Ca-丙酮丁醇棱菌(Clostridiumacetobutylicum)P262xynB(SEQIDNO33)；Cs-糞堆梭菌(Clostridiumstercorarium)xynA(SEQIDNO34)；Rf-產(chǎn)黃瘤胃球菌屬(Ruminococcusflavefaciens)(SEQIDNO35)；Tr2-里氏木霉屬(Trichodermareesei)xyn2(SEQIDNO1)；Tv-綠木霉屬(Trichodermaviride)(SEQIDNO42)；Th-哈茨木霉屬(Trichodermaharzianum)(SEQIDNO41)；Sc-裂褶菌屬(Schizophyllumcommune)xynA(SEQIDNO36)；An-黑曲霉(Aspergillusniger)awamori變種(SEQIDNO42)；Ak-川地曲霉(Aspergilluskawachii)XynC(SEQIDNO43)；At-塔賓曲霉(Aspergillustubigensis)(SEQIDNO29)；Trl-里氏木霉(Trichodermareesei)xynl(SEQIDNO2)；Aa-泡盛曲霉kawachi變種(Aspergillusawamorovar.kawachi)XynB(SEQIDNO28)；Fs-產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)XynII(SEQIDNO44)；Ss-鏈霉菌屬(Streptomycessp.)36a(SEQIDNO37)；S1B-變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)xynB(SEQIDNO38)；S1B-變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)xynC(SEQIDNO39)；T1-疏綿狀嗜熱霉菌(Thermomyceslanuginosus)Xyn(SEQIDNO45)；Tf-褐色熱單孢菌(Thermomonosporafusca)TfxA(SEQIDNO40)；Bc-環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)(SEQIDNO30)；Bs-枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)(SEQIDNO32)。圖2顯示用于指導(dǎo)修飾型木聚糖酶在里氏木霉中表達(dá)的載體pC/XHML-TV圖。圖3顯示遺傳誘變載體pALT-H(I)TXn圖，其中“n”是描述符，例如“13”或“18”，載體包含131N突變體(即pALT-ITXn)或者載體不包含131N突變體(即pALT-HTXn)例如當(dāng)“n”是18并且載體不包含131N突變體時(shí)，載體是pALT-HTX18。圖4顯示用于指導(dǎo)修飾型木聚糖酶在里氏木霉中表達(dá)的遺傳誘變載體pc/xH(I)TXn-TV的圖，其中“n”是描述符，例如“13”、“18”、“18(R135Y)”或“1(N131Q)”，載體包含131N突變體(即pc/xITXn-TV)或者載體不包含131N突變體(即pc/xHTXn-TV)例如當(dāng)″n″是18并且載體不包含131N突變體時(shí)，載體是pc/XITXn-TV。圖5顯示用于指導(dǎo)天然的(和修飾的)里氏木霉木聚糖酶I和變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C分別在里氏木霉中表達(dá)的載體圖。圖5Apc/xxynl-(T118n)-TV；圖5Bpc/xxylc-(T128N)-TV。圖6顯示修飾型木聚糖酶ITX1及其天然的對(duì)應(yīng)物HTX18的pH活性特征。圖7顯示修飾型木聚糖酶ITX1及其天然的對(duì)應(yīng)物HTX18的溫度活性特征。優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及具有增加表達(dá)的木聚糖酶，更具體是涉及自宿主中增加表達(dá)和分泌木聚糖酶。以下描述了優(yōu)選的實(shí)施方案。如本文概括的，木聚糖酶和修飾型木聚糖酶，可用于漂白紙漿的目的或其它通常需要在溫度和pH的活性超過(guò)野生型酶的其它應(yīng)用。為了生物漂白紙漿，優(yōu)選的木聚糖酶是來(lái)自被列入家族11中的木聚糖酶(參見(jiàn)表1)。通過(guò)許多種絲狀真菌和細(xì)菌生產(chǎn)的木聚糖酶，主要根據(jù)結(jié)構(gòu)和機(jī)制相似性可被分為兩種家族家族10或家族11(Henrissat，1991)。家族11木聚糖酶是相對(duì)低分子量(約20kDa和約200氨基酸殘基)的一組小酶。里氏木霉分泌的家族11木聚糖酶并不是糖基化的，這與木聚糖酶I氨基酸序列中共有序列的N-糖基化基序的缺失是一致的(Trrnen等，1992)。然而，盡管在其序列中存在兩種N-糖基化共有基序(consensusmotif)，但木聚糖酶II也不是糖基化的。相反，里氏木霉纖維素酶在共有基序Asn-Xaa-Ser/Thr內(nèi)的天冬酰胺殘基處發(fā)生N-糖基化，其中Xaa是除了脯氨酸的任何氨基酸(或-X-S/T，其中X是除了脯氨酸的任何氨基酸)。然而，并不是各種纖維素酶內(nèi)部所有的可能位點(diǎn)都是糖基化的(Hui等，2001年和2002年)。這提示木霉屬生物體并不識(shí)別天然氨基酸序列中的一些共有基序。本發(fā)明提供修飾型家族11木聚糖酶，其包含糖基化序列或基序，例如但不限于Asn-Xaa-Ser/Thr、Asn-Xaa-Thr、或Asn-Xaa-Ser，所述糖基化序列或基序不存在于自其可制備或衍生出所述修飾型木聚糖酶的對(duì)應(yīng)木聚糖酶中。此外，本發(fā)明提供具有將一個(gè)或多個(gè)選自位置34、131、180和182的氨基酸取代為天冬酰胺(Asn或N)的修飾型家族11木聚糖酶，其中所述位置通過(guò)將家族11木聚糖酶與SEQIDNO1所示的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的序列進(jìn)行對(duì)比而確定。所述的取代可以是X34N、X131N、X180N或X182N，其中氨基酸“X”在指定位置被天冬酰胺或″N″取代。例如，X131N表示位置131(根據(jù)家族11木聚糖酶與SEQIDNO1所示的里氏木霉木聚糖酶II(TrXII)氨基酸序列的序列對(duì)比而確定)的氨基酸“X”由天冬酰胺或“N”取代。優(yōu)選地，突變體在位置131或在另外的家族11木聚糖酶根據(jù)與TrXII(SEQIDNO1)序列對(duì)比而確定的對(duì)應(yīng)位置，產(chǎn)生X131N。研究者已經(jīng)觀測(cè)到包含一個(gè)或多個(gè)突變例如X131N取代的修飾型木聚糖酶，與產(chǎn)生或衍生修飾型木聚糖酶的家族11木聚糖酶相比，可顯示提高的表達(dá)效率。包含X34N、X131N、X180N或X182N突變的構(gòu)建體實(shí)例，分別包含ITX5和ITX5′、ITX1和ITX2、ITX3和ITX3′、ITX4和ITX4′。另外的突變例如X34N-S36T、X180N-S182T以及X182N-S184T，也可被引入家族11木聚糖酶來(lái)生產(chǎn)共有序列Asn-Xaa-Thr，從而確保Thr位于木聚糖酶內(nèi)部的天冬酰胺上游。包含X34N和S36T、X180N和S182T、或X182N和S184T突變的構(gòu)建體實(shí)例，分別包含ITX5′、ITX3′、以及ITX4′。本發(fā)明修飾型木聚糖酶可衍生于任何家族11木聚糖酶，例如衍生于天然木霉屬的木聚糖酶，包括但不限于里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶I、綠木霉木聚糖酶；或衍生于曲霉、鐮孢菌、放線菌(actinomycete)的木聚糖酶；或衍生于鏈霉菌屬的木聚糖酶，例如但不限于變鉛青鏈霉菌木聚糖酶B和變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C；或衍生于芽孢桿菌(Bacillus)、嗜熱放線菌(Thermobifida)、馬杜拉放線菌(Actinamadura)、毛殼菌(Chaetomium)或Thermatoga的木聚糖酶。通過(guò)比較里氏木霉木聚糖酶II序列(TrX-II；SEQIDNO1)而確定的，在位置131引入等價(jià)突變的里氏木霉木聚糖酶I(TrXI)的修飾，需要在TrX-I的位置118的突變(即突變T118N)。在這種情況下，具有T118N取代的里氏木霉木聚糖酶I，包含如TrXII中所示X131N的等價(jià)突變(參見(jiàn)圖1“Tr1”和“Tr2”的比對(duì)結(jié)果)。同樣地，通過(guò)比較TrX-11序列而確定的，在位置131引入等價(jià)突變的變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C的修飾，需要在變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C的位置128的突變(即突變T128N)。在這種情況下，在變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C中的木聚糖酶T128N，包含如TrXII中所示X131N的等價(jià)突變(參見(jiàn)圖1“S1C”和“Tr2”的比對(duì)結(jié)果)。根據(jù)術(shù)語(yǔ)“木聚糖酶”，指的是將木聚糖水解成木糖的酶。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，木聚糖酶可具有不同的性質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)(分子量、三維取向、氨基酸組成以及活性部位)和催化活性(木聚糖水解的速率和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，以及能作用于其它底物)。本發(fā)明修飾木聚糖酶可衍生于天然的或野生型木聚糖酶，或者可衍生于已經(jīng)發(fā)生改變的木聚糖酶，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法例如定點(diǎn)誘變、化學(xué)誘變或等價(jià)方法，對(duì)所述的木聚糖酶進(jìn)行誘變處理和選擇或進(jìn)行遺傳工程構(gòu)建，來(lái)改變其pH性質(zhì)、溫度特性、底物特異性或其組合。所述發(fā)生變化的木聚糖酶實(shí)例包括本文所公開(kāi)的實(shí)例，例如但不限于HTX18和HTX18-R135Y。發(fā)生改變的或遺傳工程構(gòu)建的、也可如本文所述進(jìn)行進(jìn)一步修飾的木聚糖酶的額外實(shí)例，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)例，例如包括但不限于在WO00/29587、WO01/92487和WO03/046169(在此引用作為參考)中公開(kāi)的實(shí)例，以及包括但不限于TrX-DS1、TrX-162H-DS1、TrX-162H-DS2、TrX-162H-DS4、TrX-162H-DS8、TrX-75A、TrX-HML-105H、TrX-HML-75A-105H、TrX-HML-75C-105R、TrX-HML-75G-105R、TrX-HML-75G-105R-125A-129E、TrX-HML-75G-105H-125A-129E、TrX-HML-75A-105H-125A-129E、TrX-HML-75A-105R-125A-129E、TrX-157D-161R-162H-165H、TrX-HML-AHAE、TrX-HML-AHAE-R、TrX-HML-AHAE-RR、TrX-HML-AHAE-RRR、TrX-HML-AHA-RR-DRHH、TrX-HML-AHAE-RR-DRHH、TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH、TrX-116G、TrX-118C、TrX-HML-AHCAE-R、TrX-H-11D-ML-AHGAE-RR、TrX-HML-AHGAE-R、TrX-H-11D-ML-AHGCAE-RR、TrX-H-11D-ML-AHCAE-RR。天然木聚糖酶或野生型木聚糖酶是未發(fā)生自然過(guò)程以外的修飾或改變的木聚糖酶。天然木聚糖酶可包含天然發(fā)生的突變?！袄锸夏久鼓揪厶敲窱I的序列比對(duì)”或“TrX編號(hào)”，指的是與基于里氏木霉木聚糖酶II(也稱為TrXII；參見(jiàn)表1，Tr2；圖1；以及SEQIDNO1)的氨基酸序列的氨基酸位置有關(guān)的編號(hào)。TrXII是家族11木聚糖酶的成員。家族11木聚糖酶顯示明顯的序列相似性程度(參見(jiàn)圖1)，因此，通過(guò)直線對(duì)準(zhǔn)氨基酸來(lái)優(yōu)化木聚糖酶之間的序列相似性和通過(guò)使用TrXII的氨基酸編號(hào)來(lái)作為編號(hào)基礎(chǔ)，可測(cè)定涉及TrXII的其它木聚糖酶內(nèi)部的氨基酸位置。結(jié)構(gòu)研究表明，來(lái)自細(xì)菌和真菌來(lái)源的家族11木聚糖酶共有相同的總體分子結(jié)構(gòu)(如U.S.5,405,769)，即展現(xiàn)三種二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊、卷曲以及α單螺旋。如果木聚糖酶與其它家族11木聚糖酶具有相似性，特別是在作為催化殘基的、位置86和位置177(基于里氏木霉木聚糖酶II(TrXII)的氨基酸編號(hào))的兩個(gè)谷氨酸殘基，那么該木聚糖酶可歸為“家族11木聚糖酶”類型。家族11木聚糖酶包括表1中所列出的酶。優(yōu)選地，木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶I、綠木霉木聚糖酶、變鉛青鏈霉菌木聚糖酶B、變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C，或來(lái)自曲霉、鐮孢菌或桿菌屬的木聚糖酶。表1.來(lái)自細(xì)菌和真菌的典型家族11木聚糖酶當(dāng)與自其制備或衍生出本發(fā)明的修飾型木聚糖酶的木聚糖酶相比，本發(fā)明的修飾型木聚糖酶是通過(guò)遺傳工程化以引入或包含改變的糖基化位點(diǎn)的任何木聚糖酶。所述修飾的非限制性實(shí)例包括X34N、X34N-S36T、X131N、X180N、X180N-S182T、X182N或X182N-S184T(TrX編號(hào))、或其組合。優(yōu)選地，修飾型木聚糖酶是家族11木聚糖酶。本發(fā)明修飾型木聚糖酶包括里氏木霉木聚糖酶I或II，或變鉛青鏈霉菌木聚糖酶B或C。通常認(rèn)為可對(duì)天然木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行加尾，來(lái)改變其生物化學(xué)或生物物理學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明修飾型木聚糖酶實(shí)例包含通過(guò)比較目的木聚糖酶序列與TrXII序列(SEQIDNO1)而確定的X131N突變或其等價(jià)物，以及包括其它修飾，如涉及相應(yīng)天然木聚糖酶的取代或缺失。表2顯示一些并不是用于限制的修飾型木聚糖酶的實(shí)例。位置131的天冬酰胺取代以及在家族11木聚糖酶中是高度保守的位置133的Thr/Ser取代，產(chǎn)生N-糖基化基序形成物Asn-Xaa-Thr/Ser。已經(jīng)觀測(cè)到包含131N突變的木聚糖酶帶來(lái)木聚糖酶的產(chǎn)量增加。并不期望受到理論限制，當(dāng)與沒(méi)有131N修飾的天然木聚糖酶相比，引入N-糖基化基序可使修飾型木聚糖酶提高表達(dá)效率、減少降解、增加分泌或其組合。與對(duì)應(yīng)的天然家族11木聚糖酶相比，修飾型木聚糖酶可顯示提高從里氏木霉宿主菌株中的表達(dá)，并顯示相似的生物化學(xué)和生物物理學(xué)性質(zhì)。也可在木聚糖酶中接近保守Thr/Ser的其它位置制備相似的突變，例如但不限于X34N、X180N和X182N(依次為ITX2、ITX3和ITX4；參見(jiàn)表2)，以便制備Asn-Xaa-Thr/Ser序列。在這些位置的每一個(gè)位置中，氨基酸Ser是保守的，并且折疊蛋白的3-D模型顯示這些位置位于蛋白的外表面上。可獲得的另外修飾包括X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T(依次為ITX5′、ITX3′和ITX4′)來(lái)產(chǎn)生糖基化基序Asn-Xaa-Thr。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚通過(guò)許多方法例如改變木聚糖酶一級(jí)肽序列的定點(diǎn)誘變法或隨機(jī)誘變法，可進(jìn)行氨基酸取代來(lái)制備共有序列N-糖基化基序。任何合適的方法均可用于將X34N、X131N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T突變引入木聚糖酶基因家族。例如，通過(guò)直接取代木聚糖酶一級(jí)序列中的一個(gè)或多個(gè)密碼子而不是加入編碼N-糖基化基序的額外核苷酸，來(lái)引入N-糖基化基序，從而提高宿主的木聚糖酶產(chǎn)量而無(wú)需改變酶的生物物理學(xué)和生物化學(xué)的性能?！爸苯尤〈敝傅氖峭ㄟ^(guò)在木聚糖酶編碼區(qū)內(nèi)部引入特定的核苷酸改變來(lái)引入糖基化位點(diǎn)，從而改變一級(jí)肽序列而無(wú)需由于插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸而改變序列長(zhǎng)度。如實(shí)施例11所示，并參照?qǐng)D5和圖6，包含T131N突變以及具有相似于HTX18(參見(jiàn)表2；ITX1沒(méi)有Y135R突變)的其它突變的ITX1木聚糖酶，具有相似于HTX18木聚糖酶的pH和溫度活性特征。因此，T131N突變的插入不改變木聚糖酶的生物物理學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)。此外，如實(shí)施例9和10的表3和4所示，當(dāng)與HTX18或HTX18(R135Y)相比時(shí)，制備具有提高約73％-100％表達(dá)效率的ITX1酶。表2修飾型木聚糖酶的實(shí)例“表達(dá)效率”是通過(guò)生產(chǎn)宿主而產(chǎn)生的活性酶的量或酶的活性。所有發(fā)酵條件保持恒定時(shí)，計(jì)算發(fā)酵培養(yǎng)物的每單位體積產(chǎn)生的活性酶的量或酶的活性來(lái)作為表達(dá)效率。如果所制備第一種木聚糖酶的水平高于在相同發(fā)酵條件下通過(guò)相同宿主制備的第二種木聚糖酶，那么認(rèn)為第一種木聚糖酶具有高于第二種木聚糖酶的表達(dá)效率。例如，如果與在相同發(fā)酵條件下通過(guò)相同宿主制備的第二種木聚糖酶相比，所制備的第一種木聚糖酶的量增加約40％至約2500％，或高于在此之間的數(shù)值，那么第一種木聚糖酶的表達(dá)效率大于第二種木聚糖酶的表達(dá)效率。例如，與在相同發(fā)酵條件下通過(guò)相同宿主制備的第二種木聚糖酶相比，制備的第一種木聚糖酶的量增加40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1250、1500、1750、2000、2250、或2500％，或在此之間的數(shù)值。優(yōu)選地，與在相同發(fā)酵條件下通過(guò)相同宿主制備的第二種木聚糖酶相比，制備的第一種木聚糖酶的量至少增加50％。“可操縱地連接”指的是特殊序列相互作用，來(lái)直接或間接地實(shí)施預(yù)定功能，例如基因表達(dá)的干涉或調(diào)控。例如，通過(guò)對(duì)可操縱地連接的序列有影響的蛋白來(lái)干涉可操縱地連接的序列的相互作用?！澳揪厶敲富颉敝傅氖前幋a木聚糖酶序列的DNA區(qū)。木聚糖酶基因可編碼天然的或修飾型木聚糖酶。木聚糖酶基因另外包含啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子?！澳揪厶敲高z傳構(gòu)建體”指包含產(chǎn)生和分泌天然的或修飾型木聚糖酶所必需的元件的核酸序列。優(yōu)選地，優(yōu)化木聚糖酶遺傳構(gòu)建體來(lái)允許從合適的生產(chǎn)宿主進(jìn)行表達(dá)，例如但不限于自里氏木霉宿主種生產(chǎn)。這些成分包括木聚糖酶編碼區(qū)木聚糖酶編碼區(qū)包含編碼分離自細(xì)胞外培養(yǎng)物濾液的功能性木聚糖酶所必需的DNA序列。木聚糖酶編碼區(qū)由編碼天然木聚糖酶的序列、編碼預(yù)先進(jìn)行工程構(gòu)建的突變木聚糖酶序列和編碼前述修飾型木聚糖酶序列及其組合而組成。修飾型木聚糖酶編碼區(qū)包括X34N、X131N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T突變(TrXII編號(hào))，但不包括氨基末端的分泌信號(hào)。木聚糖酶編碼區(qū)來(lái)自預(yù)先進(jìn)行改造的家族11木聚糖酶基因(參見(jiàn)以上提供的非限制性實(shí)例，例如但不限于在WO00/29587、WO01/92487和WO03/046169中公開(kāi)的實(shí)例；在此引用作為參考)，或來(lái)自天然家族11木聚糖酶，例如來(lái)自木霉屬或鏈霉菌屬基因，例如但不是用于限制，本發(fā)明修飾型木聚糖酶編碼區(qū)可來(lái)自木霉屬xln2、里氏木霉xln2或變鉛青鏈霉菌xlnC的天然或工程構(gòu)建的編碼區(qū)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，通過(guò)置換、取代、插入或刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不改變其功能，可改造或工程構(gòu)建天然編碼區(qū)。本發(fā)明的實(shí)施并不限于對(duì)木聚糖酶編碼區(qū)進(jìn)行所述的改造。分泌信號(hào)“分泌信號(hào)”是存在于分泌蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽序列，通常位于分泌蛋白質(zhì)的氨基末端，它可指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)；隨后通過(guò)信號(hào)肽酶可從成熟的分泌蛋白質(zhì)切除分泌信號(hào)。本發(fā)明修飾型木聚糖酶基因的編碼區(qū)可以可操縱地連接于編碼任何分泌信號(hào)的DNA序列(即，以可將轉(zhuǎn)錄序列定向于ER的方式進(jìn)行連接)，其中所述的分泌信號(hào)在期望的生產(chǎn)宿主(例如但不限于Trichoderrma)中是起作用的，例如，木聚糖酶分泌信號(hào)可來(lái)自任何分泌的木霉屬蛋白質(zhì)，例如來(lái)自木霉屬木聚糖酶或來(lái)自另外的真菌或細(xì)菌蛋白質(zhì)。不是出于限制目的，分泌信號(hào)可來(lái)自里氏木霉木聚糖酶I(Xln1)基因或木聚糖酶(xln2)基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可清楚通過(guò)置換、取代、插入或刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不改變其分泌信號(hào)功能，可修飾天然的分泌信號(hào)本發(fā)明的實(shí)施并不限于對(duì)分泌信號(hào)進(jìn)行所述的改造。啟動(dòng)子本發(fā)明的實(shí)施并不限于在遺傳構(gòu)建體中選擇啟動(dòng)子。優(yōu)選在生產(chǎn)宿主中起作用的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可操縱地連接于修飾型木聚糖酶基因編碼區(qū)或可操縱地連接于分泌信號(hào)，使得啟動(dòng)子分別控制編碼區(qū)、或分泌信號(hào)和編碼區(qū)的表達(dá)，其中所述的分泌信號(hào)可操縱地連接于修飾型木聚糖酶基因的編碼區(qū)。不出于限制于任何方式的目的，用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子包括木霉屬cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、Xln1和xln2啟動(dòng)子，或者兩個(gè)或多于上述兩個(gè)啟動(dòng)子的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可清楚通過(guò)置換、取代、插入或刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不改變其啟動(dòng)子功能，可修飾天然的啟動(dòng)子。本發(fā)明的實(shí)施并不限于對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行所述的改造。在分泌信號(hào)和成熟木聚糖酶編碼區(qū)之間的額外序列木聚糖酶遺傳構(gòu)建體包含可編碼分泌信號(hào)和木聚糖酶編碼區(qū)或如文中所述的修飾型木聚糖酶編碼區(qū)之間的額外氨基酸的額外序列。這些天然或人工的序列，可編碼構(gòu)建體編碼的分泌信號(hào)所對(duì)應(yīng)的成熟蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在連接分泌信號(hào)編碼序列和修飾型木聚糖酶編碼區(qū)所必需的限制酶位點(diǎn)進(jìn)行插入，可獲得這些序列。本發(fā)明的實(shí)施并不限于在分泌信號(hào)編碼序列和成熟木聚糖酶編碼區(qū)之間存在的額外DNA序列其它元件如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，木聚糖酶遺傳構(gòu)建體包含在生產(chǎn)宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄終止子，轉(zhuǎn)錄終止子直接位于木聚糖酶編碼區(qū)的下游。本發(fā)明的實(shí)施并不限于選擇可有效指導(dǎo)生產(chǎn)宿主中RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的終止的轉(zhuǎn)錄終止子。如實(shí)施例5.1-5.4所述，并不是限制于任何方式的轉(zhuǎn)錄終止子實(shí)例，包含直至木霉屬cbh2基因終止密碼子的1.9kbDNA3′。木聚糖酶遺傳構(gòu)建體包含用于測(cè)定轉(zhuǎn)化生產(chǎn)宿主的選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記可存在于相同質(zhì)粒載體上、遺傳構(gòu)建體的上游或下游(即，在構(gòu)建體的5′或3′端)，或者選擇標(biāo)記可與構(gòu)建體在一個(gè)質(zhì)粒載體上進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，選擇標(biāo)記的選擇是眾所周知的，包括賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞能利用通常不能被微生物代謝的代謝物能力(如，編碼乙酰胺酶并賦予能在作為唯一氮源的乙酰胺上生長(zhǎng)能力的A.nidulansamdS基因)或抗生素抗性(如，編碼潮霉素-β-磷酸轉(zhuǎn)移酶并賦予潮霉素抗性的Escherichiacolihph基因)的基因(人工的或天然的)。如果宿主菌株缺乏選擇標(biāo)記的功能基因，那么那些基因可以作為標(biāo)記。所述標(biāo)記的實(shí)例包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等等。因此相應(yīng)宿主菌株毫無(wú)疑問(wèn)缺乏選擇標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的功能基因，即缺乏trp、pyr、arg、leu等等的表達(dá)。在實(shí)施例5.1中描述了用于遺傳構(gòu)建體的選擇標(biāo)記的非限制性實(shí)施例。在該實(shí)施例中，選擇標(biāo)記是利用木霉屬磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)的大腸桿菌hph基因。在實(shí)施例5.2中描述了另外的選擇標(biāo)記，其包含依賴其天然啟動(dòng)子表達(dá)的粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)pyr4基因。本發(fā)明提供表達(dá)在木聚糖酶中引入或改變糖基化位點(diǎn)的修飾型木聚糖酶的遺傳構(gòu)建體和遺傳修飾的生產(chǎn)宿主，例如木霉屬菌株。包含引入糖基化位點(diǎn)的修飾型木聚糖酶的非限制性實(shí)例，包括一個(gè)或多個(gè)選自X34N、X131N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T突變(TrXII編號(hào))。本發(fā)明的修飾型木聚糖酶遺傳構(gòu)建體并不限于制備構(gòu)建體的以下方法，所述方法包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，例如通過(guò)堿裂解從大腸桿菌分離質(zhì)粒DNA、用限制性核酸內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA、通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分開(kāi)和分離DNA片段、用T4DNA連接酶連接DNA片段、通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在DNA片段末端插入稀有限制性酶切位點(diǎn)、或用T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段來(lái)加入寡核苷酸接頭和補(bǔ)平DNA片段。在實(shí)施例1-5中描述了所述的方法。在本發(fā)明另外的方面中，將修飾型木聚糖酶遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入并在期望微生物(生產(chǎn))宿主中表達(dá)。優(yōu)選地，提高來(lái)自所得重組微生物的修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率。例如，與由相應(yīng)遺傳構(gòu)建體所產(chǎn)生的相應(yīng)家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，上述表達(dá)效率至少增加40％或更多，其中所述的構(gòu)建體來(lái)自在根據(jù)相似發(fā)酵條件下生長(zhǎng)的相同微生物宿主中可衍生或生產(chǎn)修飾型木聚糖酶的構(gòu)建體。例如，與在相同發(fā)酵條件下由相同宿主生產(chǎn)的第二種木聚糖酶相比，第一種木聚糖酶的產(chǎn)量增加40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、425、450、474、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1250、1300、1500、1750、2000、2250或2500％，或者多于在此之間的任何數(shù)值。優(yōu)選地，與在相同發(fā)酵條件下由相同宿主生產(chǎn)的第二種木聚糖酶相比，第一種木聚糖酶的產(chǎn)量至少增加50％(參見(jiàn)實(shí)施例9和10)。本發(fā)明現(xiàn)有的實(shí)施方面并不限于將木聚糖酶遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入微生物宿主(生產(chǎn)宿主)的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入生產(chǎn)宿主的方法，這包括但不限于，氯化鈣處理細(xì)菌細(xì)胞或真菌原生質(zhì)體來(lái)弱化細(xì)胞膜、加入聚乙二醇融合細(xì)胞膜、通過(guò)電穿孔法去極化細(xì)胞膜、或通過(guò)用基因槍微彈轟擊使DNA穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。生產(chǎn)宿主是木霉屬成員(在不同時(shí)期已經(jīng)進(jìn)行分類，如綠木霉、長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)和最近的紅褐肉座菌(Hypocreajecorina))。參見(jiàn)Simmons(1977)、Bissett(1984)、Cannon(1986)、Kuhls等(1996)。這些菌種是很適合的，因?yàn)樗鼈兛缮a(chǎn)家族11木聚糖酶。另外，已經(jīng)公開(kāi)了用于將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入纖維素酶木霉屬生產(chǎn)菌株的方法(Lorito等，1993；Goldman等，1990；Penttila等，1987)。實(shí)施例7.1描述了一種利用微彈槍將木聚糖酶遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入木霉屬孢子的方法實(shí)施例7.2描述了一種利用聚乙二醇和氯化鈣處理而將木聚糖酶遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入木霉屬原生質(zhì)體的方法。表達(dá)效率的提高，例如對(duì)天然木聚糖酶家族增加50％表達(dá)效率，反映遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)菌株的天然變化率并具有商業(yè)意義的顯著性增加。結(jié)果表明，通過(guò)該方法提高木聚糖酶產(chǎn)量的程度，可高達(dá)2倍并達(dá)到10倍。如實(shí)施例8所述，通過(guò)培育培養(yǎng)物和測(cè)量木聚糖酶活性，測(cè)量木聚糖酶產(chǎn)量的提高程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解酶混合物的特異木聚糖酶活性(以IU/mg蛋白)隨著酶混合物中纖維素酶含量和其它蛋白含量的減少而增加。通過(guò)物理分離和機(jī)械分離酶混合物來(lái)從混合物除去纖維素酶和其它蛋白，或通過(guò)來(lái)自生產(chǎn)宿主的重組工具來(lái)缺失纖維素酶基因或其它基因，以便減少或清除纖維素酶或其它蛋白的表達(dá)。所述的方法對(duì)生產(chǎn)宿主的木聚糖酶實(shí)際產(chǎn)量幾乎沒(méi)有影響。如本文概括的，木聚糖酶和修飾型木聚糖酶，可用于漂白紙漿的目的或其它通常需要在溫度和pH的活性超過(guò)野生型酶的其它應(yīng)用。為了生物漂白紙漿，通常使用來(lái)自被列入家族11中的木聚糖酶(參見(jiàn)表1)。天然木聚糖酶蛋白中可發(fā)現(xiàn)如本文所述的修飾；當(dāng)在候選的(非天然的)生產(chǎn)宿主中表達(dá)時(shí)，這些天然的木聚糖酶可顯示如本文所述的期望特征，并歸入本發(fā)明中。發(fā)明的實(shí)施并不限于修飾木聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用。據(jù)本發(fā)明所生產(chǎn)的木聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用，包括但不限于食品加工，例如禽類或豬飼料添加劑的烘焙或釀造；或工業(yè)加工，例如生產(chǎn)紙漿和紙張。下是本發(fā)明中所公開(kāi)序列的概要(SEQIDNO28至45涉及所列出生物體的木聚糖酶，參見(jiàn)表2更多細(xì)節(jié))在以下實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1描述從里氏木霉菌株M2C38及其遺傳修飾的衍生物中分離基因組DNA。施例2-5描述構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)、克隆各種基因、修飾木聚糖酶基因序列，及修飾一些用于表達(dá)來(lái)自里氏木霉菌株RutC30和M2C38的修飾型木聚糖酶的遺傳構(gòu)建體。施例7-10描述在里氏木霉菌株RutC30和M2C38中轉(zhuǎn)化和表達(dá)木聚糖酶遺傳構(gòu)建體。實(shí)施例11和實(shí)施例12描述修飾的和天然的木聚糖酶的生物化學(xué)特征。實(shí)施例1里氏木霉基因組DNA的分離和里氏木霉基因組文庫(kù)的構(gòu)建庫(kù)里氏木霉菌株M2C38是Iogen公司從里氏木霉RutC30(ATCC#_56765；Montenecourt和Eveleigh，1979)中衍生的專有菌株，而RutC30是從里氏木霉Qm6A(ATCC#_13631；Mandels和Reese，1957)依次衍生而來(lái)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知本文所述來(lái)自這些菌株的遺傳構(gòu)建體、在這些菌株中表達(dá)遺傳構(gòu)建體的方法，都適于所有來(lái)源于Qm6A的木霉屬菌株。為了分離基因組DNA，通過(guò)無(wú)菌接種環(huán)將從馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中收集的里氏木霉孢子接種50ml馬鈴薯葡萄糖肉湯(Difco)。培養(yǎng)物以200rpm在28℃振蕩溫育2-3天。在GFA玻璃微纖維濾紙(Whatman)上過(guò)濾菌絲體，并用冷去離子水洗滌。在液氮中冰凍真菌塊，并用預(yù)冷的研缽和研棒磨成粉末；將0.5g粉末生物量重懸浮于5ml的添加了1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的100mMTris、50mMEDTA(pH7.5)中。離心裂解物(在4℃以5000g離心20分鐘)以除去細(xì)胞碎片沉淀。用1體積苯酚飽和的緩沖液(10mMTris、1mMEDTA，pH8.0)抽提上清，隨即用1體積苯酚飽和的緩沖液∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)進(jìn)行抽提以便除去可溶的蛋白。通過(guò)加入0.1體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5體積的95％冰乙醇，從溶液中沉淀DNA。在-20℃溫育至少1h后，離心沉淀DNA(在4℃以5000g離心20分鐘)，用10ml的70％乙醇洗滌，干燥后重懸浮在1ml10mMTris、1mMEDTA(pH8.0)。加入直至終濃度0.1mg/ml的核糖核酸酶A(BoehringerMannheim)并在37℃1小時(shí)，來(lái)消化RNA。用1體積苯酚飽和的緩沖液和1體積苯酚飽和的緩沖液∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)相繼抽提上清，用于除去DNA溶液的核糖核酸酶。用0.1體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5體積的95％冰乙醇再次沉淀DNA、離心沉淀、用70％乙醇洗滌、干燥并重懸浮于50μl的10mMTris、1mMEDTA(pH8.0)。通過(guò)在260nm測(cè)量溶液的吸光度，來(lái)測(cè)定DNA濃度(p.ClinSambrook等，1989)。使用分離自里氏木霉菌株M2C38的基因組DNA，構(gòu)建兩種質(zhì)粒文庫(kù)和一種噬菌體文庫(kù)。根據(jù)以下步驟在載體pUC119(Viera和Messing，1987)中構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)將10μg基因組DNA在100μl體積的含2單位/ug的HindIII、BamHI或EcoRl限制性內(nèi)切酶中于37℃消化20小時(shí)。消化的DNA在0.75％瓊脂糖凝膠上通過(guò)0.04MTris-醋酸鹽、1mMEDTA進(jìn)行電泳分離，并用溴化乙啶染色。切下目的基因大小相對(duì)應(yīng)的膠片并進(jìn)行電洗脫來(lái)復(fù)性DNA片段(Sambrook等，pp.6.28-6.29)。通過(guò)在包含20-50μg/mlDNA(以載體∶插入DNA＝2∶1的摩爾比率)、1mMATP和5單位T4DNA連接酶的10-15μl總體積中，于4℃進(jìn)行連接16h，將這些DNA富集部分連接到pUC119以便構(gòu)建基因文庫(kù)。使用CellPorator系統(tǒng)(Gibco/BRL)并根據(jù)制造商的方法，將連接反應(yīng)產(chǎn)物電穿孔大腸桿菌株HB101，并在含70μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂板上篩選轉(zhuǎn)化子。在λ載體DASH(stratagene，Inc.)中根據(jù)以下步驟構(gòu)建噬菌體文庫(kù)用2、1、0.5和0.5單位/μg的BamHI在37℃消化基因組DNA(3μg)1小時(shí)，來(lái)產(chǎn)生9-23kB大小的片段。用1體積Tris飽和的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提、隨即用10μl的3M醋酸鈉(pH5.2)和250μl的95％乙醇(-20℃)沉淀，來(lái)純化來(lái)自各個(gè)消化產(chǎn)物的DNA。通過(guò)微離心沉淀消化的DNA、用0.5毫升70％冰乙醇洗滌、干燥并重懸浮10μl無(wú)菌去離子水。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(0.04MTris-醋酸鹽、1mMEDTA的0.8％瓊脂糖)確定的9-23kB大小的富集DNA片段。在總體積5μl的反應(yīng)體系(包含2單位DNA連接酶和1mMATP，4℃過(guò)夜)中，將消化的DNA(0.4μg)連接到用BamHI(Stratagene)預(yù)消化的1μgDASH臂上。根據(jù)制造商的方法，使用GigaPackIIGold提取盒(Stratagene)將連接混合物組裝入噬菌體粒子中。使用大腸桿菌宿主菌株XL1-BlueMRA(P2)滴定測(cè)定文庫(kù)，并得到含有3×105單個(gè)克隆。實(shí)施例2從里氏木霉M2C38文庫(kù)分離基因組克隆2.1來(lái)自pUC119文庫(kù)的細(xì)胞纖維二糖水解酶I(cbhl)和纖維二糖水解酶II(cbh2)基因通過(guò)菌落轉(zhuǎn)移雜交(colonylifthybridization)來(lái)鑒定含有來(lái)自重組體pUC119-BamHI或-EcoRI文庫(kù)的cbh1或cbh2克隆的大腸桿菌HB101轉(zhuǎn)化體將1-3X104菌落轉(zhuǎn)移到HyBondTM尼龍膜(Amersham)上；將菌落面向上的膜在用0.5MNaOH、1MNaCl飽和的吸濾紙(VWR238)上放置5分鐘來(lái)裂解細(xì)菌細(xì)胞并變性DNA；然后通過(guò)將菌落面向上的膜在用添加了1MNaCl的1.5MTris(pH7.5)飽和的吸濾紙(VWR238)上放置5分鐘來(lái)中和膜；將膜晾干30分鐘，然后通過(guò)在80℃烘干2h將DNA固定在膜上。在總體積20μ的標(biāo)記反應(yīng)體系中(包含10-50ng靶DNA、0.2mM各種d(GCT)TP、0.5μMdATP、20-4μCi的α-32P-dATP、10pmole寡核苷酸引物和0.5單位Taq聚合酶)，通過(guò)從BamBl或EcoRI酶切的片段富集庫(kù)分別PCR擴(kuò)增cbh1和cbh2編碼區(qū)的短片段(0.7-1.5kB)，制備32P標(biāo)記的探針。反應(yīng)進(jìn)行6-7個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃為2分鐘；56℃為1.5分鐘；70℃為5分鐘)。通過(guò)加入0.5ml的10％(w/v)三氯乙酸和0.5mg酵母tRNA，沉淀所擴(kuò)增的、32p標(biāo)記DNA。通過(guò)微離心沉淀DNA，用1ml的70％乙醇洗液兩次、干燥并重懸浮于1MTris(pH7.5)、1mMEDTA中。已經(jīng)將重組pUC119質(zhì)粒固定在上面的尼龍膜置于含有1MNaCl、1％SDS、50mMTris、1mMEDTA(pH7.5)連同100μg/ml變性的剪切鮭魚(yú)精子DNA的熱密封袋中，于60-65℃進(jìn)行預(yù)雜交1h。在含有相同緩沖液但僅是50μg/ml變性剪斷的鮭魚(yú)精子DNA和5×106-5×107cpm變性bgll、cbh1或cbh2探針的熱密封袋中，于60-65℃雜交16-20h。用1MNaCl、0.5％SDS將膜在60℃洗滌一次(15分鐘)，用0.3MNaCl、0.5％SDS在60℃洗滌兩次(15分鐘/每次)以及用0.03MNaCl、0.5％SDS在55℃洗滌一次(15分鐘)。將膜再次放入熱密封袋中，并在柯達(dá)RPX射線底片上于-70℃曝光16-48h。根據(jù)制造商的方法，顯影X射線底片。挑選產(chǎn)生強(qiáng)或弱信號(hào)的菌落，并培養(yǎng)在補(bǔ)充70pg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中。使用堿裂解法(Sambrook等，pp.1.25-1.28)從這些培養(yǎng)物分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性酶切、Southern雜交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)以及PCR(Sambrook等，pp.14.18-14.19)進(jìn)行分析。使用0.7kbcbh1探針，通過(guò)對(duì)pUC119-BamHl酶切的文庫(kù)進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定攜帶cbh1基因的克隆，其中用設(shè)計(jì)成能擴(kuò)增公開(kāi)cbh1序列的597-1361bp片段(Shoemaker等，1983)的寡核苷酸引物制備探針。分離包含相當(dāng)于啟動(dòng)子(4.7kb)和1kbcbh1結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)的5.7kbBamHl片段的cbh1克隆，pCOR132。由此，將包含cbh1啟動(dòng)子(2.1kb)和cbh1編碼區(qū)5端(0.4kb)的2.5kbEcoRl片段亞克隆入pUC119中，來(lái)生成pCB152。使用1.5kbcbh2探針，通過(guò)對(duì)pUC119-EcoRl酶切的文庫(kù)進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定攜帶cbh2基因的克隆，其中用設(shè)計(jì)成能擴(kuò)增公開(kāi)cbh2序列的580-2114bp片段(Chen等，1987)的寡核苷酸引物制備探針。分離包含相當(dāng)于啟動(dòng)子(600bp)和結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)以及終止子(1.9kb)的4.8kbEcoRl片段的cbh2克隆，pZUK600。2.1從λDASH文庫(kù)克隆cbh1終止子、木聚糖酶II(xln2)基因以及磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(pgkp)使用DIG標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(BoehringerMannheim)并根據(jù)制造商的方法，通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記法來(lái)PCR擴(kuò)增cbh1、xln2以及pgk基因的編碼區(qū)，制備地高辛-11-dUTP標(biāo)記探針。通過(guò)λDASH文庫(kù)的噬菌斑轉(zhuǎn)移雜交法，鑒定包含cbh1、xln2以及pgk基因的基因組克隆。對(duì)于每個(gè)目的基因，將1x104克隆轉(zhuǎn)移到Nytran(Schleicher和Schull)尼龍膜上。通過(guò)將噬菌斑面向上的膜在用0.5MNaOH、1MNaCl飽和的吸濾紙(VWR238)上放置5分鐘，裂解噬菌體顆粒和變性噬菌體DNA；然后通過(guò)將噬菌斑面向上的膜在用添加1MNaCl的1.5MTris(pH7.5)飽和的吸濾紙上放置5分鐘，來(lái)中和膜；將膜干燥30分鐘，然后通過(guò)在80℃烘干2h，將DNA固定在膜上。將膜在含有6XSSPE、5XDenhardt、1％SDS加上100μg/ml變性的剪斷鮭魚(yú)精子DNA的熱密封袋中于65℃預(yù)雜交2h。然后，將膜置于含有相同溶液但含50μg/ml變性、剪斷的鮭魚(yú)精子DNA和0.5μg地高辛-dUTP標(biāo)記探針的熱密封袋中，于65℃過(guò)夜雜交。在2XSSPE、0.1％SDS中于室溫洗膜兩次(15分鐘)，在0.2XSSPE、0.1％SDS中于65℃洗膜兩次(15分鐘)以及在2XSSPE中洗膜一次(5分鐘)。根據(jù)制造商的方法，通過(guò)抗地高辛/堿性磷酸酶抗體綴合物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和4-硝基四氨唑藍(lán)氯化物(BoehringerMannheim)進(jìn)行反應(yīng)，來(lái)鑒定陽(yáng)性雜交克隆。通過(guò)用地高辛-dUTP標(biāo)記探針的第二輪篩選，進(jìn)一步純化陽(yáng)性雜交克隆。如Sambrook等(1989，pp.2.118-2.121)所述，通過(guò)用1體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和1體積氯仿∶異戊醇(24∶1)替代CsCl梯度步驟的排除法(exception)，分離單個(gè)克隆和純化噬菌體DNA。用0.1體積3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5體積95％冰乙醇，沉淀DNA。用0.5毫升70％冰乙醇洗滌噬菌體DNA沉淀物，干燥并重懸浮于50μl10mMTris、1mMEDTA(pH8.0)中。使用用于篩選λDASH文庫(kù)的地高辛-dUTP標(biāo)記的相同探針，通過(guò)限制性消化純化的噬菌體DNA和進(jìn)行Southern印跡雜交法(Sambrook等，pp.9.38-9.44)，鑒定包含目的基因的限制性片段。通過(guò)用于噬菌斑轉(zhuǎn)移的相同方法，進(jìn)行雜交膜并目測(cè)陽(yáng)性雜交片段。一旦從每個(gè)λDASH克隆鑒定期望的限制性片段，重復(fù)限制性消化，并將片段在TAE的0.8％瓊脂糖凝膠上跑膠，并切下期望的膠帶。根據(jù)制造商的方法，使用SephaglasBandPrep試劑盒(Pharmacia)從膠片洗脫DNA。用包含公開(kāi)cbh1序列的45-2220bp(Shoemaker等)的acbh1探針，通過(guò)λDASH文庫(kù)(實(shí)施例2)的菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定攜帶cbh1基因的克隆。通過(guò)對(duì)來(lái)自λDASHcbh1克隆純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化，分離包含cbh1編碼區(qū)3′端(0.5kb)和cbh1終止子(1.3kb)的1.8kbBamHI片段。將這些片段亞克隆入大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC119的BamHI位點(diǎn)，來(lái)生成質(zhì)粒pCBlTa。用包含公開(kāi)xln2序列的100-783bp(Saarelainen等，1993)，通過(guò)λDASH文庫(kù)的菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定攜帶xln2基因的克隆。通過(guò)對(duì)從λDASHxln2克隆純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化，分離包含xln2基因的啟動(dòng)子(2.3kb)、編碼區(qū)(0.8kb)和終止子(2.6kb)的5.7kbKpnl片段。將這些片段亞克隆入pUC119的Kpnl位點(diǎn)，來(lái)生成質(zhì)粒pXYN2K-2。用包含公開(kāi)pgk序列的4-1586bp(Vanhanen等，1989)，通過(guò)λDASH文庫(kù)(實(shí)施例2)的菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定攜帶pgk基因的克隆。通過(guò)對(duì)從λDASHpgk克隆純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化，分離包含pgk基因的啟動(dòng)子(2.9kb)、編碼區(qū)(1.6kb)和終止子(0.5kb)的5.0kbEcoRl片段。將這些片段亞克隆入pUC119的EcoRl位點(diǎn)，來(lái)生成質(zhì)粒pGK5.0。實(shí)施例3里氏木霉木聚糖酶I和變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C基因的克隆和修飾使用可將NheI位點(diǎn)和KpnI位點(diǎn)分別引入編碼序列上、下游的引物，從分離自變鉛青鏈霉菌的基因組DNA中，擴(kuò)增木聚糖酶C(xylc；SEQIDNO39)。巨型引物(megaprimer)PCR用于將T128N突變引入xylC。誘變引物聯(lián)合反向引物用于將KpnI位點(diǎn)引入下游。分離所得的PCR產(chǎn)物，并作為反向引物連同正向引物來(lái)將NheI位點(diǎn)引入上游。SEQIDNO48顯示了修飾的變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C的序列。引物序列如下所示T128NCCCTCCGTGGAAGGCAACAAGACCTTCCAG(SEQIDNO15)XynC-5F(Nhe)GCCCACGCCGCTAGCACCATCACC(SEQIDNO16)XynC-3R(Kpn)CGTCCACCGGTACCAGGTCAACC(SEQIDNO17)使用可將NheI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)分別引入編碼序列上、下游的引物，從分離自里氏木霉株M2C38分離的基因組DNA中，擴(kuò)增編碼木聚糖酶I的基因(xynI，SEQIDNO2)。巨型引物PCR用于將T118N突變引入xynI誘變引物聯(lián)合反向引物用于將BamHI位點(diǎn)引入下游。分離所得的PCR產(chǎn)物，并作為反向引物連同正向引物來(lái)將NheI位點(diǎn)引入上游。SEQIDNO47顯示了修飾的里氏木霉的木聚糖酶C的序列。如下所示引物序列T118NCCATCCAGGGCAACGCGACCTTC(SEQIDNO18)XynI-FCGTCGTGCTAGCATCAACTACGAC(SEQIDNO19)XynI-R(BamHI)GGATCCTAGTTGCTGACAC(SEQIDNO20)在SEQIDNO2和SEQIDNO39中，分別顯示了由實(shí)施例5.4和5.5中所述的遺傳構(gòu)建體編碼的天然型、未修飾型里氏木霉木聚糖酶I和變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C的氨基酸序列。實(shí)施例4誘變里氏木霉木聚糖酶II來(lái)產(chǎn)生變體HTX18、ITX1-、ITX3′-5′、HTX18(R135Y)4.1突變N10H、27M、Y29L的引入通過(guò)盒式誘變?nèi)斯ln2基因(Sung等，1995；也參見(jiàn)WO01/92487和WO03/046169；在此引用作為參考)，從M2C38菌株遺傳工程構(gòu)建xln2基因。具體地說(shuō)，體外合成包含密碼子8-33的雙鏈ApaI/PinAI片段，其中如SEQID2所示，改造密碼子10、27和29。然后這些片段用于取代質(zhì)粒pUC/Xln中的天然xln2序列(Sung等，1993)。用里氏木霉xln2(包含密碼子58處的108bp內(nèi)含子)的相對(duì)應(yīng)基因組片段，取代包含pUC/XLN中的密碼子32-190的人工DNA，其中使用里氏木霉DNA作為模板并在密碼子31和32處引入唯一的PinAI位點(diǎn)和在TAG終止密碼子的毗鄰下游引入唯一的BamHI位點(diǎn)，可擴(kuò)增所述的內(nèi)含子。4.2突變75A、105H、125A、129E的引入從pC/XHML-TV(參見(jiàn)下列實(shí)施例5.1)分離包含啟動(dòng)子區(qū)、xln2基因、cbh2部分終止子的3.2kb的SstI片段，并克隆入誘變載體PALTER-1(promega)的多接頭SstI位點(diǎn)。使用特別設(shè)計(jì)能插入期望突變的引物，進(jìn)行四輪連線誘變來(lái)改造特殊氨基酸S75AAGCTACCTCGCCGTGTACGG(SEQIDNO3)，L105HCCACCAAGCACGGCGAGGT(SEQIDNO4)，S125AACGCAGCGCGTCAACGCCCCGTCCATCATCGGC(SEQIDNO5)，和I129EAACGCCCCGTCCATCGAGGGCACCGCCACCTTT(SEQIDNO6)(參見(jiàn)WO01/92487和WO03/046169；在此引用作為相關(guān)方法的參考)；這生成質(zhì)粒pALT-HTX13(圖3中顯示該質(zhì)粒的普通形態(tài)，“pALT-H(I)TXn”)。通過(guò)DNA測(cè)序分析法，檢驗(yàn)所有突變的插入。4.3突變Y135R、H144R、N157D、Q161R、Q162H和T165H的引入使用PromegaAlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)，在質(zhì)粒pALT-HTX13上進(jìn)行四輪連續(xù)誘變，來(lái)引入六個(gè)靶氨基酸取代并產(chǎn)生pALT-HTX18，步驟如下-使用引物序列Y135RGGCACCGCCACCTTTCGCCAGTACTGGTCC(SEQIDNO7)和H144RGTCCGCCGCAACCGCCGCTCGAGCGGCTC(SEQIDNO8)將135R和144R突變加入pALT-HTX13，來(lái)生成pALT-HTX13+135R/144R；-使用引物序列N157DAACCACTTCGACGCGTGG(SEQIDNO9)和Q162HGGCTCAGCACGGCCTGACG(SEQIDNO11)將157D和162H突變加入pALT-HTX13+135R/144R，來(lái)生pALT-HTX13+135R/144R/157D/162H；-使用引物序列Q161RTTCGACGCGTGGGCTCGCCACGGCCTGACGCTC(SEQIDNO10)將161R突變加入pALT-HTX13+135RT/144R/157D/162H，來(lái)生成pALT-HTX13+135R/144R/157D/161R/162H；-使用引物序列T165HGCTCGCCACGGCCTGCACCTCGGGACGATGGAT(SEQIDNO12)將165H突變加入pALT-HTX13+135R144R157D/161R/162H，來(lái)生成pALT-HTX18。在圖3中顯示了質(zhì)粒的普通形態(tài)“pALT-H(I)TXn”。通過(guò)DNA測(cè)序分析，來(lái)檢驗(yàn)所有突變的插入。4.4突變Y135R的回復(fù)突變和T131N引入HTX18使用PromegaAlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)和引物序列T131N、R135YGGCAACGCCACCTTTTACCAGTACTGGTCC(SEQIDNO13)在質(zhì)粒pALT-HTX18上進(jìn)行一輪誘變，來(lái)引入T131N和R135Y突變，并生成pALT-ITXI。在圖3中顯示了質(zhì)粒的普通形態(tài)“pALT-H(I)TXn”。通過(guò)DNA測(cè)序分析，來(lái)檢驗(yàn)所有突變的插入。4.5Y135R突變?cè)贖TX18中的回復(fù)突變使用PromegaAlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)和引物序列R135YGGCACCGCCACCTTTTACCAGTACTGGTCC(SEQIDNO14)，在質(zhì)粒pALT-HTX18上進(jìn)行一輪誘變，來(lái)引入R135Y突變并生成pALT-HTX18R135Y。在圖3中顯示了質(zhì)粒的普通形態(tài)“pALT-H(I)TXn”。通過(guò)DNA測(cè)序分析，來(lái)檢驗(yàn)所有突變的插入。4.6在HTX18內(nèi)部位點(diǎn)34、131、180和182引入糖基化位點(diǎn)使用PromegaAlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)和下列引物序列，在pALT-HTX18上進(jìn)行一輪誘變，來(lái)生成質(zhì)粒pALT-ITXn和pALT-ITXn′(其中n等于2至5)T131NCCGTCCATCGAGGGCAACGCCACCTTTCGC(SEQIDNO21)F180NGTGGAGGGTTACAACAGCTCTGGCTCTGCT(SEQIDNO22)F180N、S182TGTGGAGGGTTACAACAGCACCGGCTCTGCT(SEQIDNO23)S182NGGTTACTTTAGCAACGGCTCTGCTTCCATC(SEQIDNO24)S182N、S184TGGTTACTTTAGCAACGGCACCGCTTCCATC(SEQIDNO25)Q34NGGTCCCGGCGGGAACTTCTCCGTCAACTGG(SEQIDNO26)Q34N、S36TGGTCCCGGCGGGAACTTCACCGTCAACTGG(SEQIDNO27)。在圖3中顯示了這些質(zhì)粒的普通圖“pALT-H(I)TXn”。通過(guò)DNA測(cè)序分析，來(lái)檢驗(yàn)所有突變的插入。實(shí)施例5用于指導(dǎo)里氏木霉中表達(dá)天然型和修飾型家族11木聚糖酶的載體的構(gòu)建5.1pC/XHML-TV的構(gòu)建使用在190-195bp處含有PinA1的和含有密碼子31和32的xln2特異引物以及pUC反向引物(目錄號(hào)18432-013，Gibco/BRL)，通過(guò)來(lái)自xln2亞克隆pXYN2K-2的Pwo聚合酶，擴(kuò)增包含xln2基因的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的2.4kb片段(-2150至+195bp，其中+1表示ATG起始密碼子，+193-195表示密碼子32)，其中所述引物在X1712基因的5′端Xpnl位點(diǎn)下游進(jìn)行退火。以多聚接頭的BamHI位點(diǎn)是3′至Pifai位點(diǎn)的方向，將這些xln2PCR產(chǎn)物作為平末端片段插入pUC119的多聚接頭的SmaI位點(diǎn)；這些生成質(zhì)粒pUC/XynPSS(Pin)。通過(guò)用EcoRl(其中從pXYN2K-2擴(kuò)增pUC119的部分多聚接頭)和BamHI進(jìn)行消化，從pUC/XynPSS(Pin)再次分離相同的xln2PCR產(chǎn)物，并插入也用EcoRI和RamHI消化的質(zhì)粒pBR322L(在565bp和650bp的原始Sphl和Sall位點(diǎn)之間包含Sphl-Notl-Sal1接頭的pBR322衍生物)中，從而生成質(zhì)粒pBR322LXP。為了便于高水平表達(dá)HTX4木聚糖酶，用包含cbh1啟動(dòng)子的-1399bp至-204bp的1.2kbHindIII片段替換包含pBR322LXP的xln2啟動(dòng)子的-1400bp至-121bp的1.3kbHindIII片段，其中所述的1.2kbHindIII片段通過(guò)HindIII消化pCOR132而分離；這生成質(zhì)粒pBR322LXC。最后，用Klenow補(bǔ)平pBR322LXC的EcoRl位點(diǎn)，并加入Spel接頭(目錄號(hào)1086，NewEnglandBiolabs)以生成pBR322SpXC。從被NheI和BamHI消化的質(zhì)粒pUC/HTX4(以上實(shí)施例4.1所述的)，分離包含木聚糖酶基因(包含突變N10H、Y27M、N29L)密碼子1-190的片段，并插入用NheI和BamHI消化的pCB219N-N中，從而生成pHTX4/C2ter。為了制備pCB219N-N，使用與公開(kāi)的cbh2基因3′非翻譯區(qū)2226bp-2242bp(Chen等，1987)相同的引物和pUC正向引物(目錄號(hào)1224，NewEnglandBiolabs)，從pZUK600(以上實(shí)施例2所述的)模板擴(kuò)增acbh2終止子片段，其中cbh2基因在5′端包含含有XbaI-Nhel-BamHI-SmaI-Kpnl位點(diǎn)的短多聚接頭，并且所述的引物在pZUK6003′端EcoRI位點(diǎn)上游進(jìn)行退火。在工程構(gòu)建的Xba1和EcoRI位點(diǎn)消化該片段，并插入pUC119的相應(yīng)位點(diǎn)來(lái)生成pCB219。將EcoRI-NotI接頭(目錄號(hào)35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219的唯一EcoRI位點(diǎn)來(lái)生成pCB219N。通過(guò)用PinAI和NotI進(jìn)行消化，從pHTX4/C2ter分離包含HTX4基因的密碼子9-190和cbh2終止子的2.7kb片段，并插入用PinAI和NotI消化的pBR322SpXC，來(lái)生成表達(dá)盒pXHML-EC。用Pwo聚合酶從質(zhì)粒pVU1005(VandenElzen等，1989)從木霉擴(kuò)增作為選擇標(biāo)記的大腸桿菌潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)。分別設(shè)計(jì)在hph編碼區(qū)(所公開(kāi)的hph序列的211-1236bp，Gritz和Davies，1983)的5′和3′端引入SphI和KpnI位點(diǎn)的引物。用SphI和KpnI消化PCR產(chǎn)物，并插入pUC119多聚接頭區(qū)的相應(yīng)位點(diǎn)。得到的質(zhì)粒pHPT100作為用于構(gòu)建選擇盒的起始質(zhì)粒。將兩個(gè)新的連接區(qū)引入質(zhì)粒pHPT100來(lái)便于啟動(dòng)子和終止子片段的克隆。將HindIII-XbaI-XhoI-SphI接頭插入HindIII和SphI之間的位點(diǎn)，以及將插入pUC119的KpnI和SacI位點(diǎn)之間的KpnI-NotI-SacI保留在pHPT100中。該構(gòu)建體被稱為pHPT102。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增pgk啟動(dòng)子(Vanhanen等，1991)的引物，來(lái)在啟動(dòng)子-970和+1位點(diǎn)分別引入XhoI位點(diǎn)和SphI位點(diǎn)。這些位點(diǎn)隨后用于將啟動(dòng)子pgk插入pHPT102的XhoI和SphI位點(diǎn)來(lái)生成pHPT115使用在cbhI的3′非翻譯區(qū)(公開(kāi)的cbh1序列的1864bp-1899bp)退火的引物和pUC反向引物(目錄號(hào)18432-013，Gibco/BRL)，通過(guò)Pwo聚合酶從pCB1Ta擴(kuò)增1.3kbcbh1終止子片段，其中所述的cbh1在1877bp-1882bp處包含Kpnl位點(diǎn)，并且反向引物在pCB1Ta的cbh1終止子3′端的EcoRI位點(diǎn)下游進(jìn)行退火。用KpnI消化cbh1終止子的PCR產(chǎn)物，并插入pHPT115的唯一XpnI位點(diǎn)，來(lái)生成選擇盒質(zhì)粒pHPT136。通過(guò)包含xln2轉(zhuǎn)錄終止子的2.6kbKpnI片段替換選擇盒質(zhì)粒pHPT136中的cbh1終止子。使用將在公開(kāi)的xln2序列(Saarelainen等1993)780bp下游處引入KpnI點(diǎn)的引物和pUC正向引物(目錄號(hào)18431-015，Gibco/BRL)，通過(guò)Pwo聚合酶從基因組亞克隆pXYN2K-2擴(kuò)增xln2終止子，其中所述的正向引物在pXYN2K-2xln2基因3′端下游進(jìn)行退火。用KpnI消化xln2終止子的PCR產(chǎn)物，并連接到來(lái)自pHPT136的5.1kbKpnI片段(包含pUC119的pgk驅(qū)動(dòng)的Hph基因)，來(lái)生成選擇盒質(zhì)粒pHPT136X，從而在選擇盒3′端保留唯一的NotI位點(diǎn)。為了制備轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)NotI消化、用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平NotI位點(diǎn)以及SpeI消化，從pC/XHML-EC分離表達(dá)盒。同時(shí)，通過(guò)用XhoI、用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平XhoI位點(diǎn)以及隨后用XbaI消化，制備選擇盒質(zhì)粒來(lái)接納這些片段。將SpeI表達(dá)盒-NotI片段插入pHPT136X選擇盒上游的XbaI和XhoI位點(diǎn)之間。在通過(guò)如實(shí)施例7所述的微彈轟擊導(dǎo)入里氏木霉M2C38之前，通過(guò)用NotI消化，線性化最終的轉(zhuǎn)化載體pC/XHML-TV(圖2)。5.2pC/XH(I)TXn-TV的構(gòu)建將包含來(lái)自pALT-H(I)TXn的啟動(dòng)子區(qū)、修飾的xln2基因和cbh2部分終止子(如實(shí)施例4中所述的)的3640bpSacI片段，克隆入含有pSP72中剩余的cbh2終止子序列的質(zhì)粒的SacI位點(diǎn)。這生成含有表達(dá)盒的質(zhì)粒pc/xH(I)TXnPSP。含有質(zhì)粒pNCBglNSNB(r)的選擇盒，衍生于含有質(zhì)粒pFB6的(Radford等，1985)的粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)pyr4中。將來(lái)自pFB6的3.2kbBglII片段(含有粗糙鏈孢霉pyr4基因(GenBank登錄號(hào)M13448)及其啟動(dòng)子、終止子和一些5′UTR序列)，克隆入在多聚接頭(介于EcoRI和SacI之間)中含有NotI、SmaI、NheI以及BglII位點(diǎn)的修飾型pUC119的BamHI位點(diǎn)，從而生成pNCBgl-NSNB(r)。從pNCBgl-NSNB(r)分離含有粗糙鏈孢霉pyr4全部編碼區(qū)、啟動(dòng)子以及終止子序列的2238bp的KpnI片段，并克隆入pc/xHTX18PSP中唯一的KpnI位點(diǎn)，來(lái)生成pc/xHTX18-TV(圖4中顯示普通形式的質(zhì)?！皃c/xH(I)TXn-TV”)。5.3pc/xHTX18(R135Y)-TV的構(gòu)建將包含來(lái)自pALT-HTX18(R135Y)的啟動(dòng)子區(qū)、修飾的xln2基因和cbh2部分終止子(如實(shí)施例4中所述的)的3640bpSacI片段，克隆入含有pSP72中剩余的cbh2終止子序列的質(zhì)粒的SacI位點(diǎn)。這生成含有表達(dá)盒的質(zhì)粒pc/xHYX18(R135Y)PSP。從pNCBgl-NSNB(r)(以上實(shí)施例5.2中所述)分離含有粗糙鏈孢霉pyr4全部編碼區(qū)、啟動(dòng)子以及終止子序列的2238bp的KpnI片段，并克隆入含有表達(dá)盒的質(zhì)粒的唯一的KpnI位點(diǎn)，來(lái)生成pc/xHTX18-TV(R135Y)-TV(圖4中顯示普通形式的質(zhì)?！皃c/xH(I)TXn-TV”，其中“n”是“18(R135Y)”)。5.4pc/xxynl-TV和pc/xxynl-T118N-TV的構(gòu)建用NheI和BamHI消化675bp野生型和修飾型xynlPCR產(chǎn)物(如以上實(shí)施例3所述)，并插入質(zhì)粒pCB219N-N中的相應(yīng)位點(diǎn)(如以上實(shí)施例5.1所述)，來(lái)生成質(zhì)粒pXlC2ter和pXl(118N)C2ter。使用在cbh1啟動(dòng)子的-1399bp處引入XbaI位點(diǎn)并在Gln密碼子(包括木聚糖酶II成熟蛋白的第一個(gè)氨基酸)的毗鄰下游引入NheI位點(diǎn)的引物，從質(zhì)粒pBR322LXC(如在實(shí)施例5.1中所述)擴(kuò)增包含cbh1啟動(dòng)子-1399bp至-204bp和xln2啟動(dòng)子-121bp至-1bp以及包含編碼xln2分泌信號(hào)的序列的1.6kb片段。用Xbal和NheI消化這些PCR產(chǎn)物，并插入與天然型和修飾型木聚糖酶I編碼區(qū)相對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒pXlC2ter和pXl(118N)C2ter位點(diǎn)中，來(lái)生成表達(dá)盒質(zhì)粒pc/xxynl-EC和pc/xxynl-T118N-EC。通過(guò)用xbaI消化、用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平XbaI位點(diǎn)并用EcoRI消化，來(lái)切下表達(dá)盒。通過(guò)用NotI消化、用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平NotI位點(diǎn)并用EcoRI消化，制備含有粗糙鏈孢霉pyr4的質(zhì)粒pNCBglNSNB(r)(如以上實(shí)施例5.2中所述)來(lái)接納該片段。將EcoRI-xynI表達(dá)盒XbaI片段插入選擇盒的下游EcoRI和NotI位點(diǎn)之間，來(lái)制備轉(zhuǎn)化載體pc/xxynl-TV和pc/xxynl-T118N-TV(圖5)。如實(shí)施例7中所述，在通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入里氏木霉M2C38aux5之前，通過(guò)用XbaI消化來(lái)線性化最終的轉(zhuǎn)化載體。5.5pc/xxynC-T128N-TV的構(gòu)建用NheI和KpnI消化木聚糖酶I表達(dá)盒質(zhì)粒pc/xXln1-EC，敲除木聚糖酶I編碼區(qū)，并將大片段與用NheI和KpnI消化的修飾型xyncPCR產(chǎn)物(如以上實(shí)施例3中所述)進(jìn)行連接，從而生成表達(dá)盒質(zhì)粒pc/xxynC-T128N-EC通過(guò)用NotI消化、用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平NotI位點(diǎn)并用XbaI消化，切下表達(dá)盒。同時(shí)，通過(guò)用XhoI消化、用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平XhoI位點(diǎn)并隨后用XbaI消化，制備含有hph的選擇盒質(zhì)粒pHPT136(如以上實(shí)施例5.1所述)來(lái)容納該片段。將XbaI-xynC表達(dá)盒-NotI片段插入pHPT136的選擇盒上游的XbaI和XhoI位點(diǎn)之間。如實(shí)施例7中所述，在通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入里氏木霉RutC30之前，通過(guò)用XbaI消化來(lái)線性化最終的轉(zhuǎn)化載體pc/xxynC-T128N-TV。實(shí)施例6里氏木霉株M2C38的pyr4營(yíng)養(yǎng)缺陷型的分離為了將粗糙鏈孢霉pyr4基因作為選擇標(biāo)記，根據(jù)下列步驟分離M2C38的天然pyr4營(yíng)養(yǎng)缺陷型如先前用于篩選里氏木霉pyr4營(yíng)養(yǎng)缺陷型所述(Berges和Barreau，1991)，將1×106個(gè)M2C38孢子鋪在含有5mM尿苷盒0.15％(w/v)的尿苷類似物5-氟乳清酸(fluorooroticacid，F(xiàn)OA)。在含F(xiàn)OA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，可篩選在編碼乳清苷(orotidine)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的pyr2基因中或在編碼乳清苷5’-磷酸脫羧酶的pyr2基因中的突變中斷。將天然FOA抗性克隆進(jìn)行含或不含尿苷的基本培養(yǎng)基的二次篩選。然后通過(guò)微彈轟擊用pNCBglNSNB(r)來(lái)轉(zhuǎn)化不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的FOA抗性菌落孢子，從中篩選可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的孢子。僅僅將通過(guò)pNCBglNSNB(r)中的粗糙鏈孢霉pyr4基因補(bǔ)足的那些菌株，在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這些是真正的pyr4營(yíng)養(yǎng)缺陷型。使用該方法，選出營(yíng)養(yǎng)缺陷型5(M2C38aux)作為M2C38的穩(wěn)定pyr4營(yíng)養(yǎng)缺陷型。實(shí)施例7里氏木霉M2C38的轉(zhuǎn)化7.1通過(guò)微彈轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化BiolisticPDS-1000/He系統(tǒng)(BioRad；E.I.DuPontdeNemoursandCompany)用于轉(zhuǎn)化M2C38木霉菌株的孢子，并且所有方法根據(jù)制造商的建議進(jìn)行。金粒子(粒徑中值0.6μM，BioRad目錄號(hào)1652262)作為微載體。以下參數(shù)用于轉(zhuǎn)化的最佳條件1100psi爆破壓、29毫米汞柱的氦壓、0.95cm的間隙距離、16mm的微彈飛行距離以及9cm的靶距離。在基本培養(yǎng)基瓊脂(下列實(shí)施例7.2)上制備具有1×106孢子的平板。轟擊的平板在28℃溫育。在菌落轉(zhuǎn)入單獨(dú)的MM瓊脂培養(yǎng)皿中并可長(zhǎng)出孢子的3-6天培育之后，觀測(cè)轉(zhuǎn)化體。7.2使用聚乙二醇(pEG)和CaCl2進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將5×106個(gè)M2G38aux5孢子鋪在補(bǔ)充5mM尿苷的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的無(wú)菌玻璃紙上，并在30℃溫育20小時(shí)來(lái)促進(jìn)孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)。將具有菌絲體的玻璃紙培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入10ml原生質(zhì)體溶液，其中該溶液在含有0.6M硫酸銨(緩沖液P)的50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中含有7.5g/lDriselase和4g/1β-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.，目錄號(hào)分別是0465-1和0439-2)。菌絲叢以60rpm在28℃振動(dòng)消化5小時(shí)室溫下以1000-1500×g離心10分鐘，來(lái)回收原生質(zhì)體用5ml緩沖液P洗滌原生質(zhì)體，并在室溫下以1000-1500×g再次離心10分鐘。將原生質(zhì)體重懸浮在1mlSTC緩沖液(1.2M山梨糖醇、10mMCal2、10mMTris-HCL，pH7.5)，并穿過(guò)無(wú)菌No.60MIRACLOTHTM來(lái)從未消化的菌絲體分離原生質(zhì)體，并收集在無(wú)菌微量離心管中。為了轉(zhuǎn)化，將0.1ml重懸浮的原生質(zhì)體(約5×106原生質(zhì)體)混和2μg載體DNA和25μlPEG溶液(25％PEG4000、50mMCaCl2、10mMTris-HCl，pH7.5)。冰上溫育30分鐘后，加入1mlPEG溶液并將混和液室溫下溫育5分鐘。用2ml1.2M山梨糖醇的PEG溶液稀釋轉(zhuǎn)化混和液，將0.75ml混和液加入冷卻到約47℃的25mL熔融MMSS瓊脂培養(yǎng)基(見(jiàn)下文)，并將原生質(zhì)體懸浮液倒在MM瓊脂上(見(jiàn)下文)。在30℃溫育平板，直至菌落生長(zhǎng)肉眼可見(jiàn)。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)入含有MM瓊脂的單個(gè)平板，使其形成孢子收集孢子，以高稀釋度鋪在MM瓊脂上來(lái)分離同核體轉(zhuǎn)化體，然后鋪在PDA上使其生長(zhǎng)并形成足夠的孢子來(lái)接種以下實(shí)施例9中所述的篩選培養(yǎng)物?；九囵B(yǎng)基(MM)瓊脂包含MMSS瓊脂含有MM瓊脂的相同成分，并添加1.2M山梨糖醇、4mMMgSO4、1g/LYNB(油包水型酵母氮堿氨基酸，購(gòu)自DIFCO，目錄號(hào)291940)以及0.12g/l氨基酸(-UraDO補(bǔ)充物，購(gòu)自CLONTECH，目錄號(hào)8601-1)。實(shí)施例8里氏木霉培養(yǎng)物濾液中木聚糖酶活性的檢測(cè)表達(dá)HTX18、HTZ18(R135Y)、ITX1-5以及ITX′-5的嗜熱木聚糖酶活性的檢測(cè)通過(guò)在65℃測(cè)量還原糖從可溶的阿糖基木聚糖底物的釋放量，測(cè)定里氏木霉轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物濾液中嗜熱木聚糖酶活性的存在。具體地說(shuō)，將30μl合適稀釋度的培養(yǎng)物濾液在65℃預(yù)溫育5分鐘隨后，將再溶解于也在65℃預(yù)溫育了5分鐘的、含有0.04％Tween的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的300μl的1.5％小麥阿糖基木聚糖(MegazymeInternational)溶液，加入微量離心管中的酶試樣中。短暫渦旋試管來(lái)促進(jìn)混合，然后將反應(yīng)液在65℃溫育20分鐘。通過(guò)加入150μl含有43.64mM2-羥基3，5-二硝基苯甲酸、0.93M酒石酸鉀鈉、0.4M氫氧化鈉以及0.4M氫氧化鉀的終止溶液，來(lái)終止酶催化水解反應(yīng)。然后煮沸所得溶液10分鐘，來(lái)促進(jìn)2-羥基-3，5-二硝基苯甲酸與通過(guò)酶從阿糖基木聚糖底物釋放的還原糖進(jìn)行反應(yīng)。在冷水浴中冷卻試管5分鐘，然后加入1.5ml去離子水。在530nm測(cè)量溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溫育期間嗜熱木聚糖酶釋放的還原糖的量，其中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線是基于與相同終止液反應(yīng)的純木糖溶液的幾種稀釋度的A530測(cè)量值。天然的或修飾的里氏木霉木聚糖酶I和變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C-131N超表達(dá)的木聚糖酶I活性的檢測(cè)除了在40℃進(jìn)行溫育以及在含有0.04％Tween的醋酸鹽緩沖液(pH4.0)中制備1.5％小麥阿糖基木聚糖底物之外，根據(jù)以上章節(jié)8.1所述的，對(duì)超表達(dá)天然或修飾木聚糖酶I的里氏木霉菌株的培養(yǎng)物濾液中木聚糖酶I活性進(jìn)行檢測(cè)。除了在40℃進(jìn)行溫育以及在醋酸鹽緩沖液(pH6.0)中制備1.5％小麥阿糖基木聚糖底物之外，根據(jù)以上章節(jié)8.1所述的，對(duì)超表達(dá)修飾的變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C的里氏木霉菌株的培養(yǎng)物濾液中的xylC-131N活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例9在液體培養(yǎng)物中生產(chǎn)修飾型木聚糖酶將單個(gè)木霉屬菌落轉(zhuǎn)入用于增殖各個(gè)培養(yǎng)物的PDA平板。孢子形成是均一接種搖瓶所必需的，其中搖瓶用于測(cè)試培養(yǎng)物生產(chǎn)嗜熱木聚糖酶和纖維素酶的能力。以下是培養(yǎng)基組成組成g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4-7H2O2.02CaCl2-2H2O0.53CSL6.25CaCO310.00碳源**5-200示蹤元素*1mL/L*示蹤元素溶液含有5g/LFeSO4*7H2O、1.6g/LMnSO4*H2O、1.4g/LZnSO4*7H2O。**葡萄糖、Solkafloc、乳糖、纖維二糖、槐糖、玉米糖漿或微晶纖維素(Avicel)碳源以水性溶液形式在pH2至7進(jìn)行單獨(dú)滅菌，并在發(fā)酵過(guò)程開(kāi)始或期間加入剩余的培養(yǎng)基中。將單個(gè)轉(zhuǎn)化體在含有上述培養(yǎng)基的150mL培養(yǎng)液的1升燒瓶中或在24孔微平板的1ml培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。接種之前，起始pH是5.5，并用蒸汽高壓鍋將培養(yǎng)基在121℃滅菌30分鐘。對(duì)于天然的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，如實(shí)施例8所述，從PDA平板分離孢子，并將104-106孢子/ml用于接種各個(gè)培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液以200-300rpm在28℃振蕩培養(yǎng)6天通過(guò)GF/A玻璃微纖維濾紙(Whatman)進(jìn)行過(guò)濾或通過(guò)在12000rpm進(jìn)行離心，從含有分泌蛋白的濾液分離生物量。使用Bio-RadProteinAssay(目錄號(hào)500-0001)，測(cè)定蛋白濃度。如實(shí)施例8中所述，測(cè)定木聚糖酶活性。從每個(gè)構(gòu)建體選擇表達(dá)最高木聚糖酶活性的和顯示高蛋白質(zhì)總產(chǎn)量的菌株，以用于在14升預(yù)發(fā)酵(pilotfermentation)中生長(zhǎng)。實(shí)施例10在14L分批供料發(fā)酵中生產(chǎn)木聚糖酶里氏木霉菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上于28-30℃生長(zhǎng)，直至得到鋪滿的孢子菌苔。收集孢子并用于在1L擋板燒瓶中接種750mlBerkeley培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、1.4g/l(NH4)2SO4、2.0g/lKH2PO4、0.31g/lMgSO4*7H2O、0.53g/lCaCl2、5.1g/l干玉米浸出物、5mg/lFeSO4*7H2O、0.8mg/lMnSO4*H2O、0.7mg/lZnSO4*7H2O)。在28℃和150rpm中生長(zhǎng)3天后，將該培養(yǎng)物用于接種具有下列初始成分的10L發(fā)酵培養(yǎng)基13g/l葡萄糖、2.2g/l(NH4)2SO4、1.39g/lKH2PO4、0.7g/lMgSO4*7H2O、0.185g/lCaCl2、6g/l干玉米浸出物、3.75mg/lFeSO4*7H2O、1.2mg/lMnSO4*H2O、1.05g/lZnSO4*7H2O。在14L的NewBrunswickMicroform發(fā)酵罐中，使用一個(gè)或多個(gè)在實(shí)施例9中列出的誘導(dǎo)碳水化合物來(lái)源，在pH4.5和28-30℃下實(shí)施6天的分批供料需氧發(fā)酵6天后，將培養(yǎng)物對(duì)Harborlite過(guò)濾，調(diào)節(jié)培養(yǎng)物濾液至pH4.5，并用0.5％苯甲酸鹽保存來(lái)防止微生物生長(zhǎng)。因?yàn)榈?天生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)所有發(fā)酵都積累相似數(shù)量的生物質(zhì)(表3)，因此表達(dá)修飾木聚糖酶并未顯著改變木霉宿主菌株的生長(zhǎng)。根據(jù)下列步驟測(cè)定發(fā)酵罐樣品中生物質(zhì)濃度稱重并記錄5-10g發(fā)酵肉湯。然后經(jīng)過(guò)預(yù)稱重的玻璃微纖維濾紙(Whatman)過(guò)濾發(fā)酵肉湯，并用水洗滌將過(guò)濾的生物質(zhì)在110℃烘箱中過(guò)夜干燥。通過(guò)加上濾紙的干生物質(zhì)的質(zhì)量減去濾紙質(zhì)量，測(cè)定干生物質(zhì)重量。如下計(jì)算生物質(zhì)量生物量(g/L)＝[干生物質(zhì)量(g)/濕生物質(zhì)量(g)]×[樣品密度(g/mL)]×1000mL/L與產(chǎn)生相應(yīng)的未修飾木聚糖酶(表3)的菌株相比，產(chǎn)生包含X34N、X131N、X180N或X182N突變的修飾木聚糖酶(參見(jiàn)表2描述的突變)的菌株，可產(chǎn)生更高水平的總蛋白。使用Bio-RadProteinAssay(目錄號(hào)500-0001)，測(cè)定每天發(fā)酵罐樣品的蛋白濃度。表3從轉(zhuǎn)化的里氏木霉菌株表達(dá)修飾型木聚糖酶(生物量和木聚糖酶活性)a在40℃、pH4.0下測(cè)量；b涉及表達(dá)包含除新引入糖基化基序之外的相同一級(jí)氨基酸序列的相應(yīng)未修飾木聚糖酶；c涉及表達(dá)包含Y135R但無(wú)131N突變的修飾木聚糖酶的P67AB的木聚糖酶表達(dá)效率；d涉及表達(dá)不包含T131N或Y135R突變的修飾木聚糖酶菌株2013B的木聚糖酶表達(dá)效率；e在40℃、pH6.0下測(cè)量。如實(shí)施例8中所述，測(cè)定木聚糖酶活性。與HTX18生產(chǎn)菌株P(guān)67AB相比，包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體的菌株P(guān)210A和P284A，可分別產(chǎn)生4.6和2.9倍高的木聚糖酶活性，其中所述的構(gòu)建體除存在于HTX18的突變之外，還含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置131-133處的N-糖基化基序N-X-T。與表達(dá)未修飾HTX18的菌株P(guān)67AB相比，包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體的菌株P(guān)304B和P321H，可產(chǎn)生直到兩倍高的木聚糖酶活性，其中所述的構(gòu)建體除存在于HTX18的突變之外，還含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置180-182處的N-糖基化基序N-X-S/T。與表達(dá)未修飾HTX18的菌株P(guān)67AB相比，包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體的菌株P(guān)322B和P323B，可產(chǎn)生直到3.5倍高的木聚糖酶活性，其中所述的構(gòu)建體除存在于HTX18的突變之外，還含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置182-184處的N-糖基化基序N-X-S/T。與HTX18生產(chǎn)菌株P(guān)67AB相比，包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體的菌株P(guān)331B和P336B，可分別產(chǎn)生1.6和2.1倍高的木聚糖酶活性，其中所述的構(gòu)建體除存在于HTX18的突變之外，含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置34-36處的N-糖基化基序N-X-S/T。與表達(dá)未修飾木聚糖酶I的菌株P(guān)300A相比，包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體的菌株P(guān)279A，可產(chǎn)生直到15.0倍高的木聚糖酶活性，其中所述的構(gòu)建體除含有天然里氏木霉木聚糖酶I序列的位置118-120處的N-糖基化基序N-X-T該突變相當(dāng)于里氏木霉木聚糖酶II的X131N(參見(jiàn)圖1)。包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體(含有天然變鉛青鏈霉菌木聚糖酶C序列的位置128-130處N-糖基化基序N-X-T)的菌株P(guān)348C，可產(chǎn)生與菌株P(guān)279A相同高水平的木聚糖酶活性，其中菌株P(guān)279A也包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體(含有天然木聚糖酶I序列的位置118-120處N-糖基化基序N-X-T)，并具有用于生產(chǎn)工業(yè)應(yīng)用的木聚糖酶的商業(yè)用途該突變相當(dāng)于里氏木霉木聚糖酶II的X131N(參見(jiàn)圖1)。與包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體(含有木聚糖酶II序列內(nèi)部各自相同位點(diǎn)的N-X-S糖基化基序)的菌株P(guān)304B、P322B和P331B相比，包含修飾木聚糖酶遺傳構(gòu)建體(含有N-X-T糖基化基序)的菌株P(guān)321H、P323B和P336B，可產(chǎn)生更高量的木聚糖酶活性。實(shí)施例11比較修飾木聚糖酶ITX1與其天然配對(duì)物HTX18的嗜堿性和耐熱性如實(shí)施例8中所述，測(cè)定酶活為了測(cè)定嗜堿性(圖6)，將測(cè)試的溫育溫度降至55℃，并將含有Tween-20和NSP底物液的磷酸鹽緩沖液調(diào)至適于測(cè)量酶活的期望pH。為了測(cè)定耐熱性(圖7)，將溫育溫度調(diào)至適于測(cè)量酶活的期望溫度。由菌株P(guān)210A(包含HTX18的相同突變但無(wú)Y135R突變和T131N突變，參見(jiàn)表2)產(chǎn)生的修飾ITX1木聚糖酶，具有與HTX18木聚糖酶相似的pH和溫度活性特征(圖6和圖7)。因此，加入T131N突變不會(huì)因?yàn)榱硪粋€(gè)突變而改變木聚糖酶的期望生物物理和生物化學(xué)性質(zhì)。通過(guò)引入X131N突變(TrX編號(hào))，這可有效用于提高所有木霉屬目的家族11的表達(dá)。實(shí)施例12包含T131N突變的ITX1酶的質(zhì)譜分析通過(guò)菌株P(guān)210A產(chǎn)生的、并含有修飾木聚糖酶ITX1的發(fā)酵濾液，稀釋在2×Laemmli緩沖液(62.5mMTris-HCl(pH6.8)、10％丙三醇、2％SDS、5％β-巰基乙醇)，煮沸5分鐘并冷卻。使用含有12％丙烯酰胺(37.5∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺，BioRad目錄號(hào)161-0122)的分辨膠以及使用Mini-PROTEAN3ElectrophoresisCell(BioRad目錄號(hào)165-3301)，在200V(恒壓)電泳40分鐘，通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分離蛋白。使用Bio-SafemCoomassieStain(BioRad目錄號(hào)161-0786)，通過(guò)染色來(lái)目測(cè)凝膠中的蛋白質(zhì)。從凝膠切下20kDa的蛋白帶，脫色并用胰蛋白酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行膠內(nèi)消化。簡(jiǎn)言之，在100mM碳酸氫銨中，用30％乙腈短暫洗滌凝膠帶約10分鐘，并棄去上清。重復(fù)該過(guò)程直至染色被完全除去。然后用去離子水之后用乙腈洗滌凝膠帶將含有20ng胰蛋白酶的約20mL碳酸氫銨(50mM)加入每條凝膠帶中。使凝膠帶再次膨脹10分鐘，并用約30mL碳酸氫銨(50mM)終止(在消化期間，足以保證完全浸沒(méi)凝膠塊)。將來(lái)自每種樣品的液體轉(zhuǎn)入新的小瓶中。之后，使消化繼續(xù)進(jìn)行4小時(shí)將溶液在Savant上蒸發(fā)直至終體積約10mL。使用配備了Q-TOF2四極雜交飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Waters)的CapLC系統(tǒng)(Waters)，通過(guò)納米HPLC串聯(lián)質(zhì)譜分析法(納米LC-MS/MS)分析消化液。將10mL消化液中的3mL注射到0.3×5mm的C18MicroPrecolumnCartridge(Dionex/LCPackings)上留住肽，而沖去鹽和其它溶液成分。然后將阱沿著75mm×150mm的C18納米Series柱(Dionex/LC-Packings)排列，并通過(guò)梯度洗脫(35分鐘的3-45％乙腈和0.2％甲酸，隨即在38.5分鐘內(nèi)甲酸濃度激增至85％)分離肽。以適于兩倍和三倍電荷離子的自動(dòng)模式設(shè)定質(zhì)譜儀來(lái)獲得MS/MS譜。優(yōu)選收集來(lái)自具有和沒(méi)有吸附的HexNAc殘基的重胰蛋白酶肽123-141的多倍電荷離子。手動(dòng)分析MS/MS譜。表4通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)在131N的糖基化這些結(jié)果證實(shí)木霉屬宿主菌株可識(shí)別通過(guò)T131N突變而引入的NAT共有序列N-糖基化基序，并且引入該功能性糖基化基序可促進(jìn)木霉屬的修飾木聚糖酶的高水平表達(dá)?？傊?，通過(guò)X131N突變(TrX編號(hào))，可從木霉屬構(gòu)建顯示表達(dá)效率提高的修飾型木聚糖酶。如本文所述的，當(dāng)家族11木聚糖酶聯(lián)合TrxII時(shí)，通過(guò)將其它N-糖基化基序(N-X-S/T)導(dǎo)入家族11木聚糖酶的位置X34N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T、X182N-S184T或其位置組合，也可獲得相似增加的表達(dá)效率。本發(fā)明描述了可自木霉屬宿主增加表達(dá)和分泌的突變木聚糖酶。這些突變木聚糖酶可用于工業(yè)生產(chǎn)方法，例如紙漿和紙張加工、或作為動(dòng)物飼料添加劑、或用于烘焙和釀造用途。通過(guò)一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明。然而，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是在不背離如權(quán)利要求書(shū)所限定的發(fā)明范圍的基礎(chǔ)上，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多改變和修飾。所有文獻(xiàn)和引文在此引用作為參考。參考文獻(xiàn)Arase，A.，Yomo，T.，Urabe，I.，Hata，Y.，Katsube，Y.andOkada，H.(1993)FEBSLett.316123-127.Berka，R.M.，Kodama，K.H.，Rey，M.W.，Wison，L.J.andWard，M.(1991)ThedevelopmentofAspergillusnigervar.awarmoriasahostfortheexpressionandsecretionofheterologousgeneproducts.Biochem.Soc.Trans.19681-685.Berges，T.andBarreau，C.(1991)IsolationofuridineauxotrophsfromTrichodermareeseiandefficienttransformationwiththeclonedura3andura5genes.Curr.Genet.19359-365.Bissett，J.(1984)ArevisionofthegenusTrichodermaI.SectionLongibrachiatumSect.nov.Can.J.Bot.62924-931.Campbell，R.L.，Rose，D.R.，Sung，W.L.，Yaguchi，M.andWakarchuk，W.(1995)USpatentno.5,405,769issuedonApr.11，1995.Cannon，P.(1986)InternationalCommissionontheTaxonomyofFungi(ICTF)namechangesinfungiofmicrobiological，industrialandmedicalimportance，Part2，Microb.Sci，Vol.3Chen，C.M.，Gritzali，M.andStafford，D.W.(1987)″NucleotidesequenceanddeducedprimarystructureofcellobiohydrolaseIIfromTrichodermareesei″，Bio/Technology5274-278Conesa，A.，Punt，P.J.，vanLuijk，N.andvandenHondel，C.A.M.J.J.(2001)Thesecretionpathwayinfilamentousfungiabiotechnologicalview.Fung.Genet.Biol.33155-171.Goldman，VanMontaguandHerrera-Estrella，(1990)″TransformationofTrichodermaharzianumbyhigh-voltageelectricpulse″，Curr.Genet.17169-174Gritz，L.andDavies，J.(1983)Plasmid-encodedhygromycinBresistancethesequenceofhygromycinBphosphotransferasegeneanditsexpressioninEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiae.Gene25179-188Henrissat，B.(1991)Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.280309-316.Hui，J.P.M.，Lanthier，P.，White，T.C.，McHugh，S.G.，Yaguchi，M.，Roy，R.，andThibault，P.(2001)CharacterizationofcellobiohydrolaseI(cel7a)glycoformsfromextractsofTrichodermareeseiusingcapilliaryisoelectricfocusingandelectrospraymassspectrometry.J.Chrom.B.752349-368.Hui，J.P.M.，White，T.C，andThibault，P.(2002)IdentificationofglycanstructureandglycosylationsitesincellobiohydrolaseliandendoglucanasesIandIIfromTrichodermareesei.Glycobiology12837-849.Kuhls，K.，Lieckfeldt，E.，Samuels，G.J.，Kovacs，W.Meyer，W.，Petrini，O.Gams，W.Brner，T.&Kubicek，C.P.(1996)MolecularevidencethattheasexualindustrialfungusTrichodermareeseiisaclonalderivativeoftheascomyceteHypocreajecorina.Proc.Natl.Acad.Sci.937755-7760.Kulkarni，N.，Shendye，A.andRao，M.(1999)Molecularandbiotechnicalaspectsofxylanases.FEMSMicrobiol.Rev.23411-456Lorito，Hayes，DiPietroandHarman，1993，BiolisticTransformationofTrichodermaharzianumandGliocladiumvirensusingplasmidandgenomicDNA.Curr.Genet.24349-356.Luth，E.，Jasmat，N.B.，andBergquist，P.L.(1990)Appl.Environ.Microbiol.562677-2683.Mandels，M.andReese，E.T.(1957)InductionofcellulaseinTrichodemnaloirideasinfluencedbycarbonsourcesandmetals.J.Bacteriol.73269-278.Mantyla，A.，Paloheimo，M.，Lantto，R.，F(xiàn)agerstrom，R.，Lahtinen，T.，Suominen，P.，andVehmaanpera，J.(2003)SequencesofXylanaseandXylanaseExpressionVectors.US6,667,170.Montenecourt，B.andEveleigh，D.(1979)SelectiveisolationofhighyieldingcellulasemutantsofT.reesei.Adv.Chem.Ser.181289-301.Paloheimo，M.，Mantyla，A.，Kaooio，J.andSuominen，P.(2003)High-yieldproductionofabacterialxylanaseinthefilamentousfungusTrichodermareeseirequiresacarrierpolypeptidewithanintactdomainstructure.Appl.Environ.Microbiol.697073-7082.Paloheimo，M.，Hakola，S.，Mantyla，A.，Vehmaanpera，J.，Lantto，R.，Lahtinen，T.，F(xiàn)agerstrom，R.B.，andSuominen，P.(2001)Xylanases，genesencodingthem，andusesthereof.US6,635,464.Penttila，Nevalainen，Ratto，SalminenandKnowles(1987)AversatiletransformationsystemforthecellulolyticfungusTrichodermareesei.Gene6155-164.Radford，A.，Buston，F(xiàn).P.，Newbury，S.F.andGlazebrook，J.A.(1985)RegulationofpyrimidinemetabolisminNeurospora.InMolecularGeneticsofFilamentousFungi(Timberlake，W.E.，editor)，AlanR.Liss(NewYork)，pages127-143.Saarelainen，R.，Paloheimo，M.，F(xiàn)agerstrom，R.，Suominen，P.L.，andNevalainen，K.M.H.(1993)Cloning，sequencingandenhancedexpressionoftheTrichodermareeseiendoxylanaseII(pI9)，xln2.Mol.Gen.Genet.241497-503.Sagt，C.M.J.，Kleizen，B.，Verwaal，R.，deJong，M.D.M.，Muller，W.H.，Smits，A.，Visser，C.，Boonstra，J.，Sung，W.L.，Yaguchi，MandIshikawa，K.(1999)USpatent#5,866,408，issuedonFeb.2，1999Tsai，B.，Ye，Y.andRapoport，T.A.(2002).Retro-translocationofproteinsfromtheendoplasmicreticulumintothecytosol.NatureReviews-MolecularCellbiology3246-255Te′o，V.S.J.，Cziferszky，A.E.，Bergquist，P.L.，andNevalainen，K.M.H.(2000)CodonoptimizationofxylanasegenexynBfromthethermophilicbacteriumDictyoglomusthermophilumforexpressioninthefilamentousfungusTrichodermareesei.FEMSMicrobiol.Letters19013-19.Trrnen，A.，Mach，R.L.，Messer，R.，Gonzalez，R.，Kalkkinen，N.，Harkki，A.，andKubicek，C.P.(1992)ThetwomajorxylanasesfromTrichodermareeseicharacterizationfobothenzymesandgenes.Bio/technology101461-1465.Turenen，O.，Etuaho，K.，F(xiàn)enel，F(xiàn).，Vehmaanpera，J.，Wu，X.Rouvinen，J.，andLeisola，M.(2001)J.Biotech.8837-46.vandenBrink，H.，Andreasen，B.，Rahbek-Nielsen，H.，Hellmuth，K.，andHarboe，M.(2004)GlycosylationasatoolforimprovedproteinproductioninAspergillusniger.AbstractforposterVIIIp-2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rArgThrGlnArgValAsnGlnProSerIle115120125IleGlyThrAlaThrPheTyrGlnTyrTrpSerValArgArgThrHis130135140ArgSerSerGlySerValAsnThrAlaAsnHisPheAsnAlaTrpAla145150155160GlnGlnGlyLeuThrLeuGlyThrMetAspTyrGlnIleValAlaVal165170175GluGlyTyrPheSerSerGlySerAlaSerIleThrValSer180185190<210>43<211>178<212>PRT<213>TrichodermareeseixylanaseI<400>43AlaSerIleAsnTyrAspGlnAsnTyrGlnThrGlyGlyGlnValSer151015TyrSerProSerAsnThrGlyPheSerValAsnTrpAsnThrGlnAsp202530AspPheValValGlyValGlyTrpThrThrGlySerSerAlaProIle354045AsnPheGlyGlySerPheSerValAsnSerGlyThrGlyLeuLeuSer505560ValTyrGlyTrpSerThrAsnProLeuValGluTyrTyrIleMetGlu65707580AspAsnHisAsnTyrProAlaGlnGlyThrValLysGlyThrValThr859095SerAspGlyAlaThrTyrThrIleTrpGluAsnThrArgValAsnGlu100105110ProSerIleGlnGlyThrAlaThrPheAsnGlnTyrIleSerValArg115120125AsnSerProArgThrSerGlyThrValThrValGlnAsnHisPheAsn130135140AlaTrpAlaSerLeuGlyLeuHisLeuGlyGlnMetAsnTyrGlnVal145150155160ValAlaValGluGlyTrpGlyGlySerGlySerAlaSerGlnSerVal165170175SerAsn<210>44<211>191<212>PRT<213>StreptomyceslividansxylanaseC<400>44AlaThrThrIleThrThrAsnGlnThrGlyThrAspGlyMetTyrTyr151015SerPheTrpThrAspGlyGlyGlySerValSerMetThrLeuAsnGly202530GlyGlySerTyrSerThrGlnTrpThrAsnCysGlyAsnPheValAla354045GlyLysGlyTrpSerThrGlyAspGlyAsnValArgTyrAsnGlyTyr505560PheAsnProValGlyAsnGlyTyrGlyCysLeuTyrGlyTrpThrSer65707580AsnProLeuValGluTyrTyrIleValAspAsnTrpGlySerTyrArg859095ProThrGlyThrTyrLysGlyThrValSerSerAspGlyGlyThrTyr100105110AspIleTyrGlnThrThrArgTyrAsnAlaProSerValGluGlyAsn115120125LysThrPheGlnGlnTyrTrpSerValArgGlnSerLysValThrSer130135140GlySerGlyThrIleThrThrGlyAsnHisPheAspAlaTrpAlaArg145150155160AlaGlyMetAsnMetGlyGlnPheArgTyrTyrMetIleMetAlaThr165170175GluGlyTyrGlnSerSerGlySerSerAsnIleThrValSerGly180185190權(quán)利要求1.一種修飾型家族11木聚糖酶，其包含引入功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)的序列，其中所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。2.權(quán)利要求1的修飾型家族11木聚糖酶，其中通過(guò)在自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶的一級(jí)序列中直接取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，來(lái)產(chǎn)生所述修飾。3.權(quán)利要求2的修飾型家族11木聚糖酶，其包含將選自位置34(X34N)、位置131(X131N)、位置180(X180N)、位置182(X182N)及其組合的位置替換成天冬酰胺的氨基酸取代，所述位置通過(guò)將家族11木聚糖酶與如SEQIDNO1中所示的里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶II的氨基酸序列的序列進(jìn)行對(duì)比而確定。4.權(quán)利要求3的修飾型家族11木聚糖酶，其包含X131N。5.權(quán)利要求3的修飾型家族11木聚糖酶，其還包含將選自位置36(X34N-S36T)、位置182(X180N-S182T)、位置184(X182N-S184T)及其組合的位置替換成蘇氨酸的氨基酸取代。6.權(quán)利要求1的修飾型家族11木聚糖酶，其中當(dāng)在木霉屬宿主菌株中表達(dá)時(shí)，與自其衍生出所述修飾型木聚糖酶的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所述修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。7.權(quán)利要求2的修飾型家族11木聚糖酶，其中當(dāng)在木霉屬宿主菌株中表達(dá)時(shí)，與自其衍生出所述修飾型木聚糖酶的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所述修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。8.權(quán)利要求3的修飾型家族11木聚糖酶，其中當(dāng)在木霉屬宿主菌株中表達(dá)時(shí)，與自其衍生出所述修飾型木聚糖酶的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所述修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。9.權(quán)利要求1的修飾型家族11木聚糖酶，其中家族11木聚糖酶是木霉屬木聚糖酶。10.權(quán)利要求2的修飾型家族11木聚糖酶，其中家族11木聚糖酶是木霉屬木聚糖酶。11.權(quán)利要求3的修飾型家族11木聚糖酶，其中家族11木聚糖酶是木霉屬木聚糖酶。12.權(quán)利要求9的修飾型家族11木聚糖酶，其中木霉屬木聚糖酶是來(lái)自里氏木霉的木聚糖酶1或木聚糖酶2。13.權(quán)利要求10的修飾型家族11木聚糖酶，其中木霉屬木聚糖酶是來(lái)自里氏木霉的木聚糖酶1或木聚糖酶2。14.權(quán)利要求11的修飾型家族11木聚糖酶，其中木霉屬木聚糖酶是來(lái)自里氏木霉的木聚糖酶1或木聚糖酶2。15.一種修飾型家族11木聚糖酶，其選自ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITX5、Xln1-131N以及變鉛青鏈霉菌(S.lividans)xlnC-T131N。16.一種修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其包含可操縱地連接于分泌信號(hào)的啟動(dòng)子，所述分泌信號(hào)可操縱地連接于包含功能性共有序列N-糖基化位點(diǎn)的編碼區(qū)，所述位點(diǎn)不存在于自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中；與自其衍生出所編碼的修飾型木聚糖酶的所編碼的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所述修飾型木聚糖酶遺傳構(gòu)建體使得所編碼的修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加。17.權(quán)利要求16的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中通過(guò)在自其衍生出所述修飾型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶的一級(jí)序列中直接取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，來(lái)產(chǎn)生所述修飾。18.權(quán)利要求16的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中與自其衍生出所編碼的修飾型木聚糖酶的所編碼的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所編碼的修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。19.權(quán)利要求17的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中與自其衍生出所編碼的修飾型木聚糖酶的所編碼的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所編碼的修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。20.權(quán)利要求16的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中分泌信號(hào)是木霉屬分泌信號(hào)。21.權(quán)利要求16的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中木霉屬分泌信號(hào)是木聚糖酶分泌信號(hào)。22.權(quán)利要求21的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中木聚糖酶分泌信號(hào)是木霉屬木聚糖酶I分泌信號(hào)或木霉屬木聚糖酶II分泌信號(hào)。23.權(quán)利要求16的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中所述編碼區(qū)編碼選自以下一組的修飾型木聚糖酶ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITX5、Xln1-131N以及變鉛青鏈霉菌xlnC-T131N。24.權(quán)利要求23的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體，其中所述編碼區(qū)編碼ITX1。25.權(quán)利要求16的遺傳構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子選自木霉屬cbh1啟動(dòng)子、cbh2啟動(dòng)子、eg1啟動(dòng)子、eg2啟動(dòng)子、eg3啟動(dòng)子、eg5啟動(dòng)子、xln1啟動(dòng)子、xln2啟動(dòng)子以及這些啟動(dòng)子的兩個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子組合。26.一種遺傳修飾的微生物，其包含權(quán)利要求16的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體。27.一種遺傳修飾的微生物，其包含權(quán)利要求17的修飾型家族11木聚糖酶遺傳構(gòu)建體。28.權(quán)利要求26的遺傳修飾的微生物，其中與自其衍生出所編碼的修飾型木聚糖酶的所編碼的家族11木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所編碼的修飾型木聚糖酶的表達(dá)效率增加至少40％。29.權(quán)利要求26的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物包含木霉屬或肉座菌屬的成員。30.權(quán)利要求26的遺傳修飾的微生物，其中所述分泌信號(hào)是木霉屬分泌信號(hào)。31.權(quán)利要求30的遺傳修飾的微生物，其中木霉屬分泌信號(hào)是木霉屬木聚糖酶分泌信號(hào)。32.權(quán)利要求31的遺傳修飾的微生物，其中木霉屬木聚糖酶分泌信號(hào)是木霉屬木聚糖酶I分泌信號(hào)或木霉屬木聚糖酶II分泌信號(hào)。33.權(quán)利要求26的遺傳修飾的微生物，其中所述編碼區(qū)編碼選自以下一組的修飾型木聚糖酶ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITX5′、Xln1-131N以及變鉛青鏈霉菌xlnC-T131N。34.權(quán)利要求26的遺傳修飾的微生物，其中所述啟動(dòng)子選自木霉屬cbh1啟動(dòng)子、cbh2啟動(dòng)子、eg1啟動(dòng)子、eg2啟動(dòng)子、eg3啟動(dòng)子、eg5啟動(dòng)子、xln1啟動(dòng)子、xln2啟動(dòng)子以及這些啟動(dòng)子的兩個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子組合。35.一種加工食品或飼料的方法，包括用包含權(quán)利要求1的修飾型家族11木聚糖酶的添加劑處理食品或飼料。36.權(quán)利要求35的方法，其中食物或飼料添加劑選自禽類飼料添加劑、豬飼料添加劑、用于烘焙的添加劑或用于釀酒的添加劑。37.一種生產(chǎn)紙漿的方法，包括用權(quán)利要求1的修飾型家族11木聚糖酶處理紙漿。38.權(quán)利要求1的修飾型木聚糖酶在工業(yè)、飼料或食品加工中的用途。39.權(quán)利要求38的用途，其中工業(yè)加工是生產(chǎn)紙漿。全文摘要本發(fā)明提供了包含引入功能性共有序列糖基化位點(diǎn)的序列的修飾型家族(11)木聚糖酶。所引入的糖基化位點(diǎn)的非限制性實(shí)例包括將在位置(34、131、180、182)或其位置組合的氨基酸突變成天冬酰胺。通過(guò)將目的木聚糖酶序列與里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，測(cè)定家族(11)木聚糖酶中的上述氨基酸位置。使用相似的宿主菌株和生長(zhǎng)條件，當(dāng)與自其衍生出所述修飾型木聚糖酶的相應(yīng)木聚糖酶的表達(dá)效率相比，所引入的共有序列糖基化位點(diǎn)可促進(jìn)修飾型木聚糖酶提高表達(dá)效率。文檔編號(hào)C12N15/74GK101023173SQ200580016801公開(kāi)日2007年8月22日申請(qǐng)日期2005年3月24日優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日發(fā)明者特雷莎·懷特,吉納維芙·R.·吉羅克斯,凱蒂·E.·A.·華萊士申請(qǐng)人:埃歐金生物制品公司